Способ и набор для обнаружения вируса лихорадки долины рифт в биологическом материале

 

Способ диагностики лихорадки долины Рифт включает постановку реакции и учет ее результатов. При этом проводят твердофазный иммуноферментный анализ. В качестве биологического материала используют 10%-ную суспензию исследуемых органов, кровь, культуральные материалы, зараженные вирусом лихорадки долины Рифт. Перечисленные биологические материалы сорбируют в лунки микротитрационной пластины. Далее в лунки пластины сорбируют специфический Ig G-биотин. После отмывки сорбируют стрептавидин и биотин-β-галактозидазу, взятые в соотношении 2 : 1 соответственно или 1 : 1. Набор для обнаружения вируса лихорадки долины Рифт в биологическом материале содержит антиген и конъюгаты и дополнительно стрептавидин. При этом в качестве конъюгатов набор содержит специфический Ig G-биотин и биотин-β-галактозидазу, а в качестве антигенов - контрольный антиген и специфический антиген к вирусу лихорадки долины Рифт. Набор содержит перечисленные препараты, помещенные в ампулы по 0,5 мл. Способ позволяет повысить чувствительность реакции определения, может быть использован в научно-исследовательских учреждениях и предприятиях биологической промышленности для наработки наборов. 2 с.п.ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к способу и набору для обнаружения вируса лихорадки долины Рифт (ЛДР) и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и предприятиях биологической промышленности для наработки наборов. Известно использование иммуноферментного метода (ИФМ) для обнаружения антигена вируса ЛДР (Morril G.C. et al. , 1989).

Известно также использование авидин-биотинового комплекса на основе фермента пероксидазы для обнаружения антигена вируса ЛДР в срезах тканей печени (Arborio M. and Hall W.C., 1989). Однако антиген обнаруживали в изобилии только в отдельных гепатоцитах и воспроизвести это авторам не удалось. Метод более трудоемкий, громоздкий, продолжительный, требует специальной подготовки и оборудования.

Целью настоящего изобретения является разработка способа и набора для обнаружения вируса ЛДР в различных биологических материалах (органных, культуральных, крови).

Предлагаемый способ позволяет обнаруживать антиген вируса ЛДР в биологических материалах путем применения комплекса специфические Ig G-биотин + стрептавидин + биотин-β-галактозидаза при соотношении стрептавидина и биотинилированного фермента 2 и 1 мкг/мл или 1 и 2 мкг/мл соответственно, благодаря этому чувствительность реакции повышается в 25-500 раз, что позволяет обнаруживать 3 1g ЛД 50/мл, 2 1g ТЦД 50/мл вируса.

Предлагаемый набор включает емкости, содержащие контрольный и специфический антигены, конъюгаты: специфический Ig G-биотин, биотин-β-галактозидаза, стептавидин.

Пример конкретного выполнения. Для диагностики ЛДР твердофазным иммуноферментным методом (ТФ ИФМ) готовят 10% суспензию исследуемых органов, отбирают культуральные пробы (при выделении вируса), исследуемые образцы крови. Исследуемые образцы антигена вносят в лунки микротитрационных пластин, сорбируют при +37^oC 1-2 часа или при температуре +4^oC в течение ночи, далее ведут поэтапную сорбцию при +37^oC специфических биотинилированных IgG и стрептавидина + биотин-β-галактозидазы, отмывают лунки пластин между этапами от несвязавшихся препаратов (табл. 1). В табл. 1 представлены результаты тестирования антигенной активности органных и культуральных проб вируса двумя методами - предлагаемым иммуноферментным методом (ИФМ) на основе стрептавидин-биотинового комплекса (СБК) и известным "сэндвич"-методом на основе конъюгата Ig G-β-галактозидаза. Из данных табл. 1 видно, что предлагаемый способ в 25-125 раз чувствительнее ранее известного для обнаружения антигена вируса и позволяет обнаруживать 3 lg ЛД 50/мл и 2 lg ТЦД 50/мл вируса.

Оптимальные соотношения количества стрептавидина и биотинилированной -β-галактозидазы подбирают эмпирически (табл. 2). Данные табл. 2 показывают, что минимальные количества стрептавидина и биотинилированной -β-галактозидазы, позволяющие достичь максимальной чувствительности метода при минимальном фоне, равны 2 : 1 или 1 : 1 соответственно.

