Аглюкодальбагептиды и/или их соли с кислотами или основаниями, или их внутренние соли, способ получения, фармацевтическая композиция

 

Аглюкодальбагептиды формулы I, где W - остаток формулы (а) ; R₆ и R₉ - водород, R₇ и R₈ - водород или хлор; R₁₀ - гидроксигруппа; Z - остаток формулы (б); Y - карбоксильная группа или ее производное низшего алкилового эфира; R, R₁ и R₂ - водород; или их соли с кислотами или основаниями, или их внутренние соли. Соединения формулы I можно использовать в качестве активных ингредиентов антимикробных препаратов, используемых в медицине и ветеринарии для предотвращения и лечения инфекционных заболеваний, вызываемых патогенными бактериями. 3 с. и 6 з.п. ф-лы, 2 табл.

Настоящее изобретение относится к синтетическим аглюкодальбагептидам общей формулы /I/: где W и Z, каждый независимо, представляет соответствующие части агликона антибиотика дальбагептидной группы /аглюкодальбагептиды/; Y представляет карбоксильную группу или функциональное производное указанной карбоксильной группы; R и R₁ каждый независимо представляет водород; R₂ представляет водород.

Настоящее изобретение включает соли вышеуказанных представителей аглюкодальбагептидов с кислотами или основаниями, а также их внутренние соли.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения аглюкодальбагептидных антибиотиков формулы /I/, представленной ранее, из тетрапептидов формулы /II/: где: W и Z каждый независимо, представляет соответствующие части аглюкона антибиотика дальбагептидной группы /аглюкодальбагептиды/; Y представляет карбоксильную группу или функциональное производное указанной карбоксильной группы; R₃ и R₄ каждый независимо, представляет амино- или защищенную аминогруппу; и
R₅ представляет водород.

Тетрапептиды общей формулы /II/, представленной выше, их соли и способ получения представлены в международной публикации заявки N 09210517. Вышеуказанная международная заявка содержит также исчерпывающее описание встречающихся в природе дальбагептидных антибиотиков и их классификацию на четыре подгруппы, именуемые соответственно, как дальбагептиды типа ризтоцетина, типа ванкомицина, типа авопарцина и типа синмоницина.

Пентапептидные предшественники, подходящие для получения вышеуказанных тетрапептидов, раскрыты в Европейской патентной публикации N 409045.

Термином дальбагептиды обычно обозначают все вещества антибиотики, которые содержат общую сильно модифицированную линейную гептапептидную структуру, состоящую из семи аминокислот, пять из которых являются постоянно арил- и арилметил-аминокислотами, причем указанная структура является детерминантой общего механизма действия, т.е. специфической комплексации с D-аланил-D-аланиновым концом одного или более из промежуточных соединений в синтезе клеточных стенок, что приводит к разрушению клеток /см. также: F.Parenti and B.Cavalleri, "Novel glycopeptide antibiotics of the dalboheptide group, Drugs of the future V. 15/1/: 57-72/1990/ u B.Cavalleri., F.Parenti: Cyclopeptides (dalbaheptides)" in Kirk-Othmer's Eucyclopedia of Chemical Technology V. 2, 995-1018, G.Whiley and Sons. 1992/.

В соответствии с предпочтительным вариантом настоящего изобретения синтетические аглюкодальбагептиды формулы /1/, представленной ранее, содержат такие производные, в которых имеет следующие значения:


где i/ A представляет водород или защитную группу фенольного гидроксильного фрагмента; R₆, R₇ и R₈, каждый независимо, представляют водород или галоид, где галоидом, предпочтительно, является хлор или бром, и, наиболее предпочтительно, чтобы они находились в ортоположении по отношению к эфирной связи; R₉ и R₁₀, каждый независимо, представляют водород или группу OR₁₅, где R₁₅ представляет водород или защитную группу бензильного гидроксильного фрагмента.

Как видно из формулы /I/, представленной ранее, группа одновременно связана со вторым, четвертым и шестым аминокислотными /считая справа/ фрагментами гептапептидной цепи аглюкодальбагептидов;
ii/ группы OR₁₁ и OR₁₂, предпочтительно, находятся, соответственно, в пара- и ортоположениях по отношению к связи, соединяющей два фенильных кольца, и радикал R₁₁ и R₁₂, каждый независимо, представляет водород или защитную группу фенольного гидроксифрагмента; группа OR₁₃ предпочтительно, находится в ортоположении по отношению к связи, соединяющей два фенильных кольца, а радикал R₁₂ представляет водород или защитную группу фенольного гидроксифрагмента; группа R₁₄, предпочтительно, находится в положении мета- по отношению к связи, соединяющей два фенильных кольца и представляет водород или галоид, предпочтительно, водород или хлор.

Как представлено формулой /I/ ранее, группа Z связана с аминокислотами, соответствующими пятому и седьмому аминокислотным /считая справа/ фрагментам гептапептидной цепи аглюкодальбагептидов.

Заключенные в кружок цифры в ароматических кольцах указывают соответствующие аминокислоты аглюкодальбагептидной цепи, к которым присоединены конкретные арильные или аралкильные фрагменты.

Символ Y в формуле /I/ представляет гидроксильную группу, ее функциональное производное, предпочтительно, сложный эфир. Такие производные сложных эфиров включают защищенные карбоксильные группы, у которых можно удалить защиту и восстановить свободные карбоксильные группы в специфических условиях, при которых не затрагивается аминокислотная цепочка. Эти определения включают производные низших сложных эфиров, а также сложные эфиры, образуемые при взаимодействии карбоксильной функции с алифатическими спиртами, содержащими заместители /например, гидрокси, галоид, низший алкокси, амино, низший алкиламино, ди-/низший алкил/амино/, циано и фенил, необязательно замещенный низшим алкилом, низшим алкокси, галоидом или нитро/ в алифатической цепи.

Термин "функциональное производное карбоксильной группы" включает также карбоксамидные фрагменты, которые описаны в международной опубликованной заявке N 092/10517, где значения символа Y тетрапептидного исходного материала формулы /II/ проиллюстрированы более подробно. Указанные карбоксамидные фрагменты являются функциональными производными, образующимися при взаимодействии карбоксильной группы с алифатическими, циклоалифатическими и гетероциклическими аминами. В частности, среди алифатических аминов предпочтительны низшие алкиламины и ди-низшие-алкиламины, у которых необязательно может быть такой заместитель на алифатической цепи, как амино, низший алкиламино, д/низший алкиламино/, пирролидино, пиперидино, N-/низший алкил/пиперазино, морфолино, гидрокси, низший алкокси, карбокси, карбо/низший алкокси/, карбамоил, моно- и ди-/низший алкил/карбамоил и т.п.; среди циклоалифатических аминов предпочтительны C₄-C₇циклоалифатические первичные амины; среди гетероциклических аминов предпочтительны насыщенные, содержащие азот, 5-7-членные гетероциклические фрагменты, например, пирролидин, морфолин, пиперазин и N-/низший алкил/пиперазин.

Соли целевых соединений формулы /I/ и исходных соединений формулы /II/ представляют собой соли, полученные при взаимодействии с кислотами основных групп молекулы, например, с аминофрагментами NHR и/или NR₁R₂.

Представителями солей присоединения кислот являются такие соли, которые образуются в реакции как с неорганическими, так и органическими кислотами, например, соляной, серной, фосфорной, янтарной, лимонной, молочной, малеиновой, фумаровой, холевой, o-глутаминовой, о-камфорной, глутаревой, фталевой, винной, метансульфокислотой, бензолсульфокислотой, бензойной, салициловой, трифторуксусной кислотой и т.п. В другом варианте соли могут быть образованы за счет образования соли по группе карбоновой кислоты, представленной символом У, с таким соответствующим основанием, как, например, гидроксид или карбонат щелочного металла, или таким органическим амином, как моно-, ди- или три-/низший алкил/амин, моно-, ди- или три-//гидрокси-низший алкил/амин.

