Способ получения вакцины, способ получения свободной от клеток вакцины, способ культивирования клеток, питательная среда

 

Изобретение относится к получению живой аттенуированной вакцины на основе внеклеточного вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (VZV) и может быть использовано в биотехнологии и иммунологии. Культивирование монослойных культур в обогащенной липидными добавками среде позволяет повысить выход вирусных бляшкообразующих единиц и вирусного антигена. При использовании стандартных сосудов для культивирования плотность клеток достигает 500000 кл. /см². Оптимизация условий культивирования позволяет увеличить продуцирование вирусной вакцины. 4 с.и 8 з.п.ф-лы, 8 табл.,5 ил.

Вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая (VZV) вызывает ветряную оспу и опоясывающий лишай (опоясывающий герпес). Ветряная оспа является высокоинфекционным заболеванием, которое поражает индивидуумов, не обладающих иммунитетом против VZV. Более чем 90% населения заболевает этой болезнью в течение первых двух десятилетий своей жизни. Это заболевание трудно поддается лечению у людей с пониженным иммунитетом и у взрослых людей. В большинстве случаев, VZV становится патентным в клетках спинномозгового ганглия. Опоясывающий герпес как тяжелое хроническое заболевание возникает при реактивации вируса VZV из его патентного состояния.

В целях профилактики заболеваний ветряной оспой предусматривается проведение мероприятий по всеобщей вакцинации детей с использованием живого аттенуированного вакционного вируса ветряной оспы. В предыдущих работах сообщалось о размножении вируса VZV в различных системах клеточных культур, а также об использовании живого аттенуированного внеклеточного VZV в качестве вакцины. В патенте США 3985615 описывается продуцирование в первичных эмбриональных клетках морской свинки аттенуированного штамма Ока вируса VZV, подходящего для использования в качестве стабилизатора вакцины. В литературе также описаны композиции для поддержания жизнеспособного VZV, например, SPGA. В патенте США N 4000256 описан метод получения вакцины против вируса varicella zoster путем выращивания вируса в клетках WI-38 и MRC-5 в среде EBME с использованием сахарозы в стабилизирующем растворе, который добавляется до сбора вируса, т.е. после инфекции.

В отличие от способа, описанного в патенте США N 4000256 в настоящем изобретении сахароза или любой другой неметаболизируемый дисахарид используется до инфекции. Также в указанном патенте не описано использование хлорида аммония или хлорквина в физиологическом буфере для отмывания клеток, инфицированных вирусом varicella zoster.

Основным недостатком промышленного получения VZV-вакцины является ограниченный выход внеклеточного VZV из систем клеточных культур, известных специалистам. Выход внеклеточного вируса VZV может быть увеличен примерно в 5-20 раз при использовании нового способа настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу продукции аттенуированной вакцины с использованием внеклеточного вируса VZV с высоким выходом.

Специалистам известно, что метод с использованием монослойной культуры клеток обычно дает около 80000 - 160000 кл/см² (Mann, Dev. Biol. Stand 37, 149-152 (1977); Wood и Minor, Biological 18, 143-146 (1990)). Использование монослойных клеточных культур для продукции вирусных антигенов имеет тот недостаток, что культивирование этих монослойных культур может быть осуществлено с ограниченной плотностью.

Попытки увеличения плотности клеточных культур, предпринимаемые ранее, привели к использованию специальных сосудов для перфузионных культур, в результате чего максимальная плотность клеток достигала около 1·10⁶ кл./см² (Mann, Dev. Biol. Stand. 37, 149-152 (1977). В настоящем изобретении предлагается уникальный метод увеличения клеточного выхода с использованием уже существующих систем клеточных культур.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток с получением гораздо более высокой плотности, чем это было возможно до сих пор, и тем самым с получением более высокого выхода вируса, культивируемого на монослоях клеток, и используемого для продуцирования вакцины.

Настоящее изобретение относится к новому способу культивирования монослоя клеток и к новой композиции, используемой в этом способе. Для осуществления данного способа необходимо использование обогащенной культуральной среды (в противоположность минимальной среде) и добавление к данной обогащенной среде оптимизированной концентрации липида. В соответствии с настоящим изобретением использование новой культуральной среды, включающей среду SRFE-2, дополненную соевым липидом в концентрации примерно 0,02-0,4 г/мл, дает возможность значительно увеличить плотность монослойной клеточной культуры. Увеличение плотности монослойной клеточной культуры позволяет в свою очередь увеличить эффективность продуцирования вирусных антигенов для изготовления противовирусной вакцины.

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования больших количеств живой аттенуированной вакцины с использованием внеклеточного вируса VZV в целях профилактики заболеваний ветряной оспы, заключающемуся в оптимальном размножении вируса VZV в клеточной культуре с последующим сбором этого вируса в условиях максимизации выхода и стабильности VZV. Указанный оптимизированный способ включает в себя следующие стадии: a) культивирование клеток, восприимчивых к VZV-инфекции и выбранных из диплоидных клеток человека, таких, как MRC-5, в монослойной культуре до состояния сплошности с использованием больших объемов культуры или обогащенной культуральной среды, и с добавлением неметаболизируемого дисахарида, такого, как сахароза; b) инфицирование клеток, культивированных, как описано в стадии (a), до состояния, по возможности, наиболее близкого к состоянию сплошности, с использованием VZV-инфицированных клеток с высокой множественностью заражения; c) выдерживание VZV-инфицированной культуры в высокопитательной среде в течение 22-96 часов с последующим образом клеток, продуцирующих максимальный уровень VZV; d) промывание VZV-инфицированной культуры физиологическим раствором, необязательно содержащим лизосомотропный агент, такой, как хлорид аммония или хлорхин, с последующим сбором VZV-инфицированных клеток; e) введение собранных VZV-инфицированных клеток в минимальный объем стабилизирующего раствора с последующим немедленным лизисом клеток, либо замораживанием этих клеток с последующим их лизисом; f) осуществление лизиса VZV-инфицированных клеток в целях оптимального высвобождения ассоциированного с клетками вируса VZV с последующим удалением клеточного дебриса и получением препарата внеклеточного VZV.

На фиг. 1 проиллюстрирован выход VZV-PFU в среде, дополненной сахарозой; на фиг. 2 - выход внеклеточного VZV-антигена; на фиг. 3 - стабильность вируса VZV в PGA-стабилизаторе при -20 или 4^oC; на фиг. 4 - выход VZV-PFU, достигаемый с использованием других культуральных сред;
на фиг. 5 проиллюстрировано влияние исходной клеточно-ассоциированной MOI на выходы внеклеточного VZV.

Настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток в монослойной культуре.

Целью настоящего изобретения является увеличение плотности клеток в клеточной культуре.

Эта цель может быть достигнута путем использования обогащенной культуральной среды, дополненной липидом в оптимальных концентрациях. В соответствии с настоящим изобретением культивирование монослойных культур в композиции "среда - липид" позволяет значительно повысить выход вирусных бляшкообразующих единиц (PFU) или увеличить продуцирование вирусного антигена. Так, например, способ культивирования клеточных культур настоящего изобретения может быть использован для продуцирования вакцин против вируса гепатита A, вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая, краснухи, ротавируса, вируса кори, вируса полиомиелита, вируса свинки и др.

Предпочтительной обогащенной средой для использования в способе настоящего изобретения является SRFE-2 (коммерческий продукт от SIGMA Chemical Co., St. Loiis MO, 2138 от Serva Fine Chemical, Heildelberg, Germany 47523). Эта среда описана Weiss и др. [In vitro 16(7), 616-628 (1980)]. Другие эквивалентные среды или небольшие изменения в составе среды SRFE-2, используемые способом, аналогичным способу, описанному в настоящей заявке, являются естественным дополнением к настоящему изобретению.

В целях настоящего изобретения могут быть использованы любые липидные добавки. Было установлено, что предпочтительными добавками к обогащенной среде являются, например, липиды с высоким содержанием холестерина из сыворотки взрослого быка (SIGMA CHEMICAL CO. каталог N L-4646), липид 1 EX-CYTE или липид с очень низким содержанием эндотоксина (VLE) (MILES Inc., каталог N 82-004-7-8 и 82-019-1). Предпочтительной липидной добавкой является соевый липидный экстракт, поставляемый Boehringer Mannheim BioChemical, Indianapolis 1N каталог # 1074 482. Этот материал или аналогичный материал описан Iscove и Melchers [J. al. Exp Medicine, 147, 923-933 (1979)), в качестве замены сыворотки в культуре B-лимфоцитов. Однако в этих работах и в описании Каталога продуктов Boehringer Mannheim нет каких-либо предположений относительно использования соевой липидной добавки к обогащенной среде. В этих работах липид используется для замены сыворотки в культурах в минимальных средах. В соответствии с настоящим изобретением липид используется в качестве добавки к обогащенной среде. Кроме того, согласно опубликованным источникам, липид используется в концентрации примерно 10-100 мкг/мл. А согласно настоящему изобретению оптимальная концентрация липида в 2-3 раза превышает концентрации, предлагаемые в литературе или используемые производителями. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением липидная добавка может быть использована в дополнение (а не вместо) к сыворотке.

В способе настоящего изобретения клетки MRC-5, клетки WI-38, клетки Vero или другие клетки, обычно используемые для размножения вируса, засевают в сосуд для культивирования. Начальную фазу культивирования клеток проводят либо в минимальной среде, известной специалистам как EMEM или EBME, либо в обогащенной среде, такой, как SRFE-2-среда без липидной добавки. Для лучшего эффекта в эту среду может быть также добавлено около 10% плодной телячьей сыворотки (FCS), антибиотик, такой, как неомицин (около 50 мкг/мл) и L-глутамин (около 2 мМ). Клетки культивируют в течение нескольких дней при температуре, благоприятной для клетки и вируса и составляющей обычно около 34-37^oC, а предпочтительно около 35^oC в зависимости от продуцируемого вируса.

После явного прилипания и разрастания клеток в монослойной культуре минимальную или обогащенную среду удаляют и заменяют свежей обогащенной средой, дополненной оптимизированной концентрацией липида.

После второй стадии культивирования среда может быть снова удалена и заменена свежей обогащенной средой, не содержащей липидной добавки. Было установлено, что добавление липида после того, как клетки слиплись или достигли сплошности, оказывает обратное действие, уменьшая максимальный выход клеток.

В том случае, когда культивированные в монослойной культуре клетки инфицируют вирусным инокулятом, липидную добавку удаляют, а вирусный сток вводят в свежую партию обогащенной среды. Отсутствие липида в этой свежей среде способствует свободному росту клеток, не затрудненному вышеуказанными ограничениями.

