Адъюванты

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к использованию аминокислотных и дипептидных производных фуллерена в качестве стимуляторов иммунного ответа - адъювантов, и может быть использовано в биологической промышленности при разработке и производстве вакцин. Изобретение относится к использованию описанных ранее соединений, фуллереновых производных аминокислот и дипептидов общей формулы I в качестве адъювантов: С60-X, где С60 - фуллереновое ядро; X=NH-chr-COOH, NH-(CH2)n-COOH, NH-chr-CO-NH-chr-COOH, где n = 2 - 6; R - боковой радикал природной аминокислоты. Изобретение обеспечивает при экспериментах с эритроцитами человека возможность использовать высокие дозы - 400 мкМ, но даже они не обладают гемолитическими свойствами, клетки в процессе инкубации не агглюцинируют и их морфология не изменяется. Введение мышам высокой дозы этих соединений - 80 мг/кг - не влияет на жизнеспособность и поведение мышей в течение 6 месяцев. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к использованию аминокислотных и дипептидных производных фуллерена в качестве стимуляторов иммунного ответа - адъювантов, и может быть использовано в научно-исследовательской практике, а также в биологической промышленности при разработке и производстве вакцин.

Известно, что в качестве адъювантов применяются микроорганизмы, продукты их метаболизма, их суспензии в минеральных маслах (адъювант Фрейнда), гидроокись алюминия, нерастворимые неорганические соли, сапонины, а также экстракты растительного происхождения гидрофобной природы.

Однако известно также, что иммунизация с адъювантами, представляющими собой водно-масляные эмульсии и суспензии, часто приводит к нежелательным осложнениям, таким как местные инфильтрации, изъязвления и аллергические реакции [1 - 3].

Описано использование низкомолекулярного растворимого адъюванта, синтетического фрагмента пептидогликана из стенки микобактерий - N-ацетил-мурамил-Л-аланил-Д-изо-глутамина (МДП) [4].

Использование водорастворимого адъюванта, МДП, исключает те нежелательные последствия, которые проявляются при иммунизации адъювантами на основе водно-масляных эмульсий и суспензий, однако имеет ряд недостатков иного характера, а именно наблюдается пирогенность [5] и нейрофармакологический эффект [3], стимулирующая активность проявляется лишь при относительно высоких дозах, причем для некоторых антигенов требуется ковалентное присоединение МДП к молекуле антигена. Кроме того, этот адъювант лишь заменяет бактериальный компонент в адъюванте Фрейнда, но не отменяет применение масляного компонента, и для ряда антигенов его применение неэффективно [6].

Предлагаемое изобретение относится к использованию описанных ранее соединений, фуллереновых производных аминокислот и дипептидов общей формулы I в качестве адъювантов C60-X, где С60 - фуллереновое ядро; X = NH-СHR-COOH, NH-(CH2)n-COOH, NH-chr-CO-NH-chr-COOH, где n = от 2 до 6, R - боковой радикал природной аминокислоты.

Производные фуллерена общей формулы I представляют собой относительно новый класс органических соединений. Иx синтезируют непосредственно присоединением остатков аминокислот или дипептидов к фуллереновому ядру [7]. Они представляют собой твердые порошкообразные вещества темно-коричневого цвета, растворимые в воде. Их биологические свойства в настоящее время широко изучаются.

Оценку адъювантных свойств соединений I осуществляют в две стадии. На 1-й стадии оценивают их антигенные свойства. Для этого получают гипериммунную сыворотку, иммунизируя кроликов и мышей препаратами различных производных фуллерена совместно с сильным адъювантом Фрейнда. Анализ сывороток проводят по стандартной методике методом ИФА.

На 2-й стадии определяют адъювантные свойства соединений I. Для этого одну группу мышей иммунизируют модельным антигеном - яичным альбумином (Ova), другие несколько групп - смесью Ova с различными соединениями I (Ova-I).

Для выявления IgG - антител используют меченый пероксидазой анти-IgG мыши (Sigma). За титр принимается величина, обратная разведению образца, оптическая плотность (ОП) которого равна ОП образца нормальной сыворотки (перед иммунизацией), разведенного в 50 раз (ОП нормальной сыворотки 0.2, что достигается подбором условий ИФА). Эффективность адъюванта определяют как отношение титра анти-Ova-I-сыворотки к титру анти-Ova-сыворотки.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

I. Определение иммуногенности.

Получение сывороток.

Пример 1.

