Аналоги антагонистов lhrh и способы их получения

 

Сущность изобретения: новые антагонисты LHRH формулы [NАc - D2Nal¹ - D_pClphe² - D³pal³ - Ser⁴ - Mop⁵ - D3pal⁶ - Leu⁷ - Ary⁸ - pro⁹ - DАla¹⁰]NH₂ или [NАc - D2Nal¹ - Dphe² - D3pal³ - ser⁴ - Mop⁵ - D3pal³ - Leu⁷ - Arg⁸ - pro⁹ - DАla¹⁰] NH₂ или [Nac - D2Nal¹ - D_pClphe² - D3pal³ - Ser⁴ - Arg⁵ - D3pal⁶ - Leu⁷ - pap⁸ - pro⁹ - DАla¹⁰]NH₂. Новые антагонисты LHRH формулы [NАc - D2Nal¹ - AA² - AA³ - Ser⁴ - AA⁵ - AA⁶ - Leu⁷ - AA⁸ - pro⁹ - DАla¹⁰] NH₂, где DNal : DArAla, где AA² - DArAl, где AA³: DArAla, где или где AA⁵ - Arg, Tyr, или DArAla, где или где -N(R¹R²), R¹ и R² - CH₃, CH₃CH₂, C₃H₇, C₄H₉; AA⁶ - DАrphe, где или где или NR¹R², где R¹ и R² - CH₃, CH₃CH₂, AA⁸ - Arg или DArAla, где или где или NR¹R², где R¹, R² - CH₃, CH₃CH₂, C₃H₇, C₄H₉ как новые пептиды могут быть использованы при лечении заболеваний эндокринной системы, для лечения рака, а также в качестве мужских и женских контрацептивов. Изобретение включает также способ получения антагонистов LHRH , заключающийся в том, что С-концевую N -защищенную аминокислоту присоединяют к бензгидриламиновой смоле, отщепляют защитную группу и продолжают наращивание пептидной цепи в последовательности, соответствующей пептиду формулы IV в условиях твердофазного синтеза, и от полученного пептидилполимера отщепляют пептид. Получают пептиды с ценными свойствами, с активностью по стимуляции выделения гистамина сниженной до такого уровня, чтобы удовлетворять клиническим требованиям. 3 с.п.ф-лы, 6 ил., 4 табл.

Настоящее изобретение относится к новым пептидам и их производным, имеющим точную химическую структуру. Изобретение также адресуется к методам их получения и применения. Гипоталамический гормон, стимулирующий выделение лютеинизирующего гормона (LHRH), действует на переднюю долю гипофиза, стимулируя секрецию лютеинизирующего гормона (LH) и фолликулостимулирующего гормона (FSH). Антагонистический аналог LHRH действует на переднюю долю гипофиза быстро, длительно, может быть безопасно и обратимо использован для контрацепции или селективного подавления секреции гонадотропных гормонов. При таком применении LHRH антагонисты преобладают над агонистами. К настоящему моменту предсказано и синтезировано более двух тысяч аналогов LHRH, среди которых аналог "Nal-Arg", который проявил также сильную активность в отношении стимуляции выделения гистамина (HRA). Он вызывал проходящий отек мордочки и конечностей у крыс при применении в дозах в 50-100 раз превышающих терапевтическую дозу. Результаты клинического испытания продемонстрировали системные воздействия, связанные с гистамином. Другие антагонисты ГСЛГ, содержащие DArg⁶ или DLys⁶, показали сходные побочные действия, их ED₅₀ для HRA были ниже 1 мкг/мл. Настоящее изобретение представляет новые антагонисты, которые обладают очень высокой антиовуляторной активностью (АОА) и очень низкой активностью в отношении стимуляции выделения гистамина HRA и незначительными побочными эффектами. Содержание и примеры этого изобретения включают следующее.

