Способ определения чувствительности микроба к антибиотику

 

Изобретение относится к медицине, а именно к бактериологии, и касается способа определения чувствительности микроба к антибиотику. Сущность изобретения заключается в посеве микроорганизма на питательную среду, исследовании роста микроорганизма в присутствии антибиотика, а также цитокина или смеси цитокинов, которые используют в конечной концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика. Технический результат изобретения заключается в повышении информативности способа.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням и бактериологии, и может быть, в частности, использовано при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотику.

Из практики медицины известны способы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотику in vitro, заключающиеся в нанесении бумажного диска с антибиотиком на поверхность плотной питательной среды после посева культуры микроорганизма и оценкой диаметра зоны задержки роста или во введении антибиотика в серийных разведениях в питательную среду с последующим посевом культуры микроорганизма и определением концентрации препарата, вызывающей видимую задержку роста или не дающую роста [1].

На основании информации результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотику по описанным способам проводят исследования антибиотика in vivo и его клинические исследования.

В последние годы разрабатываются методы лечения инфекционных заболеваний, включающие антибиотикотерапию и применение цитокинов (например, интерферонов, фактора некроза опухолей-α) в качестве иммунобиологических препаратов. Авторами предлагаемого способа установлено, что препараты цитокинов - единственные из известных иммунобиологических препаратов, изменяющие чувствительность микроорганизмов к антибиотику.

Известные способы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотику не учитывают влияние цитокинов, являющихся необходимыми компонентами внутренней среды организма, на чувствительность микроорганизма к антибиотику. Это является их существенным недостатком, снижающим информативность исследования антибиотика in vitro.

Предлагаемый способ определения чувствительности микроба к антибиотику является новым и в литературе не описан.

В основу предлагаемого способа положена задача определения чувствительности микроорганизмов к антибиотику в присутствии цитокинов, повышающая информативность способа для исследования in vivo, в соответствии с полученными авторами предлагаемого способа данными о влиянии цитокинов на чувствительность микроорганизмов к антибиотику.

Задача решена тем, что при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, включающем посев на питательную среду микроорганизмов с последующим исследованием их роста в присутствии антибиотика, при наличии в организме цитокинов исследование роста микроорганизмов осуществляют в присутствии одновременно антибиотика и цитокина или смеси цитокинов, которые используют в конечной концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика.

При этом в зависимости от используемых цитокинов выявляется более или менее выраженное изменение чувствительности микроорганизмов к антибиотику, соответствующее результату исследования антибиотика и цитокина или смеси цитокинов in vivo.

Предложенный способ апробирован на изолятах Staphylococcus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae.

Пример 1. Готовили взвесь культуры Staphylococcus aureus плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуре. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл водного раствора рекомбинантного фактора некроза опухолей-α с активностью 5х10⁵ МЕ/мл при концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика, и помещали коммерческий бумажный диск с ампициллином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с ампициллином. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Диаметр зоны задержки роста в присутствии ампициллина и фактора некроза опухолей-α составил 25 мм, в присутствии только ампициллина - 20 мм.

При исследовании in vivo на модели стафилококкового сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения ампициллина и рекомбинантного фактора некроза опухолей-α увеличился в 1,3 раза по сравнению с группой животных, получавших ампициллин.

Пример 2. Готовили взвесь культуры Staphylococcus aureus плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0.9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуре. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл водного раствора рекомбинантного γ-интерферона с активностью 5х10 МЕ/мл при концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика, и помещали коммерческий бумажный диск с ампициллином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с ампициллином. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Диаметр зоны задержки роста в присутствии ампициллина и γ-интерферона составил 22 мм, в присутствии только ампициллина - 20 мм.

При исследовании in vivo на модели стафилококкового сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения ампициллина и рекомбинантного γ-интерферона увеличился в 1,2 раза по сравнению с группой животных, получавших ампициллин.

Пример 3. Готовили взвесь культуры Staphylococcus aureus плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0.9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуре. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл водного раствора рекомбинантного α₂-интерферона с активностью 5х10⁶ МЕ/мл при концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика, и помещали коммерческий бумажный диск с ампициллином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с ампициллином. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Диаметр зоны задержки роста в присутствии ампициллина и α₂-интерферона составил 8 мм, в присутствии только ампициллина - 20 мм.

