Пептид или его органические или неорганические соли, способ получения, фармацевтическая композиция, способы стимулирования высвобождения гормона роста и увеличения его содержания в крови

 

Изобретние относится к новым пептидам формулы 1, где А₁, А₂, А₅, С₁, С₂, C₃ представляют собой различные аминокислотные остатки или (низший алкил) замещенные остатки аминокарбоновых кислот, определенные в п.1 формулы изобретения. Раскрыты также их соли, способ получения, фармацевтическая композиция на основе пептидов, а также способ стимулирования высвобождения гормона роста и увеличения его содержания в крови. Соединения фopмулы 1 могут быть использованы в терапевтических целях для лечения заболеваний, где необходимо повышение уровней гормона роста, а также для увеличения надоев молока и повышения массы тела у животных. 5 с. и 14 з.п. ф-лы, 7 табл., 3 ил.

А₁ - А₂ - С₁ - С₂ - C₃ - А₅ (1)

Настоящее изобретение относится к новым полипептидным соединениям, которые при введение их животным, а предпочтительно человеку, стимулируют высвобождение гормона роста. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способам стимулирования высвобождения гормона роста и повышения его уровней у животных путем введения этим животным указанных полипептидных соединений, высвобождающих гормон роста.

Повышение уровней гормона роста (ГР) у животных, например у млекопитающих (включая человека), после введения этим животным соединений, высвобождающих гормон роста, может привести к увеличению массы тела и к повышению молочной продуктивности в случае, если введение указанных соединений способствует достаточному увеличению ГР - уровней. Кроме того, известно, что повышение уровней гормона роста у млекопитающих и человека может быть продуцировано путем введения известных агентов, высвобождающих гормон роста, например, таких как натуральные рилизинг-факторы ростового гормона.

Повышение уровней гормона роста у млекопитающих может быть также вызвано путем введения этим млекопитающим пептидов, высвобождающих ГР, некоторые из которых были ранее описаны в литературе, например в патентах США N 4 223 019, 4 223 020, 4 223 021, 4 224 316, 4 226 857, 4 228 155, 4 228 156, 4 228 157, 4 228 158, 4 410 512, 4 410 513.

Для повышения ГР - уровней были также использованы антитела против эндогенного ингибитора высвобождения гормона роста, соматостатина (SR1 - фактор, или SR 1F). В этом случае, ГР - уровни повышают путем удаления эндогенного ингибитора ГР - высвобождения (SR1F) до того, как этот ингибитор достигнет гипофиза, где он подавляет выделение ГР.

В каждом из этих методов, направленных на увеличение уровней гормона роста, используются материалы, синтез и/или выделение которых со степенью чистоты, достаточной для последующего введения целевому животному, являются слишком дорогостоящими процедурами. Поэтому было бы желательно получить короткоцепочечные, низкомолекулярные и относительно простые полипептиды, которые обладали бы способностью стимулировать высвобождение гормона роста, и которые были бы относительно недорогостоящими, то есть они должны быть легко и без особых затрат синтезируемыми, легко химически и/или физически модифицируемыми, легко поддаваться очистке и введению в фармацевтические композиции, а также они должны обладать прекрасными транспортными свойствами.

Хотя специалистам известны некоторые короткоцепочечные полипептиды, которые способны стимулировать высвобождение гормона роста и повышение его уровней в крови (например, такие как полипептид His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂, описанный в патенте США 4 410 512), но по разным причинам, например, для улучшения доставки к тканям, улучшения биологической усвояемости, для повышение времени удержания и т.п. Очень важно, чтобы данные полипептиды обладали бы способностью к конструированию. Однако замена аминокислот в некоторых положениях может весьма неблагоприятно отразиться на способность такого короткоцепочечного пептида к стимулированию высвобождения гормона роста.

Поэтому, было бы желательно получить другие короткоцепочечные полипептиды, которые были бы способны стимулировать высвобождение гормонов роста и повышение их уровня в крови животного, а в частности, человека. Было бы также желательно использовать такие полипептиды в целях стимулирования высвобождения и/или повышения уровней гормона роста в крови человека и животных.

Кроме того, было бы желательно разработать методы стимуляции высвобождения гормона роста и/или повышения его уровня в крови животных, используя при этом указанные полипептиды с короткой цепью.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть определены следующей формулой: A₁-A₂-C₁-C₂-C₃-A₅, где: A₁ представляет собой Cly, DAla, β-Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, N-(низший алкил) - аминокарбоновую кислоту, N,N-бис(низший алкил)аминокарбоновую кислоту, азолкарбоновую кислоту, или (низший алкил)аминокарбоновую кислоту, где низшая алкильная группа имеет прямую цепь, содержащую 2-10 атомов углерода. При этом предпочтительно если A₁ является DAla.

A₂ представляет собой DTrp, DβNal, D-4-Y-Phe или 5-Y-D-Trp, где Y является OH, Cl, Br, F или H. Предпочтительно если A₂ является DβNal. A₅ представляет собой A₃-A₄-A_5', A₃-A_5' или A_5'.

Предпочтительно если A₅ является A_5'. A₃ представляет собой Ala, Gly, DAla, Pro или des Ala. A₄ представляет собой Ala, Gly, DAla, Pro, (линейный низший алкил)аминокарбоновую кислоту, или des Ala. A₅ представляет собой Lys(ζ-R₁,R₂)-Z, Orn (δ-R₁,R₂)-Z, NH(CH₂)_xN(R₃, R₄). A_5' может быть также Lys-Z, Orn-Z или Arg-Z, если A₁ не является His. R₁ представляет собой линейную низшую группу или атом водорода. R₂ представляет собой линейную алкильную группу водорода. Если R₁ является атомом водорода, то R₂ не является атомом водорода; и аналогично, если R₂ является атомом водорода, то R₁ не является атомом водорода. R₃ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом водорода. Указанная низшая алкильная группа содержит прямую цепь с 2-10 атомами углерода. Z представляет собой NH (линейную низшую алкильную группу), N (линейную низшую алкильную группу)₂, O - (линейную низшую алкильную группу), NH₂ или OH, где линейная низшая алкильная группа является такой, как она была определена выше. "x" представляет собой число от 2 до 15. C₁ является Ala. C₂ является Trp, Phe, или Ch xAla. Предпочтительно, если C₂ является Trp или Phe, а более предпочтительно Trp. C₃ является DPhe, DPal или DCh x Ala. Предпочтительно если C₃ является DPhe.

Указанные полипептиды могут быть также получены в виде органических или неорганических аддитивных солей. Предпочтительным полипептидом является: A₁-A_{2 (2-апр-1999)2}-DPhe-A₅, а более предпочтительными является полипептид: A₁-A₂-Ala-Trp-DPhe-A₅.

Краткое описание рисунков На фиг. 1 представлена серия графиков, иллюстрирующая зависимость уровней гормона роста в сыворотке человека от времени.

Авторами настоящей заявки были получены новые полипептиды с короткой цепью, которые стимулируют высвобождение гормона роста и повышение его уровней в крови животных. Эти полипептиды могут быть определены следующей формулой: A₁-A₂-Ala-Trp-DPhe-A₅, где A₁ представляет собой Gly, β-Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, имидазолуксусную кислоту, N-(низший алкил)аминокарбоновую кислоту, N,N-бис(низший алкил)аминокарбоновую кислоту, азолкарбоновую кислоту, или (низший алкил) карбоновую кислоту, где низшая алкильная группа имеет прямую цепь с 2-10 атомами углерода. Предпочтительно если низшая алкильная группа является прямой и имеет 2-6 атомов углерода. Указанная низшая алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Предпочтительными заместителями являются O, N, или Si. Предпочтительно если низшая алкильная группа является незамещенной. Предпочтительной азолкарбоновой кислотой является Nα -4-имидазолуксусная кислота (IMA). A₁ предпочтительно является Gle, DAla или His, более предпочтительно His или DAla, а наиболее предпочтительно DAla.

A₂ представляет собой DTrp, DβNal, D-4-Y-Phe- или 5-Y-D-Trp, где Y является OH, Cl, Br, F или H. A₂ предпочтительно является DβNal, D-4-Y-Phe или 5-Y-D-Trp, а более предпочтительно DβNal. Y предпочтительно является OH или H.

A₅ представляет собой A₃-A₄-A_5', A₃-A_5', A₄-A_5', или A_5'. Предпочтительно если A₅ является A_5'. A₃ представляет собой Ala, Gly, DAla, Pro или desAla. A₄ представляет собой Ala, Gly, DAla, Pro, (линейный низший алкил) аминокарбоновую кислоту, или desAla; а A₅ представляет собой Lys(ζ-R₁,R₂)-Z, Orn(δ-R₁,R₂)- Z, LArg (g - R₅ - R₆), NH(CH₂)_xN(R₃, R₄). A_5' может быть также Lys-Z, Orn-Z или Arg-Z, в том случае, если A₁ не является His. R₁ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом водорода. Если R₁ является H, то R₂ не является H; и аналогично, если R₂ является H, то R₁ не является H. R₃ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом H. R₄ представляет собой линейную алкильную группу или атом водорода. R₅ и R₆ являются линейными низшими алкильными группами. Указанная низшая алкильная группа состоит из прямой цепи, имеющей от 2 до около 10 атомов углерода. Предпочтительно если эта алкильная группа имеет прямую цепь с 2-6 атомами углерода. Причем, указанная низшая алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Предпочтительными заместителями являются O, N, или Si. Предпочтительно если указанная низшая алкильная группа является незамещенной. "g" - гуанидино. Z - NH (линейная низшая алкильная группа), N (линейная низшая алкильная группа)₂, O (линейная низшая алкильная группа), NH₂ или OH, где линейная низшая алкильная группа является такой, как она была определена выше. "x" является числом от 2 до 15, предпочтительно 2 - 6. A₅ является предпочтительно Lys - NH₂. Рассматриваемые полипептиды могут быть также получены в виде органических или неорганических аддитивных солей.

