Способ идентификации антиген/гаптенспецифических субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови

 

Изобретение относится к иммунологии, в частности к иммунодиагностике, и может быть использовано при идентификации антиген-гаптенспецифических иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов и других антиген/гаптенспецифических иммунокомпетентных клеток крови. С целью идентификации антиген/гаптенспецифических иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов и других видов антиген/гаптенспецифических иммунокомпетентных клеток крови вносят индикаторные частицы одного вида, предварительно нагруженные раствором заданного гаптена/антигена, в концентрации 10^-2 моль/л для выявления антиген/гаптенспецифических клеток. Реакцию учитывают не позднее 24 ч после ее постановки с помощью люминесцентного микроскопа. Способ универсален для выявления клеточной сенсибилизации к антиген/гаптенам белкового или другого органического или неорганического происхождения и дает возможность проводить ранее этиотропное профилактическое лечение больных группы риска по развитию той или иной патологии.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, в частности к иммунодиагностике, и может быть использовано при идентификации антиген/гаптен-специфических иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов и других антиген/гаптенспецифических иммунокомпетентных клеток крови.

Существующие способы определения лимфоцитов с рецепторами к антигену/гаптену не позволяют определять антиген/гаптенспецифические иммунорегуляторные субпопуляции лимфоцитов, и тем более антиген/гаптенспецифические субпопуляции других видов иммунокомпетентных клеток крови. Кроме того, имеющиеся способы не являются универсальными одновременно для антигенов белкового и гаптенов неорганического (промышленного) происхождения. Известные способы длительны, трудоемки и невысоко чувствительны.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в обеспечении ранней доклинической диагностики патологии, связанной со специфической сенсибилизацией организма к определенному антигену/гаптену (аллергены белкового происхождения, антигены органического и неорганического происхождения, токсины, ксенобиотики), а также для определения варианта и степени сенсибилизации организма к исследуемому антигену/гаптену.

Известен "Способ определения лимфоцитов с рецепторами к антигену/гаптену методом тройного розеткообразования" (Хилько Т.Ф., 1984 г.) Алексеева О.Г. Иммунология профессиональных хронических бронхолегочных заболеваний. -М.: Медицина. 1987, с.46., состоящий во внесении в исследуемую пробу одновременно трех видов индикаторных частиц: 1. Эритроцитов барана для идентификации Т-лимфоцитов: 2. Неокрашенного зимозана, нагруженного C3-компонентом комплемента для идентификации B-лимфоцитов; 3. Зимозана, предварительно окрашенного и нагруженного гаптеном для идентификации лимфоцитов с рецепторами к гаптену.

Все четыре компонента-лимфоциты, эритроциты барана, комплекс зимозан-комплемент и комплекс окрашенной зимозан-гаптен вносятся в пробирку одновременно по 100 мкл каждый. Пробирку 5 мин инкубируют при 37 ^o C, 1-2 мин центрифугируют при 1500 об/мин, 1 ч инкубируют при 12 ^o C, 20 мин. Фиксируют в глютаровом альдегиде, 2-3 мин отмывают центрифугированием в дистиллированной воде при 1500 об/мин, клетки ресуспендируют, готовят мазки, которые высушивают при комнатной температуре, фиксируют высушивают, окрашивают по Романовскому-Гимзе, промывают, высушивают и микроскопируют световым микроскопом. Названный способ является самым близким прототипом для заявляемого изобретения, с его помощью возможно обнаружить Т-лимфоциты с рецепторами к гаптену, B-лимфоциту с рецепторами к гаптену, рецепторы к гаптену на "нулевых" (ни T-, ни B-лимфоциты) клетках, лимфоциты с рецепторами одновременно к гаптену и C3-компонента комплемента. Однако прототип имеет ряд существенных недостатков: - отсутствие информации о перераспределении антиген/гаптенспецифических иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов (хелперов индукторов, киллеров, супрессоров), связанных со специфической сенсибилизацией организма к исследуемому антигену: - отсутствие информации о перераспределении антигенспецифических субпопуляций других видов иммунокомпетентных клеток, связанное со специфической сенсибилизацией организма к исследуемому антигену; - неуниверсальность способа: способ предложен только для выявления сенсибилизации лимфоцитов с рецепторами к гаптенам промышленного происхождения (металлы, металлоиды, химические неорганические соединения); - искажение результатов вследствие длительной инкубации лимфоцитов с индикаторными частицами, нагруженными гаптеном в концентрации 0,1% из-за цитотоксического воздействия данной концентрации на рецепторный аппарат лимфоцитов; - скорость центрифугирования - 1500 об/мин - при приготовлении комплексов "зимозан-гаптен" недостаточна для полноценной нагрузки зимозана гаптеном; - субъективное, затрудненное восприятие вводимых в систему индикаторных частиц при подсчете клеток: предварительно окрашенный в фиолетовый цвет зимозан плохо воспринимается и дифференцируется при идентификации и подсчете клеток в приготовленных мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, где эритроциты имеют зеленовато-синий цвет, частицы предварительно неокрашенного зимозана - светло-фиолетовый цвет, а частицы предварительно окрашенного зимозана - фиолетовый цвет. Таким образом, дифференцировка цвета частиц зимозана носит довольно субъективный характер. При окраске по методу Браше дифференцировка клеток более четкая, но сама методика окраски очень трудоемка и длительна, что делает ее неудобной для использования в практике клинических лабораторий. Подсчет клеток длительный, утомительный, не лишен субъективизма;
- погрешности при связывании индикаторными частицами специфических рецепторов лимфоцитов при одновременном введении двух изначально различных по своей химической и биологической природе, а также массе и размерами частиц, в связи с тем, что в силу своих различных свойств частицы имеют различную способность к аглютинации;
- необходимость большого объема крови для определения гаптенспецифических рецептов лимфоцитов к нескольким гаптенам одновременно (по 100 мкл взвеси лимфоцитов на каждую пробу), так как требует большое число лимфоцитов на исследование. В результате увеличивается время подготовки проб лимфоцитов (выделение и отмывание, подсчет числа лимфоцитов в пробах);
- время инкубации - 5 мин при 37 ^o С - индикаторных частиц, нагруженных гаптеном, со взвесью лимфоцитов является недостаточным для установления связей между гаптеном, адсорбированном на индикаторных частицах и рецепторами к данному гаптену на поверхности лимфоцитов;
- скорость центрифугирования лимфоцитов с индикаторными частицами - 1500 об/мин - неоптимальна, т.к. при такой скорости центрифугирования возможно разрушение клеток и прилипание клеток к стенкам пробирки;
- время инкубирования - 30 мин - индикаторных частиц с раствором гаптена является недостаточным для полноценной нагрузки индикаторных частиц гаптеном;
- режим инкубирования взвеси лимфоцитов с индикаторными частицами, нагруженными гаптеном - 1 ч при 12 ^oC - оптимальный, т.к. при таком режиме создаются недостаточно оптимальные условия для образования достаточно прочных связей между гаптенспецифическими рецепторами лимфоцитов и гаптеном, адсорбированном на поверхности индикаторных частиц;
- используемый для фиксации комплексов "лимфоцит-индикаторная частица" глютаровый альдегид, может способствовать скученности лимфоцитов и индикаторных частиц в мазке, что приводит к погрешности при подсчете гаптенспецифических клеток;
- механический отрыв индикаторных частиц во время приготовления мазка, что снижает достоверность результатов;
- наложение одних лимфоцитов на другие с присоединившимися к ним индикаторными частицами, либо образование полей скопления индикаторных частиц и лимфоцитов, обусловленное фиксацией клеток глютаровым альдегидом, а затем приготовлением и высушиванием мазков, также затрудняет правильность идентификации и подсчет гаптенспецифических клеток, что также в свою очередь влияет на результаты исследования;
- способ предполагает значительные затраты времени на приготовление, высушивание, фиксацию, окраску мазков: весь алгоритм способа занимает по времени 18 - 24 ч, что делает прототип неудобным для использования в практических клинических лабораториях.

