Способ получения липосомальных препаратов

 

Изобретение относится к области прикладной биотехнологии. Липосомальные препараты получают путем смешивания в емкости биологически активного вещества, фосфолипидов, растворителя и порошкообразного наполнителя и после достижения однородности массы растворитель при перемешивании отгоняют в условиях пониженного давления. Предлагаемый способ значительно упрощает и удешевляет приготовление липосомальных препаратов, обеспечивает высокий процент включения в липосомы биологически активных веществ. 1 з.п. ф-лы, 11 табл., 6 ил.

Изобретение относится к области прикладной биотехнологии, а именно к способам получения липосомальных препаратов для лечения и профилактики заболеваний человека и животных.

Известны способы получения липосомальных препаратов путем диспергирования компонентов в растворителе и последующего получения липосом, имеющие различные модификации (Liposomes: a practical approach. Ed. News R.R.C., IRL Press, Oxford, 1989, pp. 1-142).

При физическом диспергировании фосфолипиды высушивают на твердой подложке и затем диспергируют в водной среде, содержащей лекарственные вещества. В этих условиях липиды отслаиваются от подложки и образуют замкнутые многослойные липосомы с включенным во внутренний объем лекарственным веществом. После получения мультиламеллярных везикул получает липосомальные лекарственные препараты с улучшенными свойствами путем их обработки ультразвуком, микроэмульгаторами, замораживанием-оттаиванием, Ca⁺⁺-индуцированным слиянием или иными методами (пат. США N 4927637, кл. A 61 K 37/22, 1990; пат. США N 4883665, кл. A 61 K 37/22, 1990; заявка РСТ N 89/03679, кл. A 61 K 37/22, 1989; пат. Японии N 201117, кл. A 61 K 9/10, 1988; Михайлова С. Фармация, 1988, т. 38, N 6, с. 24-30).

При использовании способа диспергирования с помощью растворителя фосфолипиды растворяют в органическом растворителе, который затем приводят в контакт с водной фазой, содержащей лекарственные препараты, которые должны быть включены в липосомы (Lasic D.D. Les liposomes. La Recherche. 1989. v. 20, N 212, p. 904-913).

При использовании способа детергентной солюбилизации фосфолипиды приводят в контакт с водной фазой через посредник - детергент, который ассоциирован с фосфолипидными молекулами и служит для экранирования гидрофобных частей молекул от воды. При удалении детергента путем диализа или хроматографии происходит образование моноламеллярных липосом (пат. США N 5019394, кл. A 61 K 9/127, 1991).

Недостатком данных способов является: получение водных нестабильных дисперсий липосомальных препаратов, которые должны быть стабилизированы лишь с помощью дополнительных процессов лиофилизации или распылительной сушки, сложность в изготовлении, низкий процент включения биологически активных веществ и лекарств в липосомы, что исключает возможность получения препаратов в промышленных объемах.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является способ получения липосомальных лекарственных препаратов путем приготовления раствора лекарственного средства (ЛС) в смеси воды, этилового спирта, поверхностно-активного вещества (ПАВ), липидов и введении в него многоступенчато при интенсивном перемешивании буферного раствора. В ходе процесса образуется дисперсия липосом, содержащих ЛС, в водно-спиртовом растворе липосом, содержащих ЛС (Евр. пат. N 0158441, кл. A 61 K 9/50, 1985).

Недостатками прототипа являются возможность получения препаратов только с растворимыми в воде ЛС и растворимыми в этиловом спирте липидами, относительно невысокая (около 40%) степень включения ЛС в липосомы, многостадийность процесса, получение в виде конечного продукта неудобной при транспортировке, хранении и применении жидкой лекарственной формы.

Задачей настоящего изобретения является разработка более универсального и технологически простого способа получения липосомальных препаратов, содержащих биологически активные вещества, лекарства и/или антигены, повышение технологичности способа и обеспечение возможности получения различных форм липосомальных лекарственных препаратов (ЛЛП) в промышленных масштабах.

Поставленная задача решается путем смешивания биологически активного вещества (БАВ), фосфолипидов, органического растворителя, способного растворять фосфолипиды, и порошкообразного наполнителя в одной емкости с последующим удалением растворителя в условиях пониженного давления (вакуума) при сохраняющемся постоянном перемешивании. В результате получают сухой порошкообразный препарат биологически активного вещества, при растворении которого в воде или в биологических жидкостях организма образуется липосомальный препарат.

В качестве фосфолипидов могут быть использованы как индивидуальные фосфолипиды, так и их смеси, полученные из растительного, животного или биотехнологического сырья.

В качестве органических растворителей могут быть использованы хлороформ, метанол, этанол, гексан, эфир, бензол и другие растворители, в которых могут растворяться используемые фосфолипиды.