Для приготовления гипериммунной сыворотки 100 мкг препарата C60-Ser растворяют в 0.5 мл 0.05 М фосфатного буфера с pH 7.4. Первую иммунизацию проводят в полном адъюванте Фрейнда (Gibco, 1:1 об/об), последующие три иммунизации проводят в неполном адъюванте Фрейнда. Кролику породы шиншилла подкожно вводят препараты с двухнедельным интервалом. Забор крови осуществляют в те же интервалы, и полученные из крови образцы сывороток анализируют на антитела к C60-Ser иммуноферментным методом.

Пример 2.

Способ осуществляют как указано в примере 1, но в качестве антигена используют C60-Ala.

Пример 3.

Способ осуществляют как указано в примерах 1 и 2, но в качестве антигена для получения антисыворотки используют дипептидное производное C60-Ala-Ala.

II. Проведение иммуноферментного анализа.

Для проведения ИФА производные фуллерена, указанные в примерах 1 - 3, растворяют в 60 мМ карбонат-бикарбонатном буфере (pH 9.6) и наносят на планшеты GREINER в концентрации 20 мкг/мл. После инкубации в течение 1.5 ч при 37oC планшеты отмывают от несвязавшихся компонентов фосфатно-солевым буфером (ФСБ) pH 7.4 с 0.05% твин-20. Тестируемые сыворотки, полученные соответственно по примерам 1 - 3, разводят в 50 раз раствором 0.5% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) с 0.05% твин-20 в ФСБ и инкубируют с адсорбированными на планшете препаратами в течение 30 мин при 37oC. После инкубации планшеты 4 раза отмывают раствором ФСБ/0.05% твин-20. Раствор конъюгата анти-lgG кролика с пероксидазой (Sigma) в рабочем разведении инкубируют в лунках планшета 30 мин при 37oC и проводят аналогичную отмывку. Для выявления иммунных комплексов используют проявляющую смесь: 4 мг о-фенилендиамина/10 мл 0.1 М цитратфосфатного буфера/80 мкл 3% H2O2. Реакцию останавливают 2N H2SO4, и оптическую плотность в лунках измеряют при 492 нм, используя автоматический сканер Multiscan Plus (Flow Laboratories, Швейцария). Величину фонового поглощения (Cut off) оценивают как среднее значение величины оптической плотности для нормальных кроличьих сывороток (n=5)+3SD. Титр сывороток оценивали при двоичном разведении сывороток, первичное разведение составляло 1:50. Данные приведены в таблице 1.

Как показывают 4 серии иммунизаций, приведенных в таблице 1, аминокислотные и дипептидные производные фуллерена не обладают антигенными свойствами, что, вероятно, обусловлено его особой чужеродностью, т.е. резким отличием их структур от структур природных антигенов и отсутствием подходящих клонов лимфоцитов в природном репертуаре.

III. Определение адъювантных свойств.

1. Получение сывороток.

Пример 1.

Одну группу мышей (7 животных) породы Fl (CBA/BALB/c) иммунизируют внутрибрюшинно 3-кратно через 3-недельные интервалы, вводя в каждую мышь 30 г Ova в 0.5 мл 0.05 М фосфатного буфера с pH 7.4.

Другую группу мышей (7 животных) иммунизируют аналогичным способом, однако используя на каждую мышь 10 г Ova с 330 г C60-Ser /соотношение 3: 100 (в/в)/.

Забор крови осуществляют в те же 3-недельные интервалы, и полученные из крови образцы сывороток анализируют в ИФА, как описано в п. II. Для выявления IgG-антител используют меченый пероксилазой анти-IgG мыши (Sigma). Полученные результаты приведены в таблице 2.

Пример 2.

Способ осуществляют как описано в примере III.1, но в качестве антигена используют смесь 10 г Ova с 30 г C60-Ala /весовое соотношение 1:3/.

Пример 3.

Способ осуществляют как описано в примере III.1, но в качестве антигена используют смесь 15 г Ova с 105 г C60-Ala-Ala /весовое соотношение 1:7/.

Пример 4.

Способ осуществляют как описано в примере III.1, но в качестве антигена используют смесь 10 г Ova с 200 г C60- -аминокапроновая кислота (C60--Acp) /весовое соотношение 1:20/.

Пример 5.

Способ осуществляют как описано в примере III.1, 2, но в качестве антигена используют смесь 20 г Ova с 260 г C60-Phe-Lys /соотношение 1:13/.

Пример 6.

Способ осуществляют как описано в примере III.1, 2, но в качестве антигена используют смесь 20 г Ova с 60 г C60-Lys-Tyr /соотношение 1:3/.

Пример 7.

Способ осуществляют как описано в примере III.1, 2, но в качестве антигена используют смесь 45 г Ova с 300 г C60-Ala-Arg /соотношение 3:20/.

Пример 8.

