Фрагмент днк человека для идентификации живых организмов

 

Использование: биотехнология, генетическая инженерия, криминалистика, генетика. Сущность изобретения: фрагмент ДНК человека для идентификации живых организмов размеров 485, п.н. содержит повторяющийся тринуклеотид ТСС и имеет участок узнавания рестриктазой Есо311 на расстоянии 460 п.н. от левого конца вставки, участки узнавания рестриктазой Gsu1 на расстоянии 154 и 308 п.н. от левого конца вставки. 1 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, генетической инженерии, и может найти применение в криминалистике при идентификации личности, установлении отцовства и материнства, а также в генетике и селекции живых организмов.

Известен олигонуклеотид (TCC)₅, применяемый в качестве зонда при идентификации живых организмов по способу, включающему выделение их ДНК, ее фрагментацию, фракционирование, гибридизацию с зондом и собственно идентификацию по результатам анализа полученной картины гибридизации (Epplen J.T. at.al. Hum. Genet., 1989, v. 82, p.227-233).

Однако картина гибридизации, получаемая при использовании данного известного зонда, недостаточно информативна, что снижает достоверность идентификации.

Известен фрагмент ДНК человека в составе рекомбинантной плазмиды (Шленский А.Б. автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук. - М. - 1993. - С. 34.).

Однако фрагмент ДНК человека, содержащийся в известной плазмиде, не позволяет получать достаточно информативные картины гибридизации и идентифицировать живые организмы, что делает актуальной задачу расширения ассортимента зондов, применяемых с этой целью.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является получение нового зонда, позволяющего получать высоко информативные картины гибридизации и тем самым повысить достоверность идентификации живых организмов.

Достигается это тем, что для использования в качестве зонда при идентификации живых организмов предложен фрагмент ДНК человека размером 485 п.н. , содержащий повторяющийся тринуклеотид TCC, имеющий строение, приведенное в конце формулы изобретения.

в котором участок узнавания рестриктазой Eco311 на расстоянии 460 п.н. от левого конца вставки; участки узнавания рестриктазой Gsu1 на расстоянии 154 и 308 п. н. от левого конца вставки; промоторы и участки, содержащие гены, отсутствуют.

На фигуре представлена физическая карта новой плазмиды pTCC1, в состав которой включен новый фрагмент ДНК человека. Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. В процессе получения фрагмента используют библиотеку геномной ДНК человека на фаге EMBL-3 (фирма Atlanta). Скрининг проводят с олигонуклеотидом (TCC)₅. Олигонуклеотид метят ( γ - ³²P) ATP с помощью полинуклеотидкиназы фага T4 по следующей методике: 5 мкл (1-50 нМ) олигонуклеотида (TCC) 40 мкл воды, 5 мкл буфера (500 мМ трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ MgCl, 50 мM DTT, 1 мM спермидина, 1 мМ ЭДТА), 50 мКи ( γ - ³²P) - ATP 1 мкл полинуклеотидкиназы T4 при 37^oC 1 час. В работе используют штамм E.coli LE392 (F^-, hsdR514[r_k - , m_k-] , su⁺, supE44, supF58, lacY1, galK2, galT22, metB1, trpR55, λ -). Фаговую библиотеку, разводят в SM буфере (50 мМ трис-HCl pH 7.5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgSO, 0.01%-ный желатин) и высевают с 3 мл расплавленного верхнего агара (0.7%-ная агароза в питательном бульоне) с добавлением клеток E. coli LE392. Клетки готовят следующим образом: штамм растят до стационарной фазы, затем осаждают и разводят в 0.01 М MgSO до концентрации 1.5·10⁹ кл./мл. Высев производят на застывший 1.5%-ный бакто-агар с питательным бульоном. Чашки инкубируют при 37^oC 3-8 часов до образования бляшек фаголизатов. Реплики получают на нитроцеллюлозных фильтрах фирмы Schleicher and Schuell BA 85, путем наложения их на чашки Петри с фаговыми бляшками.

Отпечатки затем лизируют в денатурирующем растворе (0.5 М NaOH, 1.5 М NaCl) в течение 5 мин, затем в нейтрализующем растворе (0.5 М Мтрис-HCl, 1.5 М NaCl) 5 минут. ДНК закрепляют на фильтрах запеканием при 80^oC. Условия гибридизации олигонуклеотида (TCC)₅, меченного ( γ - ³²P)-ATP, с фильтрами репликами, рассчитанные согласно Nucleic acid hybridisation Hames A., Higgins A., 1985., гл. 4.1, составляют: 37^oC 6 часов в растворе, содержащем 5-кратный SSC, 5 мМ EDTA, 5-кратный Денхардт раствор, 0,1%-ный SDS. После гибридизации фильтры отмывают в 4-кратном SSC при 37^oC 2 часа. Радиоавтографию проводят на рентгеновской пленке PM-B в течение нескольких суток.

Отбирают наиболее яркие сигналы на радиоавтографах. Эллюируют соответствующие фаговые бляшки на чашках Петри и консервируют в SM буфере.

