Способ культивирования грибов рода monascus

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования грибов рода Monascus, продуцирующих ряд ценных биологически активных веществ. Способ предусматривает засев питательной среды, представляющий собой 15-25% суспензию измельченной ткани клубней картофеля, культурой гриба Monascus и осуществляют культивирование гриба. Способ позволяет упростить состав среды, не снижая биосинтеза метаболитов. 6 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается культивирования грибов рода Monascus.

Грибы рода Monascus представляют значительный интерес в первую очередь потому, что продуцируют пигменты, применимые в пищевой промышленности, а также комплекс продуктов, обладающих антибиотической активностью, и ряд амилолитических ферментов.

Пигменты, образуемые этими грибами, традиционно используются в Японии, Корее и странах Юго-Восточной Азии как пищевой краситель.

Вместе с тем, известна возможность использования этих грибов как промышленных продуцентов антибиотика монасцедина и фермента амилазы.

Для получения биосинтезируемых грибами Monascus пигментов и биологически активных веществ соответствующие их штаммы выращивают в оптимальных для развития условиях на подходящих питательных средах.

Как правило, ферментационные среды для культивирования грибов рода Monascus являются многокомпонентными и обладают сравнительно сложным составом.

Известен, например, способ культивирования гриба Monascus anka для получения пигментов, заключающийся в том, что штамм-продуцент выращивают на среде, содержащей 3% рисовой муки, 0,15% нитрата натрия, 0,1% сульфата магния и 0,25% однозамещенного фосфата калия, при pH среды 6,0 и при температуре 30^o [1].

Для получения пигментов и антибиотиков гриб Monascus purpureus может быть выращен на среде, содержащей 10,0 пептона, 5,0 солодового экстракта и 20,0 глюкозы на 1 л воды. Значение pH среды составляет 5,5 и выращивание проводится при температуре 35^o [2].

Амилазы, продуцируемые культурой Monascus anka V-2, были получены при выращивании продуцента на поверхности полированного риса [3].

Чтобы повысить выход пигментов предлагалось двухэтапное культивирование грибов рода Monascus сначала на среде, содержащей 4% глюкозы, 1% дрожжевого экстракта, 0,3% однозамещенного фосфата калия и 1,5% агара, при pH 4,0 - 7,0, а затем на среде, содержащей 3% глюкозы, 0,15% хлористого аммония, 0,1% однозамещенного фосфата калия, 0,05% сернокислого магния, 0,05% хлористого натрия, 0,01% сернокислого закисного железа, при pH 2,0 - 4,0 [4].

Наиболее близким к предложенному является способ культивирования гриба рода Monascus, предусматривающий выращивание продуцента в оптимальных условиях на среде, содержащей 0,1 - 95,0% мальтозы как источника углерода, крахмалосодержащий субстрат, например рисовую муку, а также аспарагин, аспарагиновую кислоту или ее соль. Может быть использован, в частности, следующий состав среды (вес./об.%): гидрогенизированный мальтозный сироп (4,0), аспартат магния (0,5), нитрат натрия (0,15), сульфат магния (0,1) и вода [5].

Известные способы культивирования грибов рода Monascus не являются идеальными, так как предусматривают выращивание продуцента на питательных средах сложного состава, включающих зачастую пищевые и относительно труднодоступные и достаточно дорогие продукты.

Цель настоящего изобретения - упростить способ культивирования грибов рода Monascus за счет использования питательной среды более простого состава.

Поставленная цель была достигнута в результате того, что культивирование грибов рода Monascus осуществляют на среде, содержащей суспензию измельченной ткани клубней картофеля.

Исследованиями заявителя первоначально было показано, что при суспензионном выращивании грибов рода Monascus на питательной среде, содержащей суспензию измельченной ткани клубней картофеля и солевые компоненты, обычно используемые при культивировании грибов этого рода, накопление пигментов, а также антибиотическая и амилолитическая активность культуральной жидкости имеют более высокое значение, чем при использовании других источников углерода, что видно, в частности, из табл. 1.