Внутренними солями аглюкодальбагептидов формулы /I/ являются те соли, которые получаются при внутреннем солеобразовании в случае, когда одновременно присутствуют основная /например, амино/ и кислотная /например, карбоксильная/ функциональные группы достаточной силы в одном соединении.

В вышеуказанной формуле /I/ и в других соответствующих формулах в этом описании и в формуле изобретения хиральный центр каждой из пяти основных арил- и арилметил-аминокислот аглюкодальбагептидов имеет ту же абсолютную конфигурацию, что и конфигурация соответствующей аминокислоты в природном дальбапептиде, из которого был получен исходный материал /II/.

Хиральные центры, которые вводятся в аглюкодальбагептиды настоящего изобретения при синтезе, отмечены индексами 3 и 15, соответственно, в вышеприведенной формуле /I/ и могут быть как в R, так и в S абсолютной конфигурации, в зависимости от абсолютной конфигурации аминокислоты, которую включают в молекулу.

Однако, в соответствии с предпочтительным вариантом настоящего изобретения вводимого хирального центра, обозначенная индексом 3, является S-конфигурацией, тогда как конфигурация хирального центра, отмеченного индексом 15, может быть как R, так и S, но более предпочтительно, R конфигурацией.

Наиболее предпочтительная группа аглюкодальбагептидных антибиотиков настоящего изобретения содержит производные формулы /Iа/.

где Y представляет карбоксильную группу или производное низшего алкилового сложного эфира указанной карбоксильной группы;
R и R₁ каждый независимо представляет водород или группу, защищающую амино-функцию, предпочтительно, водород;
R₂ представляет водород;
R₆ представляет водород;
R₇ и R₈ каждый независимо представляет водород или хлор;
R₉ представляет водород или гидрокси; предпочтительно, водород;
R₁₀ представляет водород или гидрокси; и
их соли с кислотами и основаниями, предпочтительно, их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами и основаниями, а также их внутренние соли.

В соответствии с настоящим изобретением способ получения аглюкодальбагептидных антибиотиков формулы /I/ ведут в соответствии со схемой реакции 1.

В схеме 1 реакции символы W и Z имеют те же значения что и ранее, тогда как термин "функц. производное карбокси" относящийся к символу Y означает, что этот символ представляет функциональное производное карбоксильной группы, как указано ранее, включая защищенные карбоксильные группы, защиту у которых можно удалить в конце процесса.

Первая стадия /a/ схемы 1 реакции включает селективную защиту аминогруппы, представленной символом R₄ в тетрапептиде /TP/ формулы /IIa/ до получения TP формулы /IIb/.

Указанную селективную защиту можно осуществить, например, защищая вначале более реакционноспособную аминогруппу, обозначенную символом R₃ в TP формулы /IIa/, затем, защищая аминогруппу, обозначенную символом R₄, защитной группой другого типа, которая не отщепляется в условиях, необходимых для последующего удаления защиты у аминогруппы, представленной символом R₃.

Эта последняя операция приводит к получению соединения TP /IIb/, где R₄ представляет защищенную аминогруппу, а R₃ является свободной аминогруппой, способной реагировать с выбранным производным аминокислоты, то есть, N-защищенным фенилаланином, до получения пентапептида /PP/ в соответствии со стадией /b/ схемы реакции. Эта стадия завершается удалением N-защищающей группы N-защищенного фенилаланинового предшественника, что приводит к получению PP формулы /III/.

Осуществление вышеуказанной реакции на стадии /b/ включает осуществление таких условий реакции, когда присутствие свободной карбоксильной группы в положении Y отрицательно влияет на ход реакции. Поэтому, предпочтительно, использовать такое TP производное /IIb/, где Y представляет функциональное производное указанной карбоксильной группы, во избежание любого нежелательного взаимодействия со свободной карбоксильной группой, если используют условия конденсации для сочетания N-защищенного фенилаланина с TP /IIb/ с получением PP /III/.

По аналогичным соображениям, предпочтительно, сохранять защиту карбоксильной группы, представленной символом Y, также и на последующих стадиях, включающих образование других пептидных связей.

При осуществлении вышеуказанных стадий реакции, а также и последующих реакций нет необходимости обеспечивать защиту фенольных или бензильных карбоксильных групп, которые могут находиться в частях W и Z, TP и PP. Однако, если эти защищающие группы исходно присутствуют в TP формулы /II/, как полученные в соответствии с международной опубликованной заявкой WO 92/10517, они могут сохраняться на протяжении всех последующих реакций, и их можно необязательно отщепить в конце всего процесса, если получают аглюкодальбагептид /Ib/ или /Ic/.

Следующая стадия /c/ включает внутримолекулярную конденсацию свободной аминогруппы PP /III/ и карбоксильного фрагмента COOR₅, где R₅ представляет водород. Также и в этом случае на ход реакции может оказать отрицательное влияние наличие дополнительной свободной карбоксильной группы в положении Y PP. Действительно, такая дополнительная карбоксильная группа может принять участие в реакциях внутримолекулярной конденсации со свободной аминогруппой, что может привести к образованию нежелательных побочных продуктов. Поэтому в таком случае особенно важно сохранять защиту у таких карбоксильных групп, как было указано ранее. Стадия /c/ включает также удаление защиты у аминогруппы, представленной символом R₄ для получения промежуточного гексапептида /HP/ формулы /IV/.

Следующая стадия /d/ включает присоединение второй аминокислоты за счет конденсации с Nα, Nε^--защищенным производным лизина, до получения производного аглюкодальбагептида /Ib/, который на последующей стадии /e/ может быть подвергнут удалению N-защитной группы лизинового фрагмента. При желании, если Y представляет легко отщепляемую защитную карбоксигруппу, можно удалить защиту у указанной защищенной карбоксигруппы, что приведет к получению аглюкодальбагептида /Ic/, где Y представляет карбоксильную группу.

В нижеприводимом описании дано более подробное описание каждой стадии осуществления вышеописанного способа.

Стадия /а/:
Основным моментом осуществления указанной стадии /а/ является выбор реагента, подходящего для введения защитной группы первичной аминофункции, который преимущественно реагирует с аминогруппой, представленной символом R₃ формулы /IIa/.

В отношении этого желательного эффекта было обнаружено, что удовлетворительная селективность и выходы достигаются при использовании ди-трет.-бутилдикарбоната в качестве реагента, образующего N-защитную группу.

Этот реагент подвергают взаимодействию /в Примерно эквимолярном соотношении/ с TP формулы /IIa/ в растворе, состоящем из смеси воды и инертного, смешивающегося с водой органического растворителя, предпочтительно выбранного из низших спиртов, ацетона, тетрагидрофурана, диоксана и диметоксиэтана, при температуре от -5 до 20^oC, предпочтительно, от 0^o до 10^oC, при pH от 6 до 8, предпочтительно, от 6,5 до 7,5.

Соотношение воды и органического растворителя меняется в интервале от 1: 9 до 9:1, и предпочтительно, от 4:6 до 6:4.

Целевой продукт формулы /IIa/, где R₃ представляет трет.-бутоксикарбониламиногруппу /все остальные символы имеют те же значения, что указаны в схеме реакции 1/, обычно получают вместе с небольшим количеством побочного продукта формулы /IIa/, где оба R₃ и R₄ представляют трет.-бутоксикарбониламино фрагменты.

Побочный продукт можно легко отделить из целевого монозащищенного продукта, например, экстрагируя кислотную водную смесь, содержащую оба продукта, несмешивающимся с водой растворителем.