При культивировании в соответствии с вышеуказанным способом достигаются значительные увеличение клеток и выход вируса. Так, например, при культивировании на клетках MRC-5 достигается значительное увеличение выхода PFU-VZV по сравнению с культивированием этих клеток в минимальной среде или в одной SRFE-2-среде. Аналогично, клетки WI-38, используемые для индуцирования роста вируса ветряной оспы или вируса краснухи, разрастаются до значительно большей плотности, если их культивировать в соответствии с новым способом настоящего изобретения.

В целях продуцирования конкретной вакцины новый способ настоящего изобретения предусматривает размножение VZV в клеточной культуре с последующим сбором полученного вируса в соответствии с условиями, оптимальными для выхода вируса и его стабильности. Преимущества способа настоящего изобретения в отношении продуцирования VZV относятся также к продуцированию и других оболочечных вирусов, включая другие вирусы герпеса, вирус кори, вирус свинки (инфекционного паротита) или вирус краснухи.

Конечной целью настоящего изобретения является разработка способа эффективного продуцирования VZV с последующим его использованием в качестве вакцины. Эффективность этого способа определяется клеточным выходом внеклеточного вируса, достигаемым при оптимизации каждой стадии рассматриваемого способа. Выход оценивают посредством титра инфекционности конечного препарата внеклеточного VZV. Титры инфекционности препаратов вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (VZV) были получены с помощью процедуры с использованием верхнего агарозного слоя или жидкого верхнего слоя, описанной Krah и др. (J. Virol. Methods, 1990, 27: 319-326). Вкратце этот метод заключается в культивировании клеток MRC-5, восприимчивых к VZV-инфекции, до стадии активной репликации, то есть до той стадии, когда клетки достигают примерно 50-80% сплошности. После этого вирус наносят поверх клеточного монослоя в минимальном объеме, выдерживают некоторое время для прикрепления этого вируса к клеткам, а затем добавляют дополнительную ростовую среду. После культивирования в течение нескольких дней, клетки обрабатывают белковым красителем, и подсчитывают светлые области, бляшки. Так, например, для известного объема вирусного инокулята, число бляшкообразующих единиц (PFU) на один миллилитр представляет собой хороший параметр для оценки выхода вируса. При этом, может быть вычислено полное число PFU путем умножения данного числа PFU на полный объем внеклеточного вируса, полученного из любого конкретного вирусного препарата.

Вследствие вариабельности самих оценок, увеличение числа PFU, полученное с помощью любой оптимизации конкретного способа, определяется как отношение к числу PFU, полученному в несколько менее оптимизированной стадии процесса. Такое определение степени увеличения выхода вируса сводит к нулю любое разногласие в оценках PFU. И наконец, стадии способа, описанного в настоящей заявке, в целом, приводят примерно к 16-20-кратному увеличению выхода VZV по сравнению с выходами VZV, достигаемыми с использованием известных методов. О такой степени увеличения выхода вируса в литературе нигде не сообщается, а поэтому способ настоящего изобретения является ценным вкладом в область продуцирования VZV-вакцины.

Вследствие того, что оценка VZV-бляшек требует определенного времени, осуществлять текущий контроль, в этом случае не представляется возможным. Быстрый ELISA-анализ VZV-антигена дает возможность измерять количества VZV-антигена, и тем самым контролировать рост вируса в процессе изготовления живой вакцины против ветряной оспы. Кроме того, этот тест может быть использован для оценки количеств VZV-антигена в осветленной и обработанной ультразвуком вакцинной массе, а также для возможного измерения антигена в сосудах, заполненных лиофилизованной вакционной массой. Короче говоря, этот анализ проводят путем инкубирования VZV-антигена, взятого из испытуемых образцов, с сывороткой против VZV в растворе. Оставшееся свободное антитело подвергают связыванию с VZV-антигеном, иммобилизованным на ELISA-планшетах для микротитрования. Количество антитела, способного связываться с планшетами, в основном, пропорционально количеству антигена в испытуемом образце. Количественную оценку антитела, связывающегося с планшетами, осуществляют с помощью реакции с античеловеческим ферментно-связанным антителом и соответствующим субстратом в целях получения окрашенного продукта, который может быть подвергнут спектрофотометрической количественной оценке.

В результате ELISA-анализа на VZV-антиген и оценочного анализа VZV-бляшек, в основном, получают коррелированные данные, однако, эти данные также нуждаются в коррекции, так как анализ на VZV-антиген обнаруживает как "живой", так и "неживой" вирус. Поскольку, как было установлено, иммунный ответ, генерированный убитым вирусом, является не таким эффективным, как ответ, генерированный живым аттенуированным вирусом, то оценка бляшек является критическим анализом для определения дозы вирусного инокулята, необходимой для продуцирования VZV-вакцины. Однако, анализ на антиген является важным потому, что он дает данные относительно полной загрузки антигеном, вводимым реципиенту в виде VZV-вакцины; он является более быстрым, чем PFU-анализ, и, следовательно, позволяет осуществлять контроль в процессе VZV-продуцирования; и кроме того, он коррелирует, по крайней мере, с уровнем максимального продуцирования VZV-PFU, что дает возможность определить оптимальное время сбора.

Эффективность способа настоящего изобретения заключается в инкрементальном увеличении (т. е. увеличении путем последовательных приращений - прим. пер.) каждого из нижеописанных критических параметров, которые входят в объем настоящего изобретения:
a. Культивирование восприимчивых к VZV-инфекции клеток, выбранных из диплоидных клеток человека, таких, как MRC-5, в монослойной культуре до состояния сплошности с использованием больших объемов культуры или обогащенной культуральной среды в целях достижения высокого уровня клеточной репликации, и с добавлением неметаболизируемого дисахарида, такого, как сахароза:
Для продуцирования VZV может быть использована любая из известных систем для культивирования клеток, которые обычно используются в таких случаях. Так, например, для этих целей могут быть использованы клетки Vero, клетки WI-38, клетки MRC-5 и ряд других клеток. В настоящей работе, мы использовали, в основном, клетки MRC-5, которые являются подходящими для изготовления вакцины, предназначенной для введения человеку. Однако, если при использовании другой продуктивной клеточной линии вместо MRC-5, выходы внеклеточного VZV будут превышать достигнутые в настоящей работе уровни. Исходя из того, что такая клеточная линия может быть адаптирована к рассматриваемому способу, настоящее изобретение также включает применение этого способа к клеткам такого рода.

Сравнение выходов внеклеточного живого вируса в субконфлюентных либо в конфлюентных монослоях MRC-5-клеток, инкубированных при 35^oC, в атмосфере 5% CO₂ в минимальной среде Игла (EMEM), содержащей 2 или 10% околоплодной сыворотки теленка (FCS), показало, что степень конфлюентности клеток влияет на выход PFU внеклеточного вируса VZV (см. пример 2, табл.1).

Использование конфлюентных клеточных монослоев дает примерно 2-3-кратное увеличение выхода внеклеточных PFU/мл по сравнению с выходом, получаемым путем инфицирования субконфлюентных монослоев независимо от того, происходит ли активная пролиферация субконфлюентных культур (10% сыворотки) или нет (2% сыворотки). Отсюда следует, что для повышения VZV-выходов в процессе получения вакцины, очевидно, необходимо использовать конфлюентные, а не активно пролиферирующие клетки.

Процентное содержание околоплодной сыворотки теленка, используемое в процессе наращивания вируса, очевидно не имеет большого значения для выхода внеклеточных PFU. Так, например, обычно во время фазы роста клеток FCS присутствует в количестве около 10%, а во время фазы наращивания вируса данного процесса FCS присутствует в количестве около 2%, независимо от того, используется ли для культивирования клеток и вируса минимальная среда, такая, как EMEM или EBME, либо обогащенная среда, такая, как SRFE-2.

Помимо FCS и среды (обычно среды, содержащей антибиотик, например 50 мкг/мл неомицина), к клеточной культуре и к средам для роста вируса добавляют глутамин (около 2 мМ).

1. Фаза посева клеток.

В сосуды для клеточных культур (колбы, вращающиеся флаконы (роллер-флаконы) или емкости, функционально эквивалентные этим сосудам), засевали клетки MRC-5 или другие диплоидные клетки, так, чтобы их начальная концентрация составляла от около 10000 до около 40000 кл./см². Эти клетки подкармливали питательной средой, дополнительной примерно 10% околоплодной телячьей сывороткой, газообразным 5% CO₂ и инкубировали при около 30-37^oC, а предпочтительно при 35^oC.

Эти клетки могут быть засеяны по возможности в небольшой объем, необходимый для полного покрытия клеток, растущих в стационарной культуре. Подходящее для работы отношение объема к поверхностной площади составляет около 0,5 мл культуральной среды на 1 см² поверхности ростовой культуры. Если клетки культивируют в роллер-флаконах, то адекватным уже является отношение 125 мл на 850 см², но предпочтительным является 425 мл/см².

В фазе посева клеток могут быть использованы коммерчески доступные минимальные среды, которые обычно применяют для клеточных культур, например, такие, как минимальная среда Игла (EMEM) или базальная среда Игла, дополненная солями Earle (EBME), и которые могут содержать около 10% FCS. Альтернативно, для эффективного осуществления этой фазы может быть использована более обогащенная среда. Например, для этой стадии может быть использована среда SRFE [Weiss и др., In vitro 16(7), 616-628 (1980)], поставляемая SIGMA, которая является обогащенной, однако, на этой стадии не имеет большого значения, является ли эта среда обогащенной или нет.

2. Стадия культивирования клеток.

На этой стадии способа настоящего изобретения очень важно, чтобы было обеспечено достаточное питание для достижения клетками высокой степени сплошности. Это может быть достигнуто при использовании большого объема минимальной среды или меньшего объема обогащенной среды. Клетки культивируют примерно при температуре 30-37^oC, а предпочтительно при температуре около 32-35^oC.

По прошествии определенного периода времени, адекватного для прилипания клеток и их роста, среда может быть удалена и заменена новой, после чего инкубирование может быть продолжено. Среда может быть удалена путем отсасывания или декантирования, либо какими-нибудь другими способами так, чтобы целостность клеточного монослоя не была нарушена. Для клеток MRC-5, засеянных как описано выше, подпитывание может быть осуществлено через 72 часа после введения клеток в сосуд для культивирования.

Объем культуральной среды может быть таким же, как и объем, используемый в стадии посева клеток. Однако предпочтительно, чтобы в стадии культивирования клеток был использован больше объем, чем в стадии посева. Это особенно важно, если клетки культивируют в минимальной среде, такой, как EMEM или EBME, содержащей FCS. Использование большого объема для культивирования является одним из способов, благодаря которому клетки получают адекватное питание.

