Штамм молочнокислых бактерий lactobacillus acidophilus и композиция против диареи

 

Изобретение касается штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1225, используемого в качестве средства против диареи. Изобретение касается композиции, предназначенной против диареи, содержащей биологически активную культуру Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1225 и приемлемый фармацевтический или пищевой носитель. Предпочтительным пищевым носителем в композиции является йогурт или порошок на основе молока. Предлагаемая культура и композиция на ее основе обладают более высокой способностью соревновательного исключения (вытеснения) патогенных бактерий из кишечных клеток, в особенности бактерий, ответственных за диарею. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к биологически чистой культуре штамма молочнокислых бактерий, а также к композиции, содержащей этот штамм и предназначенной против диареи.

Документ EP 199 535 (Горбах и Гольдин) предлагает штамм бактерий, идентифицированный в первой инстанции как Lactobacillus (L) acidophilus, но затем как более похожий на L.casei подвид ramnosus (см.M.Silva и др. в журнале "Антимикробные агенты и хемотерапия, 31, No.8, 1231-1233, 1987), который демонстрирует хорошую адгезию к клеткам слизистой оболочки тонких кишок и который подходит для терапевтического применения. Этот штамм, названный "штамм GG" и депонированный в АТСС (American Type Culture Collection) под номером 53 103, может использоваться в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, особенно в пищевых продуктах, прежде всего в кисломолочных продуктах типа йогурта.

Другие штаммы того же типа давно уже использовались в аналогичных продуктам и с аналогичными целями. Однако существует потребность в особо эффективных штаммах этого типа, которые можно было бы легко идентифицировать и которые имели неоспоримые преимущества и обогатили выбор имеющихся штаммов.

Задача изобретения состоит в том, чтобы удовлетворить указанную потребность.

Для этого изобретение предлагает биологически чистые культуры штаммов молочнокислой бактерии, выбранной за ее способность внедряться в кишечную флору, за ее адгезию к клеткам кишечника, за ее способность соревновательного вытеснения болезнетворных бактерий из кишечных клеток и за способность к иммуномодуляции и/или снижению фекальной энзимной активности.

Эти штаммы особенно пригодны для назначения людям и животным для терапевтического и профилактического лечения расстройств желудочно-кишечного тракта, а именно в качестве средства против диареи. Штамм может назначаться в форме биологически чистой культуры, например, как таковой или после ее замораживания или высушивания при низкой температуре. Такая культура может содержать, например, 10⁸ - 10¹⁰ cfu живых микробов (cfu-единица, названная по первым буквам английского выражения "colony forming units" - колониеобразующих единиц) на 1 грамм жидкой или замороженной культуры и 10⁹ - 10¹¹ cfu/г для высушенной замораживанием культуры.

Штамм может также назначаться в форме композиции, содержащей культуру и съедобный носитель, конкретнее фармацевтически приемлемый носитель или пищевой продукт, такой как кислое молоко, или еще лучше йогурт, или порошковая композиция на основе молока.

Таким образом, изобретение предлагает культуру штамма кисломолочной бактерии, выбранную за ее способность соревновательного вытеснения болезнетворных бактерий, возбудителей диареи, из кишечных клеток.

Среди различных штаммов выбранных таким образом бактерий, выделенных, в частности, из кисломолочных продуктов, особенно коммерческого йогурта, или из коммерческих культур, предназначенных для приготовления таких молочных продуктов или, например, из экскрементов младенцев, несколько было зарегистрировано согласно Будапештскому договору (30.6.92) в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) Пастеровского института (28 Rue de Dr.Roux, 75 724, Paris Cedex 15), Франция, где каждый из них получил соответствующий номер CNCM. В частности, был зарегистрирован штамм L.acidophilus CNCM I-1225.

Морфология и общие характеристики этого штамма приводятся ниже. L.acidophilus CNCM I-1225 Морфология: - Грам-положительный неподвижный микроорганизм, не образующий спор.

- Изолирован, имеет форму довольно коротких и толстых палочек.

Метаболизм: - Микроаэрофильный микроорганизм с гомоферментативным метаболизмом, вызывающим образование L(+) и D(-) молочной кислоты.

- Другие характеристики: катализа (-), выделение CO₂(-), гидролиз аргинина (-).