При исследовании in vivo на модели стафилококкового сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения ампициллина и рекомбинантного α₂-интерферона уменьшился в 1,4 раза по сравнению с группой животных, получавших ампициллин.

Пример 4. Готовили взвесь культуры Staphylococcus aureus плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуре. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл водного раствора с 5х10⁵ МЕ/мл рекомбинантного фактора некроза опухолей-α, 5х10⁶ МЕ/мл рекомбинантного α₂-интерферона и 5х10⁵ МЕ/мл γ-интерферона при конечной концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика, и помещали коммерческий бумажный диск с ампициллином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с ампициллином. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС Диаметр зоны задержки роста в присутствии ампициллина, фактора некроза опухолей-α , α₂-интерферона и γ-интерферона составил 8 мм, в присутствии только ампициллина - 20 мм.

При исследовании in vivo на модели стафилококкового сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения ампициллина и смеси рекомбинантных цитокинов (рекомбинантного фактора некроза опухолей-α , рекомбинантного α₂-интерферона, рекомбинантного γ-интерферона) уменьшился в 1,2 раза по сравнению с группой животных, получавших ампициллин.

Пример 5. Готовили взвесь культуры Escherichia coli плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуре. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл водного раствора рекомбинантного фактора некроза опухолей-α с активностью 10⁵ МЕ/мл при концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика, и помещали коммерческий бумажный диск с тетрациклином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с тетрациклином. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Диаметр зоны задержки роста в присутствии тетрациклина и фактора некроза опухолей-α составил 16 мм, в присутствии только тетрациклина - 12 мм.

При исследовании in vivo на модели эшерихиозного сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения тетрациклина и рекомбинантного фактора некроза опухолей-α увеличился в 1,2 раза по сравнению с группой животных, получавших тетрациклин.

Пример 6. Готовили взвесь культуры Escherichia coli плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуре. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл водного раствора рекомбинантного γ-интерферона с активностью 10⁵ МЕ/мл при концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика, и помещали коммерческий бумажный диск с тетрациклином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с тетрациклином. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Диаметр зоны задержки роста в присутствии тетрациклина и γ-интерферона составил 19 мм, в присутствии только тетрациклина - 12 мм.

При исследовании in vivo на модели эшерихиозного сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения тетрациклина и рекомбинантного γ-интерферона увеличился в 1,4 раза по сравнению с группой животных, получавших тетрациклин.

Пример 7. Готовили взвесь культуры Escherichia coli плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуры. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл водного раствора рекомбинантного α₂-интерферона с активностью 10⁶ МЕ/мл при концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика, и помещали коммерческий бумажный диск с тетрациклином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с тетрациклином. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Диаметр зоны задержки роста в присутствии тетрациклина и α₂-интерферона составил 9 мм, в присутствии только тетрациклина - 12 мм.

При исследовании in vivo на модели эшерихиозного сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения тетрациклина и рекомбинантного α₂-интерферона уменьшился в 1,2 раза по сравнению с группой животных, получавших тетрациклин.

Пример 8. Готовили взвесь культуры Escherichia coli плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуре. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл водного раствора с 10⁵ МЕ/мл рекомбинантного фактора некроза опухолей-α, 10⁶ МЕ/мл рекомбинантного α₂-интерферона и 10⁵ МЕ/мл γ-интерферона при их конечной концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика, и помещали коммерческий бумажный диск с тетрациклином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с тетрациклином. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Диаметр зоны задержки роста в присутствии тетрациклина и смеси цитокинов составил 9 мм, в присутствии только тетрациклина - 12 мм.

При исследовании in vivo на модели эшерихиозного сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения тетрациклина и смеси цитокинов (рекомбинантного фактора некроза опухолей-α, рекомбинантного α₂-интерферона, рекомбинантного γ-интерферона) уменьшился в 1,2 раза по сравнению с группой животных, получавших тетрациклин.

Пример 9. Готовили взвесь культуры Staphylococcus aureus плотностью 10 ЕД оптического стандарта ГИСК на стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри наливали 1 мл полученной взвеси и равномерно распределяли ее по всей поверхности среды. Подсушивали среду 10 мин при комнатной температуре. На поверхность газона с одной стороны наносили 0,1 мл жидкой питательной среды после культивирования в ней в течение 48 ч лимфоцитов периферической крови человека, преинкубированных с 10⁵ МЕ/мл рекомбинантного фактора некроза опухолей, и помещали коммерческий бумажный диск с ампициллином, с другой стороны помещали только коммерческий бумажный диск с ампициллином. Полученная жидкая питательная среда не вызывала гибель микроорганизмов без антибиотика. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Диаметр зоны задержки роста в присутстви ампициллина и жидкой питательной среды составил 23 мм, в присутствии только ампициллина - 20 мм.