Требования к использованию большого объема могут быть несколько снижены, если в стадии культивирования используется обогащенная среда. Для этих целей, особенно предпочтительно использовать среду SRFE-2 (SIGMA). Использование на этой стадии вместо минимальной среды обогащенной среды способствует значительному увеличению плотности клеточного монослоя при конфлюентности. Увеличение клеточной плотности влечет за собой увеличение выхода VZV, получаемого от инфицированной клеточной культуры, выращиваемой в обогащенной среде. Так, например, использование обогащенной среды во время стадии культивирования клеток дает примерно 2-4-кратное увеличение конечного выхода VZV по сравнению с выходом, достигаемым при культивировании этих клеток в минимальных средах.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения среду SRFE-2 дополняют липидом. В данном случае может быть использована любая из известных липидных добавок. Так, например, было установлено, что подходящими добавками для обогащенной или минимальной среды могут служить липиды с высоким содержанием холестерина, полученные из сыворотки взрослого быка (SIGMA CHEMICAL CO. ); липид EXCYTE 1; или липид с очень низким содержанием эндотоксина (VLE) (MILES). Коммерчески доступный соевый липид, взятый в концентрации около 0,2 мг/мл (Boehringer Mannheimm, см. также Iscove и др., J. Exp. Med. 147, 923-933 (1978) также является очень эффективной добавкой. С использованием среды SRFE-2 + липид и FCS были достигнуты плотности порядка около 500000/см². При этом использование липида, независимо от того добавлялся ли он к минимальной среде или обогащенной среде, давало увеличение выхода VZV. Коммерчески доступный материал поставлялся как 20 мг/мл липида, 100 мг/мл маточного раствора альбумина бычьей сыворотки. Этот материала обычно использовали при конечном разведении 1:100. При этом конечный выход VZV увеличивался в 9 раз по сравнению с выходом VZV, достигаемым с использованием лишь одной EMEM; и примерно в 3,3 раза по сравнению с выходом VZV, достигаемым с использованием лишь одной среды SRFE-2, в том случае, когда во время стадии культивирования использовали среду SRFE-2, дополненную примерно 0,2 мг/мл осевого липида.

3. Прединфекционная стадия.

Нами было установлено, что конечный выход VZV может быть еще более увеличен, если культивированные клетки перед их VZV-инфицированием обработать неметаболизируемым нетоксичным дисахаридом в оптимальной концентрации. Для большей эффективности предпочтительно вводить около 20-60 мМ сахарозы примерно через 72 часа после внесения клеток в сосуд для культивирования, а более предпочтительно примерно за 24-96 часов до VZV-инфицирования культуры. Фактически вышеуказанным критериям соответствует использование 50 мМ сахарозы в подпитывающей среде в стадии 2, в результате чего снижается число стерильных манипуляций, необходимых для эффективного осуществления этой и предыдущих стадий.

Другие дисахариды, включая лактозу, целлюлозу и мальтозу также способствуют повышению конечного выхода VZV, однако предпочтительней использовать сахарозу. Такие моносахариды, как фруктоза и рибоза не увеличивают выхода VZV (рибоза может быть даже токсичной). Было установлено, что дисахариды, концентрируясь в лизосомах растущих клеток, способствуют набуханию этих лизосом с образованием вакуолей De Courcy и Storrie, Exp. Cell. Res. 192, 52-60 (1991). Действие этого дисахарида на выход VZV может быть обусловлено ослаблением лизосомного разрушения VZV. Помимо добавления дисахаридов, по-видимому, хороший эффект может дать добавление три- и тетрасахаридов, поскольку, как было отмечено Cohn и Ehrenreich [J. Exp. Med. 129, 201-222 (1969)] , добавление этих высших сахаров или сахарозы к макрофагам для подпитки вызывает идентичную вакуолизацию, если только эти сахара не метаболизируются клетками.

Инфицирование клеток, культивированных как описано в стадии (a), до состояния, по возможности, наиболее близкого к состоянию сплошности, с использованием VZV-инфицированных клеток с высокой множественностью заражения.

С помощью нескольких экспериментов было обнаружено, что в среднем клетки, выдержанные в течение 48 часов после достижения ими стадии сплошности, давали выход, составляющий лишь около 50% VZV-PFU/мл, по сравнению с выходом, который может быть получен, если конфлюентные клетки инфицировать вирусом VZV. Так, например, в этом случае очень важно, чтобы введение PFU-инокулята осуществлялось на стадии, как можно более близкой к стадии сплошности клеток. К сожалению, сплошности представляет собой параметр, который зависит от типа используемой среды, типа культивируемых клеток и других используемых условий культивирования. В случае клеток MRC-5, культивируемых в соответствии с вышеприведенным описанием стадии (a) (1), инфицирование обычно проводят на стадии достижения этими клетками состояния сплошности.

В качестве вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (VZV) используют предпочтительно штамм Ока аттенуированного вируса, описанного в патенте США 3985615 и депонированного ATCC. Этот вирус был адаптирован для выращивания в клеточных культурах эмбриональных клеток морской свинки и в клеточных культурах диплоидных фибробластов легких человека (например, клетки MRC-5).

Исходная культура инфекционных жизнеспособных и инфицированных вирусом ветряной оспы клеток может быть получена путем инфицирования клеток MRC-5 при множественности заражения, составляющей около 1:125, с последующим выдерживанием инфицированных клеток для репликации вируса, а также трипсинизацией этих клеток и немедленным использованием выделенных клеток для посева, либо их сохранением для последующего использования и количественной оценки PFU путем медленного замораживания с использованием криоконсерванта, такого, как ДМСО или глицерин, при плотности около 10⁷ кл./мл. Замороженный VZV-инфицированный клеточный сток оттаивают и добавляют к конфлюентной клеточной культуре для инициации VZV-инфекции.

Альтернативно VZV-инфицированные клетки могут быть лиофилизованы методом, описанным Hondo и др. [Archiv fur die gesamte Virusforschungg 40, 397-399 (1973)], который дает возможность хранить лиофилизованный инокулят в течение длительного периода времени при 4^oC. В качестве инокулята можно также использовать внеклеточный VZV, однако это приводит к потерям выхода вируса после сбора, а поэтому предпочтительней использовать инокулят вируса, связанного с клетками.

Существует и другая возможность получения вирус-инфицированного посевного материала, которая заключается в инициации клеточного роста для продуцирования вирусного посевного материала перед продуцированием клеток для посева. На стадии инфицирования посевных клеток VZV-инфицированными клетками для достижения состояния конфлюэнтности посев продуктивных клеток можно начинать в то время, когда VZV-титры вирусного посевного материала достигнут пика. В менее оптимальном, но зато более удобном варианте посевной клеточный материал и разросшиеся клетки могут быть посеяны одновременно в небольшом объеме культуральной среды (около 125 мл на 850 см² роллер-флакона). После примерно 2-дневного культивирования для продуцирования VZV-посевного материала объем флаконов увеличивали примерно до 425 мл, либо проводили подпитку обогащенной средой для достижения состояния сплошности. Затем продуктивные клетки оставляли в относительно покоящемся состоянии в небольшом объеме минимальной среды (содержащей около 10% FCS) на период, который оканчивался примерно за два дня до инфицирования посевного клеточного материала VZV-инфицированными клетками. На этой стадии объем продуцирования клеток повышают примерно до 425 мл или осуществляют подпитку обогащенной средой, такой, как SRFE-2 + оптимальное количество соевого липида и околоплодной телячьей сыворотки. После этого продуктивные клетки культивируют до высокой степени конфлюэнтности. Через два дня продуктивные клетки (рабочий посевной материал) уже в состоянии сплошности (конфлюэнтности) инфицируют VZV-инфицированными клетками при множественности заражения 1:125 или выше, после чего для репликации VZV культивирование продолжают в течение 2-3 дней. К этому времени продуцирование VZV в посевных культурах достигает своего пика, причем продуктивные клетки достигают состояния сплошности. После этого посевной клеточный материал собирают и добавляют к продуктивным клеткам.

Независимо от времени продуцирования посевного материала, по истечении соответствующего периода времени после VZV-инфицирования среду удаляют из VZV-инфицированной посевной культуре, VZV-инфицированный материал собирают путем трипсинизации (около 0,25% трипсина) или с помощью какого-либо другого не разрушающего клетки способа, и продуктивные клеточные культуры инфицируют при известной множественности заражения (MOI).

Schmidt N.S. и Lennette E.H. (Infection and Immunity 14, 709-715 (1976) отмечали важность высокой MOI для получения высокого выхода VZV, но при этом они не проводили каких-либо конкретных сравнений с использованием низких значений MOI. В настоящем изобретении были проведены точные сравнения.

Клетки инфицировали вирусом VZV путем удаления культуральной среды из клеточных культур и ее замены свежей средой, содержащей известное количество VZV-инфицированных клеток, полученный как описано выше. Вирусный препарат предпочтительно титровали на бляшкообразующие единицы вируса ветряной оспы (PFU), и для количественной оценки множественности инфекции (MOI) подсчитывали число реципиентных клеток, MOI выражали как отношение VZV-инфицированных клеток в инокуляте к числу неинфицированных монослойных клеток в культуре. Так, например, величина MOI = 1:10 является высокой, а 1:625 - низкой. Высокое значение MOI является предпочтительным, но лишь в практическом смысле, поскольку хорошие выходы VZV могут быть достигнуты и при MOI = 1:125.

В диапазоне значений MOI = 1:7 - 1:625 выходы составляют от около 500000 PFU/мл (при самом высоком MOI) до около 100000 PFU/мл (при самом низком MOI) (см. табл. 3, пример 5). Чем выше MOI, тем меньшее время инкубирования потребуется для достижения пика PFU и получения более высокого выхода. Так, например, в зависимости от величины MOI и времени сбора может быть достигнуто 5-кратное увеличение конечного количества PFU.

Поддержание VZV-инфицированной культуры в высокопитательной среде в течение 22-96 часов и сбор на стадии максимального продуцирования VZV.

Культивирование VZV-инфицированных клеток продолжали приблизительно 22-96 после инфицирования. При этом очень важно, чтобы на этой стадии роста вируса обеспечивалось адекватное питание. Для этого предпочтительно использовать либо большие объемы минимальной среды, такой, как EMEM + около 2-10% FCS, либо меньшие объемы обогащенной среды. Наиболее предпочтительно использовать SRFE-2 + 2-10% FCS без добавления липидной добавки. В связи с этим следует отметить, что на этой стадии добавление липида будет способствовать снижению VZV-выхода.