Ферментация сахаров: Амигдалин (+), арабиноза (-), целлобиоза (+), эскулин (+), фруктоза (+), галактоза (-), глюкоза (+), лактоза (+), мальтоза (+/-), маннитол (-), манноза (+), мелибиоза (-), раффиноза (+), рибоза (-), салицин (+), сахароза (+), трегалоза (+).

Подробности частных свойств, по которым данный штамм был выбран, приводятся ниже.

Имплантация в кишечную флору Гнотоксеничные мыши Каждую из двух групп аксеничных мышей (мышей без кишечной флоры) ассоциировали с человеческой флорой различных доноров с получением гнотоксеничных мышей. Через несколько дней, необходимых для акклиматизации, кишечная флора мышей была полностью сопоставима с флорой людей-доноров с функциональной, качественной и количественной точек зрения.

По изобретению были испытаны многие штаммы на их способность колонизировать пищеварительный тракт этих мышей с человеческой флорой, т.е. на их способность внедряться в эту кишечную флору.

Оказалось, что большинство штаммов неспособны колонизировать кишечник этих животных даже после многократных последовательных прививок, тогда как L.acidophilus CNCM I-1225, например, мог размножаться и внедряться в пищеварительный тракт, т.е. в кишечную флору мышей двух групп даже после однократной прививки.

Эта колонизация или внедрение позволяет штамму присутствовать в экскрементах в количестве более 10⁶ cfu/грамм. Такое содержание живых микроорганизмов в экскрементах может считаться необходимым и/или достаточным для того, чтобы метаболизм штамма мог модифицировать метаболизм хозяина.

Оказалось также, что имплантация сохраняется до тех пор, пока не изменится окружающая среда животных.

Гнотоксеничные крысы Аксеничные крысы ассоциируют для получения гнотоксеничных крыс с изолированным штаммом Bacteroides thetaiotamicron FI-1 из частной коллекции Центра исследований фирмы Нестек СА (CH-1000, Лозанна, Швейцария) кишечной флоры здоровья донора, выбранного, как будет видно из дальнейшего, для имитации продуцирования энзимов полной фекальной флоры человека. Эта ассоциация дает в результате обильную колонизацию кишечного тракта этих крыс, так что бактерия присутствует в экскрементах в количестве приблизительно 10⁸ cfu/грамм.

Испытание имплантации штамма L.acidophilus CNCM I-1225 в эту флору дает в результате хорошую колонизацию, так что этот штамм присутствует в экскрементах в количестве приблизительно 10⁸ cfu/грамм.

Исследования на людях-добровольцах Для сравнения определяли количество живых микроорганизмов L.bulgaricus, появляющееся в экскрементах здоровых людей-добровольцев, которые ели традиционный йогурт, приготовленный ферментацией коровьего молока с коммерческой культурой L.bulgaricus и S.thermophilus.

Добровольцы не употребляли в пищу никаких ферментированных молочных продуктов в течение трех последовательных периодов по три недели каждый, кроме йогурта, который они получали в течение второго трехнедельного периода.

В течение трех недель, когда они получали йогурт, они каждый день принимали с ним примерно 10¹⁰ cfu штамма L.bulgaricus, что приблизительно соответствует трем порциям йогурта по 120 г в день. В течение периода потребления йогурта экскременты добровольцев содержали примерно 10⁵ cfu/грамм L. bulgaricus.

По изобретению было проведено испытание по такому же сценарию, что и выше, но с йогуртом, приготовленным ферментацией молока коммерческой культурой S. thermophilus и B. bifidus и дополнительно культурой L.acidophilus CNCMI-1225 в концентрации того же порядка.

Общее количество живых молочнокислых бактерий в экскрементах добровольцев определяли до, в течение и после периода потребления йогурта. До потребления были получены величины 10⁵ - 10⁶ cfu/грамм, в период потребления были получены величины более 10⁷ cfu/грамм, а после периода потребления были получены величины 10⁶ cfu/грамм.

Соответственно, был обнаружен рост общего количества молочнокислых бактерий в экскрементах в течение периода потребления йогурта. Штамм CNCM I - 1225 был найден в значительном количестве и в живой форме у добровольцев. Напротив, этот микроорганизм исчезал через несколько дней после того, как добровольцы переставали есть йогурт.