Выделенный побочный продукт можно превратить в незащищенный исходный материал за счет кислотного гидролиза /например, трифторуксусной кислотой/. Регенерированный исходный материал, в свою очередь, снова подвергают взаимодействию с ди-трет.-бутилдикарбонатом в вышеуказанных условиях. При необходимости процесс регенерирования побочного продукта после реакции в ди-трет. -бутилдикарбонатом можно повторять дважды или трижды для получения высокого выхода целевого моно-защищенного продукта.

Затем моно-защищенный продукт вводят в следующий промежуточный процесс для защиты свободной аминогруппы, представленной символом R₄, защитной группой, которая не отщепляется в условиях кислотной обработки, которые необходимы для удаления трет-бутоксикарбонильной группы. Реагенты, которые можно использовать для достижения желаемого эффекта, можно выбрать из тех, которые образуют карбаматные производные.

Примеры таких реагентов и соответствующие условия реакций описаны, например, в книге T. W. Creene and P.GM.Wuts: "Protectike Croups in Organic Synthesis" Slcoud edition J.Wiley N.Y., 1991 /см. стр. 315-348/.

Соответственно, нижеследующие защитные группы являются наиболее подходящими для защиты аминогруппы, обозначенной символом R₄ в TP формулы /IIb/: 9-фторенилметоксикарбонил, 9-/2-сульфо/фторенилметоксикарбонил, 9-/2,7-ди-бром/фторенилметоксикарбонил, 2,7-дитрет. -бутил/9-10,10-диоксо-тиоксантенил//метоксикарбонил, 1,1-диметил-2,2-дибромэтоксикарбонил, 1,1-диметил-2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, аллилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, пара-нитробензилоксикарбонил, пара-бромбензилоксикарбонил, 2,4-дихлорбензилоксикарбонил и 4-метилсульфинилбензилоксикарбонил.

В соответствии с предпочтительным вариантом настоящего изобретения бензилоксикарбонильный радикал используют в качестве защитной группы аминофункции, представленной радикалом R₄ формулы /IIa/. Для этой цели вышеуказанный моно-защищенный TP формулы /IIa/, где R₃ представляет трет.-бутоксикарбониламино фрагмент, подвергают взаимодействию с подходящим реагентом, способным вводить такую бензилоксикарбонильную группу в аминофункцию, например, бензилхлорформиат, в присутствии избытка мягкого основания, например, бикарбоната натрия, бикарбоната калия или три-/низший алкил/амина.

Реагент, обеспечивающий N-защищающую группу, обычно используют в эквимолярном количестве по отношению к TP. Однако в некоторых случаях может оказаться необходимым использовать количество, несколько превышающее молярный эквивалент /вплоть до 20 %/ такого реагента для завершения реакции.

Реакцию обычно ведут в присутствии растворителя, предпочтительно, состоящего из смеси воды и смешивающегося с водой инертного органического растворителя, такого как те, которые указаны ранее для введения трет-бутоксикарбонильного фрагмента. Температуру реакции поддерживают в интервале от 0^o до 50^oC, предпочтительно, от 15^o до 30^oC. Ди-защищенный TP, полученный указанным ранее способом, подвергают затем кислотной обработке, подходящей для селективного удаления трет.-бутоксикарбонильной группы.

Такая обработка состоит, например, в осуществлении взаимодействия ди-защищенного TP с избытком сухой трифторуксусной кислоты при температуре от 5 до 30^oC в течение 5-25 минут.

TP формулы /IIb/, где R₄ представляет оксикарбониламино фрагмент /все остальные символы имеют те же значения, которые указаны в схеме реакции 1/ выделяют затем из реакционной среды известными per е специалистам способами.

Стадия /Ib/: Эта стадия состоит в осуществлении взаимодействия N-защищенного TP формулы /IIb/ с подходящим производным фенилаланина. Такое производное должно быть защищено по аминогруппе, и должно содержать группу, активирующую карбоксильный фрагмент, для промотирования процесса конденсации. Защитная группа аминофрагмента в фенилаланине должна отличаться от защитной группы в R₄ части TP, так как ее следует удалять на следующей стадии в условиях, которые не влияют на R₄ часть.

Решение этой проблемы состоит в использовании группы, образующей карбамат, которую использовали на предшествующей стадии /а/. Поэтому трет.-бутоксикарбонильный фрагмент и является одним из наиболее предпочтительных N-защитных групп для фенилаланина.

Активированную группу N-защищенной карбоксильной группы фенилаланина можно выбрать из групп, которые образуют обычные активированные сложноэфирные фрагменты.

Примерами активированных сложных эфиров являются те, которые описаны вообще как аминокислотные сложные эфиры для реакций пептидного сочетания в книге L.F.Fieser and M.Fieser, "Reagent for organic Synthesis" J.Wiley, New-York.

Реагенты, образующие активированные сложные эфиры, которые можно использовать для активации карбоксильной функции N-защищенного фенилаланина, описаны, например, R.Schwyser et al. in Helv. Chim. Acta., 1955, 38, 69-70, и включают следующие:
ClCH₂CN, BrCH₂COOC₂H₅, BrCH/COOC₂H₅/₂, ClCH₂COCH₃,

Другие группы, активирующие карбоксильную функцию N-защищенного фенилаланина, которые можно использовать в способе настоящего изобретения, представляют сложные эфиры карбоксильной группы следующих гидроксильных соединений, приведенных в конце описания ( как указано I.Iones в "The Chemical Synthesis of Peptides", pp. 55-58, Clarendon Press-Oxford /1991/).

В соответствии с одним предпочтительным вариантом настоящего изобретения сложный эфир N-защищенного фенилаланина с N-гидроксисукцинимидом используют для реакции конденсации с TP формулы /IIb/.

Реакцию конденсации ведут в обычных условиях, необходимых для образования полипептидов. Обычно два реагента контактируют в Примерно эквимолярных количествах/ в присутствии Примерно эквимолярного количества органического третичного амина, например, три-/низший алкил/амина, если аминогруппа R₃в соединении /IIb/ находится в форме соли присоединения кислоты/ в органическом растворителе при температуре от 5 до 35^oC, предпочтительно, от 15 до 25^oC. Органический инертный растворитель обычно выбирают из органических амидов /например, диметилформамида/, полиэфиров /например, диметоксиэтана/, циклических эфиров /например, тетрагидрофурана/, низших алифатических сложных эфиров /например, этилацетата/ и диметилсульфоксида. Предпочтительным растворителем является диметилформамид.

Ди-защищенное PP производное, которое участвует в следующей реакции конденсации, обрабатывают затем в условиях, промотирующих отщепление N-защищенной аминогруппы фенилаланинового остатка, не затрагивая при этом N-защищенной аминогруппы R₄, в результате чего получают PP формулы /III/. В том случае, если аминогруппа фенилаланина защищена за счет образования трет.-бутилкарбамата, a R₄ представляет бензилоксикарбониламино, предпочтительная обработка в основном такая же, что и в конце стадии /а/ для удаления защитной трет-бутоксикарбонильной группы R₃ аминофрагмента соответствующего TP.

Стадия /c/:
Моно-защищенный PP /III/, образовавшийся в предыдущей реакции, подвергают внутримолекулярной конденсации для получения пептидной связи между свободной аминогруппой фенилаланинового фрагмента и карбоксильной группой COOR₅, где R₅ представляет водород.