В соответствии со стандартной номенклатурой пептидов, используемые в настоящем описании аббревиатуры аминокислотных остатков имеют следующие значения: Gly - Глицин Tyr - L - Тирозин Ile - L - Изолейцин
Glu - L - Глутаминовая кислота
Thr - L - Треонин
Phe - L - Фенилаланин
Ala - L - Аланин
Lys - L - Лизин
Asp - L - Аспарагиновая кислота
Cys - L - Цистеин
Arg - L - Аргинин
Ava - Аминовалерьяновая кислота
Aib - Аминоизомасляная кислота
Gln - L - Глутамин
Pro - L - Пролин
Leu - L - Лейцин
Met - L - Метионин
Ser - L - Серин
Asn - L - Аспарагин
His - L - Гистидин
Trp - L - Триптофан
Val - L - Валин
DOPA - 3,4-Дигидроксифенилаланин
Met(O) - Метионинсульфоксид
Abu - α- Аминомасляная кислота
iLys - Nε- Изопропил - L - лизин
4-Abu - 4-аминомасляная кислота
Orn - L - Орнитин
DαNal - α-Нафтил-D-Аланин
DβNal - β-Нафтил-D-Аланин
Sar - Саркозин
LArg - гомоаргинин
Chx - циклогексил
ChxAla - L-циклогексилаланин
DChxAla - D-циклогексилаланин
IMA - Nα-имидазолуксусная кислота
Tcc - 1,2,3,4-тетрагидро-7-каролин-3-карбоновая кислота
Tic - 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота
Tip - 4,5,6,7-тетрагидро-IH-имидазо[e]-6-карбоновая кислота
α,γABU - альфа, гамма-аминомасляная кислота
DPal - D-3-пиридилаланин
Во всех обозначениях аминокислот, где трехбуквенной аббревиатуре предшествует буква "D", эта буква указывает на D-конфигурацию аминокислотного остатка, а глицин относится к аминокислотам, определяемым термином "натуральные L-аминокислоты".

В этих короткоцепочечных полипептидах имеются некоторые положения, которые, по сравнению с другими, являются более толерантными к замене аминокислот, то есть в этих положениях замена аминокислот не оказывает неблагоприятного воздействия на способность полипептида к стимулированию высвобождения гормона роста и/или повышению его уровней в крови животных. К таким положениям относится, например, положение A₅. Другие положения являются менее толерантными к таким изменениям, например, средние аминокислотные остатки Ala, Trp, DPhe, обозначенные C₁, C₂ и C₃ соответственно. Ранее предполагалось, что A₁ и A₂ должны присутствовать в L- и D-форме соответственно и что Trp и DPhe должны быть в L- и D-форме, составляющей LD LD - ряды. Однако авторами настоящей заявки было обнаружено, что LD LD - последовательность может быть DD LD - последовательностью. Таким образом, было неожиданно обнаружено, что полипептид формулы A₁-A₂-C₁-C₂-C₃-A₅, где A₁, A₂, A₅ являются такими, как они были определены выше; C₁ является Ala; C₂ является Trp, Phe, и CDxAla; а C₃ является DPhe, DPal, или DChxAla, обладает способностью стимулировать высвобождение гормона роста и/или повышение его уровней в крови животного.

Предпочтительно если C₂ является Trp или Phe, а более предпочтительно Trp.

C₃ является предпочтительно DPhe. Если C₂ является ChxAla, то C₃ предпочтительно является DPhe. Если C₃ является DPal, то Z предпочтительно является OH.

Повышенная гибкость в выборе основных, нейтральных или кислотных аминокислотных остатков и L - и D-форм, который может быть осуществлен для аминокислот A₁, A₂, A₃, A₄, A₅,C₂ и C₃, дает большие возможности для регулирования физиологических свойств нужного пептида.

Хотя DAla -DβNal- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ и DAla -DβNal- Ala-Phe-DPhe-Lys-NH₂ имеют аналогичную активность в отношении ГР - высвобождения, однако замена остатка Trp остатком Phe может способствовать повышению химической стабильности DAla -DβNal- Ala-Phe-DPhe-Lys-NH₂, поскольку Trp является более восприимчивым к окислению, чем Phe. Кроме того, замена Trp на Phe будет придавать пептиду большую гидрофобность, и это качество вместе с вышеуказанной химической стабильностью будет определять физико-химические свойства пептида, которые могут оказаться предпочтительными для повышения абсорбции пептида, а также для составления пероральных, трансдермальных и/или назальных препаратов, содержащих указанный пептид. Кроме того, величины ED₅₀ (50%-ная эффективная доза) в гистаминовом анализе (с использованием крысиных клеток) DAla -DβNal- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ и DAla -DβNal- Ala-Phe-Dphe-Lys-NH₂ являются одинаковыми, т.е. 30,5±0,5 и 30,8±0,3 мкг/мл, указывают на более высокую гистаминовую активность по сравнению с гистаминовой активностью пептида Ala-His -DβNal- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂, для которого это значение составляет 11,0±1,0 мкг/мл. Пептиды с меньшей гистамин-высвобождающей активностью (выше ED₅₀) могут быть клинически более эффективными, поскольку они будут в меньшей степени продуцировать неблагоприятную местную реакцию при их инъецировании, и/или они будут в меньшей степени продуцировать клинически неблагоприятное системное антигенное действие.

Вышеуказанная гибкость в выборе аминокислотных остатков дает также важное преимущество в отношении составления лекарственных средств, содержащих данные пептиды, и доставки этих пептидов к любым участкам организма. Проводимые замены аминокислот могут также способствовать улучшению пероральной абсорбции, метаболизма и экскреции пептидов. Например, по своей способности к высвобождения гормона роста у человека пептид Ala-His -DβNal- Ala-Trp-Dphe-Lys-NH₂(GHR P-1) является более эффективным, чем пептид Ala-His-DTrp-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH₂. Однако при пероральном введении пептид DAla -DβNal- Ala-Trp-Dphe-Lys-NH₂ (GHR P-2) является более эффективным, чем GHRP-1. См. , например, чертеж, который иллюстрирует уровни гормона роста в сыворотке нормального молодого человека в зависимости от времени после введения 300 мкг/кг GHRP-1 40 индивидуумам (график 1-1 (о)), 600 мкг/кг GHR P-1 39 индивидуумам (график 1-2(Δ)), и 100 мкг/кг GHR P-2 11 индивидуумам (график 1-3 (□)).В этих исследованиях нормальным молодым людям в возрасте 25 лет вводили GHRP сначала в 20 мл H₂O, затем 100 мл H₂O. Пробы крови брали в соответствии со схемой, показанной на диаграмме. Уровни ГР определяли с помощью радиоиммуноанализа.

Предполагается также, что поскольку в этих пептидах ароматические боковые цепи могут быть также элиминированы в некоторых положениях, где они, как считалось ранее, были необходимы и что D - аминокислотный остаток должен быть биологически более защищен, чем остаток в L - форме, то могут быть использованы некоторые пептиды с большей защитой и меньшими массами для того, чтобы посредством последующего конструирования полипептида можно было бы придать этому полипептиду улучшенные свойства, такие как назальная, пероральная и трансдермальная абсорбция, in vivo - стабильность, и т.п.

Группы R₁, R₂, R₃, R₄ и Z могут варьироваться, и тем самым обеспечивать дополнительный контроль физико-химических свойств нужного соединения. Поэтому можно получить пептид с повышенной способностью доставки к конкретному рецептору и в конкретном хозяине.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными ГР - высвобождающими соединениями являются
A₁-A₂-Ala-Trp-DPhe-A_5',
или органические или неорганические аддитивные соли любых полипептидов, где A₁, A₂ и A_5' являются такими, как они были определены выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используемый ГР - высвобождающий пептид имеет формулу:
DAla-A₂-Ala-Trp-DPhe-A_5',
или его органические или неорганические аддитивные соли. Предпочтительными пептидами являются члены следующей группы соединений:
DAla -DβNal- Ala-Trp-DPhr-Lys NH₂
DAla -DβNal- Ala-Trp-DPhe -Lys(ε-iPr)NH₂
DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe -Lys(ε-iPr) NH₂
DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys NH₂
DAla -DβNal- Ala-Trp-DPhe-NH(CH₂)₅NH₂
NH₂(CH₂)₅CO -Dβ- Nal-Ala-Trp-D-Phe-NH(CH₂)₅NH₂,
а также их органические или неорганические аддитивные соли.