Во время культивирования, проводимого в течение 22-96 часов после инфицирования, VZV реплицируется в инфицированных клетках и распространяется дальше, инфицируя соседние клетки. Однако старые инфицированные клетки не дают экстрагируемых внеклеточных PFS. Кривая роста VZV и последующий спад могут быть очень резкими. Поэтому для максимизации выхода инфекционного VZV очень важно правильно выбрать время сбора, которое может быть точно установлено путем постоянного контроля за входным MOI, питанием и временем инкубирования от одной партии продуцирования до другой партии продуцирования. Кроме того, для оптимизации времени сбора может быть использован быстрый ELISA-анализ на VZV-антиген, поскольку продуцирование инфекционного VZV коррелирует с продуцированием VZV-антигена по крайней мере до того момента, когда начинается гибель вируса (см. фиг. 5 и 6).

Для VZV-инфицированных клеток MRC-5, собранных через 72 часа после инфицирования, где каждая из предыдущих стадий была оптимизирована (т.е. культивирование в обогащенной среде, и прединфекционное экспонирование клеток 50 миллилитрами сахарозы в течение 72 часов), конечный выход внеклеточного возрастает примерно в 16 раз по сравнению с выходом, получаемым с использованием минимальной среды при сборе через 48 часов и даже превышает выход, получаемый при сборе через 96 часов (см. пример 8, фиг. 1). При тех же самых оптимизированных условиях выход VZV примерно лишь в 4 раза превышает выход, полученный в минимальной среде и при сборе через 48 часов после инфекции; и несколько больше он превышает выход, полученный в минимальной среде и при сборе через 96 часов. Таким образом, выход вируса гораздо выше, а гибель вируса значительно снижается в обогащенной среде, причем во время культивирования в этой среде не наблюдается слишком резкого спада выхода вируса. Кроме того, в обогащенной среде параметр MOI является менее критическим.

Промывание VZV-инфицированных культур физиологическим раствором, необязательно содержащим лизосомотропный агент, такой, как хлорид аммония или хлорхин, до стадии сбора VZV-инфицированных клеток.

Для удаления сыворотки, липида и клеточного дебриса из культуры монослойную культуру промывают физиологическим буфером, который не вызывает лизиса клеток. Для этих целей наиболее предпочтительно использовать забуференный фосфатом физиологический раствор. Клетки могут быть промыты несколько раз, после чего промывочный раствор удаляют путем декантирования, отсасывания, либо каким-либо другим способом, так, чтобы не была нарушена целостность монослоя.

Если клетки подвергаются химическому выделению из сосуда культивирования, то они должны быть концентрированы путем центрифугирования, а физиологический буфер должен быть заменен стабилизирующим раствором.

Было установлено, что для увеличения конечных выходов VZV добавление хлорида аммония или хлорхина должно быть осуществлено до сбора клеток. Kielian и др. [EMBO J. 5, 3108-3109 (1986)] использовали хлорид аммония для контроля внутреннего pH клеточных эндосом, где инфицирующие вирусы, очевидно, проводят определенный период своей внутриклеточной жизни. Возможно, что механизм увеличения выхода VZV после обработки клеток лизосомотропными агентами связан с индуцированием менее неблагоприятного эндосомального окружения. Поэтому прединфекционная загрузка клеток нетоксичными неметаболизируемыми дисахаридами, такими, как сахароза, а также обработка клеток хлоридом или хлорхином могут, очевидно, действовать по аналогичному механизму. В любом случае чисто эмпирические наблюдения подтвердили, что конечные выходы VZV возрастают, если хлорид аммония используют в конечной концентрации, составляющей 1-100 мМ, а более предпочтительно в концентрации 20-50 мМ, при этом предпочтительно, чтобы эта обработка проводилась при 4^oC примерно в течение 25-50 минут до разрушения клеток. Второй лизосомотропный агент, а именно хлорхин, используемый при концентрации около 230 мкМ, также способствует увеличению выхода VZV-PFU/мл.

Сбор VZV-инфицированных клеток в минимальный объем стабилизирующего раствора с последующим либо немедленным разрушением клеток, либо замораживанием этих клеток для их последующего разрушения.

После промывания VZV-инфицированных клеток эти клетки могут быть собраны путем соскоба, если это позволяет сосуд для культивирования, либо они могут быть отделены от сосуда химическими способами. Ферментативное выделение клеток менее желательно, поскольку оставшийся после разрушения клеток фермент может способствовать снижению выхода вируса. Как указывалось выше, в том случае, если клетки высвобождаются в физиологический раствор, то их подвергают концентрированию путем центрифугирования, а физиологический раствор заменяют минимальным объемом VZV-стабилизирующего раствора. Приемлемый объем стабилизатора по отношению к поверхностной площади клеточной культуры составляет около 40 мл стабилизатора на 850 см².

Вирусные стабилизаторы описаны в литературе. Так, например, в патенте США N 3985615 предлагается проводить стабилизацию с использованием 5% сахарозы в забуференном фосфатном физиологическом растворе, тогда, как в других работах рекомендуется использовать все более сложные стабилизаторы, такие, как SPGA.

После ресуспендирования VZV-инфицированных клеток в стабилизирующем растворе эти клетки могут быть подвергнуты немедленному разрушению, либо в случае получения больших количеств VZV клетки могут быть заморожены при -70^oC для последующей обработки. VZV-выход на 1 см² культивированных клеток может быть немного увеличен, если клетки будут разрушены сразу, однако стадия замораживания обычно не дает увеличения в выходе более чем на 10% по отношению к выходу, полученному после непосредственной обработки.

Разрушение VZV-инфицированных клеток для оптимального высвобождения клеточно-ассоциированного VZV и удаление клеточного дебриса для получения внеклеточного.

Как описано выше, предпочтительно, если культуральную среду удаляют из клеток до их разрушения с последующей заменой этой среды минимальным объемом VZV-стабилизатора, в который затем соскребают эти клетки, либо высвобождают каким-нибудь другим способом. Затем клеточную суспензию охлаждают до 0-4^oC, а клетки разрушают подходящим способом, таким, как ультразвуковая обработка, DOUNCE-гомогенизация, либо более масштабным, чем DOUNCE, способом, либо, с использованием комбинации этих способов.

Нами было установлено, что одна лишь обработка ультразвуком не дает значительного выхода внеклеточного VZV. Практически, выход VZV при разрушении клеток может быть значительно увеличен, если DOUNCE-гомогенизацию использовать как начальную стадию разрушения, с последующим проведением центрифугирования; удерживанием супернатанта (как супернатант I); обработкой ультразвуком полученного осадка и центрифугирования этого осадка с получением супернатанта II. Объединенный выход от супернатантов I и II в четыре раза превышал выход, полученный лишь с использованием одной обработки ультразвуком.

После разрушения клеток, клеточный дебрис удаляют путем центрифугирования, фильтрации, либо другими известными способами, которые обычно используют для удаления клеточного дебриса, если только они не оказывают неблагоприятного воздействия на оставшиеся VZV. Затем внеклеточный вирусный препарат разводят стабилизирующим раствором, и разделяют на отдельные партии для использования в качестве вакцины. Для более длительного хранения, VZV предпочтительно лиофилизуют одним из стандартных способов.

Суммируя вышесказанное, можно утверждать, что по сравнению с продуцированием VZV, полученным при культивировании клеток в минимальной среде, потенциальный выход VZV может быть увеличен с использованием следующих оптимизированных стадий способа настоящего изобретения:
Стадия - Краткость увеличения VZV (примерно)
Среда/Добавки
1. MO1 - 2-5
2. Конфлюэнтность клеток - 2-3
3. Среда SRFE-2 + липид - 2-3
4. Сахароза в пред-инфекционной стадии - 2-5
5. Оптимальный объем среды - 1-2
Точное потенциальное увеличение выхода для объединенных добавок среды/стабилизатора, и для оптимизированных условий инфицирования - ≥8
Наблюдаемое увеличение для комбинаций 3, 4 и 5 в роллер-флаконах - 16
6. Объединенные способы механической гомогенизации и обработки ультразвуком для высвобождения клеточно-ассоциированного - 1,5
Полное потенциальное увеличение выхода VZV по сравнению с неоптимизированным способом - ≥18
Использование описанного способа для изготовления вакцины
Ниже проиллюстрировано использование аттенюированного внеклеточного VZV в качестве вакцины для предупреждения ветряной оспы. Множество клинических исследований убедительно доказало эффективность использования такой вакцины, и это доказательство уже прочно заняло свое место в науке [см., например, Pediatric 88 (3), 604-607 (1991); Pediatric 87 (5), 604-610 (1991)]. Таким образом, высокоэффективный способ получения живой аттенюированной вакцины с высоким выходом, раскрытый в настоящей заявке, является неоценимым вкладом в эту область медицины. Вирус VZV, полученный в соответствии с настоящим изобретением, может быть использован для изготовления вакцины известными способами, и введен реципиенту в соответствии с хорошо известной традиционной схемой вакцинации. Например, живой аттенюированный внеклеточный VZV-продукт настоящего изобретения может быть разведен в стабилизаторе, помещен во флаконы, лиофилизован при около 4^oC или ниже, так, чтобы ко времени использования этого продукта, эта доза составляла около 1000 PFU. VZV-вакцина, изготовленная в соответствии со способом настоящего изобретения, может быть использована в виде одноразовых препаратов для введения человеку в целях продуцирования у него иммунозащитный ответ против заражения вирулентными штаммами VZV. Минимальная доза для подкожного или внутримышечного введения, предпочтительно составляет около 2000 PFU/мл (1000PFU на 0,5 мл-дозу). В целом, могут быть использованы дозы 15000-20000 PFU.

Благодаря оптимизации процесса продуцирования аттенюированного VZV, настоящее изобретение позволяет изготавливать вакцину для бустер-иммунизации против вируса ветряной оспы.

Ниже приводятся примеры, иллюстрирующие настоящее изобретение, которые, однако, не должны рассматриваться как некое ограничение его объема.