Целью изобретения является индентификация антиген/гаптенспецифических иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов и других видов антиген/гаптенспецифических иммунокомпетентных клеток крови.

Цель достигается тем, что в каждую исследуемую пробу выделенной культуры клеток, содержащую 100000 - 500000 (в 20 мкл) клеток, вносится 20 мкл индикаторных частиц одного вида, нагруженных раствором антиген/гаптен в концентрации 10 моль/л для выявления антиген/гаптенспецифических клеток. Пробирки инкубируют 7 - 10 мин при 37^oC, 1 - 2 мин центрифугируют при 1200 об/мин, затем в течение 30 мин инкубируют при 4^oC, затем пробирки центрифугируют при 1200 об/мин, надосадочную жидкость осторожно удаляют. В каждую пробирку вносят по 20 мкл готового моноклонального антигена заданной специфичности для выявления принадлежности иммунокомпетентных клеток к определенной субпопуляции/популяции. При комнатной температуре пробирки инкубируют 30 мин, затем взвесь клеток отмывают в 1,0 мл, физиологического раствора, центрифугируют при 1200 об/мин, после чего в пробирки вносят по 20 мкл проявляющих антител меченных ФИТЦ, пробирки инкубируют 30 мин при 4^oC. Клетки отмывают 1-2 раза в 1,0 мл физраствора в центрифуге при 1200 об/мин, ресуспендируют в 40 мкл физраствора, переносят на предметное стекло, обработанное предварительно в 0,005% растворе poli-L-Lisin, инкубируют клетки на стекле в течение 20 мин при комнатной температуре, фильтровальными полосками отсасывают физраствор, вносят в каждую пробу по 20 мкл 50% раствора глицерина на физрастворе в качестве иммерсионной среды. Подсчет результатов производят с помощью люминесцентного микроскопа.

Описание изобретения
1. Предназначенную для исследования культуру клеток выделяют из крови известным для данной культуры клеток способом, отмывают 2-3 раза в центрифуге при 1500 об/мин по 2-3 мин средой 199. Готовят взвесь клеток из расчета 100000 - 500000 клеток в 20 мкл.

2. Готовят комплекс "индикаторная частица - антиген/гаптен", для этого к 1 мл 0,5% взвеси индикаторных частиц прибавляют 1 мл 10 моль/л раствора гаптена/антигена. Данная концентрация подобрана опытным путем потому, что именно такая концентрация обеспечивает полноценную "нагрузку" индикаторных частиц антигеном/гаптеном, что обеспечивает выявлением оптимального числа антиген/гаптенспецифических клеток. Концентрация менее 10 моль/л оказывается недостаточной для полноценной нагрузки индикаторных частиц антигеном/гаптеном, а более 10 моль/л, оказывается токсической для рецепторного аппарата клеток, в результате процент выявленных антиген/гаптенспецифических клеток существенно снижается.

Содержимое пробирки перемешивают, 45-60 мин инкубируют при 37^oC, осаждают центрифугированием при 1700 об/мин в течение 3-5 мин, затем 1 - 2 раза отмывают в 1 мл физраствора в том же режиме центрифугирования. Осадок ресуспендируют в 0,6 мл физраствора.