Эти соединения являются наиболее предпочтительными, поскольку указанные полипептиды с более короткой цепью являются экономически более выгодными для синтеза, и обладают при этом высокой степенью способности стимулировать увеличение уровней гормона роста в крови.

Другими предпочтительными пептидами являются пептиды формулы A₁-A₂-Ala-Phe-DPhe-A₅. Предпочтительными членами этой группы соединений являются соединения, в которых A₁ представляет собой NαIMA,αγABU, DAla, His, Ala, или αγABU; A₂ представляет собой DβNal или DPhe, а A₅ представляет собой LysNH₂, LysNH₂, ArgNH₂, NH-Chx-NH₂ (1,4 Chx - диамин) или Lys EA.

Например:
NαIMa-DβNal- Ala-Phe-DPhe-LysNH₂,
α,γ ABU-DβNal- Ala-Phe-DPhe-LysNH₂,
DAla-DPhe-Ala-Phe-DPhe-LysNH₂,
βAla-His-DβNal- Ala-Phe-DPhe-LysNH₂,
NαIMA-DβNal- Ala-Phe-DPhe-NH-Chx-NH₂,
α,γABU-DβNal- ALa-Phe-DPhe-NH-Chx-NH₂,
DAla -DβNal- Ala-Phe-DPhe-Lys EA,
DAla -DβNal- Ala-Phe-DPhe-Arg NH₂,
а также их органические или неорганические соли.

В другом своем варианте настоящее изобретение включает в себя полипептиды формулы: A₁-A₂-C₁-C₂-C₃-A₅, где C₁ является Ala; C₂ является Trp, Phe или ChxAla; C₃ является DPhe или DChxAla, A₁ является предпочтительно DAla. A₂ является предпочтительно DβNal.
Например:
DAla -DβNal- Ala-ChxAla-DPhe-Lys NH₂,
DAla -DβNal- Ala-Phe-DChxAla-Lys NH₂,
DAla -DβNal- Ala-ChxAla-DChxAla-Lys NH₂,
а также их органические или неорганические аддитивные соли.

Описанные выше соединения могут быть легко синтезированы, являются высокоэффективными стимуляторами повышения уровней гормона роста в сыворотке, и обладают достаточно хорошими свойствами, облегчающими их промышленное производство и использование. Кроме того, указанные соединения могут иметь физиохимические свойства, которые являются предпочтительными для эффективной пероральной, назальной и пролонгированной доставки таких полипептидных соединений широкому ряду животных с использованием конкретных химических/механических методов; причем, указанные структурно пластичные полипептиды могут быть наделены вышеописанными физиохимическими свойствами посредством различных замещений в ряде положений полипептида и посредством выбора полярной, нейтральной или неполярной природы C-концевых и центральных положений данного полипептида.

Пептиды настоящего изобретения могут быть использованы в терапевтических целях в том случае, где необходимо повышение уровней гормона роста, например, для лечения таких заболеваний, как гипофизарный инфантилизм, остеопороз, ожоги, острая почечная недостаточность, несращиваемые переломы кости и для более быстрого заживления ран. Кроме того, эти полипептиды могут быть использованы для ускорения выздоровления после хирургической операции, а также при истощении после острого/хронического заболевания. Поскольку указанные полипептиды обладают анаболическим действием на кожу, мускулы и кости и одновременно способствуют уменьшению содержания жира в организме, то они могут быть с успехом использованы для предотвращения процессов старения организма. Эти пептиды могут быть также использованы при лечении пациентов, страдающих раковыми заболеваниями, например, для предупреждения и/или кахексии у этих пациентов. Указанные способы лечения могут быть проведены с использованием терапевтически эффективного количества пептида. Таким количеством является количество, необходимое для стимулирования высвобождения нужного уровня гормона роста, как обсуждалось выше.

Соединения настоящего изобретения могут быть также использованы для увеличения ГР - уровней в крови у животных; для увеличения надоев молока у коров; для повышения массы тела у животных, например, у млекопитающих (таких как человек, овцы, бычки и свиньи), у рыб, домашней птицы, а также у других позвоночных и ракообразных; и для усиления роста шерсти и/или меха у млекопитающих. Количество прироста массы тела зависит от пола и возраста животных, от дозы и природы вводимых ГР - высвобождающих соединений, от способа введения, и т.п. Соединения настоящего изобретения также способствуют увеличению уровней ГР в сыворотке человека; ускорению роста у детей маленького роста; снижению количества жира в организме; улучшению метаболизма белка у детей, и кроме того, улучшению белкового метаболизма кожи, мускул, кости при одновременном снижении содержания жира у пожилых людей, особенно при дефиците в организме гормона роста.

Рассматриваемые пептиды могут быть также использованы для улучшения состава липидов в организме человека путем снижения уровня холестерина и липопротеина низкой плотности в сыворотке, и увеличения количества сывороточного липопротеина высокой плотности.

Новые полипептидные соединения настоящего изобретения могут быть синтезированы стандартными методами твердофазной пептидной химии, или классическими методами, хорошо известными специалистам.

Для синтеза пептидных амидов твердофазный синтез предпочтительно начинать с C-конца пептида. Подходящий исходный материал может быть получен, например, путем связывания нужной защищенной альфа-аминокислоты с хлорометилированным полимером, гидроксиметиловым полимером, бензгидриламиновым (ВНА) полимером или пара-метил-бензгидриламиновым (p-Me-BHA) полимером. Один из таких полимеров, например хлорометиловый полимер, продается под торговой маркой BIOBEADS SX-1 (Bio Rad Laboratories, Richmond, California). Получение гидроксиметилового полимера описано Bodansky и др., Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966). BHA-полимер описан Pietta и Marshall, Chem. Comm. 650 (1970), и являются коммерческим продуктом, поставляемым Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, California.

После первоначального связывания альфа-амино-защитная группа может быть удалена с помощью кислотного реагента, например раствора трифтороуксусной кислоты (TFA) или соляной кислоты (HCl), в органических растворителях при комнатной температуре. После удаления α -амино-защитной группы, оставшиеся защищенные аминокислоты могут быть поэтапно присоединены в нужном порядке. Каждая защищенная аминокислота может быть подвергнута реакции (например в 3-кратном избытке) с использованием соответствующего активатора карбоксильной группы, такого как дициклогексилкарбодиимид (DCC) или диизопропилкарбодиимид (DIC) в растворе, например, в метиленхлориде (CH₂Cl₂) или диметилформамиде (ДМФ), или в их смеси.

После получения нужной аминокислотной последовательности синтезированный пептид может быть отщеплен от бензгидриламиновой полимерной подложки посредством обработки соответствующим реагентом, таким как фторводород (HF), который не только отщепляет пептид от полимера, но и также отщепляет наиболее часто используемые боковые защитные группы. В случае использования хлорометилового или гидроксиметилового полимера обработка фторводородом приводит к образованию свободной кислоты пептида. Однако, из этих пептидных полимеров могут быть легко получены сложные эфиры и алкиламиды этих пептидов посредством гидролиза соответствующим алкиламином, диалкиламином или диаминоалканом, либо посредством переэтерификации с использованием спирта с высоким pH.

Процедура твердофазного синтеза хорошо известна специалистам и описана Stewart и Young, Solid Phase Peptide Syntesis: 2-ое изд. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984).

Некоторые из хорошо известных методов синтеза в растворе, которые могут быть использованы для синтеза частей пептида настоящего изобретения, описаны Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2-ое изд., John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1976.

Очевидно, что наиболее предпочтительным синтезом пептидов является синтез в жидкой фазе, который предусматривает реакцию конденсации по крайней мере двух пептидных фрагментов.

Этот метод включает в себя конденсацию пептидного фрагмента X-A₁-Y с пептидным фрагментом U-V-W, где все аминокислотные боковые цепи, за исключением A₁, являются нейтральными или защищенными, а X представляет собой Prot, где Prot является N-концевой защитной группой; Y представляет собой A₂-Q, Ala-A₂-Q, A₂-Ala-Q, Ala-A₂-Ala-Q, A₂-Ala-Trp-Q, Ala-A₂-Ala-Trp-Q, Ala-Q или -Q, где Y является Q; U является J-A₂-Ala-Trp, или J-Ala-A₂-Ala-Trp. Если Y является Ala-Q, то U является J-A₂-Ala-Trp. Если Y является A₂-Q или Ala-A₂-Q, то U является J-Ala-Trp. Если Y является A₂-Ala-Trp-Q или Ala-A₂-Ala-Trp-Q, то U является J. V представляет собой A₅ или Z. Если V является A₅, то W является Z. Если V является Z, то W отсутствует. A₁, A₂, A₅ и Z являются такими, как они определены выше.

Q представляет собой карбоксиконец пептидного фрагмента и является /OR³ или -M, где M представляет собой часть, которая может быть заменена азотсодержащим нуклеофилом, а R³ представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до около 10 атомов углерода; арильную группу, имеющую от 6 до около 12 атомов углерода; или арилалкильную группу, имеющую от 7 до около 12 атомов углерода.