Способ осуществляют как описано в примере III.1, 2, но в качестве антигена используют смесь 20 г Ova с 100 г C60-Lys-Ala /соотношение 1:5/.

Пример 9.

Способ осуществляют как описано в примерах III.1, 2, но в качестве антигена используют смесь 20 г Ova с 120 г C60-Ala-Thr при соотношении 1:6.

Определение токсичности.

Эксперименты с эритроцитами человека показали, что даже в высоких дозах - 400 мкМ - они не обладают гемолитическими свойствами, клетки в процессе инкубации не агглюцинируют и их морфология не изменяется. Введение мышам высокой дозы этих соединений (80 мг/кг) не влияет на жизнеспособность и поведение мышей в течение 6 месяцев.

Таким образом, заявляемые в качестве адъювантов фуллереновые производные аминокислот и дипептидов, как видно из таблицы 2, хорошо стимулируют иммунный ответ на белковый антиген. Как показало тестированиеб указанные производные не обладают собственной иммуногеностью, гемолитическими свойствами, они нетоксичны при введении в высоких дозах.

Cписок литературы 1. Иммунологические адъюванты. Доклад научной группы ВОЗ. М., 1978.

2. Murhay R., Cohen P. and Hardegree M.C.//Ann. Allergy, 1972, 30, 146.

3. Chedid L. //Ann. Inst. Pasteur/Lmmunol., 1985, 136 D, 283 - 291.

4. Merser C. , Sinay P. and Adam A.// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, 66, 1316 - 1322.

5. Kotani S., Watanabe Y., Shimono T., Harada K., Shiba T., Kusumoto S., Yokogawa K, and Taniguchi M.//Biken J., 1976, 19, 9 - 13.

6. Иванов Б.Б. Создание иммунопотенциирующих систем для пептидных экспериментальных вакцин. Канд. диссертация, 1992.

7. В.С.Романова, В.А.Цыряпкин, Ю.А.Ляховецкий, З.Н.Парнес, М.Е.Вольпин// Изв. РАН, сер. Xим., 1994, 1151.

Формула изобретения

Применение фуллереновых производных аминокислот и дипептидов общей формулы C60-X, где C60 - фуллереновое ядро,
X = NH - chr - COOH, NH - (CH2)nCOOH, NH - chr - CO - NH - chr - COOH;
n = от 2 до 6;
R - боковой радикал природной аминокислоты,
в качестве адъювантов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, преимущественно к кардиологии, и раскрывает новое средство для лечения ишемической болезни сердца (ИБС) человека

Изобретение относится к медицине, в частности касается препаратов, которые позволяют проводить коррекцию иммунитета живого организма и представляют собой высокоэффективные иммуномодуляторы

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммуностимуляторам и препаратам на их основе

Изобретение относится к медицине, а именно, к способу фармакологического лечения острых респираторных вирусных заболеваний и гриппа с помощью индуктора эндогенного интерферона-дибазола

Изобретение относится к кристаллической -полиморфной форме соединения формулы характеризующейся инфракрасным спектром в минеральном масле (нуйол), проявляющим полосы поглощения при = 3407, 3386, 3223, 3153, 1699, 1652, 1626, 1594, 1516, 1457 (нуйол), 1377 (нуйол), 1344, 1334, 1317, 1267, 1241, 1228, 1210, 1164, 1151, 1137, 1118, 1109, 1093, 1074, 1045, 1019, 1003, 981, 965, 911, 897, 862, 818, 800, 778, 762, 721 и 655 см-1, а также способу ее получения, промежуточным продуктам, используемым при ее получении, композициям, содержащим ее и к применению - полиморфной формы, например композиции, ингибирующей ангиотензин

Изобретение относится к медицине, к фармацевтическим препаратам на основе пептидов, а именно к фармацевтическим композициям на основе L-глутамил-L-триптофана

Изобретение относится к фармакологии, а именно к лекарственным средствам, содержащим пептиды и композиции на их основе, которые могут найти профилактическое и/или лечебное применение в медицине в качестве стимуляторов регенерации тканей при гнойно-воспалительных заболеваниях и послеоперационных осложнениях, трофических нарушениях, заболеваниях и поражениях кожи и слизистых оболочек, последствиях воздействия радиационных, термических и химических факторов, сопровождающихся нарушением репаративных процессов

Изобретение относится к области медицины, а именно к новым пептидным структурам, обладающим иммуномодулирующими свойствами, и препаратам на их основе

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к использованию аминокислотных и дипептидных производных фуллерена в качестве стимуляторов иммунного ответа - адъювантов, и может быть использовано в биологической промышленности при разработке и производстве вакцин

Наверх