Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в промышленном производстве сухой живой вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных. Для этого глубинное культивирование проводят в течение 6-8 ч при (37±1)^oС со снижением окислительно-восстановительного потенциала среды после засева, поддержанием парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода и дозированной подачей глюкозы при лимитировании роста сальмонелл глюкозой. Полученную культуру концентрируют, разводят сахарозо-желатиновой с тиомочевиной защитной средой на калийфосфатном буферном растворе, фасуют во флаконы и лиофильно высушивают. Использование данного режима культивирования сальмонелл и защитной среды позволяет удешевить вакцину и повысить накопление жизнеспособных бактерий, качество, стабильность и стандартность биологических свойств вакцины. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве сухой живой вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных.

Известен способ получения сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней (патент РФ N 1577116 A 61 K 39/112, С 12 N 1/20, 14.09.98).

Существующий способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных обладает рядом недостатков: процесс культивирования довольно продолжителен (12-14 ч), не позволяет использовать современное оборудование и приборы, защитная среда для лиофильного высушивания не обеспечивает стабильности вакцины при длительном хранении, что сказывается на качестве препарата, а также на эффективности производства.

При анализе патентной документации и научно-технической литературы нами не обнаружено достаточно эффективного способа изготовления живых сухих вакцин против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных, приближающегося к современному уровню производства биопрепаратов.

Целью заявляемого изобретения является сокращение времени выращивания культуры, снижение себестоимости препарата, а также повышение качества, стабильности в процессе хранения и стандартности биологических свойств вакцины.

Поставленная цель достигается за счет того, что периодическое глубинное культивирование сальмонелл проводят в питательной среде в течение 6-8 ч в соответствии с разработанным алгоритмом управления процессом, концентрируют полученную культуру, бактериальную массу ресуспендируют в разработанной защитной среде и высушивают.

Способ осуществляется следующим образом.

В стерильный ферментер загружают жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Питательную среду в ферментере засевают культурой сальмонелл (Salmonella choleralsuis или Salmonella dublin), выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и выращивают при температуре (37±1)^oC в течение 6-8 часов.

После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до (-110) - (-130) мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и при минимальной скорости вращения мешалки, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 15-25% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости регулируют 10%-ным раствором NaOH, поддерживают на уровне 7,6 - 7,8 ед. pH, дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05 - 0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при постоянных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения pH культуральной жидкости. Полученную культуру концентрируют, разводят сахарозо-желатиновой с тиомочевиной защитной средой на калий-фосфатном буферном растворе, фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

Пример 1. Способ изготовления вакцины с минимальными значениями параметров.

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)^o в течение 6 часов. После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -110 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 15% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости на уровне 7,6 ед. pH с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения pH культуральной жидкости. Накопление биомассы в 1 см³ составляет 22.6 млрд. Полученную культуру концентрируют и разводят сахарозо-желатиновой с тиомочевиной защитной средой на калийфосфатном буферном растворе, приготовленной по следующей прописи, мас.%: Сахароза - 8,0 Желатин - 0,4 Тиомочевина - 0,4 Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,14 Вода дистиллированная - До 100,0 Разведенную культуру фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

Количество живых клеток в вакцине до сушки в 1 см³ составляет 15,0 млрд, после сушки - 7,3 млрд, через 12 мес. хранения - 2,9 млрд.

Пример 2. Способ изготовления вакцины с оптимальными значениями параметров.

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)^oC в течение 7 ч. После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -120 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 20% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,7 ед. pH с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,1% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения pH культуральной жидкости. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 40,0 млрд. Полученную культуру концентрируют и разводят сахарозо-желатиновой с тиомочевиной защитной средой на калийфосфатном буферном растворе, приготовленной по следующей прописи, мас.%: Сахароза - 10,0 Желатин - 0,5
Тиомочевина - 05
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,17
Вода дистиллированная - До 100,0
Разведенную культуру фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

Количество живых клеток в вакцине до сушки в 1 см³ составляет 30,0 млрд, после сушки - 28,0 млрд, через 12 мес. хранения - 24,0 млрд.

Пример 3. Способ изготовления вакцины с максимальными значениями параметров.

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)^oC в течение 8 ч. После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -130 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 25% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,8 ед. pH с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения pH культуральной жидкости. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 25,0 млрд. Полученную культуру концентрируют и разводят сахарозо-желатиновой с тиомочевиной защитной средой на калийфосфатном буферном растворе, приготовленной по следующей прописи, мас.%:
Сахароза - 12,0
Желатин - 0,6
Тиомочевина - 0,6
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,6
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,2
Вода дистиллированная - До 100,0
Разведенную культуру фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

Количество живых клеток в вакцине до сушки в 1 см³ составляет 20,0 млрд, после сушки - 14,0 млрд через 12 мес. хранения - 8,0 млрд.

Пример 4. Способ изготовления вакцины со значениями параметров ниже минимальных.

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)^oC в течение 5 ч. После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до - 100 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 10% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,5 ед. pH с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а подачу глюкозы не осуществляют. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 1,0 млрд. Полученную культуру концентрируют и разводят сахарозо-желатиновой с тиомочевиной защитной средой на калийфосфатном растворе, приготовленной по следующей прописи, мас.%:
Сахароза - 6,0
Желатин - 0,3
Тиомочевина - 0,3
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,3
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,11
Вода дистиллированная - До 100,0
Разведенную культуру фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

Количество живых клеток в вакцине до сушки в 1 см³ составляет 2,0 млрд, после сушки - 0,9 млрд, через 12 мес. хранения - 0,03 млрд.

Пример 5. Способ изготовления вакцины со значениями параметров выше максимальных.

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при температуре (37±1)^oC в течение 9 ч. После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -140 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 30% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,9 ед. pH с помощью 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,20% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения pH культуральной жидкости. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 10,0 млрд. Полученную культуру концентрируют и разводят сахарозо-желатиновой с тиомочевиной средой на калийфосфатном буферном растворе, приготовленной по следующей прописи, мас.%:
Сахароза - 14,0
Желатин - 0,7
Тиомочевина - 0,7
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,7
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,23
Вода дистиллированная - До 100,0
Разведенную культуру фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

Количество живых клеток в вакцине до сушки в 1 см³ составляет 5,0 млрд, после сушки - 1,8 млрд, через 12 мес. Хранения - 0,2 млрд.

Технологические параметры изготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных, указанные в примерах, приведены в табл.

Преимущества заявленного способа перед известным:
1. Применение интенсифицированного способа культивирования позволяет повысить накопление жизнеспособных бактерий при сокращении времени выращивания с 12- 14 до 6-8 часов.

2. Вакцина, полученная этим способом, более стабильна по биологическим свойствам, в том числе и по иммуногенности.

Формула изобретения

Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных, включающий засев вакцинного штамма сальмонелл, культивирование в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера с дробной подачей глюкозы с последующим концентрированием и лиофилизацией полученной бактериальной суспензии в защитной среде, содержащей сахарозу и желатин, отличающийся тем, что культивирование проводят в течение 6 - 8 ч, причем после засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до (-110) - (-130) мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 15 - 25% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,6 - 7,8 ед. pH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05 - 0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, лиофильное высушивание ведут в защитной среде, дополнительно содержащей тиомочевину, калий фосфорнокислый однозамещенный и калий фосфорнокислый двузамещенный, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Сахароза - 8,0 - 12,0
Желатин - 0,40 - 0,60
Тиомочевина - 0,40 - 0,60
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,40 - 0,60
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,14 - 0,20
Вода дистиллированная - До 100,0

РИСУНКИ

Рисунок 1