Методология прогноза структуры этого изобретения основана на топологическом сходстве молекулы исходного соединения (NAc - D2Nal', DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰)NH₂ (II) и нейропептида, субстанция P, которая является характерной черной модификации как щелочной, так и липофильной области молекулы исходного соединения для получения новых антагонистов, обладающих как высокой АОА, так и низкой ГСА. Термин модификация здесь означает построение или замену аминокислот на участке Tyr⁵ - DArg⁶ - Arg⁸ в C-конце и ароматических кислот в N-конце (II). Более точно, создание структуры состоит во введении подходящей щелочной группы и замещений на природно несвойственные аминокислоты в положении 2, 3, 5, 6, 8 в (II).

Нижеследующее также входит в методы и примеры этого изобретения.

1. Замещение D₃Pal, которая является ароматической аминокислотой, имеющей подходящую щелочность, вместо DArg⁸ в (II) с получением аналога (III): (NAc-2DNal', DpClPhe², D3Pal³, Ser₄, Tyr₅, D3Pal₆, Ser₇, Arg₈, Pro₉, DAla₁₀)NH₂ 2. Замещение Tyr⁵ на Arg⁵ в (III) для получения (IV): (NAc-D2Nal', DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰)NH₂ 3. Замещение D3Pal³ в (IV) на DPhe³ или его производные DXCH₂Phe, чтобы получить (V): (NAc-D2Nal', DpClPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰)NH₂ или его аналогов (DXCH₂Phe³) 4. Замещения DPhe³ и его производными D3Pal³ в (III), чтобы получить (V'): (NAc-D2Nal', DpClPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰)NH₂ или его аналогов (DXCH₂Phe³) Синтезированы серии новых антагонистов LHRH с формулой (NAc-D2Nal', AA², AA³, Ser⁴, AA⁵, AA⁶. Leu⁷, AA⁸, DAla¹⁰)NH₂, где AA являются природными или неприродными аминокислотами, которые представлены D- или L-ArAla. Более конкретно показано на схеме А в конце текста.

Антагонисты LHRH, полученные при использовании вышеописанного метода, как пептидные лекарственные препараты, могут использоваться при лечении заболеваний репродуктивной эндокринной системы, таких как эндометриоз, преждевременное половое созревание детей, и для лечения рака простаты и рака молочных желез, так же как и в качестве мужских и женских контрацептивов для регулирования рождаемости, или использоваться для диагностики и лечения бесплодия и т. п. Такой пептидный лекарственный препарат может быть приготовлен в виде обычных инъекционных форм, инъецируемых капсул или других лекарственных форм для практического применения.

Дальнейшее описание этого изобретения состоит в следующем.

При естественном пути выделения гистамина в организме очень важную роль играет нейропептидная субстанция II, ее ED₅₀ для HRA равна 5-15 мкМ. Химическая структура SP представляет собой (Arg', Pro², Lys³, Pro⁴, Gln⁵, Gln⁶, Phe⁷, Phe⁸, Gly⁹, Leu¹⁰, Met¹¹)NH₂.

Изучение взаимосвязи между ее структурой и HRA показало, что Arg¹-Pro²-Lys³ на N-конце молекулы SP существенно для ее HRA, так как при удалении этих трех аминокислот из молекулы полностью исчезает ее HRA. Для сравнения, при удалении одной, двух или трех аминокислот на C-конце HRA сохранялась на уровне одной четвертой от HRA первоначальной. Кроме того, удаление Phe⁸ и Phe⁷ снижает HRA на 4% и 0,5% таковой СП. Далее удаление Gln^5,6 не вызывает значительного изменения HRA. Вышеприведенные данные означают, что липофильная область вокруг Phe^7,8 определяет уровень HRA, эта область участвует в связывании молекулы с рецептором тучной клетки.

Как упомянуто ранее, аналоги (D2Nal', DArg⁶)LHRH показали очень высокую HPA, их молекулярное строение имеет топологическое сходство с SP: DArg⁶ - Leu⁷ - Arg⁸ в первом, по-видимому, соответствуют Arg'- Pro² - Lys³ в последнем, оба состоят из пары сильно щелочных аминокислотных остатков, между которыми только один нейтральный аминокислотный остаток, т.е. оба аналога LHPH - 2DNal', DArg и SP содержат два сильно щелочных аминокислотных остатка, которые располагаются один по отношению к другому в позициях 1,3. С другой стороны, разброс остатков ароматических аминокислот в первом, как считают, соответствует области Phe^7,8 в СП, с точки зрения определения величины HRA.

