Вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза (орнитоза) птиц

 

Изобретение касается специфической профилактики и терапии хламидиоза (орнитоза) птиц. Вакцина содержит в качестве антигена штамм Chlamydia psittaci var. avis "ДЖ-87" ВГНКИ 23-ДЕП, выращенный на монослое первичной культуры кле-ток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с титром не ниже 10^-7,0 ТЦД_50/мл.. Вакцина также содержит инактиватор-фенол и адъювант - поливинилпирролидон. Вакцина специфична, высокоиммуногенна и имеет низкую реактивность. 6 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, в частности к производству вакцин, применяемых для специфической профилактики и терапии сельскохозяйственных животных, например птиц от заболевания хламидиозом.

Известна вакцина против энзоотического аборта овец инактивированная изготовленная из зараженных хламидиями куриных эмбрионов (Franc et al. Am. J. Vet. Pec. , Vol. 29, p. 1441, 1968). Недостатком данной вакцины являются ее высокая стоимость, ее изготовление требует больших затрат времени, высокое содержание баластных белков, снижающее ее иммуногенность и повышающее реактогенность. Эта вакцина не содержит специфического антигена и поэтому неиммуногенна для птиц. Данная вакцина выбрана нами в качестве прототипа.

Наиболее близким по технической сущности является патент США N 4386065 A 61 K 39/118, 1983. "Вакцина против энзоотического аборта овец", которая включает в себя смеси водной суспензии, инактивированных формалином хламидийных элементарных телец, полученных из организмов chlamydia SP в пределах от 2 · 10⁶ до 10⁹ ELD _50/мл, размноженных в клеточной культуре и равного количества масляного адъюванта представляющего собой смесь светлого минерального масла и ланолина.

Недостатком этой вакцины является то, что штамм хламидий, как продуцент, не обладает цитопатическим действием. Вследствие этого для контроля накопления хламидий необходимо ежедневно готовить мазки, производить их окраску и подсчет зараженных клеток, а при сборе сырья требуется инфицированный монослой отделить от ростовой поверхности с помощью трипсина с верстном. Для создания нужной концентрации хламидий в вакцине культуральную суспензию подвергают центрифугированию. К тому же один стационарный монослой используется как посевной материал только для пяти чистых монослоев или их эквивалентов. Все эти операции усложняют технологический процесс производства и снижают производительность при изготовлении вакцины, что делает ее дороже. К тому же вакцина профилактирует только энзоотические аборты хламидиозной природы у овец и не профилактирует хламидиоз птиц.

Сущность изобретения Задачей данного изобретения является создание специфичной, высокоиммуногенной вакцины для профилактики хламидиоза (орнитоза) птиц, имеющей низкую реактогенность и получаемой более простым (в сравнении с прототипом) технологическим способом.

Поставленная задача достигнута благодаря тому, что вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза (орнитоза) птиц в качестве антигена, содержит штамм CHLAMYDIA PSITTACI (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл,в качестве адъюванта - поливинилпирролидон, а также фенол при следующих процентных соотношениях: 1. Суспензия клеток ФЭК (фибробластов эмбрионов кур), инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП с титром не ниже 10^-7,0 ТЦД_50/мл - 99-99,5.

2. Фенол - 0,3-0,5.

3. Полифинилпирролидон - 0,4-0,6.

Существенным отличием данной вакцины от ее прототипа является то, что в качестве антигена берут штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87", депонированный в коллекцию ВГНКИ ветпрепаратов, N 23 ДЭП. Выращивание его ведется на монослое первичной культуры ФЭК.

Штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23 - ДЭП выделен в 1987 году из печени и селезенки больного орнитозом индюшонка птицефабрики "Мрзытайская" Джамбулской области. Выделение производилось на развивающихся 6-7-дневных куриных эмбрионах путем их заражения в полость желточного мешка. Затем штамм был адаптирован к первичной культуре клеток ФЭК. Штамм прошел 52 пассажа в культуре клеток ФЭК в условиях роллера и в результате приобрел способность оказывать высокое цитопатогенное действие на монослой культуры клеток ФЭК. Наряду с этим устойчиво повысилась его иммуногенная активность и снизилась реактогенность.

Штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП входит в коллекцию ВГНКИ ветпрепаратов и хранится в музее живых культур СКЗНИВИ.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Элементарные (зрелые) тельца хламидий округлой формы, диаметром 180 - 200 нм, (инициальные-промежуточные формы - до 500 - 600 нм) окрашиваются по методу Романовского-Гимза в темно-синий цвет. При окраске акредином оранжевым хламидии приобретают оранжевый и желто-зеленый цвет. Расположены хламидии в цитоплазме клеток и в межклеточном пространстве в виде одиночных форм или скоплений.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА. Хламидии культивируются в желточных оболочках 6-7 дневных куриных эмбрионов. Штамм "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП адаптирован к культуре клеток ФЭК, вызывает образование цитоплазматических включений через 48 часов культивирования, проявляет цитопатическое действие.

ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм патогенен для индюшат, морских свинок и белых мышей - вызывает у них заболевание и гибель. В мазках-отпечатках из органов (печень, селезенка, мозг) павших и больных животных обнаружены цитоплазматические включения и элементарные частицы хламидий при парентеральном (для птиц), интраназальном, внутрибрюшинном, внутримозговом (для мышей) и внутрибрюшинном (для морских свинок) заражении.

АДАПТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП - возбудитель хламидиоза (орнитоза) птиц адаптирован к 6-7 дневным куриным эмбрионам и культуре клеток ФЭК, при этом сохраняет патогенность и иммуногенность. Титр хламидий выращенных на куриных эмбрионах составляет 10^-6 - 10^-7 ЭЛД_{50/0,3 мл} на культуре клеток ФЭК - 10^-7 - 10^-8 ТЦД_50/мл.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА. В постановке перекрестной реакции связывания комплемента (РСК) с гомологичным антигенами установлено высокое антигенное родство к гомологичному антигену в титре 1:80 - 1:160. Антигенное родство к другим антигенам хламидий стоит на четыре разведения дальше.

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. Согласно решению Юридической комиссии Международной Ассоциации Микробиологических обществ (МАМО), с 1 января 1980 года определение рассматриваемых микроорганизмов, как Chlamydia, стало обязательным. В соответствии с "The Shorter Bergey's manual of determinative" (1980), хламидии отнесены к царств Procaryotae, отделу 2 прокариотов, индифферентных к свету, т.е. "скотобактериям", классу 2 Rickettsia. В класс Rickettsia включены порядки 1 Rickettsiales и 2 Chlamydiales. Семейство Chlamydia, род Chlamydia, в который включает четыре вида: Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia pecorum. Все виды хламидий гетерогенны.

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. В опыт было взято 48 индюшат 3-недельного возраста весом 250-300 граммов. 24 индюшонка было завакцинировано культуральной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подкожно в дозе 0,5 мл. Остальные 24 индюшонка составило контрольную (не вакцинированную группу.

Через 14 дней после введения вакцины приготовленной из подтитрованного контрольного штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП с титром 10^-7,0 ТЦД_50/мл заразили 12 опытных и 12 контрольных индюшат подкожно в дозе 1 мл. Затем, через 20 дней после введения вакцины, также заразили 12 вакцинированных и 12 не вакцинированных индюшат. Результаты представлены в табл. 1.

Примечание в графах 4,5 числитель обозначает число павших индюшат, знаменатель - число выживших.

Таким образом, как видно из описания и таблицы, штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП специфичен по отношению к птицам и обладает высокими иммуногенными свойствами, что позволяет осуществить поставленную задачу.

Вторым существенным отличием является то, что в качестве адъюванта в вакцину вводят поливинилпирролидон (ПВП). Поливинилпиролидон-белый порошок, хорошо растворимый в воде, применяется как пролонгатор лекарственных средств. Ему присуще дезинтоксическое и противовоспалительное действие. В нашем препарате ПВП существенно повышает иммуногенность вакцины за счет того, что связывает (адсорбирует) антипенные белки.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав вакцины отличается от известного введением новых компонентов, а именно нового штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП с титром не менее 10^-7,0 ТЦД_50/мл и поливинилпирролидона в качестве адъюванта, а также соотношением компонентов.

Таким образом, заявляемое технологическое решение является новым. Введение в качестве адъюванта поливинилпирролидона существенно повышает иммуногенноть вакцины. По сравнению с вакциной, содержащей в качестве адъюванта вазелиновое масло. Для доказательства был проведен следующий опыт восьми голубят вводилась культуральная инактивированная вакцина, изготовленная из штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, содержащая в качестве адъюванта вазелиновое масло, и восьми - вакцина, содержащая в качестве адъюванта поливинилпирролидон. Вакцина вводилась подкожно, трехкратно с интервалом 7 дней в дозе 0,2 мл. Иммуногенность вакцины оценивалась по результатам РСК (с сывороткой крови опытных голубей, взятой через 20 дней после последнего введения вакцины). Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы следует, что иммуногенность вакцины с поливинилпирролидоном, используемым в качестве адъюванта, значительно выше, чем вакцины с вазелиновым маслом использованным в качестве адъюванта.