3. В центрифужные силиконированные пробирки вносят по 20 мкл (100000 - 500000 клеток) взвесь исследуемой культуры клеток, вносят 20 мкл комплекса "индикаторная частица - антиген/гаптен" для выявления антиген/гаптенспецифических клеток. Пробирки инкубируют 7 - 10 мин при температуре 37^oC, 1 - 2 мин центрифугируют при 1200 об/мин (для максимального сближения рецепторов клеток с антигеном/гаптеном, адсорбированным на поверхности индикаторных частиц), затем в течение 30 мин инкубируют при 4^oC (при этой температуре обеспечиваются наиболее оптимальные условия для связывания рецепторами сенсибилизированной клетки антигена/гаптена, адсорбированного на поверхности индикаторынх частиц. Затем пробирки центрифугируют при 1200 об/мин, надосадочную жидкость осторожно отсасывают фильтровальными полосками, в пробирку вносят по 20 мкл готового моноклонального антитела своей специфичности для определения принадлежности выявленных антиген/гаптенспецифических (сенсибилизированных) иммунокомпетентных клеток к конкретному виду популяции, субпопуляции. При комнатной температуре пробирки инкубируют в течение 30 мин, затем взвесь клеток осторожно отмывают в 1,0 мл физраствора в центрифуге при 1200 об/мин 1 раз. Надосадочную жидкость сливают, капельки отсасывают фильтровальными полосками. В пробирки добавляют по 20 мкл готовых проявляющих антимышинных антител, меченных ФИТЦ (FITC-anti-Mi), обеспечивающих свечение меченных моноклональных антител, перемешивают и при 4 ^oC, инкубируют в течение 30 мин. Затем клетки 1-2 раза отмывают в 1,0 мл физраствора в центрифуге при 1200 об/мин, сливают надосадочную жидкость, удаляя капельки полосками фильтровальной бумаги. В пробирки вносят по 40 мкл физраствора, легко покачивая пробирки, ресуспендируют клетки, переносят клетки на сухое предметное стекло, предварительно обработанное 0,005% раствором PoLi-L-Lisina (на одно стекло наносят клетки не более чем из 2-3 пробирок), инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем очень осторожно отсасывают фильтровальными полосками физ. раствор. Вносят в каждую пробу 20 мкл 50% раствора глицерина на физ. растворе в качестве иммерсионной среды, так как глицерин, с одной стороны, ограничивает подвижность клеток, а с другой - позволяет смещать клетки друг относительно друга с помощью объектива микроскопа. Реакцию учитывают не позднее 24 час после ее постановки с помощью люминисцентного микроскопа, объектив микроскопа X 90, окуляр X 10. Учитывают результаты, опустив объектив микроскопа в каплю с глицерином (пробы клеток в глицерине).

При этом учитывают:
- общее количество иммунокомпетентных клеток данного типа - не менее 200;
- из этих 200 клеток учитывают:
- общее количество флюоресцирующих клеток (абсолютное число %);
- количество флюоресцирующих клеток, присоединивших не менее 3 индикаторных частиц, нагруженных исследуемым антигеном/гаптеном (абсолютное число, %);
- число нефлюоресцирующих клеток, присоединивших не менее 3 индикаторных частиц. Из результатов вычитают процент флюоресцирующих клеток отрицательного контроля, в качестве которого используют препараты аналогичным способом, за исключением того, что вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса или нормальным иммуноглобулином мыши.

Заявляемое изобретение имеет следующий положительный эффект:
1. Способ дает информацию о перераспределении антиген/гаптенспецифических иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов (хелперов, индукторов, супресоров, киллеров), связанном со специфической сенсибилизацией организма к исследуемому антиген/гаптену, и позволяет проводить анализ такого перераспределения;
2. Способ дает информацию о перераспределении антиген/гаптенспецифической субпопуляции других видов иммунокомпетентных клеток, связанном со специфической сенсибилизацией организма к исследуемому антигену/гаптену, и позволяет проводить анализ такого перераспределения;
3. Способ универсален для выявления клеточной сенсибилизации к антиген/гаптенам белкового, другого органического и неорганического происхождения;
4. Способ позволяет определять вариант сенсибилизации организма к исследуемому антигену/гаптену.

5. Способ позволяет определять степень сенсибилизации организма к исследуемому антигену/гаптену и определять степень зависимости лабораторных показателей от клинических проявлений патологии. Таким образом, заявленный способ позволяет проводить раннюю доклиническую диагностику развивающейся патологии, связанной со специфической сенсибилизацией организма к определенному антигену/гаптену (лекарственные вещества, органические аллергены, токсины, ксенобиотики, тяжелые металлы, промышленные гаптены и др.);
На основании вышеперечисленного можно будет проводить ранее этиотропное профилактическое лечение больных группы риска по развитию той или иной патологии.

6. Способ количественный, что позволяет проводить динамический контроль за содержанием антиген/гаптенспецифических иммунокомпетентных клеток крови, т.е. за степенью сенсибилизации организма, в процессе этиотропного профилактического лечения, либо в течение всего времени наблюдения за субъектом.

7. Способ прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, что делает реальной возможность его использования в любой практической клинической лаборатории.

8. Способ лишен погрешностей, связанных с использованием трех индикаторных частиц (две из которых имеют одинаковую форму, но отличаются друг от друга на полтона), что затрудняет идентификацию и подсчет клеток.

9. Способ лишен погрешностей, связанных с нефизиологично подобранной концентрацией раствора антигена/гаптена, используемого для "нагрузки" индикаторных частиц заданным антигеном/гаптеном.

10. Способ лишен погрешности, связанной с недостаточным временем инкубации, недостаточной скоростью центрифугирования индикаторных частиц с раствором антигена/гаптена, необходимых для "нагрузки" индикаторных частиц заданным антигеном/гаптеном.