J представляет собой аминоконец указанного фрагмента; а H представляет собой защитную группу, которая не затрудняет реакцию присоединения, например бензильную группу.

Затем защитные группы удаляют. Альтернативно, полученный таким образом защищенный пептид может быть использован в последующих реакциях конденсации для получения более крупного пептида.

Этот предпочтительный метод синтеза более подробно описан в заявке на патент США рег. N 559 121, поданной 24 июля 1990 г. под названием "Способ синтеза пептидов", и опубликованной как WO 9201709 ("Pro cess for Synthesizi ng Peptides", John C. Hubbs и S.W. Parker).

В соответствии с другим вариантом своего осуществления настоящее изобретение относится к способу стимулирования высвобождения гормона роста и/или повышения его уровней в крови животного. Этот способ стимуляции высвобождения ГР и/или повышения его уровней в крови может быть использован для терапевтического лечения вышеуказанных заболеваний. Этот способ заключается во введении животному эффективной дозы по крайней мере одного из описанных выше полипептидов. В одном из вариантов осуществления этого способа используются животные за исключением человека.

Соединения настоящего изобретения могут быть введены перорально, парентерально (внутримышечно (I.m.), внутрибрюшинно (i.p.), внутривенно (i.v.), или подкожно (s.c.)), через нос, вагинально, ректально, подъязычно, а также путем внутрилегочной ингаляции в виде лекарственных форм, подходящих для каждого способа введения. При этом предпочтительным путем введения являются парентеральные инъекции.

Твердые лекарственные формы для перорального введения обычно изготавливаются в виде капсул, таблеток, драже, порошков и гранул. Для приготовления таких твердых лекарственных форм активное соединение смешивают по крайней мере с одним инертным носителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Помимо инертных наполнителей указанные лекарственные формы могут содержать замасливающие агенты, такие как стеарат магния. В случае использования капсул, таблеток и драже эти лекарственные препараты могут также содержать буферные агенты. Таблетки и драже могут быть изготовлены с энтеросолюбильным покрытием.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения обычно изготавливаются в виде эмульсий, растворов, суспензий, сиропов и элексиров, содержащих инертные разбавители, которые обычно используются в этих целях, например, такие как вода. Помимо указанных инертных разбавителей, такие композиции могут также содержать адъюванты, например, смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, а также подслащивающие, вкусовые и ароматизирующие вещества.

Препараты настоящего изобретения, предназначенные для парентерального введения, могут быть изготовлены в виде стерильных водных или безводных растворов, суспензий или эмульсий. Примерами безводных растворителей или разбавителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Указанные лекарственные формы могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Они могут быть стерилизованы, например, путем фильтрации через бактериальные фильтры путем введения в композиции стерилизующих агентов, путем облучения этих композиций или путем их нагревания. Указанные препараты могут быть также приготовлены в водной среде или в другой стерильной инъецируемой среде непосредственно перед их использованием.

Новые соединения настоящего изобретения могут быть также введены в комбинации с фактором высвобождения гормона роста (т.е. природным рилизинг-фактором ростового гормона, его аналогом и функциональным эквивалентом), а также в комбинации с другими соединениями, способствующими высвобождению гормона роста, такими как ГР - высвобождающие пептиды (см., патент США N 880 778, который вводится в описание посредством ссылки), например, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, β- адренергические блокирующие агенты, α²- адренергические блокирующие агенты и т.п. Такие комбинации с ГР - высвобождающими пептидами настоящего изобретения являются особенно предпочтительными, поскольку они стимулируют гораздо большее высвобождение гормона, чем это ожидается при суммировании отдельных ответов для каждого компонента комбинации, то есть, другими словами, эта комбинация продуцирует синергический ответ. Более подробное описание введения комбинации ГР - высвобождающих пептидов приводится в вышеуказанном патенте. Такими синергическими соединениями являются предпочтительно соединения, которые действуют как агонисты фактора ГР - высвобождения в реакции связывания с рецептором, или ингибиторы действия сомастатина. Этот синергизм может быть бинарным, то есть синергическими соединениями являются пептиды настоящего изобретения и одно из указанных других соединений, либо более чем одно из указанных соединений.

Комбинации, способствующие эффективному высвобождению гормона роста и повышение его уровней в крови животного, включая человека, содержат эффективное количество полипептидов, выбранных из полипептидов настоящего изобретения, и по крайней мере одного полипептида, принадлежащего к полипептидам Группы 1 или к полипептидам Группы 2 (т.е. соединениям, стимулирующим высвобождение гормона роста); причем полипептиды Группы 1 выбирают из природных факторов высвобождения ГР и их функциональных эквивалентов, где указанные полипептиды действуют как агонисты фактора ГР - высвобождения в реакции связывания с рецептором млекопитающих и других позвоночных и ракообразных; а полипептиды группы 2 выбирают из любых полипептидов, имеющих следующую структуру:
Tyr-DArg-Phe-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-NH₂;
Tyr-DArg (NO₂)-Phe-NH₂;
Tyr-DMet (O)-Phe-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DThr-Phe-Gly-NH₂;
Phe-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Gly-Phe-NH₂;
Tyr-DArg-Gly-Trp-NH₂;
Tyr-DArg(NO₂)-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DMet (O)-Phe-Gly-NH₂
(NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-оI
Tyr-DAla-Phe-Sar-ol
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH₂;
Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol;
Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Net(O)-ol;
Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH₂;
Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Gly-ol;
Туr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH₂;
Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (циклический дисульфид);
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (свободный дитиол);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (циклический дисульфид);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (свободный дитиол);
Tyr-DAla-Phe-Gly-Туr-Pro-Ser-NH₂;
Tуr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH₂;
Туr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Туr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Туr-DArg-Phe-Gly-Туr-Pro-Ser-NH₂;
и органические или неорганические аддитивные соли указанных полипептидов Группы 2; при этом вышеуказанную комбинацию вводят в таком отношении ингредиентов, что их совместное действие вызывает синергическое высвобождение гормона роста и увеличение его уровней в крови животного.

Примерами других хорошо известных соединений, способствующих высвобождению гормонов роста, являются ингибиторы ацетилхолинэстеразы, β- адренегенные блокаторы и α²- адренергические агонисты.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения пептиды настоящего изобретения используют вместе с природными факторами высвобождения гормона роста или их функциональными эквивалентами и вместе с соединениями, стимулирующими высвобождение гормона роста. Например, вместе с пептидами настоящего изобретения могут быть использованы соединения Группы 1 и Группы 2; либо в другом примере с пептидами настоящего изобретения могут быть использованы соединения Группы 1 или β- адренергические блокирующие агенты.

Количество вводимого полипептида или комбинации полипептидов настоящего изобретения может широко варьироваться в зависимости от многих факторов, например, от конкретного животного, которому вводят данный полипептид или композицию; от возраста и пола этого животного; от нужного терапевтического эффекта; от способа введения; и от конкретно используемого полипептида или композиции полипептидов. Однако во всех случаях используемая доза должна быть эффективной (терапевтически эффективное количество) для стимулирования высвобождения гормона роста и повышения его уровней в крови животного-реципиента. В основном такая доза колеблется в пределах от около 0,1 мкг до 10 мг всего полипептида на один килограмм массы тела. Предпочтительное количество может быть легко определено самим специалистом исходя из настоящего описания.

Например, предпочтительная доза для внутривенного введения человеку составляет в пределах от около 0,1 мкг до 10 мг всего полипептида на кг веса тела, более предпочтительно от около 0,5 мкг до 5 мкг, и наиболее предпочтительно от около 0,7 мкг до около 3,0 мкг на кг веса тела. В случае использования комбинаций пептидов высвобождения гормона роста описанные пептиды настоящего изобретения могут присутствовать в меньшем количестве. Например, при использовании пептида настоящего изобретения в сочетании с синергическим соединением Группы 1 (Патент США N 4 880 778), таким как GHRH, количество пептида настоящего изобретения предпочтительно составляет от около 0,1 мкг до около 5 мкг на кг массы тела, а количество синергического соединения (напр. , GHRH) составляет от около 0,5 мкг до около 15,0 мкг; а более предпочтительно если количество соединения настоящего изобретения составляет от около 0,1 мкг до около 3 мкг, а количество синергического соединения составляет от около 1,0 мкг до около 3,0 мкг на кг массы тела.

При пероральном введении обычно требуются большие количества. Например, доза для перорального введения человеку обычно составляет от около 30 до около 1200 мкг полипептида на кг массы тела, более предпочтительно от около 70 мкг до около 600 мкг, а наиболее предпочтительно от около 200 мкг до около 600 мкг всего полипептида на кг массы тела. Коровам и свиньям требуется примерно такая же доза, как и человеку, однако крысам необходимы более высокие дозы. Точная доза может быть определена любым специалистом исходя из описания настоящего изобретения.

В основном, как указывалось выше, при введении комбинаций пептидов высвобождения ГР предусматривается использование более низких доз каждого из указанных соединений по сравнению с дозами отдельных соединений, необходимыми для получения адекватного ответа, поскольку вышеуказанная композиция этих соединений обладает синергическим действием.