Внутримолекулярная конденсация, очевидно, происходит только в хорошо определенных условиях, при выборе соответствующего конденсирующего агента, растворителей, соотношений реагентов и температуры. Внутримолекулярная реакция происходит за счет активации карбоксильной группы COOR₅ PP формулы /III/ за счет взаимодействия с N-гидроксибензотриазолом в присутствии дициклогексилкарбодиимида. Условия для образования активированного карбоксипроизводного PP требуют, чтобы перед взаимодействием с N-гидроксибензотриазолом была получена соль карбоксигруппы COOR₅ с таким органическим третичным амином как диэтиламин, N-метилпирролидон, N-метилпиперазин или N-метилморфолин. PP, органический амин и N-гидроксибензотриазол используют Примерно в эквимолярных количествах, тогда как дициклогексилкарбодиимид используют в 10-20% молярном избытке. Реакцию, предпочтительно, ведут в смеси растворителей, состоящей из диметилформамида и дихлорметана Примерно в равных объемах. Температуру реакции поддерживают в интервале от 10 до 35^oC в течение достаточного промежутка времени для завершения внутримолекулярной конденсации. Не обходимое время можно определить в ходе реакции с помощью обычных аналитических систем, которые включают ТСХ и ВЭЖХ.

Твердый продукт, выделенный из этой реакции можно очистить с помощью хроматографической колонки с обращенной фазой, например, на силикагеле, используя линейный градиент от 10 до 70% ацетонитрила в воде, и контролируя собираемые фракции с помощью ВЭЖХ. Фракции, содержащие чистый N-защищенный HP объединяют, и, после концентрирования, продукт переосаждают, добавляя растворитель в котором продукт нерастворим /например, диэтиловый эфир/. Неорганические примеси, которые могут присутствовать в осажденном продукте, можно удалить, добавляя продукт к диметилсульфоксиду, фильтруя суспензию и лиофилизуя прозрачный фильтрат.

Затем N-защищенный HP превращают в HP соединение формулы /IV/, удаляя защитную группу аминофрагмента, обозначенного как радикал R₄. Указанную защитную группу можно исключить, используя способы, предлагаемые в специальной литературе, касающейся указанных ранее N-защитных групп. Если N-защищающая группа аминофункции, обозначенной как радикал R₄ представляет бензилоксикарбонильную группу, удаление такой защитной группы обычно осуществляют каталитическим гидрированием при атмосферном давлении и комнатной температуре в присутствии органического растворителя или смеси органических растворителей и предпочтительно водной минеральной кислоты /например, 1н. HCl/. В таком случае HP формулы /IV/ выделяют из отфильтрованного гидрированного раствора в виде соли с указанной минеральной кислотой.

Стадия /d/:
HP формулы /IV/ со стадии /c/ конденсируют с N^L,N^E- защищенным производным лизина, активированным по карбоксильной группе. Как для N-защищенной, так и для активированной карбоксильной группы лизина используют те же реагенты, что и для N-защиты и карбокси-активации фенилаланина на стадии /b/. Условия реакции и общие соотношения реагентов, а также способ выделения практически такие же, как и в указанном ранее случае.

В результате такой конденсации получают аглюкодальбагептид формулы /Ib/, в котором каждая из двух аминогрупп лизиновой части имеет N-защитную группу.

Стадия /e/:
Эта стадия предназначена для удаления двух защитных групп аглюкодальбагептида /Ib/. При этом удалении не возникает особых проблем. В частности, если такие N-защитные группы представляют трет.-бутоксикарбонильные фрагменты, удаление осуществляют практически такой же обработкой трифторуксусной кислотой, как было описано для удаления трет.-бутоксикарбонильного фрагмента фенилаланиновой части PP, полученного на стадии /c/. Аглюкодальбагептид /Ic/ можно получить в результате вышеуказанной обработки в виде свободного основания, если остаток выпаренного раствора трифторуксусной кислоты обрабатывают водным щелочным раствором при pH 8,5. Свободное основание аглюкодальбагептида можно далее очистить с помощью хроматографической колонки с обращенной фазой, используя практически ту же методику и условия, что на стадии /c/ для очистки HP формулы /IV/.

Аглюкодальбагептид формулы /Ic/, если Y представляет защищенную карбоксильную функцию, при желании можно превратить в соответствующее производное свободной гидрокси, удаляя защитную группу.

Так, например, если защищенная карбоксильная группа представляет сложный эфир низшего спирта, гидролиз такого сложного эфира можно вести, суспендируя продукт в тетрагидрофуране, и добавляя молярный избыток /10-50%/ 1н NaOH при комнатной температуре. Вышеуказанные условия не влияют на другие части молекулы.

Если заместитель Y аглюкодальбагептида /Ic/ представляет функциональное производное карбоксильной группы, которое нелегко расщепляется в мягких условиях, такую функцию оставляют немодифицированной в конечном соединении, однако оно все равно составляет часть настоящего изобретения.

Если аглюкодальбагептид /Ic/ в качестве заместителя Y содержит карбоксильную группу, его можно превратить в производное аглюкодальбагептида формулы /Ic/, где Y представляет функциональное производное такой карбоксильной функции /например, сложный эфир или амид/, как указано ранее. Способы получения таких функциональных производных из соответствующего свободнокарбоксильного соединения подробно описаны в литературе, посвященной дальбагептидам. В частности, см. следующие патентные заявки: EPA публикации 216775, 340245, 370283, 376041, 351685, 460448 и международная патентная публикация WO 93/0360. В конкретном представленном Примере осуществления вышеуказанной схемы реакции 1, TP формулы /IIa/, полученный из аглюкотеикопланина используют в качестве исходного материала. Указанный TP имеет следующую структурную формулу:
Nα, Nε
и в последующем описании фигурирует как метиловый сложный эфир ATTP. Для ясности и лучшего понимания Примеров, которые следуют за этим описанием, в вышеуказанной формуле атомы азота двух различных аминогрупп обозначены буквами B и A, соответственно.

В соответствии с многостадийным процессом, описанным ранее, и, используя соответствующие защищенные аминокислоты L-фенилаланин и D-лизин на стадиях /b/ и /d/, соответственно, было получено следующее соединение, соответствующее общей формуле /Ic/:

в котором хиральные центры, обозначенные индексами 3 и 15, имеют соответственно, S и R абсолютную конфигурацию.

В процессе этой реакции получают соответствующие PP и HP промежуточные соединения формул /III/ и /IV/, которые могут быть обозначены как N^B-защищенный-/L-фенилаланил/³-ATPP метиловый сложный эфир и /L-фенилаланил/³ метиловый сложный эфир, соответственно.

Вышеуказанное соединение может быть названо /L-фенилаланил/³-/D-лизил/¹⁵-аглюкотеикопланиндальбагептида метиловым сложным эфиром [/L-фенилаланил/³-/D-лизил/¹⁵-АТДН метиловым сложным эфиром/, где цифры 3 и 15 показывают, что аминокислотные фрагменты, содержащие атомы углерода под номерами 3 и 15 в аглюкотеикопланина основном скелете в соответствии с классификацией A. Malabaroa et.al.J. Antibiotics 42, 1684-1697 /1989/ заменены на L-фенилаланиновый и D-лизиновый фрагмент, соответственно. Абсолютная конфигурация хиральных центров, обозначенных цифрами 3 и 15, является S и R, соответственно, как было указано ранее.

Это соединение демонстрирует значительную антимикробную активность в экспериментах in vitro, как видно из таблицы 1, в которой в качестве сравнительных соединений использованы теикопланин и теикопланинагликон.

In vitro антибактериальную активность соединений определяют с помощью стандартных тестов разбавления агара в микротитре. Для всех бактерий кроме Streptococcu /Todd-Wewitt бульон, Difco/ и enterococci /Mueller-Hintou, Difco/ используют Yso-Seusites бульон /Oxforo/. Культуры бульонов разбавляют таким образом, чтобы финальный инокулюм составлял бы около 5·10⁵ cfu /мл/ colony forming units per ml = колонии образующих единиц на мл/. Все микроразбавления бульона MIC проводят в присутствии 0,01% альбумина бычьей сыворотки /Pentax fraction Y.Sigma/. MIC/ минимальная ингибирующая концентрация представляет собой самую низкую концентрацию, при которой не наблюдается видимого роста после инкубирования при 37^oC в течение 18-24 часов.