При исследовании in vivo на модели стафилококкового сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения ампициллина и рекомбинантного фактора некроза опухолей-α увеличился в 1,3 раза по сравнению с группой животных, получавших ампициллин.

Пример 10. В предварительном опыте методом серийных разведений определяли минимальную дозу бензилпенициллина натриевой соли, полностью подавляющую рост Staphylococcus aureus при посеве инокулята 0,1 мл взвеси плотностью 10 ЕД оптической плотности ГИСК в 1 мл жидкой питательной среды. Эта доза составила 10³ ЕД/мл. В основном опыте использовали три пробирки: первая - контрольная - без антибиотика и цитокина, вторая - с бензилпенициллином натриевой соли в концентрации 10³ ЕД/мл, третья - с антибиотиком в концентрации 10³ ЕД/мл и рекомбинантным α₂-интерфероном в концентрации 5 х 10⁵ ЕД/мл. Все три пробирки засевали взвесью Staphylococcus aureus так же, как в предварительном опыте. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Во второй пробирке рост Staphylococcus aureus был полностью подавлен. В третьей пробирке та же концентрация бензилпенициллина натриевой соли не подавляла роста микроорганизмов. Визуально результаты опыта в первой и третьей пробирках были идентичны.

При исследовании in vivo на модели стафилококкового сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения бензилпенициллина натриевой соли и рекомбинантного α₂-интерферона уменьшился в 1,4 раза по сравнению с группой животных, получавших бензилпенициллин натриевую соль.

Пример 11. В предварительном опыте методом серийных разведений определяли минимальную дозу бензилпенициллина натриевой соли, полностью подавляющую рост Staphylococcus aureus при посеве инокулята 0,1 мл взвеси плотностью 10 ЕД оптической плотности ГИСК в 1 мл жидкой питательной среды. Эта доза составила 10³ ЕД/мл. В основном опыте использовали три пробирки: первая - контрольная - без антибиотика и цитокина, вторая - с бензилпенициллином натриевой соли в концентрации 10³ ЕД/мл, третья - с антибиотиком в концентрации 10³ ЕД/мл, рекомбинантным α₂-интерфероном в концентрации 5 х 10⁵ ЕД/мл, рекомбинантным γ-интерфероном в концентрации 5 х 10⁴ ЕД/мл, с рекомбинантным фактором некрозом опухолей-α в концентрации 5 х 10⁴ ЕД/мл. Все три пробирки засевали взвесью Staphylococcus aureus так же, как в предварительном опыте. Инкубировали в термостате в течение 18 ч при температуре 37^oС. Во второй пробирке рост Staphylococcus aureus был полностью подавлен. В третьей пробирке та же концентрация бензилпенициллина натриевой соли не подавляла роста микроорганизмов. Визуально результаты опыта в первой и третьей пробирках были идентичны.

При исследовании in vivo на модели стафилококкового сепсиса у мышей показано, что процент выживаемости животных при использовании парентерального введения бензилпенициллина натриевой соли, рекомбинантного α₂-интерферона, рекомбинантного γ-интерферона и рекомбинантного фактора некроза опухолей-α уменьшился в 1,4 раза по сравнению с группой животных, получавших бензилпенициллин натриевую соль.

Предлагаемый способ выявляет изменение чувствительности микроорганизмов к антибиотику в присутствии цитокинов in vitro, соответствует результатам исследования антибиотика и цитокина или смеси цитокинов in vivo и поэтому является более информативным.

Источник информации Красильников А.П. Микробиологический словарь-справочник. Минск, 1986, с. 334-338.

Формула изобретения

Способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, включающий посев на питательную среду микроорганизмов с последующим исследованием их роста в присутствии антибиотика, отличающийся тем, что исследование роста микроорганизмов осуществляют в присутствии одновременно антибиотика и цитокина или смеси цитокинов, которые используют в конечной концентрации, не вызывающей гибель микроорганизмов без антибиотика.