В объем настоящего изобретения также входят композиции, содержащие в качестве активного ингредиента органические или неорганические аддитивные соли вышеописанных полипептидов и их комбинаций, в сочетании, но необязательно, с носителем, разбавителем, матрицей замедленного высвобождения или с покрытием.

Примерами органических или неорганических аддитивных солей соединений, стимулирующих высвобождение ГР, или их комбинаций, которые входят в объем настоящего изобретения, могут служить органические соли, такие как ацетат, трифторацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, бензоат, лактат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафталат и т.п., и неорганические соли, такие как соли металлов Группы I (т.е. щелочных металлов), соли Группы II (т. е. щелочно-земельных металлов), соли аммония, протамина, а также соли цинка, железа и т.п., соли с противоионами, например хлорид, бромид, сульфат, фосфат и т.п., т.е. аналогичные тем, которые были указаны выше для органических соединений.

Для введения человеку фармацевтически приемлемые соли являются предпочтительными. Такие соли, как нетоксичные соли щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и соли аммония (например, соли натрия, калия, лития кальция, магния, бария, аммония и протамина), которые обычно используются в фармацевтической промышленности, могут быть получены хорошо известными способами. Термин "фармацевтически приемлемые соли" также включает в себя нетоксичные кислые аддитивные соли, которые могут быть получены при помощи реакции соединений настоящего изобретения с соответствующей органической или неорганической кислотой. Типичными примерами таких солей являются гидрохлорид, гидробромид, сульфат, бисульфат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат и т.п.

Настоящее изобретение также иллюстрируется нижеприведенными примерами, не ограничивающими, однако, его объема.

Пример 1.

Синтез пептидов, способствующих высвобождению гормона роста
Параметилбензгидриламино-гидрохлоридный (pMe-BHA · HCl) полимер помещали в реакционный сосуд в стандартный автоматический синтезатор пептидов. Полимер был замещен свободным амином вплоть загрузки от около 5 мМ/грамм. Соединения получают путем присоединения отдельных аминокислот, начиная с карбоксиконца пептидной последовательности и используя соответствующий активирующий реагент, такой как N,N-дициклогексилкарбодиимид (_DCC). Альфа-амин отдельных аминокислот является защищенным, например, в виде т-бутилоксикарбонильного производного (t-Boc), а реактивные функциональные группы боковой цепи являются защищенными, как показано в таблице 1.

До введения начальной аминокислоты полимер три раза (около 1 минуты каждый раз) размешивали с дихлорметаном (CH₂Cl₂; около 10 мг/г полимера); нейтрализовали путем трехкратного (около 2 минут каждый раз) размешивания с N, N-диизопропилэтиламином (DIEA) в дихлорметане (10:90; около 10 мг/г полимера); три раза (около 1 минуты каждый раз) с дихлорметаном (около 10 мл/г полимера). Начальную и каждую последующую аминокислоту присоединяли к полимеру с помощью предварительно образованного симметричного ангидрида с использованием примерно 6-кратного избытка (по отношению к полной реакционной емкости полимера) соответствующим образом защищенной аминокислоты и примерно 2-кратного избытка (по отношению к полной связывающей емкости полимера) DIC в соответствующем количестве дихлорметана. Для аминокислот с низкой растворимостью в дихлорметане добавляли N,N-диметилформамид (ДМФ) в целях получения гомогенного раствора. Обычно симметричный ангидрид получали за 30 минут до введения в реакционный сосуд при комнатной температуре или ниже. Дициклогексилмочевину, которая образуется при получении симметричного ангидрида, удаляли путем гравитационного фильтрования раствора в реакционный сосуд. Течение реакции присоединения аминокислот к полимеру прослеживали с помощью цветной реакции, используя соответствующий реагент, такой как нингидрин (который реагирует с первичными и вторичными аминами). После завершения присоединения аминокислоты к полимеру (> 99%), αаминозащитную группу удаляли путем обработки кислотным реагентом (или реагентами). Обычно использовался реагент, состоящий из раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (33:66).

После получения желаемой аминокислотной последовательности, нужный пептид может быть отщеплен от полимерной подложки путем обработки соответствующим реагентом таким как фтороводород (HF), который не только отщепляет пептид от полимера, но и также отщепляет наиболее часто используемые защитные группы боковых цепей. Если используется BHA- или p-Me-BHA-полимер, то HF - обработка приводит непосредственно к образованию свободных амидов пептида. В случае, если синтез проводят по методу Меррифилда, то свободные алкиламиды пептида отщепляют путем обработки соответствующим амином (в том случае, использование Boc -Nε- FMOC-Lys позволяет одновременно удалить FMOC-группу).

Полный процесс присоединения каждого отдельного аминокислотного остатка к полимеру показан в таблице 2.

С использованием описанной выше процедуры были получены соединения, представленные в таблицах 3, 4, 5 и 6.

Пример 2
In vivo - высвобождение гормона роста у крыс
Незрелые самки крыс Sprague-Dawley были получены из Charles River Laboratories (Wilmington, MA). После получения этих крыс содержали в условиях суточного цикла "день : ночь = 14 : 15" и при температуре 25^oC. Воду и еду для крыс Purina животные получали ad libitum. Детенышей держали вместе с матерью до тех пор, пока они не достигнут 21-дневного возраста.

Крыс в возрасте 26 дней (6 крыс на обрабатываемую группу) за двадцать минут до внутривенной инъекции пептида анастезировали путем введения (внутрибрюшинно) 50 мг/кг пентобарбитала. Внутривенные инъекции пептида (i. v.) вводили в нормальном физиологическом растворе, содержащем 0,1% желатина. Анастезированным крысам весом 55-65 грамм внутривенно инъецировали соединения, способствующие высвобождению гормона роста, в количестве, указанном в таблице 3. Инъекцию в виде 0,1 мл раствора делали в яремную вену.

Через 10 минут после инъекции всех животных умерщвляли путем декапитации (см. таблицу 3). Кровь собирали для определения ГР-уровней. После свертывания крови ее центрифугировали и отделяли сыворотку. Эту сыворотку замораживали и содержали в этом состоянии вплоть до проведения радиоиммуноанализа (РИА), осуществляемого для определения уровней гормона роста (ГР) в соответствии с процедурой, разработанной Национальным институтом артрита, диабета, желудочных и почечных заболеваний (NIADDK).

В пробирки для РИА-анализа при температуре рефрижератора (около 4^oC) добавляли реагенты (за одну стадию) в следующем порядке:
(a) буфер,
(b) "холодный" (т.е., нерадиоактивный) стандарт или неизвестный образец сыворотки для анализа,
(c) меченный радиоактивным йодом антиген гормона роста, и
(d) антисыворотку против гормона роста.

Добавление реагентов, в основном, осуществляли так, чтобы конечное разведение в РИА-пробирке составляло примерно 1:30000 (антисыворотка : полный объем жидкости = объем : объем).

Затем смешанные реагенты инкубировали при комнатной температуре (около 25^oC) в течение 24 часов, после чего добавляли второе антитело (например, козью или кроличью антиобезьянью гаммаглобулиновую сыворотку), которое связывается с конъюгированной антисывороткой против гормона роста и вызывает осаждение этого коньюгата. Затем осажденное содержимое РИА-пробирок анализировали, и с помощью гамма-сцинтилляционного счетчика определяли число отсчетов в определенный период времени. После этого строили стандартную кривую зависимости числа радиоактивных отсчетов от уровня гормона роста (ГР). С помощью этой эталонной кривой определяли затем ГР-уровни анализируемых образцов.

Сывороточные ГР-уровни измеряли при помощи РИА с использованием реагентов, предусматриваемых Национальной программой по гормональным и гипофизарным исследованиям.

В таблице 3 представлены сывороточные уровни (нг/мл), исходя из стандартных ГР-уровней крысы, составляющих 0,61 Международных единиц/мг (ME/мг). Приведенные данные представляют собой средние величины ± ср.кв.ош. (SEM). Статистический анализ проводили в соответствии с т-критерием Стьюдента. Результаты, приведенные в таблице 3, представляют собой средние величины, полученные в эксперименте с 6 крысами.

В таблице 3 соединения настоящего изобретения сравниваются с соединениями, структура которых выходит за пределы общей формулы заявленных соединений, и на основании этого сравнения показывается, что соединения настоящего изобретения обладают способностью стимулировать высвобождение гормона роста и увеличения его уровней в крови крыс, которым были введены эти соединения предпочтительным способом. Эта неожиданная активность к ГР-высвобождению, обнаруживаемая предпочтительными соединениями настоящего изобретения, является очень важным фактом, который подтверждает, что для повышения уровней гормона роста в крови животных и человека может быть использован менее дорогостоящий метод, чем методы, применяемые до настоящего времени, то есть может быть использован низкомолекулярный полипептид с более короткой цепью, имеющей относительно стабильный и экономически выгодный D-аланин у своего аминоконца, и пентандиамин (вместо Lys) у C-конца.

Пример 3
In vivo - высвобождение гормона роста (ГР) у крыс после перорального введения
Повторяли процедуру примера 2, за исключением того, что крысам вводили указанные дозы соединений с помощью желудочного зонда. В таблице 4 указаны вводимые соединения, использованные дозы и данные, полученные в результате эксперимента.