Таким образом, данный состав компонентов придает вакцине новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технологического решения критерию "изобретательский уровень".

Пример 1. (Оптимальный вариант).

Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями производили по общепринятой методике (Л.П.Дьяконов и др. Культивирование клеток и тканей животных. Часть 1, Ставрополь, 1986). Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подвергали контрольным высевам на бактериальную и грибковую контаминацию. После этого чистую, не контаминированную, суспензию брали для определения титра ТЦД_50/мл. Титр определяли по общепринятой методике и подсчитывали по методу Рида и Менча. В данном примере он равен 10^-7,0 ТЦД_50/мл.

Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями - 99,1%, фенол - 0,35 мас.%, поливинилпирролидона - 0,55 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 96 часов при температуре +10^oC.

Далее проводили выборочный контроль на иммуногенность. Для этого брали восемь голубей и вводили им вакцину по следующей схеме: 1-е введение - подкожно 0,2 мл; 2-е введение - подкожно через 7 суток 0,2 мл; 3-е введение - подкожно через 14 суток 0,2 мл.

Контролем служили четыре голубя, которым вакцина не вводилась. Через три недели после последнего введения вакцины определяли уровень накопления антител в сыворотке крови голубей в реакции связывания комплемента (РСК). Результат: четыре креста в разведении 1:5, четыре - в разведении 1:10, два - в разведении 1:20.

Аналогично делали для титра 7,5; 7,75; 6,5; 6,0; 5,5 ТЦД_50/мл. Сведения приведены в табл. 3.

Таким образом, титр хламидийного штамма от 7,0 и ниже обеспечивает высокое накопление антител в сыворотке крови голубей. Вакцина с качествами, приведенными в примерах 1, 4, 5, считается пригодной для применения на птице. В целях экономии штаммного материала при получении титра выше 7,8 ТЦД_50/мл суспензия разводится питательной средой ГЛА до титра, приведенного в примерах 1, 4, 5. Титр штамма ниже 6,5 ТЦД_50/мл (пр.6) не обеспечивает нужного накопления хламидий ниже применяется для иммунизации птиц.

В данном опыте отчетливо видна зависимость титра антител в сыворотке крови голубей от титра штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП. Этот тест взят нами в качестве контроля иммуногенности вакцины при ее изготовлении.

Пример N 7. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями, выращивание и накопление их производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию и одновременно определяли усредненный титр ТЦД_50/мл, который в данном примере равен 10^-7,2 ТЦД_50/мл. Чистую, неконтаминированную бактериальной и грибковой флорой клеточную хламидийную суспензию, объединяли в общую стерильную емкость и проводили инактивацию хламидий фенолом. Для этого в емкости смешивали компоненты в следующем соотношении: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,2 мас. %, а инактиватор (фенола) добавляли 0,4 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 98 часов при температуре +10^oC. Затем добавляли 0,4 мас. % адъюванта (поливинилпирролидона). Затем проводили выборочный контроль на полноту инактивации. Для этого 10 развивающимся куриным эмбрионам 7-суточной инкубации стерильно вводили в полость желточного мешка 0,3 мл вакцины и инкубировали их при 37,0-37,5^o в течение 12 суток. В качестве контроля использовали 10 эмбрионов, которым вводили не инактивированную клеточную взвесь, содержащую хламидий штамма "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП. Условия инкубации такие же. Опытные эмбрионы оставались живыми в течение 12 суток. В мазках-отпечатках, изготовленных из оболочек желточного мешка, окрашенных по методу Романовского-Гимза, хламидии не обнаруживались. Контрольные эмбрионы пали на 5-7 сутки. Этот результат соответствует установленному контролю вакцины на полноту инактивации.

Аналогично делали для следующих количеств фенола: 0,3 мас.%; 0,2 мас.%; 0,5 мас.%; 0,6 мас.%. Результаты приведены в таблице 4.

Исходя из данных приведенных в таблице, видно, что количество инактиватора в интервале от 0,3 мас.% до 0,5 мас.% обеспечивает полноту инактивации хламидий в суспензии. Свыше 0,5 мас.% фенол не добавляют с целью его экономии, т.к. качества вакцины этого не улучшает. Концентрацию инактиватора ниже 0,3 мас. % не допускают, т.к. это не обеспечивает полной инактивации хламидий.