Пример 1
Анализ для определения выхода
Титры инфекционности препаратов вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (VZV) оценивали с помощью процедуры с использованием верхнего слоя агарозы или верхнего слоя жидкости, которая была описана Krah и др. (J. Virol Methods, 1990, 27: 319-326). Этот анализ осуществляли следующим образом:
Клетки MRC-5 засевали в 60-миллиметровые чашки для культивирования ткани при плотности 6·10⁵ клеток в 5 мл-объемах BME (базальная среда Игла со сбалансированным солевым раствором Хэнкса), содержащей 100 мг/л галактозы, 50 мкг/мл неомицина, 2 мМ L-глутамина; и инкубировали при 35^oC в атмосфере 5% CO₂. После инкубирования в течение 24-48 часов, клетки достигали 50-80% сплошности. Питательную среду удаляли путем отсасывания, а клетки инфицировали 100 микролитрами VZV-раствора, разведенного в соответствующем вирусном разбавителе, таком, как SPGA-буфер, или в жидкой поддерживающей среде (LMM). SPGA-буфер содержит 7,5% (масс./об.) сахарозы, 11 мМ фосфата калия, 0,1% (масс./об.) глутамина натрия, и 1% альбумина сыворотки человека. Вирус оставляли более, чем на 1 час при 35^oC в атмосфере 5% CO₂. Затем VZV-инфицированные клеточные культуры покрывали верхним слоем (5 мл) агарозы (AOM) или жидкой поддерживающей средой (LMM). Верхний слой агарозы является смесью двух растворов, а именно, жидкой верхней среды (LOM) и агарозного раствора. LOM содержит минимальную среду с солями Earle (MEM), 2% термоинактивированную фетальную бычью сыворотку, 50 мкг/мл сульфат неомицина, и 2 мМ L-глутамина. Агарозный раствор получали путем нагревания 4,5 г легкоплавкой агарозы в 100 мл MEM в течение 15 минут при 121^oC, с последующим охлаждением раствора до 45^oC. AOM получали путем смешивания одного объема агарозного раствора с 4 объемами 1,25х-концентрата LOM при 45^oC. Для отверждения AOM, чашки охлаждали до 23-25^oC. Культуры инокулировали для стимулирования образования бляшек. Через 6-7 дней, чашки со средой LOM покрывали 5 мл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS), и фиксировали по краям стеклянной пипеткой Пастера для отделения и удаления агарозы. Из чашек со средой LMM удаляли среду путем отсасывания, после чего бляшки визуализировали путем окрашивания клеток раствором 0,2% кумасси-синего R-250 в смеси этанола и 1% уксусной кислоты. Подсчет бляшек проводили, в среднем, по 4-5 дубликатным чашкам, и полученные данные выражали как число бляшкообразующих единиц на один миллилитр (PFU/мл).

Из-за возможного разнобоя в оценках, увеличение выхода VZV дается по отношению к идентичным оценкам, полученным для неоптимизированных условий.

Пример 2
Выход VZV как функция конфлюентности клеток при инфицировании
Клетки MRC-5 засевали при плотности 4·10⁶ кл./150 см², и культивировали в течение 3 дней в солевой среде Эрла, дополненной базальной средой Игла (EBME) в присутствии 10% околоплодной телячьей сыворотки (FCS). После достижения субконфлюентными клетками плотности около 12··10⁶ кл./150 см², клетки подпитывали свежей EBME, дополненной либо 2% FCS или 10% FCS. На этой стадии, субконфлюентные клетки оставляли для дальнейшего роста либо в присутствии, либо в отсутствии VZV-инфекции (MOI = 1:125), при этом, увеличение плотности клеток и выход вируса контролировали по прошествии 48 часов. Было установлено, что плотность неинфицированных клеток в 2% FCS увеличивалась лишь на 33%, тогда, как плотность в 10% FCS повышалась на 92%. Число клеток в инфицированных культурах не повышалось. Как показано в таблице 1, на выходы вируса от субконфлюентных клеток не влияет способность к клеточной репликации в культурах, независимо от того имели ли эти культуры минимальную (2% FCS) или максимальную (10% FCS) подпитку FCS.

Другие клеточные культуры культивировали еще два дня в 10% FCS до получения плотности примерно 20·10⁶ кл./150 см² (условия сплошности), а затем подпитывали свежей средой EBME, дополненной либо 2% FCS, либо 10% FCS, и либо инфицировали вирусом VZV (MOI 1:125), либо оставляли неинфицированными. Через 48 часов следили за повышением клеточной плотности и выходом вируса. Было установлено, что плотность неинфицированных клеток в 2% FCS не повышалась, а плотность клеток в 10% FCS повышалась лишь на около 15%. Таким образом, ни одно из условий не способно обеспечить значительную клеточную репликацию. Вирусные выходы при 2% FCS или 10% FCS были аналогичными и оба они в данном случае были увеличены почти в три раза по сравнению с выходами, полученными в случае клеток, инфицированных в состоянии субконфлюентности (см. табл. 1). Поэтому в соответствии с вышеуказанным для получения оптимальных выходов внеклеточного VZV, предпочтительно использовать свежие монослойные культуры конфлюентных клеток, а не монослойные культуры активно реплицирующихся субконфлюентных клеток.

Пример 3.

Сравнение выходов VZV от свежеконфлюентных и староконфлюентных клеток культур.

Роллер-флаконы (850 см²) засевали клетками MRC-5 при концентрации приблизительно 26500 кл./см². Все клетки культивировали в среде EBME, содержащей 10% (по объему) околоплодную телячью сыворотку (FCS₁₀) в атмосфере 5% CO₂ при 35^oC. Затем колбы разделяли на две группы исходя из времени инфицирования вирусом VZV. Клетки группы I культивировали в течение 5 дней, по истечении которых монослои клеток достигали сплошности. На этой стадии среду удаляли, а клетки инфицировали клеточно-ассоциированным VZV при MOI = 1:125, который был суспендирован в EMEM + 2% FCCS. Затем добавляли дополнительную среду, и клетки инкубировали еще 48 часов. Клетки группы II до инфицирования при MOI = 1:125 выдерживали еще 48 часов дополнительно.

Уровень продуцирования вируса VZV клетками группы I и группы II определяли следующим образом: из роллерных сосудов удаляли среду, а клетки промывали фосфатно-буферным раствором, соскабливали с использованием стеклянных микросфер в равные объемы стабилизатора, и охлаждали до 4^oC. Охлажденные клеточные суспензии обрабатывали в целях лизиса ультразвуком. Клеточный дебрис отделяли от вируса путем центрифугирования на низкой скорости (325 · г в течение 10 минут), клеточный дебрис удаляли, а вирусный супернатант удерживали. VZV-продуцирование оценивали с помощью анализа на бляшкообразование. Как показано в табл. 2, при инфицировании вирусом VZV монослои свежеконфлюэнтных клеток выход увеличивался примерно в 2 раза.

Пример 4.

Влияние объема культур на выход VZV-PFU/мл.

Клетки MRC-5 (10⁶) засевали в 125 мл-объемы EBME, 10% FCS, 50 мкг/мл неомицина и 2 мМ L-глутамина в роллер-факонах (850 см²) и инкубировали 3 дня при 35^oC. Затем добавляли 300 мл свежей среды, и культуры инкубировали еще 4 дня при 35^oC. Затем среду удаляли и заменяли 125 или 425 мл EMEM, 2% термоинактивированной FCS, 50 мкг/мл неомицина, и 2 мМ L-глутамина. Затем добавляли VZV-инфицированные клетки MRC-5 (MOI = около 1:125), культуры обрабатывали газообразным 5%CO₂ и инкубировали еще 46 часов при 35^oC. Среду удаляли, клетки 4 раза промывали 100 миллилитрами PBS и соскребали (с помощью стеклянных микросфер) в 43-мл объемы стабилизатора. Клетки замораживали при -70^oC. Внеклеточный вирус получали путем обработки ультразвуком. Количество инфекционного вируса в осветленном (путем центрифугирования) гомогенате определяли с помощью анализа на бляшкообразование.

Результаты:
Объем среды (мл) - VZV-PFU/мл^*
125 - 55000; 45000
425 - 153000; 103000
^* Результаты от дубликатных культур
Выводы: Использование больших объемов среды приводит примерно к 2-кратному увеличению выхода инфекционного VZV от MRC-5-клеточных культур.

Пример 5.

Влияние MOI VZV на выход VZV-PFU/мл.

Роллер-флаконы засевали клетками MRC-5 и культивировали до состояния сплошности (конфлюэнтности). Затем культуральную среду удаляли и клетки инфицировали вирусом VZV при различной MOI. Уровень продуцирования VZV-инфицированными клеточными культурами определяли с помощью анализа на бляшкообразование путем периодического сбора и анализа, как описано в примере 1. Как показано в табл. 3 и на фиг. 5, выделение внеклеточного инфекционного VZV было тем больше и достигалось за более короткий период инкубирования, чем выше используемая множественность заражения (MOI). Максимальные уровни антигена также достигались быстрее по мере увеличения MOI. При очень низкой MOI, такой, как 1:625, продуцирование антигена замедлялось и не достигало оптимального значения.

Влияние MOI клеточно-ассоциированного исходного материала на выходы внеклеточного VZV и монослойные культуры клеток МRC-5 приведено в табл. 3.

Пример 6.

Повышенная стабильность VZV в стабилизаторе при -20^oC.

Инфицированные клеточные культуры обрабатывали ультразвуком в SPGA и промывали фосфатно-буферным раствором. Связанный с клетками вирус высвобождали путем обработки ультразвуком, а клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования. Концентрацию внеклеточного вируса доводили до известной PFU/мл-концентрации, и аликвоты вируса в стабилизаторе лиофилизовали и хранили при 4^oC или при -20^oC. Через каждый месяц в течение полных 14 месяцев образцы восстанавливали и определяли остаточный титр PFU/мл. Результаты этого эксперимента проиллюстрированы на фиг. 3.

При этом совершенно очевидно, что стабильность VZV, полученная при хранении при -20^oC, была выше, чем стабильность при хранении 4^oC.

Пример 7.

Влияние количества и времени добавления сахарозы в течение фазы клеточного роста до стадии инфицирования на конечный выход VZV.

1. Фаза посева клеток
Клетки MRC-5 (5 мл) засевали в концентрации 120000 кл./мл (всего 600000 клеток) на 60-мм чашки в среде EBME, содержащей 10% FCS, 50 мкг/мл неомицина, 2 мМ L-глутамина, и инкубировали при 35^oC в атмосфере 5% CO₂.

2. Фаза культивирования клеток/фаза перед инфицированием
Клетки достигали конфлюэнтности на третий день после посева. Из 48 чашек среду для посева удаляли путем отсасывания и заменяли 8-мл-объемами среды для культивирования, содержащей либо EBME, либо SRFE-2, дополненной 10% FCS, 50 мкг/мл неомицина, 2 мМ L-глутамина, и 0,2 мг/мл осевого липида (1 мг) мл BSA с добавлением или без добавления 50 мМ сахарозы. После добавления свежей среды для культивирования клетки инкубировали еще 3 дня при 35^oC в атмосфере 5% CO₂.

3. Инфицирование вирусом
Затем из каждой чашки удаляли среду и заменяли ее 8-ю миллилитрами EMEM (вместе EBME) и SRFE-2 (вместо SRFE-2) с добавлением соевых липидов. Во всех чашках FCS снижали до 2%, но другие добавки, неомицин, глутамин и сахароза оставались такими же, как в стадии культивирования. Затем в каждую чашку добавляли 333 мкл 1:16-разведенных VZV-инфицированных клеток (PFU/мл 47000) в EMEM + 2% FCS, неомицин, глутамин.