После перорального введения крысам соединения настоящего изобретения сохраняли свою высокую активность в высвобождении ГР. Этот факт является очень важным результатом и свидетельствует о возможности перорального введения пептидов настоящего изобретения в терапевтических целях.

Пример 4
In vivo - высвобождение гормона роста (ГР) у крыс
Повторяли процедуру примера 2. Вводимые соединения, используемые дозы и результаты представлены в таблицах 5 и 6.

Как видно из таблиц 5 и 6, соединения настоящего изобретения стимулируют высвобождение гормона роста и повышение его уровней в крови в гораздо большей степени, чем соединения, имеющие более длинную цепь.

Пример 5
In vivo - высвобождение гормона роста у человека
Нормальным мужчинам, имеющим средний возраст примерно 25 лет, перорально вводили пептид Ala-His -DβNal- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ (GHR P-1) или пептид Ala -DβNal- Ala-trp-DPhe-Lys-NH₂ (GHR P-2). 40 человек получили 300 мкг/кг GHR P-1 в 20 мл воды, а затем лишь 100 мл воды; 39 человек получили 600 мкг/кг GHR P-1 в 20 мл воды, а затем 100 мл воды; и 11 человек получили 100 мкг/кг GHR P-2 в 20 мл воды, а затем 100 мл воды. У этих людей брали пробы крови через определенные промежутки времени (как показано на фиг. 1), и эти пробы подвергали радиоиммуноанализу для определения уровней гормона роста в соответствии с процедурой, описанной в примере 2. Результаты показаны на фиг. 1. Пероральное введение 100 мкг/кг GHR P-2 давало более высокие уровни гормона роста, чем пероральное введение 300 мкг/кг GHR P-1.

Пример 6
In vivo - высвобождение гормона роста у крыс
В основном, повторяли процедуру, описанную в примере 2, за исключением того, что указанные пептиды инъецировали подкожно, а не внутривенно, а животных умерщвляли не через 10 минут, а через 15 минут. Вводимые соединения, используемые дозы и полученные результаты представлены в таблице 7.

Пример 7
Реакция конденсации пептидных фрагментов с образованием пептида
Основная процедура
Точки плавления могут быть определены с помощью аппарата Томаса Гувера для капиллярного определения температур плавления. ИК-спектры могут быть сняты на спектрофотометре Perkin - Elmer Model 137 или Nicolet Model 5DX и зарегистрированы в волновых числах (см^-1). Масс-спектры (МС) могут быть получены с использованием спектрофотометра VG Analytical Ltd. Model ZAB-IF-Mass Spectrometer, где ионизацию осуществляют методами электронного удара (EI), полевой десорбции (FD), или бомбардировкой быстрыми атомами (FAB). Газовая хроматография с масс-спектроскопией (GCMS) может быть проведена на хромато-масс-спектрометре Finnigan 4023, снабженном капиллярной колонкой 30 м DB5 (J & W Scientific), где в качестве газа-носителя используют гелий. Вращение плоскости поляризации света может быть измерено с помощью поляриметра Autopol III, изготавливаемого Rudolph Research.

^IH-ЯМР - спектры могут быть получены на приборе JEOL GX - 400, работающем при 400 МГц, или на приборе JEOL GX-270, работающем при 270 МГц. Размечающая способность этих приборов составляет менее чем 0,7 Гц. Химические сдвиги выражали в миллионных долях (м.д.) и измеряли по отношению к внутреннему стандарту (3-(триметилсилил) - тетрадейтерированному пропионату натрия (TSP)).

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может быть осуществлена на системе Hitachi, содержащей регулятор градиентных объемов (l - 5000) и насос 655А, подсоединенный к полупрепаративной колонке (Видак 20ITP1010 или 218TP1010). В качестве элюирующего растворителя могут быть использованы смеси воды, содержащей 0,2% трифторуксусной кислоты и метанола. Обычно нужные соединения элюировали со скоростью потока 6 мл/мин в режиме возрастания градиента органического компонента приблизительно со скоростью 1-2% в минуту. Детекцию соединений осуществляли при соответствующей длине волны на диодном УФ-детекторе L KB 2140. Последующее интегрирование может быть осуществлено с использованием аналитического программного обеспечения (Версия 3.6)
Реакции осуществляли в инертной атмосфере азота или органа, за исключением тех случаев, когда это указано особо. Безводный тетрагидрофуран (ТГФ, сорт. U. V. ) и диметилформамид могут быть закуплены у Burdick и Jackson, и использованы непосредственно из бутыли.

А. Получение трипептидного фрагмента-₂HN-Trp-DPhe-Lys (Boc)-NH₂
Nα Бензилоксикарбонил _(Nε-т- бутоксикарбонил)лизина амида 4.

К раствору (10^oC) карбонилдиимидазола (CDI, 2, 88,24 г, 0,544М) и сухого тетрагидрофурана (ТГФ, 1500 мл) медленно добавляли Nα бензилоксикарбонил -(Nε-т- бутоксикарбонил)лизин (1, 180 г, 0,474 М). Во время этого добавления наблюдалось выделение газа. При образовании промежуточного соединения имидазолида Nε- бензилоксикарбонил -(Nε-т- бутоксикарбонил)лизина, 3, получили насыщенный раствор аммиака и ТГФ (2000 мл) (безводный газ NH₃ пропускали через ТГФ при 5-10^oC). После завершения образования промежуточного соединения 3 (примерно через 2 часа, когда прекратится выделение газа), половину ТГФ - раствора, содержащего 3, добавляли к раствору аммиака. Затем через 30 минут добавляли оставшийся раствор, содержащий 3. Во время добавления и еще 45 минут после добавления поддерживали непрерывный поток аммиачного газа. После добавления двух растворов, содержащих 3, образовался осадок. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и размешивали еще 15 часов. Растворитель удаляли из суспензии в вакууме. Остаток суспендировали в воде, а твердые вещества собирали путем вакуумной фильтрации.

Nε- т-бутоксикарбонил-лизин-амид. 5.

Раствор амида лизина 4 (181,48 г, 0,479 М) в метаноле (MeOH, 1000 мл) добавляли к суспензии катализатора (5% Pd/c, 5г) в метаноле (250 мл) в атмосфере азота. Через реакционную смесь барботировали водород (примерно 15 минут), после чего эту смесь размешивали в атмосфере водорода до тех пор, пока ВЭЖХ-анализ не покажет, что реакция завершена (36 часов). Затем атмосферу водорода заменяли аргоном. Реакционный раствор осветляли, пропуская через прокладку из Целита®, а растворитель удаляли в вакууме, в результате чего получали твердое вещество.

Nα- Бензилоксикарбонил-D-фенилаланил _(Nε-т- бутоксикарбонил)-лизин-амид. 8.

Nα- Бензилоксикарбонил-D-фенилаланин (6, 126%, 9 г, 0,423 М) медленно добавляли к раствору (10^oC) CDI (2, 66,03 г, 0,409 М) в ТГФ (500 мл). Во время добавления наблюдалось выделение газа. После прекращения выделения газа добавляли амид лизина 5 (110,75 г, 0,452 М) в виде раствора в ТГФ (500 мл). Приблизительно через 48 часов смесь фильтровали в целях удаления твердых веществ. Фильтрат концентрировали в вакууме.

Полученный остаток растворяли в этилацетате (Et OAc, 500 мл), а затем промывали в разделительной воронке следующим образом:
1. Вод. HCl (1 н., 3 x 500 мл), pH промывки 1, ок. 8; затем промывка pH 1.

2. Вода (500 мл)
3. Вод. Na₂CO₃ (1/2 насыщенный, 2 x 500 мл), фильтровали для сбора образовавшегося твердого вещества (8).

4. Вода (3 x 500 мл).

Органический слой осушали сульфатом натрия. После осветления растворитель удаляли в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывали из горячего Et OAc и получали второй образец 8.

D-Фенилаланин _(Nε-т- бутоксикарбонил)лизин-амид. 9.

Метаноловый раствор (1500 мл) амида 8 (120,53 г, 0,229 М) добавляли к суспензии катализатора (5% Pd/C, 50 г) в MeOH (200 мл). Затем атмосферу аргона заменяли водородом. После завершения реакции, на что указывала ВЭЖХ (примерно через 4 часа), атмосферу водорода заменяли аргоном. Реакционный раствор осветляли путем пропускания через прокладку из целита, а фильтрат концентрировали в вакууме. Полученный дипептид может быть использован непосредственно для получения трипептида 12.

Nα Бензилоксикарбонил-триптонил-D-фенилаланил _(Nε-т- бутоксикарбонил)лизин-амид. 12.