Вышеуказанный синтетически полученный аглюкодальбагептид, сохраняя практически тот же уровень активности, что и теикопланингликон, против большинства бактерий, которые обычно чувствительны к дальбагептидам, оказывается неожиданно активным также против клинического изолята Enterococcus faecalis , который устойчив как к теикопланину, так и к теикопланинагликону.

Используя способ настоящего изобретения, и выбирая в качестве исходного материала другие TP соединения, которые можно получить в соответствии с международной патентной публикацией WO 92/10517, можно получить ряд синтетических аглюкодальбагептидов формулы /I/.

Более того, соединения формулы /I/ с различными конфигурациями C₃ и C₁₅ можно получить, используя фенилаланин и лизин /исходные материалы/ с соответствующей хиральностью. Если используют рацемические материалы аминокислот, получают смеси диастереоизомеров формулы /I/.

Соединения настоящего изобретения можно использовать в качестве активных ингредиентов антимикробных препаратов, используемых в медицине и ветеринарии для предотвращения и лечения инфекционных заболеваний, вызываемых патогенными бактериями, которые подвержены действию указанных активных ингредиентов, в частности, для лечения заболеваний, вызываемых штаммами Streptococci, Staphylococci и Enterococci, включая Enterococci faecalis штаммы, устойчивые к теикопланину, и антибиотикам, которые в настоящее время используют для лечения серьезных инфекционных заболеваний.

Соединения настоящего изобретения можно вводить орально, местно или парэнтерально, причем предпочтителен парэнтеральный способ введения.

В зависимости от способа введения, эти соединения можно приготовить в различных дозировочных формах.

Препараты для перорального введения могут быть в форме капсул, таблеток, жидких растворов или суспензий. Как известно специалистам, капсулы и таблетки могут содержать в дополнение к активному ингредиенту, такие обычные эксципиенты, как разбавители, например, лактозу фосфат кальция, сорбитол и т.п. ; смазывающие агенты, например, стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль; связывающие агенты, например, поливинилпирролидон, желатин, сорбитол, трагакант, акация; вкусовые агенты и приемлемые разрыхляющие и смачивающие агенты. Жидкие препараты, обычно в форме водных или масляных растворов или суспензий, могут содержать такие обычные добавки, как суспендирующие агенты.

Для местного нанесения соединения настоящего изобретения могут также быть получены в подходящих формах для поглощения через слизистые мембраны тканей носа, горла или бронхов, и обычно могут иметь форму жидких спреев или препаратов для ингаляций или для смазывания горла.

Для лечения глаз или ушей эти препараты могут быть представлены в жидкой или полужидкой форме. Препараты для местного нанесения могут быть приготовлены в гидрофобных или гидрофильных основах в виде мазей, кремов, лосьонов, суспензий или порошков.

Для ректального введения соединения настоящего изобретения приготавливают в виде суппозиториев в смеси с обычными носителями, такими, как, например, масло какао, воск, спермацет или полиэтиленгликоли и их производные.

Композиции для инъекций могут принимать форму суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях, и могут содержать такие композиционные агенты, как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

В другом варианте, активный ингредиент может иметь форму порошка для смешивания его перед применением с подходящим носителем, например, стерильной водой.

Количество вводимого активного ингредиента зависит от различных факторов, таких как вес и состояние подлежащего лечению пациента, способа и частоты введения, и причины заболевания.

Соединения настоящего изобретения обычно эффективны в дозах от около 1 до около 40 мг активного ингредиента на 1 кг веса тела.

В зависимости от характеристик конкретного соединения, инфекции и пациента, эффективную дозу можно вводить в виде одной дозы раз в день, или 2-4 раза в день, разделив эту дозу на части. Наиболее предпочтительны композиции, которые приготовлены в форме единичных доз, содержащих от около 30 до около 500 мг соединения на дозу.

Пример 1. Получение метилового сложного эфира N^B-бензилоксикарбонил-аглюкотеикопланинтетрапептида /N^B-CBZ-ATTP метилового сложного эфира; схема реакции 1, формулы /IIb/
i/ Получение метилового сложного эфира N^A-трет-бутоксикарбонилаглюкотеикопланинтетрапептида /N^A-трет.-BOC-ATTP метилового сложного эфира/
Перемешиваемый раствор 3 г /около 3 ммолей/ ATTP метилового сложного эфира /синтез этого соединения описан в международной публикации заявки WO 92/10517/ в 100 мл смеси диоксан:вода 1:1 доводят до pH 7, добавляя NaHCO₃. Затем прикапывают раствор 0,65 г /около 3 ммолей/ ди-трет.-бутилдикарбоната в 20 мл диоксана, охлаждая при этом до 0^oC. Реакционную смесь перемешивают при 0^oC в течение 18 часов, а затем выливают в 400 мл смеси вода:этилацетат 1:1.

После доведения pH до 3 с помощью 1н HCl: a/ органический слой выделяют, промывают водой /3 х 100 мл/, сушат над сульфатом натрия, а затем концентрируют при 30^oC при пониженном давлении до небольшого объема /около 25 мл /. После добавления диэтилового эфира /100 мл/ твердый осадок собирают, получая 1,4 г побочного продукта N^A,N^B-ди/трет.-BOC/-ATTP метилового сложного эфира /ВЭЖХ: способ A, t_R 25,2 минуты/;
b/ водную фазу экстрагируют равным объемом бутанола, и слой бутанола концентрируют при 40^oC при пониженном давлении до небольшого объема /около 30 мл/. После добавления 100 мл диэтилового эфира твердый осадок собирают, получая 1,5 г N^A-трет.-BOC-ATTP метилового сложного эфира /таблица 2, соединение 1; ВЭЖХ: способ A, 16,4 минуты/.

Вышеуказанный ди-защищенный побочный продукт N^A,N^B-ди-/трет.-BOC/-ATTP метиловый сложный эфир /1,4 г/ обрабатывают 50 мл трифторуксусной кислоты при комнатной температуре /10 мин/ для регенерации ATTP метилового сложного эфира /1,15 г/, который затем превращают в 0,7 г N^A-трет.-BOC-ATTP метиловый сложный эфир и 0,5 г вышеуказанного побочного продукта в тех же условиях. Повторяя этот процесс трижды, общий выход превращения ATTP метилового сложного эфира в N^A-трет.-BOC-ATTP метиловый сложный эфир составляет около 80%.

ii/ Получение N^A-трет-бутоксикарбонил-N^B- бензилоксикарбонилаглюкотеикопланин-тетрапептида метилового сложного эфира -/N^A-трет-BOC-N^B-CBZ-ATTP метиловый сложный эфир/.