11. Способ предполагает использование индикаторных частиц только одного вида, что исключает погрешность при связывании их с антиген/гаптенспецифическими рецепторами клеток, обусловленную различной способностью к аглютинации одновременно вводимых в систему различных по своей природе и свойствам индикаторных частиц.

12. Способ лишен погрешности, связанной с неправильно подобранным режимом инкубирования и центрифугирования клеток с индикаторными частицами, нагруженными растворами антигена/гаптена.

12. Способ лишен погрешностей, связанных с приготовлением мазков из исследуемой культуры клеток с индикаторными частицами, предварительно фиксированными с помощью глютарового альдегида: наложение одних клеток на другие с присоединившимися к ним индикаторными частицами, либо образование полей скопления индикаторных частиц, и клеток, так как в заявленном способе взвесь клеток не высушивают, а смотрят влажными в измеренной среде - 50% растворе глицерина, который, с одной стороны, ограничивает подвижность клеток, а с другой - позволяет при необходимости смещать клетки друг относительно друга с помощью объектива микроскопа.

14. Способ лишен затрат времени на высушивание, окраску, фиксацию мазков.

15. Подсчет клеток быстрый, удобный и неутомительный в силу того, что подсчитываются четко различимые флюоресцирующие клетки, присоединившие индикаторные частицы только одного вида.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки:
1. Концентрация раствора антиген/гаптена, используемого для "нагрузки" индикаторных частиц антигеном/гаптеном составляет 10 моль/л именно по исследуемому веществу в данном антигене/гаптене, а не 0,1% раствор промышленного гаптена как в прототипе, где не учитывается процент самого исследуемого вещества. Концентрация раствора антигена/гаптена 10 моль/л подобрана опытным путем и является оптимальной; поскольку при приготовлении комплекса "индикаторная частица - антиген/гаптен" именно такая концентрация обеспечивает полноценную "нагрузку" индикаторных частиц антигеном/гаптеном, что максимально обеспечивает выявление антиген/гаптенспецифических клеток. Концентрация раствора менее 10 моль/л оказывается недостаточной для полноценной "нагрузки" индикаторных частиц антигеном/гаптеном, а концентрация более 10 моль/л является токсической для рецепторного аппарата клеток, в результате число выявленных антиген/гаптенспецифических клеток существенно снижается.

2. Скорость центрифугирования индикаторных частиц с раствором антигена/гаптена не 15000 об/мин, как в прототипе, а 1700 об/мин, так как опытным путем выявлено, что при данной скорости центрифугирования происходит наиболее полноценная нагрузка индикаторных частиц антигеном/гаптеном, что в последующем обеспечивает выявление максимального количества антиген/гаптенспецифических клеток.

3. В прототипе для выявления гаптенспецифических лимфоцитов используют три типа индикаторных частиц, одновременно вносимых в пробу исследуемых клеток.

1/ эритроциты барана для идентификации T-лимфоцитов,
2/ зимозан неокрашенный, нагруженный C-3-компонентом комплемента для идентификации B-лимфоцитов.

3/ предварительно окрашенный замозан "нагруженный" 0,1% раствором промышленного гаптена для выявления среди T и B-лимфоцитов (идентифицированных с помощью двух первых частиц) гаптен/специфических клеток. А в предложенном способе - индикаторные частицы только одного вида, "нагруженные" исследуемым раствором антиген/гаптеном в концентрации 10 моль/л, используемые для идентификации антиген/гаптенспецифических клеток. Использование в заявляемом способен индикаторных частиц только одного вида с одинаковыми свойствами исключает погрешность при связывании их с антиген/гаптенспецифическими рецепторами клеток, обусловленную различной способностью к аглютинации одновременно вводимых в пробирку с клетками различных по своей природе и свойствам индикаторных частиц.

4/ Одновременное внесение в прототипе всех индикаторных частиц в исследуемую культуру клеток и одновременное их инкубирование. А в способе - индикаторные частицы инкубируются с клетками самостоятельно (предварительно) в течение 30 мин до внесения в эту систему моноклональных антител, что исключает возможность неспецифической аглютинации моноклональных антител рецепторами антиген/гаптенспецифических клеток, что может повлиять на число выявленных антиген/гаптенспецифических клеток.

5. Количество каждого компонента системы (культура исследуемых клеток и индикаторные частицы) в прототипе составляет 100 мкл, а в заявляемом способе количество компонентов в системе (культура исследуемых клеток, индикаторные частицы, моноклональные антитела, проявляющие антитела) составляет 20 мкл. Это делает проведение реакции более удобной и обеспечивает значительно меньший расход реактивов и исследуемой культуры клеток (компонентов реакции).

6. Время инкубации при 37^oC исследуемой культуры клеток с индикаторными частицами не 5 мин, как в прототипе, а 7-10 мин, так как опытным путем установлено, что данное время является оптимальным для установления связей между антигеном/гаптеном, адсорбированном на индикаторных частицах и рецепторами к данному антигену/гаптену на поверхности клеток.

7. Скорость центрифугирования клеток с индикаторными частицами опытным путем выбрана 1200 об/мин, а не 1500 об/мин, как в прототипе, так как опытным путем установлено, что при центрифугировании при 1200 об/мин не происходит повреждения клеток или прилипания их и индикаторных частиц к стенкам пробирки, вместе с тем данная скорость центрифугирования оказывается достаточной для связывания клеток имеющих рецепторы к антигену/гаптену с индикаторными частицами, адсорбирующими этот антиген/гаптен.

8. Условия инкубирования пробы исследуемой культуры клеток с индикаторными частицами в прототипе 60 мин при 12^o С, а в заявляемом способе 30 мин при 4^oC, так как опытным путем установлено, что при 4^oC в течение 4 мин создаются оптимальные условия для образования достаточно прочных связей между антиген/гаптенспецифическими рецепторами клеток антигеном/гаптеном, адсорбированном на поверхности индикаторных частиц.