Создание структуры этого изобретения состоит из двух аспектов: один состоит в модификации участка Tyr⁵ - DArg⁶ - Arg⁸ на C-конце, и другим является тонкий подбор ароматических кислот после оптимизации модификации щелочного участка на C-конце. (NAc - D2Nal', DpClPhe², D3Pal³, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰)NH₂ (II) использован как исходное вещество, которое показало AOA 100% при дозе 0,5 мкг в кукурузном масле, 5% при 0,25 мкг.

В первую очередь, DArg⁶ в (II) мог быть замещен слабыми основными или нейтральными ароматическими кислотами, такими как D3Pal, D6Qal тетрагидротриптофан, метилтриптофан. (NAc - D2Nal', DpClPhe², D3Pal^3,6, DAla¹⁰)LHRH (III) было получено когда D3Arg⁶ в (II) был замещен на D3Pal⁶. (III) показал AOA 100% при дозе 3 мкг, 83% при 1 мкг (в кукурузном масле), и его ED₅₀ по HRA была равна 9,8 мкг/мл, что значительно лучше, чем у аналога "Nal-Arg", что ED₅₀ по HRA была меньше, чем 1 мкг/мл. По-видимому, для того чтобы получить высокую AOA, щелочность всей молекулы должна быть равной или близкой таковой пары аргинина. Поскольку позиция 5, как и позиция 6, не участвует в связывании с рецептором, в положение 5 может быть помещен широкий круг аминокислот, включая аргинин. Были созданы серии новых аналогов. Например, при замещении Tyr⁵ на Arg⁵ в (III) получены (NAc - DNal', DpClPhe², D3Pal^3,6, Arg⁵, DAla¹⁰)LHRH (IV). Оба (IV) и (II) содержали два аргининовых остатка, но расстояние между двумя аргининами в (IV), где их геометрическое взаиморасположение стало 1,4, т. е. между этими двумя аргининами были две другие аминокислоты, было больше, чем в (II). Поэтому, вероятно, HRA будет снижена и, с другой стороны, из-за наличия двух аргининов AOA не должна быть ниже, чем у (II). Результаты биологического исследования (IV) показали, что ED₅₀ по HRA была равна 3,5 мкг/мл, тогда как AOA составила 60% при 0,12 мкг (кукурузное масло), 85% при 0,25 мкг, 100% при 0,5 мкг. Это было первым случаем для антагонистов LHRH, когда достигнутая ED₅₀ для AOA была равна или менее 0,125 мкг.

Поэтому дальнейшее создание структуры базировалось на структуре (IV).

В молекуле (IV) присутствуют четыре остатка со щелочными ионами, D3Pal^3,6 и Arg^5,8, тогда как (II) содержит только три щелочных остатка. Поэтому приемлемо заменить один D3Pal нейтральной аминокислотой; с другой стороны, (IV) проявил очень высокую гидрофильность, и снижение гидрофильности замещением DPal в (IV) на гидрофобную аминокислоту, вероятно, будет благоприятным для задержки лекарства в организме и увеличения продолжительности эффекта. Затем были созданы новые серии аналогов путем замещения вместо D_BPal³. (V) проявил 100% AOA при дозе 1 мкг (в физиологическом растворе), равную активности исходного вещества (IV), тогда как HRA снижена наполовину: ED₅₀ по HRA была 7,4 мкг/мл.

Дополнительное замещение DClPhe² на DPhe снизило липофильность этого участка молекулы и снизило HRA.

Arg⁵ - D3Pal⁶ - Leu⁷ - Arg⁸ на C-конце (IV), по-видимому, играют главную роль в пусковом механизме секреции гистамина. D3Pal соединяет в одной молекуле свойства ароматического строения, щелочность и гидрофильность, он также стереоприемлем в антагонистах LHRH для связывания с рецептором. Таким образом, создание новых серий неприродных аминокислот, используя подобные свойства, как (V) D3Pal, может привести к получению лучших антагонистов, чем (IV) или (V).