Раствор (10^oC) Nα бензилоксикарбонил-триптофана (10, 67,60 г, 0,200 М), ТГФ (500 мл) и CDI (2, 33,05 г, 0,204 М) размешивали до тех пор, пока не прекратится выделение газа. Затем к реакционной смеси добавляли раствор соединения 9 (40,8 г, 0,103 М) в ТГФ (около 200 мл). Полученный раствор оставляли для реакции на 15 часов, нагревая при этом до комнатной температуры. Образовавшееся в результате твердое вещество собирали путем вакуумной фильтрации. Фильтрат концентрировали в вакууме. Полученный остаток и твердое вещество снова объединяли и растворяли в Et OAc (4000 мл), слегка нагревая. После охлаждения раствора до комнатной температуры образовалось твердое вещество. Это твердое вещество собирали путем вакуумной фильтрации. Затем его перекристаллизовывали из горячего MeOH и получали в результате очищенный трипептид 12. Et OAC-фильтрат (от первой кристаллизации) промывали в разделительной колонке следующим образом:
1. Вод. HCl (1 н., 2 х 500 мл),
2. Вода (1 х 500 мл),
3. Вод. Na₂CO₃ (1/2 насыщенный, 2 х 500 мл),
4. Вод. NaCl (1 х 500 мл).

Органический слой осушали сульфатом магния, а затем осветляли путем вакуумной фильтрации. Растворитель фильтрата удаляли в вакууме. Полученный остаток снова растворяли в этилацетате и получали сухой твердый продукт. Для получения второго сбора соединения 12 в виде белого твердого вещества этот твердый продукт может быть перекристаллизован из горячего MeOH.

Триптофил-D-фенилаланил _(Nε-т- бутилоксикарбонил)лизин-амид, 13.

Метаноловый раствор (1500 мл) трипептида 12 ( 64,59 г, 0,091 М) добавляли к суспензии катализатора (5% Pd/C, 5 г) в MeOH (250 мл) в атмосфере аргона. Затем добавляли еще 2250 мл метанола. Атмосферу аргона заменяли водородом и смесь оставляли примерно на 24 часа для реакции. После завершения реакции атмосферу водорода заменяли аргоном. Раствор осветляли путем пропускания через прокладку из Целита®, а фильтрат концентрировали в вакууме, в результате чего получали трипептид 13 в виде белого твердого вещества.

B. Получение метилового сложного эфира фрагмента трипептида: K-DAla -DβNal-Ala-Oме-Nα- бензилоксикарбонил-D-аланил-D-бетанафтил-аланина
Раствор этилацетата (400 мл) и гидрохлорида метилового сложного эфира D-бета-нафтилаланина (22, 0,62 М) промывали насыщенным карбонатом натрия (400 мл) и 0,8 н. водным гидроксидом натрия (ок. 500 мл). Образовавшуюся водную фазу удаляли (pH 8,5), а органическую фазу последовательно промывали полунасыщенным водным Na₂CO₃ (150 мл) и водой (50 мл). После концентрирования этилацетатного слоя в вакууме выделяли образовавшееся свободное основание соединения 22.

К раствору (-5^oC, в этанол-ледяной бане) Nα- бензилоксикарбонил-D-аланина (19, 14%, 5 г, 0,50 М), N-гидроксисукцинимида (HONSu, 23, 0,62 М) и свежеприготовленного свободного основания соединения 22 (ок. 0,52 М) в ДМФ (ок. 3 л) добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC, около 95 г, 0,46 М). Полученный реакционный раствор оставляли в течение 24 часов, нагревая при этом до комнатной температуры. За ходом реакции и ее завершением следили с помощью ВЭЖХ-анализа. Если реакция не была завершена, то реакционный раствор охлаждали примерно до -5^oC и к этому раствору добавляли еще одну порцию дициклокарбодиимида (около 0,17 М). Затем реакционную смесь оставляли размешиваться еще на 24 часа, нагревая при этом до комнатной температуры. Затем смесь отфильтровывали для удаления дициклогексилмочевины (DCU). К фильтрату добавляли 1 л воды и полученный раствор концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в водном растворе 1 н. HCl (ок. 1 л., до тех пор, пока pH водной фазы не достигает pH 1). Затем водную фазу экстрагировали двумя порциями этилацетата (1 л каждая). Этилацетатные слои отбрасывали. pH водной фазы корректировали путем добавления холодного 2 н. гидроксида натрия (500 мл) и гранул гидроксида натрия. В процессе этой нейтрализации раствор поддерживали при низкой температуре путем добавления холодного этилацетата (1 л). После того как pH водной фазы достигала приблизительно 7, образовалось большое количество белого твердого или маслянистого осадка. Этот осадок собирали с помощью вакуумной фильтрации или декантации и последовательно промывали полунасыщенным карбонатом натрия (2 x 1500 мл), водной (6 x 1500 мл) и этилацетатом (3 x 1500 мл). Полученный продукт осушали в высоком вакууме до получения постоянного веса. Этот продукт может сразу гидролизован без дополнительной очистки.

Nα- Бензилоксикарбонил -D-аланил-β- нафтил-D-аланин. 26.

Водный гидроксид натрия (192 мл, 0,08 г/мл раствора 0,38 М) добавляли к раствору дипептида 25 (около 0,38 М), воды (360 мл) и MeOH (около 6 л). Раствор размешивали при комнатной температуре до тех пор, пока не завершится гидролиз (около 24 часов). Исчезновение исходного пептида устанавливали с помощью ВЭЖХ-анализа. Раствор концентрировали в вакууме, в результате чего получали остаток, который растворяли в воде (около 1 л). Водный слой (pH ок. 10) затем экстрагировали этилацетатом (2 x 500 мл) в разделительной воронке. Этилацетатные слои отбрасывали. pH полученной водной фазы доводили примерно до 5 путем добавления концентрированной HCl; при этом, в момент добавления образовывался белый твердый или маслянистый осадок. Этот осадок собирали и осушали в вакууме.

Метиловый эфир Nα- Бензилоксикарбонил-D-аланил-D-бета- нафтил-аланил-аланин. 20.

Дипептид Nα- бензилоксикарбонил-D-аланил-D-бета-нафтил-аланин (26, 0,253 М) добавляли к раствору HONSu (23, 0,505 М) в ДМФ (800 мл) в атмосфере аргона. К полученному раствору добавляли смесь гидрохлорида метилового сложного эфира аланина (15, 0,303 М) N-метилморфолина (16, 0,303 М) и ДМФ (200 мл). Полученный раствор охлаждали до 10^oC и во время охлаждения добавляли дициклогексилкарбодиимид (24, 0,265 М) в метиленхлориде (27% мл). За ходом реакции следили с помощью ВЭЖХ, причем температуру реакции поддерживали при 10^oC до тех пор, пока реакция не завершится. Если через несколько дней (ок. 4) реакция не завершилась, то добавляли еще некоторое количество 24 (0,080 М), и реакционную смесь оставляли еще на день при 10^oC и при размешивании. При этом реакцию снова контролировали с помощью ВЭЖХ-анализа до тех пор, пока она не завершится (обычно, около 5 дней). Твердые вещества, образованные в процессе реакции, собирали путем вакуумной фильтрации. Затем фильтрат концентрировали в вакууме. Полученный остаток растворяли в этилацетате и экстрагировали полунасыщенным водным Na₂CO₃ (2 x 500 мл). Этилацетатную фазу осушали сульфатом магния. Полученный раствор осветляли и концентрировали в вакууме.

2 н. водный раствор гидроксида натрия (7,5 мл, 15 мМ) добавляли к метанолу (500 мл) и водному раствору (200 мл), содержащему Nα- Бензилоксикарбонил-DAla -DβNal-Ala-OMe (13,7 мМ). Реакцию размешивали в течение ночи при комнатной температуре, после чего проводили ВЭЖХ-анализ, который позволял определить количество оставшегося исходного материала. Если реакция была, в основном, завершена (напр., в течение ночи), то полученный раствор концентрировали в вакууме примерно до объема в 200 мл. Затем добавляли воду (100 мл), и посредством добавления 2 н. гидроксида натрия (1 мл) доводили pH приблизительно до 12. Полученный раствор экстрагировали этилацетатом (2 x 500 мл). Этилацетатные слои отбрасывали. После этого pH водной фазы доводили примерно до 5 путем добавления водного раствора HCl, в процессе которого образовывался осадок продукта. Для стимулирования этого осаждения очень важно минимизировать объем водной фазы. Водную фазу декантировали, а продукт промывали водой (2 x 50 мл). Выделенный продукт осушали в вакууме до получения постоянного веса.