9. Фиксация в прототипе образовавшихся комплексов (индикаторные частицы-клетки) осуществляется в течение 20 мин глютаровым альдегидом, от которого потом клетки необходимо отмыть дистиллированной водой. Глютаровый альдегид в силу своих свойств может способствовать образованию неспецифических связей между клетками и индикаторными частицами, что способствует скученности клеток и индикаторных частиц в мазке, это приводит к погрешности при подсчете антиген/гаптенспецифических клеток. В заявляемом способе выше названный момент как причина погрешности при оценке результатов в исследовании исключен, так как отсутствует фиксация клеток в глютаровом альдегиде.

10. Отсутствие в прототипе отмывания взвеси клеток при 1200 об/мин физраствором в течение 1-2 мин после инкубации клеток с индикаторными частицами в течение 30 мин при 4^oC, что необходимо для соблюдения "чистоты" эксперимента.

11. Отсутствующее в прототипе внесение в систему "клетки-индикаторные частицы" 20 мкл готового моноклонального антитела заданной специфичности для определения принадлежности выявленных антиген/гаптенспецифических (сенсибилизированных) иммунокомпетентных клеток к конкурентному виду, популяции, субпопуляции и инкубации взвеси в течение 30 мин при комнатной температуре для аглютинации моноклональных антител с рецепторами клеток на из поверхности.

12. Отсутствующее в прототипе отмывание взвеси клеток при 1200 об/мин физраствором в течение 1-2 мин с целью удалить из системы несвязавшиеся с рецепторами клеток моноклональные антитела.

13. Отсутствующее в прототипе внесение во взвесь клеток обработанную моноклональными антителами 20 мкл проявляющих (антимышечных) антител, обеспечивающих флюоресценцию моноклональных антител, адсорбированных на поверхности клеток, и инкубация полученной взвеси при 4^oC 30 мин для связывания введенных в систему проявляющих антител с адсорбированными на поверхности клеток моноклональными антителами.

14. Отсутствующее в прототипе отмывание взвеси клеток от избытка непрореагировавших (несвязавшихся) проявляющих антител в режиме центрифугирования 1200 об/мин в течение 1-2 мин.

15. Отсутствующее в прототипе ресуспендирование взвеси клеток в 40 мкл физраствора, затем инкубирование в течение 20 мин при комнатной температуре взвеси клеток с индикаторными частицами на предметном стекле, обработанном 0,005% растворам poLi-L-Lisine для адсорбции клеток на стекле и ограничения их подвижности, после чего производят отсасывание со стекла избытка физраствора.

16. Отсутствующее в прототипе внесение в пробу клеток на стекле 20 мкл 50% раствора глицерина на физрастворе в качестве иммерсионной среды. Глицерин, с одной стороны, ограничивает подвижность клеток, а с другой - позволяет смещать клетки друг относительно друга с помощью объектива микроскопа.

17. Подготовленные таким образом пробы клеток микроскопируют с помощью люминисцентного микроскопа, так как в пробе клеток идентифицируют четко различимые флюоресцирующие клетки, присоединившие индикаторные частицы, нагруженные заданным антигеном/гаптеном.

В прототипе из взвеси клеток индикаторных частиц после их фиксации в глютаровом альдегиде и отмывании дистиллированной водой готовят на предметном стекле мазки, которые затем при комнатной температуре высушивают, фиксируют, снова высушивают, затем окрашивают по Романовскому-Гимзе, затем промывают дистиллированной водой, затем снова высушивают и микроскопируют светом микроскопом в масляной имерсионной среде, где подсчитывают количество клеток, присоединивших индикаторные частицы в различных комбинациях и количестве. В результате весь алгоритм прототипа занимает по времени 20-24 ч, что делает способ длительным, а поэтому неудобным для практики клинических лабораторий.

Таким образом, в заявленном способе отсутствуют затраты времени на приготовление мазков, их высушивание, фиксацию, окраску, что значительно сокращает время исследования и делает способ удобным для применения в практике клинических лабораторий.

Пример 1. Больной К., 42 года. Жалобы на субфебриллитет, кашель с небольшим количеством мокроты, вялость, снижение аппетита, повышенную потливость, похудение.

Из анамнеза: болен в течение 6 месяцев. Заболел 12.01.96 г., когда появился кашель с мокротой, недомагание, вялость, снижение аппетита. Обратился в поликлинику по месту жительства, где больному было проведено рентгенологическое обследование органов грудной клетки и была выявлена инфильтрация в правой верхней доле легкого. Больному был выставлен диагноз: "Пневмания очаговая справа, острая"
Больной госпитализирован в стационар, где ему была проведена антибактериальная и симптоматическая терапия
В связи с отсутствием эффекта от проводимого лечения больному произведена томография легких, подтверждающая сохраняющуюся инфильтрацию в правой верхней доле легкого. Больному была произведена диагностическая бронхоскопия и последующим бактериоскопическим исследованием аспирата на "ВК"-скопию (т. е. на наличие возбудителя туберкулеза в бронхиальном секрете). Результат отрицательный, т.е. возбудители туберкулеза (бактерии Коха) не обнаружены.

По результатам томографического исследования больному выставлен предварительный диагноз: "Очаговый туберкулез легких S₂ справа, без выделение микробактерий туберкулеза (ВК-).