Реакция по обнаружению антигена заканчивается внесением в лунки пластин хромогенного субстрата 4-метилумбеллиферил-β-Д-галактопиранозида (4-МУГ) и учетом реакции через 30 минут визуально или автоматически.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность метода в 25-500 раз, обнаруживая 3 lg ЛД 50/мл и 2 lg ТЦД 50/мл и может быть промышленно применен.

При конструировании набора нарабатывают следующие диагностические препараты.

Специфический антиген получают на перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС). Сформировавшийся монослой клеток заражают вакцинным штаммом вируса традиционным методом, разведением 10 - 10.

Спустя 48 - 72 часа после заражения, когда цитопатогенный эффект (ц.п.э. ) достигает 80%, вирусную суспензию замораживают (-60^oC). Далее оттаивают и осветляют от обломков клеток, подвергают дифференциальному центрифугированию, 100-кратному концентрированию и инактивации -β-пропиолактоном. Контрольный антиген получают аналогично из интактной культуры клеток ПС.

Специфические IgG выделяют из гипериммунной асцитической жидкости (ИАЖ) мышей.

Гипериммунную ИАЖ получают от взрослых самок беспородных белых мышей после 4-кратных иммунизаций сахарозоацетоновым антигеном и введением на последнем этапе иммунизации внутрибрюшинно клеток Sarcoma TG - 180. ИАЖ отбирают через 7-10 дней. Специфические IgG получают методом аффинной хроматографии на протеин-A-сефарозе Cl-4B.

Конъюгаты специфические Ig G-биотин-β-галактозидаза, стрептавидин входят в состав комплекса.

Специфический Ig G-биотин получают путем конъюгирования специфических иммуноглобулинов (IgG) с биотин-N-гидроксисукцинимид эфиром в соотношении 67 : 1.

Биотин-β-галактозидазу получают конъюгированием фермента -β-галактозидазы (E. coli) активностью ≥ 600 ед/мл в соотношении 8 : 1.

Стрептавидин коммерческий (из Streptomyces avidinii) с биотинсвязывающей активностью 15,7 ед/мг белка.

Биотинилированные конъюгаты получают в течение 4 часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После этого конъюгаты диализуют против 0,1 М фосфатно-буферного раствора pH 7,2, добавляют консервант, стабилизатор.

Наработанные диагностические препараты фасуют в ампулы по 0,5 мл, лиофилизируют.

Предлагаемый набор укомплектован пятью ампулами и может быть промышленно применен в необходимых случаях.

Литература: 1. Arboria M. and Hall W. C. : Diagnosis of a human case of Rift Valley fever by immunoperoxidase demonstration of antigen in fixed lever tissue. Res. Virol., 140, 2, 165 - 168, 1989.

2. Morril G. C., Kuanert F. К., Ksiazek Т. G., Meegan G. and Peters C. G. : RiftValley fever infection of rhesus monkeys : implications for rapid diagnosis of human disease. Res. Virol., 140, 2, 139-146,1989.

Формула изобретения

1. Способ обнаружения вируса лихорадки долины Рифт в биологическом материале, включающий постановку реакции и учет результатов, отличающийся тем, что проводят твердофазный иммуноферментный анализ, в качестве биологического материала используют 10%-ную суспензию исследуемых органов, кровь, культуральные материалы, зараженные вирусом лихорадки долины Рифт, которые сорбируют в лунки микротитрационной пластины, далее в лунки пластины сорбируют специфический Ig G-биотин, а после отмывки сорбируют стрептавидин и биотин-β-галактозидазу, взятые в соотношении 2 : 1 соответственно или 1 : 1.

2. Набор для обнаружения вируса лихорадки долины Рифт в биологическом материале, содержащий антиген и конъюгаты, отличающийся тем, что набор дополнительно содержит стрептавидин, в качестве конъюгатов - специфический Ig G-биотин и биотин-β-галактозидазу, в качестве антигенов - контрольный антиген и специфический антиген к вирусу лихорадки долины Рифт, при этом набор содержит препараты, помещенные в ампулы по 0,5 мл.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2