К перемешиваемому раствору 2,35 г /около 2,3 ммоля/ N^A-трет-BOC-ATTP метилового сложного эфира в 100 мл смеси диоксан:вода 1:1, pH которого доводят до 7 твердым бикарбонатом натрия, прикапывают раствор 0,32 мл /около 2,3 ммоля/ бензилхлорформиата в 10 мл диоксана при комнатной температуре за 10 минут. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем выливают в 150 мл воды. Полученный мутный раствор доводят до pH добавлением 1н HCl, и экстрагируют 200 мл этилацетата. Выделяют органический слой, сушат над сульфатом натрия, а затем концентрируют при 30^oC при пониженном давлении до небольшого объема /около 20 мл/. При добавлении диэтилового эфира /100 мл/ выпадает осадок, который собирают, получая 2,4 г N^A-трет. -BOC-N^B-CBZ-ATTP метиловый эфир /таблица 2, соединение 2; ВЭЖХ: способ B, t_R 11,8 минуты/.

iii/ Получение N^B-CBZ-ATTP метилового сложного эфира
Раствор N^A-трет.-BOC-N^B-CBZ-ATTP метилового сложного эфира /2,4 г/ в 100 мл сухой трифторуксусной кислоты перемешивают при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем растворитель выпаривают при 35^oC при пониженном давлении. Маслянистый остаток растворяют в 300 мл смеси вода:этилацетат 1:1. Органический слой выделяют, дважды промывают водой /2 х 150 мл/, сушат над сульфатом натрия, а затем концентрируют при 40^oC при пониженном давлении до небольшого объема /около 15 мл/. При добавлении 100 мл диэтилового эфира твердый осадок собирают до получения 2 г N^B-CBZ-ATTP метилового сложного эфира в виде трифторацетата /таблица 2, соединение 3, аналитические данные приведены для свободного основания; ВЭЖХ, способ B t_R 8,3 минуты/.

Пример 2. Получение метилового сложного эфира N^B-бензилоксикарбонил-/L-фенилаланил/³- аглюкотеикопланинпентапептида N^B-CBZ-/L-фенилаланил/³-ATPP метилового сложного эфира; схема реакции 1, формулы /III//
i/ Получение метилового сложного эфира N^B-бензилоксикарбонил- /N-трет. -бутоксикарбонил-L-фенилаланил/³-аглюкотеикопланин- пентапептида /N^B-CBZ-/N-трет.-BOC-L-фенилаланил/³-ATPP метилового сложного эфира/.

К перемешиваемому раствору 1 г /около 0,9 ммолей/ N^B-CBZ-ATTP метилового сложного эфира трифторацетата в 20 мл диметилформамида, добавляют при комнатной температуре 0,13 мл /около 0,9 ммоля/ триэтиламина, а затем 0,34 г /около 0,9 ммоля/ сложного эфира N-трет.-BOC-L-фенилаланина с N-гидроксисукцинимидом /Sigma Chemical Co., St.Louis, USA/. После 3 часов перемешивания при комнатной температуре добавляют 100 мл воды, и pH полученного раствора доводят до 3 добавлением 1н HCl. В результате экстрагирования н-бутанолом /100 мл/ и выпаривания органического слоя получают 0,9 г N^B-CBZ-/N-трет.-BOC-L-фенилаланил/³-ATPP метилового сложного эфира /таблица 2, соединение 4; ВЭЖХ: Способ B, t_R 14,9 минуты/;
ii/ Получение /N^B-CBZ-/L-фенилаланил/³-ATTP метилового сложного эфира
Раствор N^B-CBZ-N-трет.-BOC-L-фенилаланил/³-ATPP метилового сложного эфира /220 мг/ в 10 мл сухой трифторуксусной кислоты перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем растворитель выпаривают при 30^o С при пониженном давлении. Маслянистый остаток суспендируют в диэтиловом эфире до получения 200 мг N^B-CBZ-/L-фенилаланил/³-ATPP метилового сложного эфира в виде трифторацетата /таблица 2, соединение 5, аналитические данные приведены для свободного основания; ВЭЖХ, Способ B, t_R 10,2 минуты/.

Пример 3. Получение метилового сложного эфира /L-фенилаланил/³-аглюкотеинкопланингексапептида /L-фенилаланил/³-ATHP метилового сложного эфира; схема реакции 1, формула /IV//.

Получение метилового сложного эфира N^B-бензилоксикарбонил- /L-фенилаланил/³-аглюкотеикопланингексапептида /N^B-CBZ-/L-фенилаланил/³-ATHP метилового сложного эфира/.

К перемешиваемому раствору 0,4 г /около 0,34 ммоля/ N^B-CBZ-/L-фенилаланил/³-ATPP метилового сложного эфира в 40 мл смеси диметилформамида: дихлорметана 1: 1 добавляют 0,047 г /около 0,34 ммоля/ N-гидроксибензотриазолгидрата и 0,038 мл /около 0,34 ммоля/ N-метилморфолина при комнатной температуре, а затем 0,085 г /около 0,4 ммоля/ дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, а затем растворитель - дихлорметан выпаривают при 30^oC при пониженном давлении. После этого добавляют смесь /200 мл/ воды:этилацетата 1:1 по каплям при перемешивании, pH полученной смеси доводят до 3 добавлением 1н HCl, и нерастворимую часть отфильтровывают. Выделяют органический слой, и растворитель выпаривают при 35^oC при пониженном давлении. Твердый остаток растворяют в 50 мл смеси вода:ацетонитрил:н-бутанол 1:1:2 и при перемешивании добавляют 5 г силанизированного /Silanized/ силикагеля 60 /0,06-0,2 мм, Merck/. Спустя 30 минут растворители выпаривают при 45^oC при пониженном давлении, а твердый остаток помещают в колонку с 35 г того же силанизированного силикагеля в воде. Колонку проявляют линейным градиентом от 10 до 70% ацетонитрила в воде за 15 часов при скорости потока 100 мл/час, в результате чего собирают 10 мл фракции, которые контролируют с помощью ВЭЖХ.

Фракции, содержащие чистое, указанное в заглавии соединение собирают и добавляют равный объем н-бутанола. Полученный раствор концентрируют при 40^oC при пониженном давлении до небольшого объема /около 10 мл/, а затем добавляют 100 мл диэтилового эфира. Выпавшую в осадок твердую часть собирают и добавляют к 20 мл диметилсульфоксида. Полученную суспензию фильтруют и прозрачный фильтрат лиофилизируют, получая 0,11 г чистого N^B-CBZ-/L-фенилаланил/³-ATHP метилового сложного эфира /таблица 2, соединение 6; ВЭЖХ: способ B, t_R 22,6 минуты/.

Данные ¹H-ЯМР спектра / , мл/ для протонов приведены далее /идентификация протонов проведена в соответствии со статьей J. C. J. Barna et al. J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 4895-4902/: 8,69 /w₅/, 8,65 /w₇/, 8,38 /w₄/, 7,87 /6b/, 7,70 /w₃/, 7,45 /w₂/, 6,60 /w₆/, 6,44 /7d/, 6,23 /4b/, 6,10 /7f/, 5.82 /x₄/, 5,40 /4f/, 5,13 /z₆/, 4,97 /CBZ-СH₂/, 4,60 /x₂/, 4,60 /x₅/, 4,54 /x₇/, 4,25 /x₃/, 4,24 /x₆/, 3,71 /COO-CH₃/, 2,85, 2,72 /z₂, z₂'/, 2,43, 2,25 /Phe-CH₂/.

ii/ Получение /L-фенилаланил/³-ATHP метилового сложного эфира
Раствор 1,8 г /около 1,5 ммоля/ N^B-CBZ-/L-фенилаланил/³- ATHP метилового сложного эфира в 120 мл смеси метанол:1н HCl:диметилформамид 6:2:1 гидрируют /1 атм. , 25^oC в присутствии 1,5 г 5% Pd/C. Катализатор отфильтровывают, а метанол выпаривают при 35^oC при пониженном давлении; затем добавляют 100 мл воды, и полученный раствор экстрагируют 150 мл этилацетата. Органический слой сливают, а полученную водную суспензию экстрагируют 130 мл н-бутанола. Бутанольную фазу выделяют и концентрируют при 30^o С при пониженном давлении до объема около 20 мл. После добавления 150 мл диэтилового эфира выпавшую в осадок твердую часть собирают, и получают 0,65 г /L-фенилаланил/³-ATHP метилового сложного эфира в виде гидрохлорида /ВЭЖХ: способ B, t_R 17,5 минуты, титр около 75%/, который используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

Пример 4. Получение метилового сложного эфира /L-фенилаланил/³-/D-лизил/¹⁵ аглюкотеикопланиндальбагептида[/L-фенилаланил/³- /D-лизил/¹⁵-ATDH метилового сложного эфира; схема реакции 1 формула /lc/].

i/ Получение метилового сложного эфира /L-фенилаланил/³- δ трет.-бутоксикарбонил/-D-лизил/¹⁵-аглюкотеикопланиндальбагептида [/L-фенилаланил/³ -(Nα, Nε-ди) /трет.-BOC/-D-лизил/¹⁵-ATDH метилового сложного эфира/].