Модификация природных липофильных ароматических аминокислот, например фенилаланина, например, по методу, описанному ниже в разделе Синтез неприродных аминокислот, приводит к созданию серий новых аминокислот, которые соединяют свойства ароматических соединений, гидрофильность и щелочные свойства в одной молекуле и могут выражаться формулой -R₁R₂NCH₂C₆H₄CH₂ CH(NH)CO₂H (VI), где R₁ и R₂ могут быть одинаковыми или разными, могут быть представлены цепью или циклом, могут также содержать гетероатом. При изменении R₁ и R₂ могут быть получены серии аминокислот, которые постоянно системно измененные щелочность, гидрофильность и стереостроение. Введение этих аминокислот в положения 5, 6, 8 соединения (IV) позволило получить три серии новых антагонистов LHRH. Результаты биологического исследования показали, что каждая серия дала по крайней мере один новый антагонист, проявляющий 100% AOA при дозе 1 мкг, подобно (IV), в то же время была значительно снижена. Примером был (VII): (NAc - D2Nal', DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰)NH₂, который проявил 100% AOA при 1 мкг, ED₅₀ при ГСА 14,7 мг/мл, явно лучше, чем у (V). При замещении Arg⁸ в (IV) на (VI) степень снижения HRA положительно коррелирует с длиной P в (VI), так что ED₅₀ по HRA могла бы быть выше 200 мкг/мл, такие соединения могут легко растворяться в водном растворе и, как ожидается, будут использоваться в клинике без осложнений со стороны лекарственных форм. Результаты показали, что Arg⁸ или Lys⁸ не существенны для антагонистов LHRH с высокой активностью. Соответствующий щелочной центр в положении 8 может обеспечить высокую AOA, между тем, активность по индуцированию выработки гистамина тучными клетками заметно снижалась, когда встраивалась группа с основными свойствами, упомянутая выше, создающая значительное стереопрепятствие.

Это изобретение, объединяя модификации как на конце N, так и на конце C, приводит к созданию лучших антагонистов LHRH.

Процесс синтеза иллюстрируется следующим.

1. Синтез новых неприродных аминокислот Свыше 60 серий и несерийных D- или L-аминокислот созданы и синтезированы четырьмя путями синтезами, представленными на схеме ниже (см. схемы Б в конце текста). Строение этих неприродных аминокислот показано в виде основных структурных формул, перечисленных в той же схеме. Некоторые их этих аминокислот обладают щелочностью, гидрофильностью и ароматическими свойствами соответственно, тогда как другие сочетают их все в одной молекуле.

2. Синтез пептида
Синтез начинается с C-конца пептида на бензгидриламин-гидрохлоридной смоле (BHA-смоле) с использованием твердофазного пептидного синтеза, предложенного Меррифилд. Это трехфазный процесс, включающий прикрепление, взаимодействие и отщепление. Дихлорметан (DCM) является основным растворителем, используемым для отмывания перед каждой следующей стадией реакции, в то же время спирт изопропанол (IPA) и N, N-диметилформамид (DMF) также использовались, где необходимо. Реакция связывания осуществляется при катализе избытком дициклогексилкарбодиимида (DCC) при добавлении достаточного количества 1-гидроксибензотриазола (HOBT). Степень реакции связывания определялась по нингидриновому методу Кейзеса. Вторая реакция связывания должна проводиться, если она дает положительный результат в пробе Кейзеса. Пептидная цепь отщеплялась от смолы с использованием безводного фтористого водорода (HF) в присутствии анизола после завершения всех реакций, требующих связывания со смолой, в это же время удаляются все временные защищающие группы. После отмывания этилацетатом или эфиром сырые продукты LHRH-антагонистов получают путем экстракции водным раствором уксусной кислоты с последующей лиофилизацией. Выход свыше 50%.