VZV оставляли на два дня для репликации при 35^oC и в атмосфере 5% CO₂, а затем удаляли среду из двух чашек (каждая от двух различных условий). Клетки 4 раза промывали PBS. Затем их соскабливали в 1,2 мл/чашку охлажденного льдом стабилизатора. Сбор от дубликатных чашек объединяли в 50 мл конических центрифужных пробирках и замораживали при -70^oC.

Процедуру, описанную в предыдущем абзаце, повторяли для двух чашек (для каждого условия) и третий, четвертый и пятый день после VZV-инфицирования, и собранный пул от каждой серии из двух чашек хранили при -70^oC.

Каждый из этих клеточных сборов, полученных как описано выше, затем оттаивали, обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд (при охлаждении льдом) с использованием ультразвукового прибора, снабженного чашкой в форме рога, а затем осветляли путем центрифугирования при 1000·g в течение 10 минут при 4^oC. Для осуществления анализа на бляшкообразование аликвоты супернатантов удаляли. Результаты этого анализа, проводимого как описано в примере 1, представлены на фиг. 1.

Данные, представленные на фиг. 1, подтверждают следующие выводы.

1. Стадия инкубирования клеток с 50 мМ сахарозой, осуществляемая до стадии инфицирования, очень благотворно влияет на конечный выход VZV. В каждой среде (EMEM или SRFE-2) выходы VZV увеличиваются в том случае, когда клетки обрабатывают сахарозой до проведения стадии инфицирования. Через 72 часа после инфицирования выход VZV в SRFE-2 с клетками, обработанными сахарозой, почти в 16 раз превышает выход VZV (измеренный как PFU), полученный для клеток в минимальных средах без добавления сахарозы.

2. Использование обогащенной среды (SRFE-2 + соевые липиды в стадии культивирования и SRFE-2 в стадии развития вируса) благоприятно влияет на выход VZV, но в сочетании с сахарозой эффективность продуцирования VZV возрастает на порядок величины. Таким образом, обогащенная среда в сочетании с сахарозой дает, очевидно, синергический эффект.

3. Время сбора VZV является очень важным параметром. Даже при оптимизированных условиях культивирования (SRFE-2 сахароза и т.п.) выход VZV не достигает пика через 48 часов после инфицирования. На этой стадии выход VZV лишь в четыре раза превышает выход, полученный для минимальной среды. Однако через 72 часа после инфицирования выход VZV возрастает примерно в 16 раз.

В отдельных экспериментах, в тех случаях, когда 50 мМ сахарозы добавляли во время инфицирования, а не за 72 часа до инфицирования, такого значительного увеличения выхода не наблюдалось, что свидетельствует о важности продолжительной прединфекционной стадии, которая необходима для внутриклеточной аккумуляции сахарозы. Было также обнаружено, что добавление 25 мМ или 100 мМ сахарозы менее предпочтительно, чем 50 мМ сахарозы. Аналогичные концентрации могут быть использованы и для лактозы, целлюлозы и мальтозы.

Пример 8.

Влияние изменения различных параметров способа на выход VZV.

Эксперимент с использованием роллер-флаконов осуществляли для определения влияния изменения различных параметров (культуральная среда, добавление сахарозы, добавление NH₄Cl к стабилизатору, механический лизис или обработка ультразвуком для высвобождения вируса из клеток) на выходы внеклеточного VZV (PFS). Культуры засевали в роллер-флаконы при плотности 80·10³ кл./мл·125 мл EBME, 10% FCS на флакон. атем этот объем доводили до 425 мл путем добавления EBME или подпитывали средой SRPFE + соевый липид, и инфицировали рабочим посевным материалом VZV в 125 ("малый объем") или 425 мл ("большой объем") среды EMEM или SRFE (без соевого липида). Выбор времени для замены этих сред и инфицирования осуществляли так, как описано в примере 7. В различные периоды времени перед инфицированием (за 96 или 24 ч до инфицирования или во время инфицирования) добавляли сахарозу (сах.) до 50 мМ. В том случае, когда сахарозу вводили в культуры до их инфицирования, эту сахарозу вводили в культуры до их инфицирования вирусом. Все культуры, которые были инфицированы (при MOI, равном приблизительно 1:15) VZV-инфицированными клетками в EMEM-культурах, через 46 часов после инфицирования собирали в стабилизатор, содержащий 20 мМ NH₄Cl (N), или без этой добавки. Все образцы замораживали при -70^oC, после чего вирус высвобождали из клеток либо путем ультразвуковой обработки, либо путем DOUNCE-гомогенизации. Полученные образцы осветляли с помощью центрифугирования при 1000 г в течение 10 мин.

PFU-данные, полученные для образцов, обработанных ультразвуком, позволили сделать следующие выводы.

1. Использование "большого" объема среды EMEM способствовало увеличению PFU VZV в 2 раза. Что касается среды SRFE, то из этого и других экспериментов было установлено, что оптимальные PFU-выходы достигаются скорее при "малых" объемах среды. В некоторых случаях выходы при "большом" объеме снижались.

2. NH₄Cl не имеет большого значения для достижения высокого выхода PFU.

3. Добавление сахарозы способствует 2-кратному увеличению выходов PFU для ЕВМЕ/ЕМЕМ и 5-кратному увеличению для SRFE-культур. В данном случае, очевидно, сказывается влияние времени добавления сахарозы. В других сериях этого эксперимента, для культур SRFE + соя/SRFE, не содержащих сахарозы, выходы PFU составляли 94·10³, а для культур, в которые добавляли сахарозу во время инфицирования за 24 часа до инфицирования и за 96 часов до инфицирования выходы PFU составляли 296·10³, 427·10³ и 671·10³ соответственно.

4. Обработанные сахарозой культуры обнаруживали значительно менее выраженные цитопатические эффекты, чем их необработанные сахарозой эквиваленты. В другом эксперименте культуры, обработанные сахарозой, не обнаруживали дегенеративные цитопатические эффекты уже через 1 неделю после инфицирования, тогда, как их необработанные контрольные эквиваленты были полностью лизированы. Поэтому можно с полным основанием утверждать, что обработанные сахарозой клетки будут аккумулировать большее количество VZV (антиген или PFU) при более продолжительном периоде инкубирования (более чем через 46 часов после сбора из роллер-флаконов).

5. В этом эксперименте для получения более высоких концентраций клеток во время инфицирования благодаря клеточному росту в среде SRFE, MOI не корректировали. Таким образом, в случае оптимизации этого параметра, можно даже получить более высокие выходы PFU.

Пример 9.

Выход внеклеточного VZV, достигаемый путем гомогенизации с механическим сдвигом, путем обработки ультразвуком, или при комбинировании этих методов.

Проводили крупномасштабный эксперимент с использованием множества различных условий для VZV-продуцирования, аналогичный эксперименту, описанному в примере 8. В этом эксперименте анализировали новый параметр, а именно способ разрушения клеток. Ниже приводятся данные, полученные в результате сравнения выхода внеклеточного VZV, достигаемого с использованием лишь DOUNCE-гомогенизации, лишь обработки ультразвуком и обоих способов вместе. Что касается условий культивирования, то в этом эксперименте клетки культивировали в минимальных средах (EBME/EMEM) или в высокопитательной среде (SRFE-2 + соевые липиды/SRFE-2 + 50 мМ в прединфекционной стадии). Клетки культивировали и собирали, как описано в примере 8, а VZV-PFU/мл определяли с помощью анализа, описанного в примере 1.

Из данных табл. 4 видно, что наибольшее увеличение выхода VZV достигается, если механическую гомогенизацию комбинируют с ультразвуковым разрушением клеток.

Пример 10.

Использование среды SRFE-2 и соевой липидной добавки в целях увеличения выхода живого вакциоонного вируса ветряной оспы из клеток MRC-5.

Клетки MRC-5 инокулировали в 25 см² T-колбах в EBME и инкубировали в течение 3 дней при 35^oC. Затем среду удаляли и заменяли 12,5 мл свежей среды EMEM или среды-2, содержащей 10% FCS, неомицин, глутамин и либо соевый липид, либо 1:200-разведение липида, после этого культуры инкубировали еще 3 дня при 35^oC. Затем среды удаляли, и к клеткам добавляли VZV-инфицированные клетки МRC-5 12,5 мл ЕМЕМ или SRFE-2, содержащей 2% околоплодной телячьей сыворотки, неомицин и глутамин. Культуральные условия, обозначенные как "SRFE-2", означают среды SRFE-2 в течение культивирования клеток и в течение наращивания вируса. Условия "SRFE + соя" означают, что при культивировании клеток используется среда SRFE-2 и 1:200-разведение соевого липида, но при культивировании вируса используется лишь среда SRFE-2. После культивирования в течение 48 часов среды удаляли, клетки 4 раза промывали 5 миллилитрами PBS и соскребали в 1,2 мл-объем стабилизатора. Образцы из дубликатных колб объединяли и замораживали при -70^oC. После оттаивания клетки разрушали путем ультразвуковой обработки и осветляли путем центрифугирования (1000 г в течение 10 минут), а супернатанты замораживали при -70^oC для последующего анализа титра инфекционности вируса. Результаты представлены на фиг. 4. Выводы: использование среды SRFE-2 вместо среды EMEM приводит к 2,5-кратному увеличению выхода живого вируса ветряной оспы. Использование среды SRFE-2, дополненной соевым липидом, при культивировании клеток способствует дополнительному 2,7-кратному увеличению выхода вируса, что ровно в 7 раз превышает выход, достигаемый с использованием EMEM во время вируса.

Пример 11.

Конкурентный ELISA для количественной оценки VZV-антигена.

Поскольку анализ на образование бляшек VZV требует значительного времени, то он не может быть применим для экспресс-контроля. Быстрый ELISA-анализ на VZV-антиген позволяет проводить измерения количеств VZV-антигена с одновременным контролем роста вируса в процессе изготовления живой вакцины против ветряной оспы. Кроме того, этот тест может быть использован для оценки количеств VZV-антигена в осветленной и обработанной ультразвуком вакцинной массе и потенциально для измерения антигена в сосудах, заполненных лиофилизованной вакционной массой. Короче говоря, этот анализ может быть осуществлен путем инкубирования VZV-антигена от испытуемых образцов с сывороткой против VZV в растворе. Оставшееся свободное антитело связывают с VZV-антигеном, иммобилизованным на ELISA-планшетах для микротитрования. Количество антитела, способного связываться с планшетами, обратно пропорционально количеству антигена в испытуемом образце. Антитело, связывающее с планшетами, количественно оценивают посредством реакции с ферментносвязанным античеловеческим антителом и соответствующим субстратом с последующим продуцированием окрашенного продукта, который может быть количественно оценен с помощью спектрофотометрии.