К перемешиваемому раствору 0,29 г неочищенного /L-фенилаланил/³-ATHP метилового эфира гидрохлорида добавляют при комнатной температуре 3 мл диметилформамида, 0,07 мл триэтиламина и 0,19 г сложного эфира -(Nα, Nε-ди ди-/трет. -BOC/-D-лизина с N-гидроксисукцинимидом /полученного по способу, описанному M.J.Marquisee and J.C.Kower, J.Med.Chem. 21: 1198-1194, 1978/. Спустя один день протекания реакции, добавляют 50 мл воды и pH полученной суспензии устанавливают 3 за счет 1н HCl, затем реакционную смесь экстрагируют 50 мл н-бутанола. Органический слой выделяют и промывают 25 мл воды; затем его концентрируют при 45^o С при пониженном давлении до небольшого объема /около 3 мл/. После добавления диэтилового эфира /30 мл/ выпавшую в осадок твердую часть собирают, получая 0,27 г /L-фенилаланил/³ -[Nα, Nε- ди-/трет. -BOC/-D-лизил/¹⁵-ATДH метилового сложного эфира /ВЭЖХ: способ B, t_R 22,5 минуты, титр около 45%/. Соединение используют без дополнительной очистки на конечной стадии.

ii/ Получение /L-фенилаланил/³-/D-лизил/¹⁵-ATHД метилового сложного эфира.

Неочищенный /L-фенилаланил/³ -[Nα, Nε- ди/трет. -BOC/-D-лизил/¹⁵-ATДH метиловый сложный эфир /0,27 г/ растворяют при 10^oC в 5 мл сухой трифторуксусной кислоты. Через 10 минут растворитель выпаривают при 15^oC при пониженном давлении. Маслянистый остаток растворяют в 30 мл смеси метанол: вода 1: 1, а pH полученного раствора доводят до 3 добавлением 1н HCl; затем его вводят в колонку с 50 г силанизированного силикагеля. Обработку на хроматографической колонке проводят в соответствии с представленным выше описанием очистки N^B-CBZ-/L-фенилаланил/³-ATHP метилового сложного эфира в Примере 3, в результате чего получают 0,05 г чистого указанного в заглавии соединения в виде трифторацетата. Затем продукт растворяют в 1 мл воды и pH доводят до 8,5 добавлением 1н HCl. Твердый осадок собирают и промывают водой /2 х 2 мл/, получая указанное в заглавии соединение в виде свободного основания.

/Таблица 2, соединение 7, ВЭЖХ, способ B, t_R 18,3 минуты/.

Данные ЯМР-¹H / δ, мд/ для протонов приводятся далее /трифторацетат/: 1,28, 1,45, 1,68, 2,93 /Lys-CH₂/, 3,71/COO-CH₃/, 4,14-5,34 /пептидные альфа-CH /x1-x7, 4,14 мд приписаны X¹, а 5,34 мд - x₄/, 6,64-8,59 /ароматические протоны и пептидные NH/.

Аналитические методики
1/ Методы ВЭЖХ
Реакционные растворы, элюаты и конечные продукты проверяют с помощью ВЭЖХ на колонке LiChroCART /125 х 4 мм, Merck/ предварительно набитой LiChrospher RP /5 мкм/, используя жидкостной хроматографический насос Varian модель 5500 снабженный 20 мкл петельным инжектором Rheodyne модель 7125 и УФ-детектором с переменной длиной волны. Хроматограммы записывают при 254 нм. Элюирование ведут при скорости потока 1,5 мл/мин, смешивая элюент /a/: 0,2% водный формиат аммония с элюентом /b/: ацетонитрилом, в соответствии со следующей программой линейных постадийных градиентов:
Способ A:
Время /минуты: 0 10 20 30 35 45
% /b/ ы /a/: 5 23 26 35 75 5
Способ B:
Время /минуты/ 0 30 35 40 45
% /b/ в /a/: 20 60 75 75 20
2/ Кислотно-основное титрование
Кислотно-основное титрование осуществляют в следующих условиях: образец растворяют в смеси метилцеллюлоза: вода 4:1, затем добавляют избыток 0,01М HCl в той же смеси растворителей, и полученный раствор титруют 0,01н NaOH.

3/ ¹H-ЯМР
Спектры ¹H-ЯМР записывают в растворе DMSO-d₆ при 303 K /30^oC/ на спектрометре Bruker AM 500, снабженном компьютером Аспект 3000, используя /CH₃/₄Si /б, 0,00 мд/ в качестве внутреннего стандарта.

4/ FAB-MS /Масс-спектр с бомбардировкой быстрыми атомами/
FAB-MS позитивные ионные спектры получают на масс-спектрометре Kratos MS-50 с двойной фокусировкой в массовом интервале 3000 дальтон, используя ускоряющее напряжение 8 кВ. Прибор работает под контролем компьютера. Для получения результатов с высокой точностью используют систему данных DS-90 в "raw data" накоплений (сбор "сырых" данных). Для FAB используют атомную пушку с седлообразным полем с газом Xe /2·10^-5 торр = 2,67·10^-3 Н/м² давлении по показателям на источнике ионов/ при напряжении 6 кВ и токе 1 мА. Образец растворяют в смеси метанол:вода 1:1, содержащей 0,2 н HCl, или, в другом варианте в диметилформамиде. Затем 1 мкл. этого раствора смешивают с 1 мкл тиоглицериновой матрицы, необязательно содержащей 1н уксусную кислоту на мишени.

Пример 5.

Получение внутренних солей.

Получение (L-фенилаланил)³-(D-лизил)¹⁵-ATДH (Соединение 8) омылением сложноэфирной метильной группы.

К перемешиваемой суспензии 120 мг (около 0,1 ммоль) соединения 7 (таблица 2), в виде свободного основания, в 3 мл тетрагидрофурана, по каплям прибавляют раствор 0,5 мл 1N гидроксида натрия в 1,5 мл H₂O при комнатной температуре в течение 5 минут. После перемешивания смеси при комнатной температуре еще в течение 15 минут добавляют 10 мл н-бутилового спирта, рH полученной смеси доводят до 3.5 1N HCl, после чего растворитель выпаривают при 45^oC при пониженном давлении. Твердый остаток растворяют в 2 мл H₂O и pH полученного раствора доводят до 7.25 0.1N NaOH. Осажденный твердый продукт собирают фильтрацией, промывают 1 мл H₂O и затем, сушат при комнатной температуре в вакууме в течение ночи. Получают 77 мг чистого соединения, указанного в заглавии, в виде внутренней соли.

ЖХВР, Способ B, t_R 14.7 минут.

Данные ¹H-ЯМР спектра подтверждают отсутствие метильной сложноэфирной группы (отсутствие сигнала на дельта 3.71 ч/млн).

Структура внутренней соли (отсутствие Nа и Cl неорганических противоионов) подтверждена следующими аналитическими данными:
неорганический остаток (горение при 800^oC в атмосфере кислорода) 0.1%;
анализ на содержание Cl в %: вычислено 6.10, найдено 6.05.