3. Очистка пептида
(1) Пептид очищают с помощью гельпроникающей хроматографии или распределительной хроматографии на двуокиси кремния в колонке высокой 60 - 100 см при контроле с помощью УФ/ТСХ. Очистку LHRH-антагонистов проводили однократно и продукт получали после лиофилизации основных фракций. Выход составляет 50 - 90% и чистота может быть свыше 90%.

(2) Пептид затем очищали на аппарате для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Уотерса, используя колонку с обращением фазы C18 (7,8 x 300 мм) (m Bondapak 84176). Выход на этой стадии составляет 20 - 50%, при этом чистота не менее 99%.

4. Анализ чистоты пептида
(1) Анализ TCX
Он проводится на пластиковой пластинке, покрытой силикагелем 60F254, длиной 5 - 10 см. Во всех случаях выявлялось одиночное пятно при работе с пятью разными системами растворителей.

(2) Анализ ВЭЖХ
Во всех случаях обнаружен единичный пик при элюировании двумя видами систем растворителей, соответственно, при использовании аппарата Уотерса для ВЭЖХ с аналитической колонкой ( m Bondapak 27324) при УФ-детекции ( λ = 210). Величина образца составляла 10 - 200 мкг.

5. Аминокислотный анализ пептида
В соответствии с методом PICO-TAG, разработанным фирмой Уотерс, 50 мкг образца, который был высушен под вакуумом в течение 2 часов, точно отвешивают на чашечных весах с разрешением 10^-5 г. После растворения в воде 10 мкг образца добавляют в реакционную пробирку, в которую, согласно руководству, добавлена соляная кислота 1:1 (содержащая 1% фенола). Реакция продолжается 20 - 24 ч при 105^oC. Реакция продолжается 22 - 24 ч при 105^oC в герметически закрытом контейнере, который наполнен азотом и откачен под вакуумом, чтобы удалить кислород из реакционной пробирки. Изотиоцианат фенола добавляется, чтобы получить аминогруппы после выпаривания избыточных количеств соляной кислоты. Затем он анализировался с помощью жидкостного хроматографа, снабженного аминокислотной аналитической колонкой PICO-TAG с УФ-детектором ( λ = 254 нм). Содержание каждой аминокислоты и относительное молярное соотношение рассчитывали, чтобы выявить аминокислотный состав образца, основываясь на сравнении составной части каждой аминокислоты с таковой H-стандартного образца Уотерса. Классический метод с ионообменным нингидриновым производным (IEN) был также использован как контрольный, который дал те же самые результаты. Но, чтобы получить удовлетворительные результаты, для этого метода необходимо в десять раз больше образца.

6. Оценка биологической активности
Использован метод антиовуляции крыс Корбина. В этом эксперименте использованы здоровые взрослые самки крыс SD (вес 200 - 500 г). Всех животных содержали при 22 - 24^oC и при режиме 14 ч/10 ч (свет/темнота). Они получали стандартное питание и воду по потребности. В этом эксперименте могли быть использованы крысы, у которых выявлено по крайней мере два последовательных четырехдневных цикла течки при исследовании вагинальных мазков. Крысам вводили пептиды (антагонисты LHRH) в разных дозах в физрастворе в середине стадии протечки.

Крыс забивали на следующий день, их яйцеводы с двух сторон исследовали под препаровальной лупой, чтобы определить число созревших яйцеклеток. Крысы были разделены на несколько групп по получаемым дозам, каждая группа состояла из около 10 животных, и контрольная группа, животным которой вводили равное количество физраствора, состояла из 9 - 10 крыс. Антиовуляторная активность (AOA) показана в следующем равенстве:

7. Оценка активности по стимуляции выделения гистамина
(1) Определение секреции гистамина (HRT)
В этом эксперименте использовали здоровых взрослых самцов крыс SD (вес 200 - 500 г), содержавшихся в вышеназванных условиях. После анестезии CO₂ перитонеальную полость промывали 50 мл среды PIPAS AC, содержащей 20 единиц гепарина. После последующего центрифугирования при 200хg в течение 8 мин при 4^oC клетки снова отмывали и окончательно ресуспендировали до концентрации от 8 до 24·10⁵ общего числа лейкоцитов/мл PIPAS AC. Эта суспензия содержит примерно 5 - 10% тучных клеток. Отмытые клетки использовались сразу же после отбора и предварительно нагревались в течение 5 мин при 37^oC, перед тем как 0,3 мл пробы пипеткой помещались в полистироловые пробирки, содержащие 0,3 мл разведенного пептида. Смеси инкубировали в течение 15 мин при 37^oC и реакцию останавливали центрифугированием при 400хg в течение 15 мин при 4^oC. Супернатанты исследовали на содержание гистамина с помощью метода флюорометрического определения, проводимого вручную, после последовательной экстракции н-бутанолом и н-гептаном. Содержание гистамина может быть установлено по стандартной гистаминовой кривой (см. ниже). Процесс секреции гистамина может быть рассчитан по следующему равенству
,
где
E является показанием флуорометрии для экспериментального образца; B - показание флуорометрии для образцов, содержащих только клетки и буфер; и C - показание флуорометрии "полного содержания" (клетки, обработанные HClO₄).

Стандартная кривая может быть получена путем нанесения на график значений оптической плотности по показаниям флюориметра при 350 нм/450 нм (активация/флюоресценция) для концентрацией серий разведений раствора точно взвешенного количества гидрохлорида гистамина. Относительный параметр p стандартной гистаминовой кривой может быть 0,9998 и самая низкая определяемая концентрация гистамина равна 0,5 нг/мл.

Значение ED₅₀ для пептида может быть получено из кривых зависимости ответной реакции от дозы путем нанесения на график уровня секреции гистамина в сравнении с концентрацией пептида в полулогарифмическом масштабе.

Все образцы пептидов должны быть испытаны с тучными клетками как минимум от 3 разных крыс.

(2) Кожная проба на анафилактоидную активность (CAT)
В этом эксперименте использованы здоровые взрослые крысы-самки (вес 250 г). Крысам вводили внутривенно раствор синего Еванса (1 мл 0,05%). Сразу же после этого внутрикожно вводили раствор пептида (5, 0,5 и 0,05 мг/мл соответственно) или физраствор (контроль) в обритый сектор на спине животных. Через 30 мин после инъекции крыс забивали и кожу спины отгибали. Диаметр поражений измеряли в миллиметрах в двух перпендикулярных направлениях с помощью циркуля с нониусом. Диаметр в контроле обычно меньше 5,5 мм.

Количество синего Еванса, проникающего в кожу из кровеносных сосудов, может быть тоже определено спектрофотометрически. Кожа, соответствующая области поражения, вырезалась и погружалась в смесь ацетона/физраствора (7:3, об/об) на ночь. После центрифугирования на следующий день содержание синего Еванса в супернатанте определялось на спектрофотометре (УФ-260) при 610 нм с раствором сравнения ацетон/физраствор (7:3). Каждый пептид испытывался как минимум на 3 разных крысах.

С помощью метода, описанного выше, создано и синтезировано множество новых антагонистов LRRH. Кратко, антагонисты с новой структурой были получены путем одиночных или множественных замещений разными природными и неприродными аминокислотами, перечисленными в предыдущих разделах.

Некоторые примеры новых антагонистов LHRH, полученных таким путем, показаны в таблице 1.

Применение этого изобретения
1. После завершения доклинических фармакологического и токсикологического изучения мы сможем применить эти новые антагонисты, которые обладают высокой терапевтической эффективностью и слабым побочным действием, в клинике так, чтобы разработать новое лекарство для лечения эндометриоза и других нарушений в репродуктивной эндокринной системе, включая преждевременное половое созревание у детей, рак простаты и рак молочных желез. Так как они подавляют секрецию гонадотропина путем конкурентного с эндогенным LHRH связывания с рецептором и действуют быстро, обратимо и безопасно, они могут, кроме того, разрабатываться как новый тип контрацептивов для мужчин и женщин. Сверх того, они могут быть также использованы при лечении бесплодия и для селективного и обратимого устранения функции гипофиза по секреции гонадотропина.