Уменьшение фекальной энзимной активности Гнотоксеничные крысы
Фекальную азоредуктазную и нитроредуктазную активность определяли в испытаниях на гнотобиотичных крысах, упомянутых выше, поскольку энзимы азоредуктаза и нитроредуктаза участвуют в образовании канцерогенных веществ. Высокая концентрация этих энзимов повышает риск заболевания раком прямой кишки.

Оказалось, что фекальная энзимная активность гнотобиотичных крыс с Bacteroides достигала 2,5 мкг/ч/мг протеина для азоредуктазы и до 4,2 мкг/ч/мг протеина для нитроредуктазы, тогда как у гнотобиотичных крыс с Bacteroides во флоре, в которую был внедрен штамм CNCM I - 1225, энзимная активность достигала 1,8 мкг/ч/мг протеина для азоредуктазы и 3,5 мкг/ч/мг протеина для нитроредуктакзы.

Кроме того, оказалось, что гнотобиотичные крысы с кишечной флорой, образованной исключительно штаммом CNCM I - 1225, вообще не показали никакой фекальной азоредуктазной или нитроредуктазной активности.

Другими словами, присутствие штамма CNCM I - 1225 во флоре гнотобиотичных крыс вызывает снижение производства некоторых нежелательных энзимов у этих животных, т.е. благоприятно влияет на метаболизм хозяина.

Люди-добровольцы
Фекальную нитроредуктазную активность определяли в испытаниях на людях-добровольцах. Эту активность определяли за несколько дней до периода потребления йогурта со штаммом CNCM I - 1225, в течение этого периода и первые несколько дней после него.

Оказалось, что эта активность снизилась с 8,2 до 4,9 мкг/ч/мг протеина во время периода потребления йогурта, оставалась на этом уровне примерно в течение одной недели после этого периода и затем прогрессивно увеличивалась.

Иммуномодуляция
Люди-добровольцы (фагоцитозная способность лейкоцитов)
Люди-добровольцы воздерживались от потребления ферментированных молочных продуктов, кроме продуктов, предусмотренных следующей программой: молоко в течение трех недель, йогурт, приготовленный ферментацией молока смешанной культурой коммерческого штамма S.thermophilus и L.acidophilus CNCM I - 1225 в течение следующих трех недель, и затем молоко в течение шести недель.

Фагоцитозная способность лейкоцитов периферийной крови добровольцев определялась в начале и в конце каждого из этих периодов.

Это определение предусматривало извлечение лейкоцитов из крови и приведение их в контакт с флюоресцирующими бактериями. Флюоресцентный свет, излучаемый лейкоцитами, которые поглотили флюоресцирующие бактерии, измеряли цитометрическим анализом в потоке ( с использованием устройства торговой марки "Facsan"). Процент лейкоцитов, показывающих фагоцитозную активность, т. е. фагоцитозную способность, упомянутую выше, и определялся таким образом.

Фагоцитозная способность лейкоцитов периферийной крови наблюдалась на уровне 36.5% в начале первого периода потребления (молока) и 32.7% в конце этого периода, и, естественно, столько же в начале периода потребления йогурта, а в конце периода потребления йогурта было получено 51.8% и 51.4% через шесть недель после него, т.е. соответственно в конце второго и третьего периодов потребления.

Вероятна статистическая ошибка (величина p) оценки увеличения фагоцитозной способности лейкоцитов составила менее 0.1%.

Люди-добровольцы (реакция на вакцину)
Шестнадцать здоровых людей-добровольцев (группа испытания) питались по следующей программе: в течение 2 недель (неделя 1 и 2) - нормальная диета, исключая любые ферментированные продукты; следующие три недели (неделя 3, 4 и 5) - смешанная диета, содержащая три 125-граммовые порции йогурта, приготовленного ферментацией молока коммерческой культурой штамма S.thermophilus и Bifidobacterium bifidus, к которым был добавлен штамм L.acidophilus CNCM I-1225 в количестве 10⁷ - 10⁸ cfu/мл и еще две недели (неделя 6 и 7) - нормальная диета, исключая любые ферментированные молочные продукты.

Еще 14 здоровых людей-добровольцев (контрольная группа) одновременно нормально питались, исключая любые ферментированные продукты.

