Штамм streptococcus sp. вк-18l (в-6587) - продуцент стрептококкцина

 

Штамм Streptococcus sp. ВК-18L (В-6587) получен с использованием методов биотехнологии и генетико-селекционных приемов. Путем обработки мутагеном и селекцией получен Streptococcus sp. BS, резистентный к стрептомицину. Затем электропорацией с использованием лактозной плазмиды, выделенной из лабораторного штамма Streptococcus lactis, получают штамм ВК-18L. Штамм обладает повышенной и стабильной биологической активностью, способен к росту на питательных средах с более широким диапазоном источников углерода, а также - на синтетических минеральных средах, удешевляющих производство и облегчающих выделение стрептококкцина. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может использоваться в медицинской промышленности и ветеринарии для получения коммерческого препарата "Томицид", его производных или пищевых добавок, основой которых является штамм Streptococcus sp. BK-18L и продуцируемый им стрептококкцин [1,3].

Целью настоящего изобретения является создание штамма-продуцента стрептококкцина с повышенной и стабильной биологической активностью, способного к росту на питательных средах с более широким диапазоном источников углерода, а также на синтетических минеральных средах, удешевляющих производство и облегчающих выделение стрептококкцина.

Новый штамм Streptococcus sp. BK-18L (B-6587) получен с использованием новейших методов биотехнологии и генетико-селекционных приемов по следующей схеме: путем обработки мутагеном и селекции получен штамм Streptococcus sp. BS, резистентный к стрептомицину; затем электропорацией [4] с использованием лактозной плазмиды, выделенной из лабораторного штамма Streptococcus lactis, получают штамм BK-18L.

Прототипом изобретения служит штамм Streptococcus sp. BS (B-4596) [5].

Недостатком этого штамма является его нестабильность по уровню антибактериальной активности, ограниченность в выборе питательных сред, что затрудняет очистку препарата и значительно повышает стоимость его производства.

Штамм Streptococcus sp. BK-18L (B-6587) депонирован и хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов при ГНИИгенетика и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки грамположительные, овоидные, размером 1,0-0,8 мкм, иногда в цепочках. Мясопептонный агар: 37^oC, 48 ч. Образует мелкие, круглые колонии диаметром 1-2 мм серовато-желтого цвета с полупрозрачным краем, непрозрачным центром и ровными краями. По консистенции колонии вязкие. Мясопептонный бульон: 37^oC, 48 ч. Рост с помутнением среды и выпадением рыхлого осадка. При встряхивании среда мутная. На среде Хоттингера штамм проявляет аналогичные свойства. Способен расти на синтетической среде M-9 с добавлением 5% казаминовых кислот и глюкозы, сахарозы или лактозы в концентрации 0,5% в качестве источника углерода. В этих условиях проявляет те же свойства, что и при росте на МПА. На среде "B" (среда для оптимальной продукции "Томицида" или стрептококкцина следующего состава, на 1 л: пепсин-пептон 500 мл, мясная вода 500 мл, ацетат натрия 5 г, глюкоза 1 г, или сахароза 1 г, или лактоза 1 г, pH 7,6) при аналогичных условиях выращивания штамм обладает такими же культурально-морфологическими свойствами, что и на средах МПБ, МПА и Хоттингера.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм Streptococcus sp. BK-18L, как и прототип, принадлежит к серологической группе N стрептококков (Определитель Берги, 1986 г.). Факультативный анаэроб. Грамположителен. Оптимальная температура роста 30-37^oC. Максимальная скорость роста наблюдается при 35-37^oC. Оптимальные значения pH 7,5-7,7.

В табл. 1 приведены сравнительные биохимические свойства штаммов Streptococcus sp. BS (B-4596) и Streptococcus sp. BK-18L (B-6587). Из данных, приведенных в табл. 1, следует, что по биохимическим свойствам штамм BK-18L отличается от прототипа способностью хорошо расти не только на глюкозе и сахарозе, но и на лактозе и галактозе.

Генетические признаки. Штамм устойчив к рифампицину (RifR), стрептомицину (StrR). Содержит Lac-плазмиду, детерминирующую способность к усвоению лактозы. Таким образом, сходство культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов BK-18L и BS (прототипа) устанавливает их родство, а различия в способности роста на лактозе и галактозе и генетический признак устойчивости к стрептомицину при стабильном уровне продукции антибактериального вещества позволяют идентифицировать вновь заявленный штамм как новый штамм продуцент "Томицида" и стрептококкцина.

Штамм хранят при 6 - 8^oC в лиофильно-высушенном состоянии.

Пример конкретного использования штамма.

Сущность изобретения поясняется следующим конкретным применением использования штамма Streptococcus sp. B-6587. Для получения посевного материала лиофилизованную культуру штамма в концентрации 200-500 млн. кл/мл засевают в среду "B" и культивируют при 37^oC. Затем 16 ч культуру вносят в среду того же состава в концентрации, что указана выше, и выращивают при 37^oC в ферментере в течение 48 ч. После чего культуральную жидкость отделяют от клеток сепарацией, стерилизуют фильтрацией и определяют антибактериальную активность препарата стрептококкцина методом серийных разведений (метод Государственной фармакопеи). В качестве тест-культуры используют штамм Micrococcus luteus 2665 в конечной концентрации 10/4 - 10/5 кл/мл. За единицу активности принимается наибольшее разведение препарата, задерживающее рост тест-культуры. Препарат хранят при 4 - 6^oC в течение 2 лет. В табл. 2 приведены данные по антибактериальной активности препаратов стрептококкцина штаммов Streptococcus sp. BS (B-4596) (прототип) и Streptococcus sp. BK-18L (B-6587).

Технико-экономическая или иная эффективность.

Преимущество штамма Streptococcus sp. BK-18L (B-6587) по сравнению со штаммом Streptococcus sp. BS (B-4596): более широкий диапазон использования источников углерода, высокий уровень продукции стрептококкцина при росте на синтетический минеральной среде.

Планируемый экономический эффект - снижение стоимости препарата не менее чем в 5 раз. Возможность использования штамма для получения из небелковой среды очищенных препаратов медицинского назначения.

Таким образом, штамм является более пригодным для использования в производстве препаратов для лечения инфекционных заболеваний.

Литература.

1. Блинкова Л.П. и др. Авторское свидетельство СССР N 772223, 1980, Штамм Streptococcus sp. ТОМ 1606 - продуцент антибактериальной субстанции.

2. Блинкова Л. П. и др. Патент России N 1808006 A3, C 12 N 1/00, 1993, Питательная среда для культивирования Streptococcus sp. ТОМ 1606 - продуцент антибактериального препарата "Томицид".

3. Фармакопейная статья 42-32 BC-87.

4. Тюрин М.В., Лившиц В.А. Биологические мембраны. 1994, т. 11, N 2, с. 117-139.

5. Блинкова Л. П. и др. Авторское свидетельство СССР N 1708843, Штамм Streptococcus sp. BS (B-4596) - продуцент стрептококкцина (прототип).

Формула изобретения

Штамм Streptococcus sp. ВК-18L (B-6587) - продуцент стрептококкцина.

РИСУНКИ

Рисунок 1