ELISA-анализ на VZV-антиген и анализ на VZV-бляшкообразование должны, в принципе, давать коррелятивные данные, однако, если иметь в виду, что анализ на VZV-антиген обнаруживает как жизнеспособный, так и нежизнеспособный VZV, то эти данные должны быть скорректированы. Поскольку, как было показано, иммунный ответ, генерированный убитым VZV, является не таким эффективным, как ответ, продуцированный живым аттенуированным вирусом, то анализ на бляшкообразование имеет очень большое значение для определения дозы вирусного инокулята в процессе изготовления VZV-вакцины. Однако анализ на антиген также очень важен, поскольку он позволяет определить уровень полной загрузки антигена, предназначенного для введения реципиенту в виде VZV-вакцины.

Процедура анализа:
1. ELISA-планшеты покрывали гликопротеинами (gps) от VZV-инфицированных или неинфицированных клеток MRC-5, а сверху покрывали 1% альбумином бычьей сыворотки (фракции Y, # A-9647, Sigma 0,1% NaN₃) для уменьшения неспецифической адсорбции антител на планшеты. Затем ряды через один покрывали либо VZV, либо контрольным антигеном (т.е. ряды A, C, E и G покрывают VZV-gp, а ряды B, D, F и H покрывают неинфицированным MRC-5-gp-антигеном).

2. Осветленный (3250 g -мин) испытуемый антиген разводили в стабилизаторе в 12х75 мм-пробирках или микропробирках. Стандартный вирусный антигенный препарат (26 ед./мл VZV-антигена в дот-блот-анализе) разводили 1:10, а затем проводили серийные 1:1,25х-разведения для получения концентраций антигена 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1, 0,9 ед./мл. Могут быть также проведены и дополнительные разведения для получения концентраций 0,7 и 0,5 ед./мл антигена. Эти серийные разведения использовали для построения стандартной кривой в целях измерения количеств антигена в испытуемых образцах.

3. Человеческую сыворотку против VZV разводили в стабилизаторе до получения 2-кратного конечного разведения.

4. 300 мкл разведенного антигена помещали в микропробирки, смешивали с 300 мкл разведенной сывороткой против VZV и инкубировали 15-22 минуты при 35^oC. Контроль содержал человеческую сыворотку против VZV и разбавитель (без антигена).

5. Аликвоты 100 мкл от каждой смеси "сыворотка-антиген" добавляли в 2-дубликатные лунки, покрытые VZV-гликопротеином (VZVgp), и в 2 лунки, покрытые MRC-5gp (4 лунки на образец) (например,: образец 1 в столбце 1, ряды I, B, C, и D; образец 2 в столбце 2, ряды A, B, C и D, и т.д.).

6. Планшеты инкубировали в течение 15±1 минут при 35^oC для того, чтобы свободное антитело (не связанное с антигеном в растворе) связывалось с вирусным антигеном, иммобилизованным на планшетах.

7. Несвязанное антитело удаляли путем промывания, а в лунки добавляли щелочную фосфатазу, конъюгированную с козьим античеловеческим lgG, для обнаружения связанного человеческого антитела.

8. После инкубирования в течение 15±1 минут при 35^oC, несвязанный конъюгат удаляли путем промывания. Связанный конъюгат обнаруживали путем инкубирования в течение 15 минут при 35^oC с р-нитрофенилфосфатным субстратом, растворенным в диэтаноламиновом буфере.

9. После завершения реакции с субстратом проводимой путем добавления 50 мкл/лунка 3 М NaOH определяли степень развития окраски (ОП при 405 нм) с помощью спектрофотометра для микропланшет.

Оценочные расчеты и интерпретация
1. Соответствующие дубликатные значения ОП для дубликатных лунок, покрытых VZV и MRC-5, усредняли. Результаты показали, что для различных образцов и разведений значения ОП MRC-5 совпадают. Поэтому MRC-5-значения для всего планшета усредняли и использовали для коррекции неспецифического связывания первого антитела или конъюгата с неинфицированными клеточными экстрактами. Усредненные MRC-5-ОП вычитали из соответствующих VZV-ОП, в результате чего получали VZV-специфические величины ОП ( Δ ОП).

2. Построение калибровочной кривой для измерения количеств антигена.

Калибровочная кривая представляет собой зависимость значений Δ ОП от известных концентраций антигена (ед. VZV/мл). Затем полученные данные вводили в соответствующую графическую программу (например, Cricket Graph version 1.3, Cricket Software, Malvern, PA); линейную часть кривой идентифицировали (по крайней мере по 4 точкам); и получали "формулу линейного соответствия": y = a + bx.

3. Количественная оценка антигена в испытуемых образцах: величины "a" и "b" заданы вышеуказанной линейной формулой, а "y" ( Δ ОП) является известным. Оставшаяся неизвестной величина "x", представляющая собой количество (ед. /мл) антигена, может быть соответствующим образом вычислена, а затем скорректирована в соответствии с разведением образца, в результате чего может быть получена концентрация антигена в неразведенном образце. Общий образец расчета приводится в табл.5.

Указанная концентрация антигена представляет собой концентрацию, полученную с использованием по крайней мере разведенного образца, при условии, что значение Δ ОП находится в пределах линейной части калибровочной кривой.

Пример 12.

ELISA-анализ на VZV-антиген и сравнение с выходом PFU VZV.

Образцы внеклеточного VZV, полученного в примере 7, выход которого (PFU/мл) проиллюстрирован на фиг. 1, анализировали в соответствии ELISA-анализом на VZV-антиген, описанным в примере 11. Результаты этого анализа показаны на фиг. 2.

Как видно из фиг. 2, через 96 часов содержание VZV-антигена возрастает, даже если, как показано на фиг. 1, PFU/мл убывает. Заслуживает внимания также тот факт, что уровень VZV-антигена в SRFE-2 + соя + сахароза совсем не соответствует 16-кратному возрастанию по сравнению с уровнем антигена в EMEM (фиг. 2), как в отношении жизнеспособного внеклеточного VZV-PFU/мл (фиг. 1). Из сравнения очевидно, что сахароза дает наибольший эффект, если ее вводят для подержания жизнеспособного VZV через 72 часа после инфицирования.

Пример 13.

Усиление MRC-5-клеточного роста путем использования среды SRFE-2 и добавки в виде соевого липида
Клетки MRC-5 инокулировали в 25 см²-T-колбах при плотности 53000 кл./мл в 12,5 мл-объемах EBME (10% FCS, 50 мкг/мл неомицина, и 2 мМ L-глутамина) и инкубировали при 35^oC. Через 2-3 дня среду удаляли и заменяли (смена 2) 12,5 миллилитрами свежей среды или среды SRFE-2, содержащей 10% FCS, 50 мкг/мл неомицина, 2 мМ L-глутамина и различные количества соевого липида. Неразведенный соевый липид содержал 20 мг/мл липида и 100 мг/мл альбумина бычьей сыворотки.

Через 6 дней после начального посева клеток среду удаляли и заменяли 12,5 миллилитрами EMEM, содержащей 2% FCS, 50 мкг/мл неомицина, 2 мМ L-глутамина, или SRFE-2, дополненной различными количествами соевого липида. Клетки выделяли из отобранных колб при помощи обработки трипсином, после чего их число подсчитывали в гемацитометре. Для остальных культур, число клеток подсчитывали после дополнительного 2-дневного культивирования при 35^oC, в результате чего получали суммарные данные, представленные в табл. 5.

Смена 1 среды = среда заменяется указанной средой, дополненной 10% FCS через 2-3 дня после посева.

Смена 2 среды = среда заменяется указанной средой, дополненной 2% FCS через 6 дней после посева клеток;
н.о. = не определяли
Выводы. Использование среды SRFE-2 без липидной добавки дает примерно 2-кратное увеличение числа клеток по сравнению с числом клеток, полученных при использовании лишь одной EMEM. Еще большее увеличение выхода клеток дает добавление к среде соевого липида. Максимальный выход клеток достигается с использованием среды SRFE-2 в сочетании с липидом в концентрации около 200-400 мкг/мл.

Пример 14.

Культивирование клеток WI-38 в соответствии со способом настоящего изобретения.

Клетки WI-38 инокулировали в T-колбы (25 см²) при плотности 53000 кл./мл в 12,5 мл EBME, содержащей 10% FCS, 50 мг/мл неомицина и 2 мМ L-глутамина, и инкубировали при 35^oC. Через 2 дня среду удаляли и заменяли 12,5 мл среды SRFE-2, дополненной 50 мг/мл неомицина, 2 мМ L-глутамина и 1:200-разведением соевого липида. В контрольные культуры вводили среду без липида. После 5-дневного культивирования при 35^oC среду удаляли, клетки отделяли от колб путем обработки трипсином, и количество клеток определяли с помощью гемацитометра. Остальные колбы выдерживали еще 3 дня, а затем подсчитывали число клеток. В результате получали данные, приведенные в табл.7.

Выводы: добавление обогащенной культуральной среды в сочетании с соевым липидом способствует примерно 2-кратному увеличению выходов клеток WI-38. Таким образом, как и ожидалось, клеточная линия WI-38 для продуцирования VZV может быть использована аналогично использованию клеток MRC-5.

Пример 15.

Способ оценки увеличения роста клеток MRC-5.

Клетки MRC-5 засевали в T-колбы (25 см²) при плотности около 53000 кл. /мл в 12,5-объемы базальной среды Игла, содержащей соли Эрла (EBME), 10% FCS, 50 мкг/мл сульфата неомицина (Neo) и 2 мМ глутамина (Gln). Культуры инкубировали при 35^oC в течение 3 дней, по истечении которых клеточные монослои обычно имели состояние примерно 5-75% сплошности. Затем среду удаляли и заменяли SRFE-средой, содержащей (10-12,5 мл в объеме) 10% FCS, 50 мкг/мл неомицина и 2 мМ Gln ± соевого или другого липида, после чего культуры продолжали инкубировать при 35^oC. Подсчет клеток проводили в различные интервалы времени путем трисинизации клеток (2,5 мл 0,25% раствора цитрата трипсина) с последующим их подсчетом на гемоцитометре. Жизнеспособность клеток контролировали путем исключения клеток посредством их окраски 0,2% трипановым синим. Подсчет клеток проводили в целях определения концентрации клеток, в которую затем вносили поправки на полный объем клеточной суспензии, в результате чего получали выход клеток на один флакон. В некоторых экспериментах, через 3-4 дня после замены среды, среду снова меняли на среду, содержащую 2% FCS, а затем, после дополнительного культивирования в течение 2 дней, проводили подсчет клеток.

Пример 16.

Влияние продолжительного воздействия липидных добавок на культивируемые клетки.

