Способ выделения комплекса дестабилаза - простагландин из медицинской пиявки

 

Изобретение относится к медицине и может применяться в гематологии, биохимии и медицинской промышленности. Для осуществления способа проводят очистку обработанного сырья путем аффинной хроматографии на возвратных колонках на антитела 6-кето-простагландин F_α, иммобилизированные на водонерастворимом носителе. Технический результат - повышение объема выхода конечного продукта и его чистоты. 2 табл.

Изобретение относится к медицине и может применяться в биохимии, гематологии, медицине и медицинской промышленности.

Известен способ получения дестабилазы из пиявки, взятый нами в качестве прототипа (1), включающий подготовку водных экстрактов медицинских пиявок, экстрагирование этилацетатом. В качестве сырья используют секрет слюнных желез пиявок, порошок лиофильно высушенных пиявок и экстракт из культуры бактерии-симбионта медицинских пиявок.

Однако данный способ имеет следующие недостатки: конечный продукт не является гомогенным препаратом, т. к. содержит в своем составе гирудин и ингибитор калликреина.

Целью предлагаемого изобретения является увеличение выхода конечного продукта и повышение его чистоты.

Поставленная цель достигается тем, что аффинную хроматографию проводят на антитела к 6-кето-прострагландин F_1α, иммобилизированные на водонерастворимом носителе.

Приводим примеры осуществления способа.

Пример 1. Лиофилизированную антисыворотку к 6-кето-ПГ иммобилизовывали на бромцианактивированную агарозу. На колонку наносили 5 мл водного экстракта лиофильно высушенных пиявок (система рециклина в течение 2 часов). Промывали колонку дистиллированной водой. Элюировали целевой продукт буфером, содержащим 0,2 М глицина, 0,15 M HCl pH 3,0. Собранные фракции подщелачивали 0,1 H NaOH до pH 8,0. Объем элюата 8,5 мл (белок 0,03 мг/мл). Элюат диализовали против дистиллированной воды в течение 48 часов при 4^oC через мембрану с порами размером 2000 Да, после чего лиофилизовали. Полученный препарат соответствует целевому продукту, обладает фибринолитической активностью, содержит простангландины и не обладает активностью гирудина и ингибитора калликреина плазмы крови. При электрофорезе проявляется в виде доминантной полосы, соответствующей белку с ММ 12,3 кДа (табл. 1).

Пример 2. Все продукты, как в п. 1, только в качестве сырья использовали секрет слюнных желез пиявок в количестве 5 мл, а элюирующего буфера - раствор уксусной кислоты с pH 4,0. Полученный препарат соответствует целевому продукту (табл. 2).

Пример 3. Все, как в примере 1, только в качестве сырья использовали водный экстракт культуры бактерии-симбиона медицинских пиявок, а элюирующего раствора - раствор уксусной кислоты с pH 3,5, содержащий 02 М глицина. Полученный препарат соответствует целевому продукту.

Пример 4. Все, как в примере 1, только в качестве элюирующего буфера использовали раствор уксусной кислоты с pH 5,0. Активность снижена на 80%. Полученный препарат не соответствует целевому продукту, т.к. полной элюции не произошло.

Методы определения.

1. Спектрофотометрический метод определения белка (2).

2. Активность гирудина определяли по удлинению тромбинового времени и выражали в международных ATNIH единицах. Активность ингибитора калликреина плазмы крови анализировали по удлинению времени рекальцификации плазмы и выражали в условных антипрокоагулянтных единицах (3).

3. Содержание простагландинов анализировали по прописи фирмы Amersham (США) с использованием радиоммунологического метода определения 6-кето- P₆F_1α, 4. Электрофорез проводили в системе Лемли в ПААГ в декотурирующих условиях.

5. Фибринолитическую активность определяли по размеру зон лицина на пластинах стабилизированного фибрина (3).

Предлагаемый способ позволяет получить конечный продукт с более высокой частотой и в большем объеме.

Источники информации 1. ДАН СССР, 1987, т. 292, N 6.

2. Кочетов Г. А. Практическое руководство по экзимологии. - М.: Высшая школа, 1971.

3. Кудряшов Б.А. Большой практикум по физиологии человека и животных. - М.: Высшая школа, 1984.

Формула изобретения

Способ выделения комплекса дестабилиза-простагландин из медицинской пиявки, включающий приготовление водного экстракта с последующей очисткой обработанного сырья, отличающийся тем, что очистку осуществляют аффинной хроматографией на антитела к 6-кето-простагландин F_lα, иммобилизованные на водонерастворимом носителе.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 06.09.2003

Извещение опубликовано: 10.11.2004        БИ: 31/2004

---