Результаты лабораторного обследования больного:
- общий анализ крови: НВ 112 г/л, Еч 3,0 · 10¹²/л, лейкоциты 11,0 · 10⁹/л, c/я 48%, п/я 4%, лимфоциты 32%, эоз 4%, мон 12%, СОЭ 16 мм/ч (т.е. имеет место лейкоцитоз и лимфоцитоз, умеренное ускорение СОЭ)
-ИММУНОГРАММА:
метод розеткообразования: Т-лимфоцитов-59%, В-лимфоцитов-14%, О-лимфоцитов - 20%, Т-активных лимфоцитов по результатам реакции митогенной стимуляции лимфоцитов с туберкулином - 3%.

РТМЛ (реакция торможения миграции лейкоцитов) - 20%, НСТ-тест с туберкулином - 26%.

методом моноклональных антител: Т-тотальные лимфоциты (СД₃) - 62% Т-хелперы (СД₄) - 25%, Т-супрессоры (СД₃) - 37% В-лимфоциты (СД₂₂) - 16%. СД₄/СД₈ = 25%/37% = 0,68
Уровень иммуноглобулинов сыворотки крови JgA - 2,1 г/л, JgM - 1,6 г/л, JgG - 7,1 г/л.

Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) - 71 у.е.

Приведенные результаты общеклинического и лабораторного, в том числе иммунологического, исследования больного неспецифичны, т.е. не позволяет однозначно подтвердить специфический процесс туберкулезной этиологии.

Поэтому в связи с ограниченностью использования специфических реакций (по причине их малого количества и низкой специфичности) для диагностики специфической сенсибилизации к туберкулину решено было провести дообследование больного по предложенной методике для выявления туберкулинспецифических иммунокомпетентных клеток крови, где в качестве заданного специфического антигена/гаптена использовался туберкулин в указанное в описании концентрации.

Результаты исследования: Т-специфических общих лимфоцитов - 19%, Т-специфических хелперов - 7%, Т-специфических супрессоров - 12%, В-специфических лимфоцитов - 3%. Соотношение Т-специфических хелперов к Т-специфическим супрессорам = 1/2.

Таким образом, в результате исследования крови больного по предложенной методике были идентифицированы туберкулинспецифические иммунокомпетентные клетки в иммунорегуляторных субпопуляциях, в частности туберкулин-специфические Т-хелперы и Т-супрессоры.

Анализ результатов данного исследования подтверждает специфический туберкулезный процесс. Количество специфических Т-супрессоров составило 12%, в то время как специфических Т-хелперов - 7%. Такое соотношение специфических хелперов к специфическим супрессорам свидетельствует о течение специфического туберкулезного процесса по иммуносупрессорному типу.

Антиген-специфические (в данном случае туберкулин-специфические) Т-супрессоры формируются только под влиянием конкретного антигена (в данном случае туберкулин) и действуют строго специфично. На этом фоне, как правило, наблюдается неблагоприятное течение туберкулеза. Учитывая степень и вариант сенсибилизации организма к антигену (в данном случае специфическая сенсибилизация организма к туберкулину, иммуносупрессорный вариант, средняя степень), возможно определить прогноз заболевания и назначить этиотропное патогенетически обоснованное лечение (в данном случае с использованием иммуно стимуляторов).

Пример 2. Больной В., 23 лет. Госпитализирован в пульмонологическое отделение 04.02.96 г. с жалобами на удушье, непродуктивный кашель, затрудненный выдох. Диагноз при поступлении: бронхиальная астма, атоническая, средней тяжести, постприступный период".

Из анамнеза: болен в течение 7 лет, обострения заболевания чаще весенне-летний период.

Больному проведено клинико-лабораторное исследование:
- общий анализ крови: Нв 130 г/л, Еч 3,6 · 10¹²/л, лейкоциты 10,1 · 10⁹/л, п/я 2%, с/я 56%, лимфоциты 28%, эоз 12%, мон 2%, СОЭ 13 мм/ч.

ИММУНОГРАММА:
метод розеткообразования: Т-лимфоциты 60%, В-лимфоциты 27%, О-лимфоциты 7%, Т-активные лимфоциты 21%
РТМЛ с ФГА (фитогемагглютинином) - 14%, НСТ - тест с пирогеналом 40%
метод моноклональных антител: Т-тотальные лимфоциты (СД₃) - 62%, Т-хелперов (СД₄) 35%, Т-супрессоры (СД₈) 27%, В-лимфоцитов (СД₂₂) - 29% СД₄/СД₈ = 1,3
Уровень иммуноглобулинов сыворотки крови JgA - 1,8 г/л, JgM - 1,4 г/л, JgG - 14,2 г/л
Уровень ЦИК 89 у.е.

Результат бронхоскопии: грубой патологии нет, в анализе мокроты - эозинофилия до 20%.

Данные анамнеза: в также приведенные результаты общеклинического и лабораторного, в том числе иммунологического исследований больного неспецифичны, не позволяют выявить наличие или отсутствие специфической сенсибилизации организма больного к определенным антигенам/гаптенам.

С целью выявления сенсибилизации организма к предполагаемым антигенам (неинфекционным), больной был обследован в аллергологическом кабинете с использованием стандартных наборов пыльцевых, эпидермальных, пищевых, бытовых аллергенов по стандартной методике с помощью внутрикожных аллергических проб. Результаты исследования: у больного выявлена положительная реакция (++++) на пыльцу полыни горькой и одуванчик, а также положительная реакция (+++) на березу плакучую и подсолнечник.

То есть в результате проведения внутрикожных аллергических проб выявлена сенсибилизация организма больного к четырем аллергенам пыльцевого происхождения. Однако по результатам этого исследования нельзя судить о степени выраженности и варианте сенсибилизации организма к каждому из выявленных аллергенов.

Поэтому решено провести дообследование больного по предложенной методике для выявления аллерген-специфических иммунокомпетентных клеток крови, где в качестве заданного специфического антигена/гаптена использовали стандартные аллергены пыльцы полыни горькой, одуванчика, подсолнечника, березы плакучей в указанной в описании концентрации.