Клетки MRC-5 засевали во флаконы T25, через 3 дня подпитывали (первая подпитка), и после дополнительного 3-дневного культивирования проводили подсчет клеток. Дополнительные T25-колбы продолжали культивировать после введения подпитки + липид (вторая подпитка) в течение еще 2 дней. Затем клетки выделяли с использованием трипсина для клеток, засеянных в EBME и культивированных в EMEM, выходы составляли 2,6·10⁶, а для клеток, культивированных в SRFE-2 + 1:100-разведение соевых липидов, эти выходы составляли 6,6·10⁶ и 7,7·10⁶. Для клеток, которые культивировали еще 2 дня в EBME/EMEM, выход составлял 2,76·10⁶, а для клеток в EBME/SRFE-2 без соевой липидной добавки этот выход составлял 9,2·10⁶ и 7,88·10⁶ на T25-колбу. Выходы клеток, культивированных в EBME/SRFE-2 + 1: 100 соевого липида, составляли лишь 2,48 и 2,28·10⁶. Эти данные показывают, что продолжительное воздействие (около 5 дней после второй подпитки) высокими концентрациями липида может фактически приводить к снижению выходов клеток, обусловленного, вероятно, гибелью клеток. Таким образом, в основном, клетки подпитывали обогащенной средой, не содержащей липидной добавки. Такое "переключение" на не содержащую липид, обогащенную среду очень важно в начальной стадии наращивания вируса, поскольку липид может оказаться токсичным в отношении развития вируса или жизнеспособности клеток в присутствии "атакующей" активности вируса.

Пример 17.

Влияние различных концентраций липида на рост клеток в обогащенной и минимальной средах.

В соответствии с процедурой и схемой подпитки и количественной оценки клеток MRC-5, описанной в примере 16, получали следующие выходы клеток (где символы "+" и "-" после обозначения среды указывают на присутствие или отсутствие данного количества (в мг/мл) соевого липида (SI.) в среде для второй подпитки), приведенные в табл.8.

Данные, систематизированные в вышеуказанной таблице, в основном согласуются с наблюдениями, описанными в примере 16, и свидетельствуют о том, что высокие концентрации липида не слишком благоприятны для данного способа, хотя в вышеуказанных данных токсический эффект, о котором говорилось в примере 16, менее выражен. При более низких концентрациях липида более продолжительное его воздействие сказывается менее неблагоприятным образом, а поэтому эти концентрации могут быть использованы для увеличения выхода клеток на 1 см² поверхности культуры.

Пример 18.

Влияние концентраций околоплодной телячьей сыворотки на выход клеток.

В этом эксперименте исследовали эффект добавления 2% или 10% околоплодной телячьей сыворотки в присутствии липидных добавок. Клетки MRC-5 засевали в EBME, затем через 3 дня подпитывали средой SRFE-2, дополненной различными количествами соевого липида, и еще через 2 дня подпитывали той же концентрацией липида в SRFE-2, как и в первой подпитке. При 10% FCS для культур, подпитанных 0,1, 0,2 и 0,4 мг/мл липида, выход клеток составлял 9,5, 11,3 и 12,2·10⁶ соответственно. При использовании 2% FCS, выход клеток составлял 6,5, 8,8 и 3,2·10⁶, соответственно. Этот эксперимент показал, что добавка FCS так же, как и добавка липида, благоприятно влияет на выход клеток. При этом токсическое действие повышенных концентраций липида может быть ослаблено достаточным количеством FCS-добавки.

Пример 19.

Влияние различных липидных добавок на рост клеток MRC-5.

Клетки MRC-5 засевали в T25-колбы в EBME. На третий день клетки подпитывали средой SRFE-2, содержащей 10% FCS и дополненной различными липидными добавками. При этом использовали соевый липид Boehringer Mannheim; обогащенные холестерином липиды Sigma, взятые из сыворотки взрослого быка; липид Miles/Pentex EX-CYTE 1; или бычий липопротеин с очень низким содержанием эндотоксина в указанных концентрациях. Подсчет числа клеток после подпитки (1,19·10⁶) проводили через 5 дней. Число клеток в EMEM составляло 2,97·10⁶, а в среде SRFE-2 или SRFE-2 + 0,4 мг/мл, 0,2 мг/мл и 0,1 мг/мл соевого липида это число составляло 4,83, 10,44, 8,67 и 8,04·10⁶ соответственно. При использовании EX CYTE 1 при 1:50, 1:100, 1:200 получали 5,37, 4,80 и 4,74·10⁶ клеток соответственно. При использовании EX-CYTE VLE при 1:25, 1:500, 1:100 получали 5,49, 7,23 и 7,92·10⁶ соответственно. При использовании липидов (Sigma) с высоким содержанием холестерина при 1:25, 1:50, 1:100 получали 6,87, 7,56 и 7,65 соответственно. Наибольшее увеличение выхода клеток получали с использованием соевых липидов Boehringer Manneheim, хотя липиды EX-CYTE VLE и Sigma являются почти такими же эффективными. Таким образом, влияние соевых липидов на увеличение выхода не является уникальным.

Пример 20.

Увеличение роста клеток MRC-5 с использованием высоких концентраций соевых липидов.

Клетки MRC-5 засевали в 25 см²-колбы и подпитывали на 3 день и на 6 день, как описано в примере 13. Для сред EBME/EMEM, SRFE-2 + 1/100 соевого липида или SRFE-2 + 1/50 соевого липида выход клеток на 6 день (на одну колбу) составлял 4,3, 9,7 и 11,7·10⁶ соответственно. Для всех культур жизнеспособность клеток составляла >99% (по оценке методом исключения с использованием трипанового синего). Клетки подпитывали средой ± соевым липидом, инкубировали еще 2 дня, а затем определяли их число. Для дубликатных культур EBME/EMEM число клеток составляло (на одну колбу) 2,9 и 3,5·10⁶; для культур в SRFE-2 +1/50 соевого липида, подпитываемых той же средой, число клеток составляло 11,65·10⁶, а для культур в SRFE-2 +1/50 соевого липида (дубликаты), подпитываемых средой SRFE-2 и без соевого липида, число клеток составляло 13,69 и 11,09·10⁶; для SRFE-2 +1/100 соевого липида, подпитанных той же средой, число клеток составляло 9,66·10⁶, а при подпитке средой SRFE-2 и без липида это число составляло 8,51 и 6,27·10⁶ в дубликатных культурах.

Этот эксперимент показал, что выход клеток MRC-5 увеличивается с увеличением количеств соевого липида. Максимальные выходы клеток достигаются при использовании 1/50-разведения соевого липида (наибольшая из используемых концентраций). Включение липида во вторую подпитку приводит к умеренному увеличению клеточного выхода. Однако полученные данные показали, что максимальный клеточный выход может быть достигнут с использованием 1/50-разведения липида в первой среде для подпитки. Поэтому во вторую подпитку липидную добавку можно не включать. Поскольку высокие концентрации липида неблагоприятно влияют на продуцирование вируса, то на стадии выращивания вируса, предпочтительно липид не использовать.

Формула изобретения

1. Способ получения вакцины на основе живого аттенуированного вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (VZV) штамма ОКА, включающий культивирование чувствительных к инфекции VZV диплоидных клеток человека, инфицирование вирусом, культивирование инфицированных клеток, промывание и сбор инфицированных клеток, разрушение их с освобождением VZV и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что клетки культивируют в монослое до состояния сплошности в среде SRFE-2, содержащей липид, выбранный из соевого липида в концентрации 0,02-0,4 мг/мл, липида с высоким содержанием холестерола из сыворотки крупного рогатого скота, липида EXCYTE I или липида с низким содержанием эндотоксина (VLE), при этом до инфицирования, за 24-96 ч, в среду добавляют сахарозу, клетки инфицируют вирус при множественности инфекции от 1 : 25 до 1 : 625, затем инфицированные клетки культивируют в SRFE-2, не содержащей липида, в течение 22-96 ч, а промывание клеток осуществляют в физиологическом растворе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сахарозу добавляют в концентрации 20-60 мМ, а для отмывания используют физиологический раствор, содержащий хлорохвин или хлорид аммония.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве клеток используют MRC-5, культивируют их при температуре 30-37^oC, сахарозу добавляют в концентрации 20-60 мМ, а для отмывания используют физиологический раствор, содержащий хлорид аммония в концентрации 20-50 мМ.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что сбор вируса осуществляют путем обработки ультразвуком или гомогенизацией DOUNCE.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что плотность клеток при состоянии сплошности составляет 500000/см².

6. Способ получения живой аттенуированной свободной от клеток вакцины на основе вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (VZV), штамм ОКА, включающий культивирование клеток, чувствительных к инфекции VZV, инфицирование клеток VZV-инфицированными клетками, культивирование инфицированных клеток, промывание клеток, добавление стабилизатора, сбор клеток, разрушение клеток с освобождением вируса и выделение целевого продукта с последующим дозированием во флаконы, лиофилизацией и хранением, отличающийся тем, что клетки MRC-5 культивируют в среде EBME, примерно через 3 дня среду замещают на SRFE-2, содержащую 0,2 мг/мл соевого липида, и продолжают культивирование до состояния сплошности, при этом за 24-96 ч перед инфицированием добавляют 20-50 мМ сахарозы, а после инфицирования клетки культивируют в свежей SRFE-2, не содержащей липид, в течение 37-96 ч, затем инфицированные клетки промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором, сбор клеток осуществляют путем соскоба или химически, собранные клетки разрушают путем гомогенизации DOUNCE, гомогенат центрифугируют, полученный осадок обрабатывают ультразвуком и вновь центрифугируют, супернатанты объединяют, выделяют целевой продукт и хранят при минус 4^oC и ниже.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что физиологический раствор, забуференный фосфатом, и стабилизатор дополнительно содержат 1-100 мМ хлорида аммония или примерно 230 мМ хлорохвина.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что собрание VZV-инфицированные клетки замораживают при минус 70^oC.

9. Способ культивирование клеток в моносле для получения аттенуированного штамма ОКА VZV, включающий посев и культивирование клеток, замену питательной среды, отличающийся тем, что клетки культивируют в среде SRFE-2 или EBME в течение 24-72 ч, затем среду заменяют на свежую, дополнительно содержащую 0,02-0,4 мг/мл соевого липида, а следующую замену среды на свежую среду, не содержащую липида, осуществляют через 24-72 ч.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что культивируют клетки MRC-5, или WI-38, или Vero.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что свежая среда содержит дополнительно соевый липид в концентрации 0,02-0,4 мг/мл и сыворотку.

12. Питательная среда для культивирования клеток в монослойной культуре, используемой для получения аттенуированного вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая, включающая SRFE-2, отличающаяся тем, что дополнительно содержит 0,02-0,4 мг/мл соевого липида.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13