Пример 6.

Получение кислотно- и основно-аддитивных солей и фармацевтически-приемлемых солей.

6.1 Получение кислотно-аддитивных солей (общая методика).

Соединение формулы I в виде свободного основания или внутренней соли может быть превращено в соответствующую кислотно-аддитивную соль суспендированием или растворением его в водном растворителе и добавлением небольшого молярного избытка нужной кислоты. Полученный раствор или суспензию далее лиофилизуют для выделения целевой кислотно-аддитивной соли.

В некоторых случаях, вместо лиофилизации возможно выделение конечной соли осаждением ее при добавлении растворителя, несмешивающегося с водой. В случае, когда конечная соль не растворима в органическом растворителе, в котором свободное основание или внутренняя соль растворимы, конечная соль может быть выделена фильтрованием из органического раствора несолевой формы после добавления стехиометрического количества или небольшого молярного избытка необходимой кислоты.

6.2. Получение гидрохлорида соединения 7.

Соединение 7 в виде свободного основания (0.1 ммоль) суспендируют в воде (10 мл) и, при перемешивании, добавляют 1N HCl 0.25 мл). Образуется прозрачный раствор, который лиофилизуют с получением соединения 7 (0.1 ммоль) в виде гидрохлорида. Анализ на содержание Cl в %: вычислено 11.35, найдено 11.43.

Подобным же образом получены соли с бромоводородной, серной, фосфорной, уксусной, трифторуксусной, аскорбиновой и салициловой кислотами.

6.3. Получение основно-аддитивных солей.

6.4. Получение натриевой соли соединения 8.

Соединение 8 в виде внутренней соли (0.1 ммоль) растворяют в смеси (10 мл) метанол/вода (8/2 об/об), после чего добавляют 1N NaOH (0.1 мл) при перемешивании при комнатной температуре. После добавления 5 мл н-бутилового спирта, растворитель выпаривают при 45^oC при пониженном давлении, получая целевое соединение 8 в виде натриевой соли (0.1 ммоль, твердый остаток после выпаривания растворителя). Образование соли подтверждено кислотно-основным титрованием соляной кислотой (3 эквивалента HCl необходимы для полного титрования одной COO^- и двух NH₂ групп). Подобным образом были приготовлены другие основно-аддитивные соли.

Пример 7. Препаративные формы.

Соединение формулы I можно формулировать для парентерального (внутривенных, подкожных или внутримышечных инъекций) или перорального введения.

7.1 Примеры препаративных форм для инъекции.

Композицию для инъекции, композицию А, содержащую соединение 7, готовят растворением 10 мг соединения 7 в виде дигидрохлорида в 1 мл дистиллированной, не содержащей тяжелого водорода воды. После обработки ультразвуком добавляют около 30 мкл диметилсульфоксида и pH полученного раствора доводят до 5.2 0.1 N гидроксидом калия. Осмотическое давление полученного раствора близко к осмотическому давлению физиологического раствора 1% NaCl в воде.

Композиции для инъекции, содержащие другие соединения настоящего изобретения готовят тем же способом.

7.2 Пример препаративной формы для перорального введения.

Композицию для перорального введения, композицию B, содержащую соединение 7, готовят суспендированием 150 мг соединения 7 в виде свободного основания в 10 мл очищенной воды. После этого, при перемешивании, добавляют 5 мл 90% этанола, с последующим добавлением 90% (вес/вес) раствора молочной кислоты в воде до получения прозрачного конечного раствора с pH 4.0. Препаративные формы для перорального введения, содержащие другие соединения настоящего изобретения получены тем же способом.

Пример 8. Исследование токсичности соединения 7 на мышах.

Токсичность соединения 7 исследовали подкожным введением мышам дозы 10 мг/кг композиции A и пероральным введением дозы 150 мг/кг композиции B. Никаких признаков токсичности ни непосредственно после введения, ни по истечении двух недель не наблюдалось.

Формула изобретения

1. Аглюкодальбагептиды общей формулы I:

где W

где R₆ и R₉ каждый независимо представляет собой водород;
R₇ и R₈ каждый независимо представляет собой водород или хлор;
R₁₀ представляет собой гидроксигруппу;
Z представляет собой

Y представляет карбоксильную группу или ее производное низшего алкилового эфира; R, R₁ и R₂ каждый независимо представляет водород;
и/или их соли с кислотами или основаниями, или их внутренние соли.

2. Аглюкодальбагептиды общей формулы I по п.1, в которых абсолютная конфигурация хирального центра, обозначенного цифрой 3, является S-конфигурацией, а абсолютная конфигурация хирального центра, обозначенного цифрой 15, является R- или S-конфигурацией, предпочтительно, R-конфигурацией.

3. Способ получения аглюкодальбагептидов общей формулы I по п.1, или их солей с кислотами или основаниями, или их внутренних солей, который включает:
а) конденсацию тетрапептида формулы II (b)

где W и Z имеют указанные выше значения;
Y представляет функциональное производное карбоксильной группы;
R₃ представляет NH₂;
R₄ представляет защищенную аминогруппу;
R₅ представляет водород;
с N-защищенным производным фенилаланина, и затем последовательно удаление защиты у аминогруппы фенилаланиновой части полученного пентапептида, с получением пентапептида формулы III:

где W, Z, Y, R₄ и R₅ указаны выше;
б) внутримолекулярную конденсацию пентапептида формулы III и последующее удаление защиты у защищенной аминогруппы R₄ полученного гексапептида с получением гексапептида формулы IV:

где W, Z, Y указаны выше;
R₄ представляет NH₂;
в) конденсацию гексапептида формулы IV с производным Nα,Nε-защищенного лизина, и затем удаление защиты у аминогрупп лизиновой части полученного аглюкодальбагептида с получением аглюкодальбагептида общей формулы (Ic)

где W и Z указаны выше;
Y представляет функциональное производное карбоксильной группы;
R, R₁ и R₂ каждый независимо представляет водород;
г) в случае необходимости, удаление защиты у легко расщепляемой защищенной карбоксильной группы Y с получением соответствующего карбоксипроизводного;
д) в случае необходимости, удаление защитных групп у соединения формулы Ic, в случае, если каждая часть W и Z этого соединения содержит защищенные фенильные или бензильные гидроксигруппы;
е) в случае необходимости, превращение свободного соединения формулы Ic или его соответствующей внутренней соли в его соли с кислотами и/или основаниями.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что на стадии а) N-защищенное производное фенилаланина является производным L-фенилаланина, а на стадии в) Nα,Nε- защищенное производное лизина является производным D-лизина.

5. Способ по любому из п.3 или 4, отличающийся тем, что N-защитная группа производного фенилаланина удаляется в условиях, которые не влияют на N-защитную группу защищенной аминогруппы R₄.

6. Способ по любому из пп.3-5, отличающийся тем, что N-защитная группа производного фенилаланина является трет.-бутоксикарбониламиногруппой, а N-защитная группа защищенной аминогруппы R₄ является бензилоксикарбониламиногруппой.

7. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что N-защищенное производное фенилаланина и Nα,Nε-защищенное производное лизина активированы по карбоксильной функции группами, пригодными для образования пептидных связей.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что группа, активирующая карбоксильную функцию, является сложным эфиром, образованным этой карбоксигруппой и N-гидроксисукцинимидом.

9. Фармацевтическая композиция, обладающая антимикробной активностью, включающая активный агент и наполнители, отличающаяся тем, что в качестве активного агента она содержит аглюкодальбагептиды формулы I по п.1 в эффективном количестве.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.04.2005

Извещение опубликовано: 20.09.2007        БИ: 26/2007

---