Являясь разновидностью лекарств пептидной природы, маловероятно, что антагонисты LHRH будут применяться перорально. Но они могут быть легко получены в виде лиофилизированного порошка, легко растворимого в физрастворе для инъекций внутривенно, подкожно или внутримышечно.

Кроме того, изучаются длительно действующие системы подачи лекарственного вещества, такие как биодеградируемые, инъецируемые капсулы. Капсулы могут имплантироваться подкожно с помощью специального шприца и должны абсорбироваться тканью после выделения всего количества пептида и не требуют хирургического удаления. Длительно действующие системы доставки особенно полезны для долговременного применения аналогов LHRH в клинике.

Следующее представляет собой анализы результатов из примеров (используя три аналога IV, V, VII как типичные примеры).

(1) Чистота
Тонкослойная хроматография (TCX)
На каждой из хроматограмм, полученных с пятью разными системами растворителей, присутствовало только одно пятно.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ):
На каждой из хроматограмм при элюировании двумя разными системами растворителей присутствует только один пик.

Значения Rf и времени удерживания (TP) представлены в таблице 2, хроматограммы проиллюстрированы фиг. 1 - 4.

Раствор A + 80% ацетонитрила
Система растворителей 2
Раствор A - 0,01 M KH₂PO₄ водный раствор (pH 3)
Раствор B - 20% раствор A + 80% ацетонитрила
Системы растворов для TCX
1. n BuOH/EtOAс/HOAс/H₂ (5:5:1:1)
2. n BuOH/n BuOH/HOAс/H₂O (2:8:2:3)
3. n BuOH/HOAc/H₂O (4:1:5), восходящая фаза
4. n BuOH/HOAc/H₂O (4:1:2)
5. n BuOH/EtOH/HOAc/H₂O (1:1:1:1)
(2) Аминокислотный анализ
Анализ проводился по методу классической IEN и новой PICO-TAG, результаты представлены в таблице 3 и на фиг. 5, 6.

(3) Результаты биологических исследований
Результаты биологических исследований, включая антиовуляторную активность при разных дозах и ED₅₀ по активности стимуляции выделения гистамина in vitro, показаны в таблице 4, в которой перечислены 26 антагонистов в качестве примеров.

Как показано и описано выше, антагонисты ГСЛГ, созданные и синтезированные в соответствии с этим изобретением, обнаруживают очень хорошие свойства. Они чисты по результатам анализа ТСХ или ВЭЖХ. Их структура правильна, т.е. она такая же, как запланирована. Их противозачаточная активность высока: они могут подавлять овуляцию у крыс при подкожной инъекции в позе от 0,1 до 2,0 мкг в середине стадии предтечки. Их побочное действие, связанное с гистамином низко: ED₅₀ этих препаратов по активности стимуляции выделения гистамина in vitro (эффективная доза для тучных клеток крыс, стимулирующая выделение 50% гистамина) находится в пределах 5 - 300 мкг/мл; поражение, вызываемое ими при кожной анафилактоидной пробе у крыс мало настолько, что удовлетворяет клиническим требованиям. Они очень хорошо растворяются в воде, все биоисследования проводились нами с растворами препаратов в физрастворе, так что их легко получить в виде инъекционных лекарственных форм для клинического применения. Их также легко приготовить в виде длительно действующих систем доставки, среди которых инъецируемые микрокапсулы наиболее удобны для длительного подавления гонадотропина и половых гормонов. Поэтому они могут быть использованы как эффективные, с обратным действием и безопасные контрацептивы как для мужчин, так и для женщин. Они могут быть также использованы для лечения различных заболеваний, связанных с расстройствами репродуктивной эндокринной сферы, таких как гормонозависимый рак простаты, рак грудных желез, эндометриоз, преждевременное половое созревание у детей. Они также полезны при лечении бесплодия. Новые антагонисты LHRH могут также использоваться при основополагающих физиологических и фармакологических исследованиях репродуктивной сферы, таких как при изучении функции гипофиза, по действию половых гормонов или гонадотропинов или LHRH на сексуальное поведение и т.д.