Фрагмент ДНК человека тринуклеотидным повтором TCC выделяют с помощью рестриктазы Sau3A из ДНК фага, дающего наиболее яркий сигнал на радиоавтографе. ДНК фага выделяют из ночной культуры с лизированными клетками. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием при 6000 g. Клеточную ДНК и РНК обрабатывают ДНК-зой и РНК-зой при температуре 37^oC в течение 1 часа. Фаговые частицы осаждают с помощью водного раствора, содержащего 20%-ный ПЭГ, 2.5 М NaCl, при ускорении 10000 g в течение 5 минут. ДНК выделяют фенольной обработкой с последующим переосаждением спиртом. (Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск, 1990 с. 7-8). Рестриктированную ДНК разделяют на 0,8%-ной агарозе с помощью электрофореза. Участок вставки с тринуклеотидным повтором эллюируют из агарозы выдавливанием на центрифуге.

Пример 2. Переклонирование в плазмиду осуществляют с помощью вектора Puc19 с BamHI липкими концами. Лигирование проводят в 20 мкл 1-кратного буфера для лигирования (10 мМ трис-HCl, pH 7.5, 10 мМ MgCl, 10 мМ DTT, 0,0025 мМ ATP) при 12^oC 12 часов. В реакцию брали 10 ед. T4 ДНК-лигазы.

Трансформацию лигированного материала осуществляют в компетентные клетки штамма HB101 E.coli [F-, hsdS20(r_B-, m_B-), recA13, ara - 14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(Sm^r), xyl-5, mtl-1, supE44, λ -]. Селекция рекомбинантных клонов проведена с использованием ИПТГ и X-gal на 1,5% бакто-агаре с ампициллином (50 мкг/мл).

Селектированный клон подращивают в течение ночи в питательном бульоне с ампициллином (50 мкг/мл). Бактериальные клетки осаждают на микроцентрифуге в течение 1 мин. Осадок ресуспендируют в 200 мкл STET буфера (8%-ная сахароза, 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ ЭДТА, 0,1%-ный тритон X-100) и инкубируют 5 мин после добавления 4 мкл лизоцима (50 млг/млл). Кипячением в течение 45 сек и последующим осаждением на микроцентрифуге (10 мин) удаляют бактериальную ДНК. В раствор добавляют СТАВ (5%-ный) до конечной концентрации 0,5%-ов. После перемешивания центрифугируют 5 мин на микроцентрифуге. Осадок ресуспендируют в 300 мкл 1,2 М NaCl. Добавляют 750 мкл этанола и центрифугируют на микроцентрифуге 10 мин. ДНК растворяют в 20 мкл воды.

В результате получают растворенную в воде плазмиду pTCC1, содержащую фрагмент ДНК человека с повторяющимся тринуклеотидом TCC.

Пример 3. Выделение ДНК из крови и тканей идентифицируемых живых организмов проводят известными методами.

ДНК обрабатывают рестриктазами в стандартных условиях при 37^oC в течение 12 часов. Электрофорез проводят в горизонтальном 1%-ном агарозном геле при напряженности поля 0,8 В/см 16-20 часов. ДНК, фракционированную в агарозном геле, переносят на нитроцеллюлозные фильтры по методу Саузерна. Гибридизацию проводят с высокомеченными одноцепочечными пробами на основе плазмиды pTCC1.

Высокомеченную пробу на основе плазмидного зонда pTCC1 получают с использованием рассеянной затравки. Предварительно плазмиду обрабатывают рестриктазой EcoRI, для получения релаксированной формы ДНК. Удельная активность проб составляет 10⁹ имп/мин/мкг. Перед гибридизацией пробу денатурируют в кипящей воде в течение 2 минут. Гибридизацию проводят при 60^oC 18-24 часа, в том же буфере, что и гибридизацию олигонуклеотидов с фильтрами репликами фаговых бляшек. Удельная активность пробы в растворе составляет 1-3·10⁶ имп/мин/млл.

Отмывку осуществляют при 60^oC в 2-кратном SSC, 0,1%-ном SDS 2 часа. Методом радиоавтографии на рентгеновской пленке PM-B осуществляется детекция полиморфных последовательностей ДНК.

Пример 4. ДНК обрабатывают рестриктазой MvaI. По методике примера 3 получают картины гибридизации для отца, матери и ребенка. У отца и матери наборы полос сильно отличаются, как и должно быть для двух неродственных индивидуумов. Ребенок имеет половину гибридизационных полос от матери, половину от отца. Это согласуется с Менделевским характером наследования полос. Зонд pTTC1 показывает 6-10 полос в области 9-25 т.п.н. и годен для криминалистических исследований.

Пример 5. ДНК отца матери и ребенка обрабатывают рестриктазой PstI. По способу согласно изобретению, получают картины гибридизации, согласующиеся с Менделевским типом наследования полос.

Пример 6. Исследуют три линии одного вида мышей (M. musculus). Используя в качестве зонда новую плазмиду pTCC1, получают различные картины гибридизации. В то же самое время ДНК особей одной линии дают одинаковые картины гибридизации.

Формула изобретения

Фрагмент ДНК человека для идентификации живых организмов, включающий повторяющийся тринуклеотид ТСС, имеющий следующее строение приведенное на с.

содержащий участок узнавания рестриктазой E со 311 на расстоянии 460 п. н. от левого конца вставки; участки узнавания рестриктазой Gsu 1 на расстоянии 154 и 308 п. н. от левого вида вставки, не содержащий промоторы и участки генов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2