Пример N 12. Приготовление культуры ФЭК, заражение ее хламидиями, их выращивание и накопление производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittasi (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. Если тест оказывался отрицательным, то выборочно определяли титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,3 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензия клеток, инфицированных хламидиями, брали 99,3 мас.%, фенола-0,3 мас.% (смесь выдерживали 10 часов при -6^oC). Поливинилпирролидона вводили 0,4 мас.%. Процесс вели следующим образом: навеску адъюванта и инактивированную суспензию клеток содержащую антиген штамм хламидий "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП и составляли при комнатной температуре до его полного растворения - 24 часа. Затем проводили контроль на иммуногенность, так же как в примере N1. Результат следующий: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1:10 - ++++; в разведении 1: 20 - ++. Аналогично делали для 0,3 мас.%. Результаты приведены в таблице 5.

Как указано в таблице содержание адъюванта в интервале значений от 0,4 мас. % до 0,6 мас. % обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии с установленным контролем. Количество адъюванта, превышающее 0,6 мас.%, не применяется с целью его экономии. Существенного улучшения качества вакцины при увеличении содержания в ней адъюванта свыше 0,6 мас.% не происходит.

Содержание адъюванта ниже 0,4 мас.% не допускается, т.к. иммуногенность такой вакцины ниже установленного контроля вакцины и она не вызывает надежного иммунного ответа у птицы.

Пример 17. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями их выращивание и накопление производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittasi (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. При отрицательном результате теста определяли средней титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,4 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,25 мас.%; фенола - 0,35 мас.%, поливинилпирролидона - 0,4 мас.%. Затем проводили контроль на иммуногенность как в примере 1. Результаты РСК следующие: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1: 10 - ++++; в разведении 1:20 - +++. Аналогично делали для 99 мас.%; 98 мас. %; 99,5 мас.%; 99,7 мас.% суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП. Результат представлен в таблице 6.

Как указано в таблице, содержание суспензии клеток ФЭК инфицированных хламидиями штамма "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП в пределах от 99,0 мас.% до 99,5 мас. %, обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии с ее контролем. Количество культуральной клеточной суспензии выше 99,5 мас.% не применяется, т.к. это не улучшает качество вакцины, а увеличивает расход ее дорогостоящих компонентов. Использование культуральной клеточной суспензии в количестве ниже 99,0 мас.% также не допускается, т.к. вакцина при этом не обладает иммуногенностью, соответствующей установленному контролю вакцины и не вызывает развитие надежного иммунитета у птицы.

Технический результат.

Вакцина профилактирует возникновение у птиц на почве хламидиоза: пневмонии, артрита, аэросаккулита. Повышает процесс выводимости птенцов на 10-12%, увеличивает сохранность молодняка на 18-24%. Увеличивается яйценоскость, возрастают привесы. Кроме того, вакцина сокращает загрязнение окружающей среды хламидиями, являющимися антропозоонозами, а также снижает затраты неблагополучного хозяйства на проведение малоэффективных лечебно-профилактических мероприятий с применением антибиотиков и других лечебных средств. Вакцина безвредна. В целом эффективность вакцины составляет 90-93%.

Источники информации 1. Л.П.Дьяконов, В.Ф.Глухов и др. Культивирование клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие (часть 1), Ставрополь, 1986 г.

2. Описание к патенту США N 4386065 МКИ A 61 K 39/, 1983.

3. А.с. N 645369 з. N 2528058 МКИ C 12 K 5/00.

4. А.с. N 660390 з. N 2528670 МКИ C 12 K 5/00.

5. А.с. N 661017 з. N 2528672 МКИ C 12 K 5/00.

6. А.с. N 666203 з. N 2528672 МКИ C 12 K 5/00.

7. А.с. N 666202 з. N 2528669 МКИ C 12 K 5/00.

8. А.с. N 655160 з. N 2528668 МКИ C 12 K 5/00.

Формула изобретения

Вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза (орнитоза) птиц, содержащая антиген хламидий, адъювант и инактиватор, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит штамм Chlamydia psittaci var, avis "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10^-7,0 ТЦД_50/мл, в качестве адъюванта - поливинилпирролидон, а в качестве инактиватора - фенол при следующем соотношении их, мас.%: Суспензия клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci var, avis "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП с титром не ниже 10^-7,0 ТЦД_50/мл - 99,0 - 99,5 Фенол - 0,3 - 0,5
Поливинилпирролидон - 0,4 - 0,6п

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6