Обращает на себя внимание прежде всего тот факт, что при равной концентрации ткани клубней картофеля (при пересчете на картофельный крахмал) и картофельного крахмала как такового накопление метаболитов в первом случае существенно выше.

Полученные результаты согласуются с ранее известными данными о том, что крахмал не является оптимальным источником углерода для грибов рода Monascus и при его использовании как пищевого субстрата имеет место сравнительно низкий выход пигментов [5].

В этой связи тем более неочевидной представляется возможность достижения высокого выхода метаболитов в случае выращивания грибов рода Monascus при использовании ткани клубней картофеля.

В дальнейшем заявитель установил, что при выращивании грибов рода Monascus на суспензии ткани клубней картофеля добавление солевых компонентов в питательную среду не является обязательным - высокие показатели процесса биосинтеза метаболитов сохраняются при использовании ткани клубней картофеля как единственного субстрата. В частности, соответствующие данные о биосинтезе культурой Monascus пигментов приведены в табл. 2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что уровень накопления пигментов не снижается при исключении из состава среды солевых компонентов. При использовании ткани картофеля как единственного субстрата одновременно наблюдается и высокий уровень накопления амилаз и антибиотических веществ, что показано в табл. 3 и 4.

Результаты показывают, что при использовании ткани клубней картофеля как единственного субстрата наблюдается более высокий уровень накопления амилолитических ферментов, чем на других субстратах.

Из представленных результатов можно сделать вывод о том, что выращивание культуры Monascus на ткани клубней картофеля приводит не только к активизации биосинтеза пигментов и амилолитических ферментов, но и к стимулированию образования антибиотических продуктов.

Таким образом, преимущества предложенного способа перед известными состоят в том, что предложенный способ позволяет получить достаточно высокий выход метаболитов грибов рода Monascus при культивировании этих грибов на простой однокомпонентной среде, причем единственным питательным субстратом может, естественно, служить как ткань клубней товарного картофеля, так и продукты и отходы переработки картофеля.

Преложенный способ может быть использован для получения пигментов, антибиотиков, ферментов и других метаболитов, продуцируемых грибами рода Monascus.

Способ пригоден для успешного культивирования представителей различных видов грибов рода Monascus, что подтверждается собственными наблюдениями заявителя и литературными данными [1].

Оптимальная концентрация питательного субстрата - ткани клубней картофеля - обычно составляет 15 - 25% по сырому весу или 4 - 8% по сухому весу. Более низкая концентрация субстрата может снизить выход целевого продукта, более высокая не обеспечивает заметного прироста выхода продукта и экономически менее обоснована. Влияние концентрации субстрата на уровень пигментообразования показано в табл. 5.

Результаты показывают, что превышение концентрации субстрата в 25% приводит к сравнительно низкому дальнейшему приросту пигментообразования, но повышает вязкость среды и создает нежелательные технологические затруднения в осуществлении процесса культивирования.

Измельчение ткани клубней картофеля можно проводить с помощью любых механических устройств, а размеры получаемых частиц могут лежать в широких пределах от 0,5 мм до 5 мм.

При приготовлении питательной среды обычно не возникает необходимости корректировки pH, но при культивировании отдельных штаммов значения pH среды могут оптимизироваться.

Осуществление предложенного способа не влечет за собою необходимости корректировок каких-либо параметров процесса, например температуры культивирования, уровня аэрации и пр. Оптимальная длительность ферментации также не изменяется.

Использование измельченной ткани клубней картофеля как субстрата заметно не затрудняет дальнейших этапов выделения целевых продуктов.

Обычно к 3 суткам культивирования среда просветляется и становится практически прозрачной.

Реализация предложенного способа предполагает культивирование грибов рода Monascus на среде, состоящей исключительно из суспензии измельченной ткани клубней картофеля, но допускается дополнение этой питательной среды другими субстратами.