Аббревиатуры
В тексте этого патентного заявочного документа были использованы следующие аббревиатуры
Ala аланин
AOA антиовуляторная активность
Arg аргинин
Bap дибутиламинометилфенилаланин
BOC т-бутилоксикарбонил
BuOAc бутилацетат
CAT кожная анафилактоидная проба
DCl дициклогексилкарбодиимид
DCM дихлорметан
D2Nal D -β- (2-нафтил)аланин
D3Pal D -β- (3-пиридил)аланин
DpClPhe p-хлор-D-фенилаланин
DpFPhe p-фтор-D-фенилаланин
D6Qal D -β- (6-хинолил)аланин
DMF N,N-диметилформамид
EAP диэтиламинометилфенилаланин
ED₅₀ эффективная доза для 50% ответа
EtoAc этилацетат
FSH фолликулостимулирующий гормон
Glu глютаминовая кислота
Gly глицин
His гистидин
HOBT L-гидроксибензолтриазол
ВЭЖТ высокоразрешающая жидкостная хроматография нингидриновое производное
HRA активность по стимуляции выделения гистамина
HRT определение выделения гистамина
ISN ионообменная хроматография c
IPA изопропиловый спирт
LH лютеинизирующий гормон
LHRH гормон, стимулирующий выделение лютеинизирующего гормона
Leu лейцин
Lys лизин
Map диметиламинометилаланин
Met метионин
Mop морфолинометилфенилаланин
nBuOH н-бутиловый спирт
NS нормальный физиологический раствор
Pep дипропиламинометилфенилаланин
Phe фенилаланин
Pip пиперидинометилфенилаланин
Pipes пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновая кислота)
Pro пролин
Rf степень смещения
SE стандартная ошибка
Ser серин
TFA трифторуксусная кислота
ТСХ тонкослойная хроматография
TR время удержания
Trp триптофан
Tyr тирозин
Tep тетрагидроперролилметилфенилаланинH

Формула изобретения

1. Аналоги антагонистов LHRH формулы
[NAc-D2Nal¹-DpClPhe²-D3Pal³-Ser⁴-Mop⁵-D3Pal⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-DAla¹⁰] -NH₂, I
или
[NAc-D2Nal¹-Dphe²-D3Pal³-Ser⁴-Mop⁵-D3Pal³-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-DAla¹⁰] NH₂, II,
или
[NAc-D2Nal¹-DpClphe²-D3Pal³-Ser⁴-Arg⁵-D3Pal⁶-Leu⁷-Pap⁸-Pro⁹-DAla¹⁰] NH₂, III
2. Аналоги антагонистов LHRH формулы IV
[NAc-D2Nal¹-AA²-AA³-Ser⁴-AA⁵-AA⁶-Leu⁷-AA⁸-Pro⁹-DAla¹⁰]NH₂, DNal группа формулы
DArAla,

AA² группа формулы
DArAla,
в которой Ar - группа
AA³ - группа формулы
DArAla,
где Ar -
или группа формулы


AA⁵ - Arg, Tyr, группа формулы
DArAla,

или группа формулы

--NR¹R²,
где R¹, R² - одинаковы и означают CH₃, CH₃CH₂, C₃H₇, C₄H₉;
AA⁶ - группа формулы
DArPhe,
где Ar-
или группа формулы

где X-
или группа
-NR¹R²,
где R¹, R² - одинаковы и означают CH₃, CH₃CH₂;
AA⁸ - Arg или группа формулы
DArAla,
где Ar-
или группа формулы

где X-
или группа формулы
-NR¹R²,
где R¹, R² - одинаковы и означают CH₃, CH₃CH₂, C₃H₇, C₄H₉.

3. Способ получения аналогов антагонистов LHRH общей формулы IV по п.2, отличающийся тем, что C-концевую N-защищенную аминокислоту присоединяют к бензгидриламиновой смоле, отщепляют защитную группу и продолжают наращивание пептидной цепи в последовательности, соответствующей пептиду формулы IV в условиях твердофазного синтеза, и от полученного пептидилполимера отщепляют пептид.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 09.11.2004

Извещение опубликовано: 20.09.2007        БИ: 26/2007

---