Результаты исследования на полынь горькую:
Т-специфические общие - 16:, Т-специфические хелперы - 12% Т-специфические супрессоры - 4%, B-лимфоциты специфические - 7%
Соотношение специфических Т-хелперов к Т-супрессорам = 3/1.

на пыльцу одуванчика:
T-специфические общие - 8%, T-специфические хелперы - 6%, T-специфические супрессоры - 2%, B-специфические - лимфоциты - 5%.

Соотношение специфических T-хелперов к T-суперссорам = 3/1.

на березу плакучую:
T-специфические общие - 7%, T-специфические хелперы - 4%, T-специфические супрессоры - 3%, B-специфические лимфоциты 2%
Соотношение T-специфические хелперы/T-специфические супрессоры = 4/3
на подсолнечник:
T-специфические общие - 9%, T-специфические халперы - 6%, T-специфические супрессоры - 3%, B-специфические лимфоциты - 1%
Соотношение T-специфические хелперы/T-специфические супрессоры = 2/1
В результате расширенного иммунологического исследования на предложенной методике были идентифицированы аллерген-специфические иммунокомпетентные клетки крови. В частности, аллерген-специфические Т-хелперы и Т-супрессоры.

Анализ результатов предложенного дополнительного исследования подтверждает специфической аллерген-зависимый характер заболевания.

На основании результатов этого исследования можно заключить, то что у больного более выражена сенсибилизация к пыльце полыни горькой, средняя степень сенсибилизации к пыльце одуванчика и подсолнечника и низкая степень сенсибилизации к пыльце березы плакучей.

Во всех четырех случаях имеет место преобладание количества специфических Т-хелперов над Т-супрессорами (вариант сенсибилизации - по индуктивному типу), и наиболее выражено это преобладание для пыльцы полыни горькой и пыльцы одуванчика, менее выражено - для пыльцы подсолнечника, и совсем минимальное - для березы плакучей.

Учитывая степень выраженности и вариант сенсибилизации организма больного к выявленным аллергенам, больному было назначено этиотропное, патологически обоснованное лечение с использованием иммунодепрессантов. Ремиссия на сегодняшний день - 1,5 года.

Пример 3. Беременная Т., 23 года, госпитализирована в отделение патологии беременных родильного дома с жалобами на наличие ноющих болей внизу живота тянущего характера, усиление шевелений плода, повышенную утомляемость.

Диагноз при поступлении: Беременность 29 недель. Угрожающие преждевременные роды.

Из анамнеза выяснено, что женщина соматически здорова, настоящая беременность - первая. В сроке 13 - 14 недель беременности находилась в течение трех недель на стационарном отделении по поводу угрозы прерывания беременности.

Беременная проживает в экологически неблагоприятном районе, вблизи от нефтеперерабатывающего завода, что обуславливает постоянное поступление в организм женщины токсических микроэлементов, в том числе тяжелых металлов. Известно также, что муж беременной часто курит в квартире, таким образом, женщина является пассивной курильщицей, что также является причиной поступления в организм беременной тяжелых металлов, токсичных ксентобиотиков.

Беременной проведено клинико-лабораторное обследование:
общий анализ крови: Нв 119 г/л, Еч 3,0 · 10¹² л, лейкоциты 5,5 · 10⁹/л, п/я 1%, с/я 68%, лимфоциты 29%, эоз 1%, СОЭ 12 мм/ч, Н1 0,38, тромбоциты 210 · 10³/л; МОН 1%;
Иммунограмма:
метод. розеткообразования Т-лимфоцитов - 60:, В-лимфоцитов - 18%, О-лимфоцитов - 12%, Т-активных лимфоцитов - 17%, НСТ-тест 48%
метод моноклональнных антител Т-тотальные лимфоциты (СД₃) - 58%, Т-хелперов (СД₄) - 31%, Т-супрессоров (СД₈) - 27%, В-лимфоцитов (СД₂₂) - 18%, СД₄/СД₈ = 1,15
Уровень иммуноглобулинов сыворотки крови: JgM = 1,4 г/л JgA = 0,52 г/л JgG = 9,0 г/л.

ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов) в сыворотке крови - 31 у.е.

- общий анализ мочи : следы белка, отн. плотность мочи
- 1032, соли - оксалаты +++.

- Результаты УЗИ (ультразвуковое исследование) плода и плаценты:
В полости матки лоцируется один живой плод, продольно, головное предлежание, соответствует 27 нед ± 5 дней (по последней менструации 29 нед ± 5 дней), головка плода низко над входом в малый таз, сердцебиение плода - 162 в мину, ритмичное. Плацента по задней стенке матки, "0" степени зрелости, толщиной 43 мм, имеется локальная отечность плаценты. По передней стенке матки - гипертонус миометрия. Вод относительно мало.

Доплерометрия сосудов пуповины и матки: СДО (систоло-диастолическое отношение) артерии пуповины = 3,43; СДО маточных артерий: левой = 1,9, правой = 2,8.

Заключение по УЗИ: Беременность 29 недель, синдром задержки развития плода I ст., асимметричная форма. Фето-плацентарная недостаточность II ст. Угрожающие преждевременные роды.

- Результаты исследования на ТОРСН - инфекцию: отрицательные.

Таким образом, по данным клинико-лабораторных исследований выставлен диагноз: "Беременность 29 недель". Синдром задержки развития плода I степени, ассиметричная форма. Фето-плацетарная недостаточность II ст. Угрожающие преждевременные роды".

Однако по результатам вышеперечисленных исследований нельзя установить возможную этиологию возникающих осложнений беременности.