Более подробно сущность предложенного способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Клубни картофеля измельчают на бытовой терке и получают массу с размером частиц 5 мм. Готовят 20%-ную суспензию ткани клубней картофеля в водопроводной воде. В 20 колб вместимостью 750 мл вносят по 100 мл суспензии, имеющей значение pH, равное 6,2. Колбы засевают культурой Monascus purpureus и выращивают при температуре 28 градусов на круговой качалке, делающей 200 - 220 об/мин. После 3 суток культивирования в культуральной жидкости обнаружено в среднем 20 г/л пигментов. Амилолитическая активность культуральной жидкости составляет 5х10.000 МЕ/г, а антибиотическая активность соответствует величине диаметра зоны ингибирования тест-культуры 3,0+0,2 см.

Пример 2. Культуру гриба Monascus purpureus выращивают в ферментере на стерильной питательной среде, содержащей 20% сырого картофеля, измельченного на терке. Среду стерилизуют при 120 градусах в течение 30 минут при непрерывно работающей мешалке. Инокулят вносят после охлаждения среды до 30 градусов и после доведения значения pH до 6,2. Количество посевного материала составляет 10% от объема среды.

Выращивание осуществляют при температуре 28 - 30 градусов при поддержании значения pH на уровне 6,0 - 6,2. В процессе культивирования среду перемешивают (число оборотов мешалки - 350 - 400 об/мин) и обеспечивают аэрацию среды при продувании 1 объема воздуха на 1 объем среды в минуту. Пеногашение проводят с использованием подсолнечного масла. Длительность ферментации составляет 3 суток. Образование пигментов начинается с первых суток ферментации и заканчивается на третьи сутки. Показатели, характеризующие процесс двух отдельных ферментаций, приведены в табл. 6.

Пример 3. Выращивание гриба Monascus purpureus осуществляют в промышленном ферментере вместимостью 15 м³. Предварительно 1600 кг технического картофеля из бункера подают в картофелемоечную машину и после мойки измельчают на молотовой дробилке. Суспензия измельченного картофеля поступает в емкость с мешалкой, ее объем доводят водопроводной водой до 6 м³ и нагревают до 80^o паром. Процесс разваривания заканчивают при разжижении суспензии. Среду стерилизуют при температуре 138^o и выдержке в течение 15 мин на установке непрерывной стерилизации (УНС). Из УНС среду загружают в ферментатор, где охлаждают до 30^o. Стерильную среду инокулируют культурой гриба, выращенного в посевном аппарате в течение 2 суток.

Процесс выращивания ведут при непрерывной аэрации (1 об. воздуха на 1 об. среды в мин) при температуре 28 - 30^o в течение 3 суток, после чего культуральную жидкость подают на фильтрацию, нативную жидкость упаривают на вакуум-выпарной установке и затем сушат распылением. Осадок с фильтра сушат на ленточной сушилке. Выход готового продукта (пищевого красителя) составляет 35 кг с 1 м³ культуральной жидкости.

Источники информации 1. Yuan-Chi Su and Jan-Hsiung Huang. Fermentative Production of Anka-pigments (Monascus-pigments). "Proc. Natl. Sci. Counc. ROC", 1980, Vol. 4, N 2, p. 201 - 215.

2. Hin-Chung Wong and Yun-Shen Bau. Pigmentation and Antibacterial Activity of Fast Neutron-and X-Ray-induced Strains of Monascus purpureus Went. "Plant, Physiol." 1977, Vol. 60, p. 578 - 581.

3. Yuan-Chi Su, Wen-Hsiung Liu and Sy-Dar Wang. Purification and some properties of amylases produced by Monascus anka V-2. "Memoirs of the College of Agriculture, National Taiwan University", 1975, Vol. 16, N 1, p. 93 - 103.

4. Патент США 4.145.254, кл. C 12 D 13/02, 1977.

5. Патент США 4.442.209, кл. C 12 P 17/18, 1982.

Формула изобретения

Способ культивирования грибов рода Monascus на питательной среде, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют суспензию измельченной ткани клубней картофеля, содержащую 15 - 25% тканей картофеля по сырому весу.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6