Вивотивная оральная вакцина (Salmonеlla typhi Ty21a), производимая фирмой Berna SA, назначалась добровольцам двух групп соответственно с инструкцией предпрятия-изготовителя в 1, 3 и 5 дни четвертой недели.

Брали кровь для анализа от всех добровольцев через три дня после начала третьей недели и через 1 день и через 10 дней после окончания пятой недели.

Определяли концентрацию иммуноспецифичных антител (IgA) на антигенные липополисахариды (ЛПС) Salmonella typhi методом ELISA.

Обнаружено значительное повышение концентрации специфичных IgA при наблюдении через 15 дней после вакцинации по сравнению с концентрацией, наблюдаемой за девять дней до вакцинации в двух группах (величина "p" более 0.001). Однако, если принять во внимание порядок повышения концентрации в интервалах меньше 2, от 2 до 3, от 3 до 4 и больше 4, то в них наблюдается такое распределение - соответственно 1, 6, 3 и 6 добровольцев из группы испытания против 8, 3, 0 и 3 добровольцев из контрольной группы. Другими словами, общий рост концентраций в испытательной группе значительно выше, чем в контрольной группе (величина "p" = 0.04).

Адгезия к клеткам кишечника
По изобретению излучали адгезию (прилипание) различных штаммов кисломолочных бактерий к клеткам кишечника, конкретнее к эпителиальным клеткам Caco-2 человеческого кишечника (См.M.Pinto и др. Biol.Cell., 47, 323, 1983), и к клеткам слизистой оболочки кишечника человека НТ29-МТХ (Lesuffleur и др. журнал "Cancer Res.", 50, 6334-6343) на однослойной культуре in vitro.

Для этого клетки культивировали в пластмассовых бутылочках 25 см² фирмы Корнинг для поддержания линий клеток и на обезжиренных и стерилизованных стеклянных пластинках (22 х 22 мм), размещенных на шестичашечных поддонах (Корнинг) для испытания на прилипание.

Для культивирования клеток Caco-2 и НТ29-МТХ среду, начиная со второго дня после пересева, приходилось менять каждый день. Среду готовили из минимально необходимой сухой среды фирмы Eagle, модифицированной Dulbecco (DMEM).

Молочнокислые бактерии культивировали в анаэробных условиях на среде MRS из замороженных культур. Использовали бактерии из второй субкультуры.

Смешанную среду для инкубации на клетках готовили смешиванием 50% среды DMEM без антибиотика и 50% среды MRS, в которой бактерии выращивались, эта среда содержала 10⁸ cfu молочнокислых бактерий или бифидобактерий (см.Шовьер Г. и др.FEMC Microbiol. Lett. 91, 213-218, 1992).

Для проведения испытания на прилипание смешанную среду, содержащую бактерии, помещали на ткань клеток кишечника и инкубировали в течение 1 часа при доступе воздуха. Многочашечные поддоны промывали пять раз, каждый раз с двадцатью круговыми помешиваниями, чтобы удалить неприставшие бактерии промывкой. Клеточную ткань в виде полосок затем фиксировали в последовательных ваннах с метанолом 10 мин при 70%, 10 мин при 95% и 15 мин при 100% и окрашивали по Граму или Гимзе. Уровень прилипания определяли подсчетом прилипших бактерий под микроскопом.

Среди многочисленных проверенных на прилипание штаммов некоторые штаммы показали хороший уровень прилипания к клеткам кишечника, по данным этих испытаний на клетках Caco-2.

Так, штамм L.acidophilus CNCM I-1225, который приставал к клеткам Caco-2 на уровне примерно 150+ 23 бактерий на 100 клеток Caco-2. Такой результат обозначили как "+++++". Испытания на приставание штамма L.acidophilus CNCM I-1225, например, к клеткам НТ29-МТХ дало даже еще более удачные результаты.

Неожиданно было обнаружено, что приставание этого штамма к клеткам кишечника объясняется секретом, который он выделяет в своей среде культивирования (например, в MRS или в молоке). Таким образом, когда процесс инкубации в течение 1 часа на Caco-2 был проведен на штаммах L.acidophilus CNCMI-1225 без среды его культивирования, то наблюдалось значительное уменьшение прилипания.