Учитывая экологическую обстановку, в которой проживает беременная, решено провести дополнительное исследование по предложенной методике для выявления специфической сенсибилизации организма беременной к тяжелым металлам (Cd, Pb, Zn, Cu, Mn, Hg), имеющих место в нефтеперерабатывающей промышленности, а также с Co который в избытке выделяется в воздухе при курении сигарет.

В качестве заданного специфического антигена/гаптена использовали растворы солей тяжелых металлов (Cu, Zn, Cd, Pb, Mn, Hg).

Результаты исследования:
к Cd: T-специфические общие - 12%, T-специфические хелперы - 4%, T-специфические супрессоры - 8%, B-специфические лимфоциты - 2%. Соотношение T-специфические хелперы/T-специфические супрессоры 1/2
к Pb: T-специфические общие - 8%, T-специфические хелперы - 3%, T-специфические супрессоры - 5%, B-специфические лимфоциты - 2%.

Соотношение T-специфические хелперы/T-специфические супрессоры = 3/5
к Mn: T-специфические общие - 7%, T-специфические хелперы - 2%, T-специфические супрессоры - 5%, B-специфические лимфоциты - 1%
Соотношение T-специфические хелперы/T-специфические супрессоры = 1/2,5
к Hg: T-специфические общие - 5%, T-специфические хелперы - 3%, T-специфические супрессоры - 2%, B-специфические лимфоциты 0%.

Соотношение T-специфические хелперы/T-специфические супрессоры = 1,5/1.

к Zn: T-специфические общие - 4%, T-специфические хелперы - 2%, T-специфические супрессоры - 2%, B-специфические лимфоциты - 1%.

Соотношение T-специфические хелперы/T-специфические супрессоры = 1/1.

к Cu: T-специфические общие - 4%, T-специфические хелперы - 1%, T-специфические супрессоры - 3%, B-специфические лимфоциты - 1%
Соотношение T-специфические хелперы/T-специфические супрессоры 1/3.

Как видно из приведенных результатов дополнительного исследования по предложенной методике, наиболее высокая и патогенетически значимая степень сенсибилизации организма беременной отмечена в к Cd и Pb, менее выраженная и патологическая сомнительная ступень сенсибилизации организма беременной к Mn и Hg, и незначительный, патогенетически незначительный уровень сенсибилизации отмечен к Cu и Zn .

Кроме того, на основании соотношения специфических T-супрессоров к специфическим T-хелперам можно заключить, что имеет место значительное преобладание специфических T-супрессоров над специфическими T-хелперами (в 2-3 раза). Следовательно, в данном случае имеется сенсибилизация организма к вышеперечисленным металлам в определенной нами степени преимущественно по иммуносупрессивному типу, что является крайне неблагоприятным с точки зрения прогноза для настоящей беременности.

По многочисленным литературным данным известно, что кадмий обладает эмбриотоксическим действием, являясь антиметаболитом ряда эссенциальных микроэлементов, проникает через плаценту, нарушает и развитие плода. В дозе, превышающей 11,1 мкмоль/л, обладает тератогенным действием, вызывает хромосомные аномалии, ведет к развитию внутриутробных пороков развития плода, может привести к гибели плода.

Известно также, что свинец является клеточным ядом, причиной хронического кислородного голодания тканей. Накопление свинца в ткани плаценты ведет к ее отеку, некрозу, тотальной и частичной преждевременной отслойке плаценты и гибели плода. Повышенное содержание свинца в организме матери может быть причиной самопроизвольных выкидышей, задержки развития плода, неонатальной и перинатальной гибели плода.

Для подтверждения повышенного содержания в организме беременной свинца и кадмия было проведено исследование сыворотки крови больной на содержание этих металлов с помощью АСС (атомно-абсорбционной спектрофотометрии)
Результаты исследования: кадмий - 8,6 мкмоль/л (ПДК 11,1 мкмоль/л), свинец 2,54 мкмоль/л (в норме - до 1,45 - 1,93 мкмоль/л, ПДК 3,86 мкмоль/л).

Таким образом, изменения в организме беременной, обусловленные сенсибилизацией к тяжелым металлам, привели к нарушению не только функцией плацентарного комплекса, но и к нарушению роста и развития плода (о чем свидетельствуют приведенные выше данные клинико-лабораторного обследования), что в конечном итоге ведет к невынашиванию беременности.

Формула изобретения

Способ идентификации антиген/гаптенспецифических субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови, заключающийся во внесении индикаторных частиц в культуру исследуемых иммунокомпетентных клеток и подсчета клеток, присоединивших индикаторные частицы, отличающийся тем, что во взвесь иммунокомпетентных клеток любого вида (субпопуляции, популяции) вносят индикаторные частицы одного вида, предварительно нагруженные раствором заданного гаптен/антигена в физиологическом растворе в концентрации 10^-2 моль/л в течение 45 - 60 мин при 37^oC и осажденные в режиме центрифугирования при 1700 об/мин, а затем ресуспендированные в 0,6 мл физраствора, после чего взвесь исследуемых клеток с индикаторными частицами инкубируют при 37^oC в течение 7 - 10 мин и центрифугируют при 1200 об/мин, а затем повторно инкубируют при +4^oC 30 мин и отмывают физраствором при 1200 об/мин, после чего вносят во взвесь клеток 20 мкл готовых моноклональных антител определенной (заданной) специфичности, которыми инкубируют клетки в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем отмывают клетки при 1200 об/мин физраствором и добавляют к ним 20 мкл проявляющих антител, с которыми инкубируют клетки 30 мин при +4^oC, а затем отмывают клетки при 1200 об/мин физраствором, ресуспендируют клетки в 40 мкл физраствора, переносят на предметное стекло и нефиксированными подсчитывают флюорисцирующие клетки в 50%-ном растворе глицерина на физрастворе.