C. Реакция конденсации пептидных фрагментов с образованием гексапептида
Два пептида DAla-DβNal-Ala-OH (33, 2,6 мМ) и Trp-D-Phe-Lys (Boc) - NH₂ (13, 2,8 мМ) растворяли в безводном ДМФ, и полученный раствор концентрировали в вакууме. Это предварительное концентрирование осуществляли в целях удаления любых присутствующих следовых количеств метанола. Полученную пептидную смесь снова растворяли в ДМФ, а затем добавляли N-гидроксисукцинимид (5,1 мМ). После этого полученный раствор охлаждали до температуры -2^oC и добавляли раствор дициклогексилкарбодиимида (3,4 М) в метиленхлориде (3,5 мл). Реакционную смесь оставляли размешиваться при -2^oC в течение трех дней. Для определения факта завершения реакции использовали ВЭЖХ-анализ. Если по истечении указанного времени реакция не была завершена, то добавляли дополнительное количество дициклогексилкарбодиимида, а реакционную смесь оставляли при размешивании еще на один день (при -2^oC). Если и на следующий день (всего четыре дня) реакция не была завершена (на что указывал ВЭЖХ-анализ), то реакцию завершали путем охлаждения реакционной смеси. Температуру реакционного раствора медленно повышали до комнатной температуры (25^oC) в течение нескольких часов (около 8 часов). Полученную реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре для размешивания. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока реакция не завершится. Затем добавляли воду (50 мл) и полученную смесь оставляли для размешивания еще на один день. Затем реакционный раствор фильтровали для удаления дициклогексилмочевины и полученный фильтрат концентрировали в вакууме, в результате чего получали вязкий маслообразный остаток. К тому остатку добавляли этилацетат и полунасыщенный водный раствор карбоната натрия (200 мл). Двухфазную смесь энергично размешивали на роторном испарителе в течение примерно одного часа. Образовавшиеся твердые вещества собирали путем фильтрации на воронке из спеченного стекла. Органическую фазу промывали водой, а затем осушали в вакууме до получения продукта с постоянным весом.

DAla-_D-βNal- Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂, 35
Гексапептид бензилоксикарбонил-DAla _D-βNal- Ala-Trp-D-Phe-Lys (Boc) - NH₂ (34, 1,02 мМ) добавляли при комнатной температуре к раствору трифтороуксусной кислоты (30 мл), диметилсульфида (14 мл) 1,2-этандитиола (7 мл) и анизола (2,2 мл) в метиленхлориде (15 мл). Гомогенную реакционную смесь оставляли для размешивания на 15 минут. По истечении этого времени к образовавшемуся осадку биологически активного пептидного продукта 35 добавляли безводный простой эфир (450 мл) Этот продукт выделяли путем фильтрации на воронке из спеченного стекла или путем декантации. Полученный продукт растворяли в воде и лиофилизовали. Лиофилизованный продукт может быть затем очищен с помощью хроматографии среднего давления на стеклянной колонке (26 x 460 мм), содержащей (материал для упаковки колонок, С-18, 25-40 нм, иррегулярное сито). После введения пептида в виде водного раствора колонку элюировали (со скоростью потока 9 мл/мин) пологим градиентом (0-25%) метанола в течение 5-20 часов, а затем градиентом метанола 25-55% в течение около 48 часов. Затем концентрацию метанола в градиенте повышали со скоростью 2% в час. В процессе элюирования остаточный растворитель состоял из воды, содержащей 0,2% трифторуксусной кислоты. Полученный продукт (35) идентифицировали с помощью ВЭЖХ и выделяли путем концентрирования соответствующих элюирующих объемов.

Проиллюстрированные выше варианты осуществления настоящего изобретения следует рассматривать как предпочтительные. Однако необходимо иметь в виду, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за рамки нижеприведенной формулы изобретения.

Пример рецептуры 1 (Лиофилизированная форма) (на ампулу)
Компоненты - Количество
Активный полипептид - 25 - 1000 мкг
D-Маннит - 25 мг
Лиофилизацию проводили после растворения компонентов, указанных выше, в воде для инъекции, замораживанием в течение одного часа и последующей сушкой в сублимационном осушителе в течение от 1-3 суток.

Пример рецептуры 2 (Порошок).

(на 1 г порошка)
Компоненты - Количества
Активный полипептид - 2,5 - 40 мг
D-Маннит - Соответствующее количество
Гидроксипропилцеллюлоза - 6 мг
Всего - 1000 мг
Взвешивают активный полипептид и D-Маннит и смешивают. К порошковой смеси добавляют раствор, состоящий из гидроксипропилцеллюлозы и изопропанола, помещают в месильную машину, а затем сушат в лотковой сушилке. Высушенный порошок просеивают и получают готовый порошкообразный полипептид.

Формула изобретения

1. Пептид формулы I
A1-A2-C1-C2-C3-A5, I
где A1 - представляет собой Gly, β-Ala, DАla, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, N-(низший алкил)-аминокарбоновую кислоту, N,N-бис-(низший алкил)-аминокарбоновую кислоту, азолкарбоновую кислоту, или (низший алкил)аминокарбоновую кислоту, где низшая алкильная группа является прямой цепью, имеющей от 2 до около 10 атомов углерода;
A2 представляет собой DTrp, DβNal;
А5 представляет собой A3-A4-A5', A3-A5', A4-A5', или A5', где
(а) А3 является Ala, Gly, DAla, Pro или des Ala;
(b) А4 является Ala, Gly, DAla, Pro, (линейный низший алкил) аминокарбоновой кислотой, или des Ala;
(с) А5 представляет собой Lys (ε-R₁, R₂)-Z, Orn(δ-R₁→ R₂)-L, NH(CH₂)_XN(R₃, R₄), и, если А1 не является His, то А5 может быть также Lys-Z, Orn-Z, или Arg-Z, где R₁ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом Н, R₂ представляет собой низшую алкильную группу или атом Н, но, если R₁ является Н, то R₂ не является Н, а, если R₂ является Н, то R₁ не является Н, R₃ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом Н; R₄ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом Н; Z представляет собой N4 (линейную низшую алкильную группу), N (линейную низшую алкильную группу)₂, О-(линейную С₁-С₃алкильную группу), NH₂ или ОН, где линейная низшая алкильная группа является такой, как она определена выше, Х представляет собой число от 2 до 15,
C1 представляет собой Ala,
С2 представляет собой Trp, Phe или ChxAla,
С3 представляет собой DРhe, DРal или DchxAla,
или органические или неорганические аддитивные соли указанного пептида.

2. Пептид по п.1, где А1 представляет собой Gly, DAla или His.

3. Пептид по п.1, где А1 представляет собой DAla.

4. Пептид по п.1, где А2 представляет собой DTrp или DβNal.
5. Пептид по п.1, где А2 представляет собой DβNal.
6. Пептид по п.1, где А5 представляет собой А3-А4-А5'.

7. Пептид по п.1, где А5 представляет собой А3-А5'.

8. Пептид по п.1, где А5 представляет собой А4-А5'.

9. Пептид по пп.1, 2, 3, 4 или 5, где А5 представляет собой А5'.

10. Пептиды по пп.1, 2, 3, 4 или 5, где C2 представляет собой Trp или Phe.

11. Пептиды по пп. 1, 2, 3, 4, 5, 9 или 10, где С3 представляет собой DPhe.

12. Пептиды по п.10, где С2 представляет собой Trp.

13. Пептиды по п.12, гле С3 представляет собой DРhe.

14. Пептид по п. 1, имеющий формулы: DAla-DβNal-Ala-Trp-DРhe-LysNH₂, DAla-DβNal-Ala-Trp-DРhe-Lys(ε-iPr)NH DAla-DTrp-Ala-Trp-DРhe-Lys(ε-iPr)NH₂, DAla-DTrp-Ala-Trp-DРhe-LysNH₂, DAla-DβNal-Ala-Trp-DРhe-NH(CH₂)₅NH₂, NH₂(CH₂)₅CО-Dβ-Nal-Ala-Trp-DРhe-NH(CH₂)₅NH₂, N₂IMA-DβNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH₂, α,γABL-DβNal-Ala-Phe-DРhe-LysNH₂, DAla-DРhe-Ala-Phe-DРhe-LysNH₂, βAla-His-DβNal-Ala-Phe-DРhe-LysNH₂, N₂IMA-DβNal-Ala-Phe-DРhe-NH-CH_X-NH₂, α,γABU-DβNal--Ala-Phe-DРhe-NH-CH_XNH₂, DAla-DβNal-Ala-Phe-DРhe-LysNH₂, DAla-DβNal-Ala-Trp-DРhe-ArgNH₂, DAla-DβNal-Ala-Phe-DРhe-Arg-NH₂, DAla-DβNal-Ala-ch_xAla-DРhe-LysNH₂, DAla-DβNal-Ala-Рhe-DCh_xAla-LysNH₂ или DAla-DβNal-Ala-Ch_xAla-DCh_xAlaLysNH₂
или их органические или неорганические аддитивные соли.

15. Способ стимулирования высвобождения гормона роста у животных и увеличения его содержания в крови путем введения активного вещества, отличающийся тем, что указанному животному вводят один из пептидов по пп.1, 9 - 12 или 14 в количестве 0,1 - 1200 мкг/кг веса.

16. Фармацевтическая композиция, стимулирующая высвобождение гормона роста, включающая активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит соединение по п.1 в количестве 0,1-1200 мкг/кг веса.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый носитель представляет собой изотенический раствор.

18. Способ стимулирования высвобождения гормона роста и увеличения его содержания в крови путем введения активного вещества, отличающийся тем, что вводят пептид по п.1 вместе с природным фактором высвобождения гормона роста и его функциональными эквивалентами или с соединением, которое стимулирует высвобождение гормона роста.

19. Способ получения соединений формулы I по п.1, отличающийся тем, что осуществляют твердофазный синтез указанных пептидов путем присоединения аминокислот или производных аминокислот, входящих в состав этих пептидов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17