Кроме того, если процесс инкубации проводился на Caco-2 с этим штаммом и его средой культивирования, подвергнутыми предварительно воздействию трипсина, опять наблюдалось значительное уменьшение приставания. Это, по-видимому, доказывает, что секретом, выделяемым этим штаммом и являющимся фактором прилипания, является протеин.

Соревновательное исключение патогенных бактерий.

По данному изобретению были исследованы различные штаммы молочнокислых бактерий на их способность соревновательного исключения из кишечных клеток патогенных бактерий, в особенности бактерий, ответственных за диарею.

В частности, изучали исключение некоторых сапрофитных штаммов E.colli из кишечного тракта людей и животных, которые могут размножиться и стать болезнетворными, а именно энтеротоксиногенной E.colli (ETEC), энтеропристающей E. colli (DAEC) и энтеропатогенной E.colli (EPEC), и исключения штамма Salmonella typhi-murium.

Штаммы, использовавшиеся в этих исследованиях, таковы:
- для ETEC - штамм Н10407, который выражает CFA/1 (Коллекция профессора Жоли, лаборатория микробиологии, факультет медицины и фармакологии, университет Клермон-Феррана 1,63003, Клермон-Ферран, Франция);
- для DAEC - штамм С1845 (коллекция доктора наук С.Билджа, кафедра микробиологии, медицинский институт, Дж 3111 Строение науки здоровья, Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон 98195, США);
- для EPEC - штамм JPN 15 P MAR 7, который выражает EAF и eae (коллекция проф. Дж.Кэйпера, Центр разработки вакцин, Мерилендский университет, медицинский факультет, 10 Саут Пайн Стрит, Балтимора, Мэриленд 21201, США);
- для Salmonella Typhi-murium штамм SL 1344 (Д-р Б.Стокер, Стэнфордский университет, медицинский факультет, кафедра микробиологии и иммунологии, Шерманн Сэйрчайльд Сайенс Билдинг, D 333 Стэнфорд, Калифорния 94305-5402, США).

Приставание бактерий к клеткам Caco-2 определяли следующим образом.

Кратко, монослои клеток Caco-2 дважды промывали солевым фосфатным буферным раствором (ФБР). Меченные изотопом С¹⁴ E.colli или изотопом S³⁵ Salmonella диспергировались в среде культуры в количестве 10⁸ cfu/мл и по 2 мл суспензии добавляли в каждую чашку, содержащую стеклышко с культурой клеток.

Для E.colli все инкубации проводили в присутствии однопроцентной D-маннозы. Для определения уровня (или "фактора") исключения, т.е. пропорции патогенных бактерий, которым помешали пристать к клеткам Caco-2 молочнокислые бактерии, занявшие их место, добавляли 1 мл суспензии, содержащей 10⁸ cfu/мл меченых патогенных бактерий и 1 мл суспензии, содержащей либо 10⁸, либо 10⁹ cfu/мл штамма молочнокислой бактерии к каждой чашке, содержащей стеклянную пластинку, несущую культуру клеток.

Пластинки инкубировали в течение 1 часа при 37^oC в атмосфере из 10% CO₂ и 90% воздуха. Монослои клеток промывали 5 раз стерильным ФБР. Приставшие бактерии и кишечные клетки растворяли в 0,2 н. растворе едкого натра. Количество меченых прилипших бактерий оценивали подсчетом сцинтилляций в жидкости.

Среди различных штаммов молочнокислых бактерий, испытанных таким образом по их свойствам или по их способности соревновательного исключения (вытеснения) патогенных бактерий, штамм по изобретению дал замечательные результаты, которые представлены в следующей таблице, которая показывает в процентах уровни исключения, достигнутые штаммом, испытанным на подавление различных патогенных штаммов, использованных в этом испытании.

Формула изобретения

1. Штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1225, используемый в качестве средства против диареи.

2. Композиция, предназначенная против диареи, содержащая биологически активную культуру Lactobacillus acidophilus и приемлемый фармацевтический или пищевой носитель, отличающаяся тем, что в качестве биологически активной культуры она содержит штамм Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1225.

3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что пищевым носителем является йогурт или порошок на основе молока.

РИСУНКИ

Рисунок 1