Фосфолипиды и растворитель могут вводиться в смесь в виде раствора фоосфолипидов в данном растворителе.

В качестве сухих порошкообразных наполнителей могут быть использованы сахара и/или полисахариды (глюкоза, лактоза, декстраны и т.п.), полиолы (сорбит, ксилит и другие), соли (поваренная соль и другие) и другие порошкообразные вещества.

Состав конкретных смесей определяется экспериментальным путем исходя из особенностей смешиваемых компонентов и заданных характеристик конечного продукта.

Липосомальные препараты, полученные по предлагаемому способу, как показала экспериментальная проверка, пригодны для лечения и профилактики различных заболеваний.

Сущность и промышленная применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (по прототипу).

В емкость поместили 500 мг яичного лецитина, 400 мг этанола, 100 мг водного раствора (500 мг/мл) БАВ - глюкозы и 100 мг ПАВ - спана-80 и перемешали. К полученной композиции добавляли дробно 4 мл 50 mM фосфатного буфера с pH 7.4 при интенсивном встряхивании в ходе процесса добавления, а также через 1, 15 и 30 минут после добавления буферного раствора.

Затем к полученной суспензии добавили еще 6 мл вышеуказанного буфера и энергично встряхнули сразу после добавления, а также через 1, 15 и 30 минут после указанной операции. Полученная взвесь липосом показана на фото фиг. 1. Содержание глюкозы в липосомах составило 35±5% от исходного.

Пример 2 (по предлагаемому способу).

В емкость при перемешивании поместили 800 мг БАВ - глюкозы, 200 мг яичного лецитина и 700 мг этанола и при перемешивании со скоростью 50 об/мин при 37^oC подвергли смесь в течение часа воздействию вакуума (пониженного до 0,2 ати давления).

Было получено 1.0 г сухого порошка с влажностью 0.8%. Порошок диспергировали в 10 мл дистиллированной воды. Полученная взвесь липосом (фото фиг. 2) содержала в липосомах 75±7% глюкозы от исходного количества, что вдвое больше чем при использовании способа-прототипа по степени включения и в 15 раз больше по количеству включенного лекарственного вещества.

Пример 3 (использование гидрофобного БАВ).

В емкость помещали 50 мг бета-каротина, 750 мг сорбита и раствор 200 мг яичного лецитина в 2000 мл хлороформа, тщательно перемешивали и отгоняли растворитель под вакуумом в условиях, описанных в примере 2.

Было получено 1.0 г сухих липосом. Порошок диспергировали в 10 мл воды и с помощью спекрофотометрии определяли содержание бета-каротина в липосомах. Анализ показал совпадение пиков при длиннах волн 270 нм (липосомальный пик) и 436 нм (пик бета-каротина), что свидетельствует о полном включении БАВ в липосомы.

При проведении процесса по методике прототипа в полученных липосомах БАВ присутствовало в следовых (менее 1% от исходного) количествах.

Пример 4 (масштабирование процесса получения липосомальных препаратов).

а). Получение липосомального препарата в малом объеме.

Смешали 0.2 г кристаллического бета-каротина, 1.0 г суммарных фосфолипидов из семян подсолнечника, 8.8 г сорбита и 5.0 г хлороформа в герметически закрывающейся емкости объемом 15 см³ при температуре 37^oC. Емкость закрыли и начали откачивать воздух до достижения вакуума 0.1 атм. Сушку проводили при вакуумировании в течение 1 часа при температуре 37^oC и постоянном перемешивании со скоростью 50 об/мин. В результате получили 10.0 г сухого мелкодисперсного порошка с влажностью 0.7%.

б). Получение липосомального препарата в промышленном объеме.

Смешали 0.2 кг кристаллического бета-каротина, 1.0 кг суммарных фосфолипидов из семян подсолнечника, 8.8 кг сорбита и 5.0 кг хлороформа в герметически закрывающейся емкости объемом 0.5 м³, снабженной водяной рубашкой. Емкость закрыли герметично и начали откачивать воздух до достижения вакуума 0.1 атм. Сушку проводили при вакуумировании в течение 5 часов при температуре 37^oC и постоянном перемешивании со скоростью 50 об/мин. В результате получили 10.0 кг сухого мелкодисперсного порошка с влажностью 0.7%.

По 1.0 г порошка, полученного в малом и промышленных объемах, растворяли в 10 мл дистиллированной воды, оба липосомальных препарата представляли собой взвесь моно- и мультиламеллярных липосом (фиг. 3 и 4).

Разделили оба препарата на липосомальную и нелипосомальную фракции с помощью гельпроникающей хроматографии. Детекцию проводили при длинах волн 270 нм (липосомальный пик) и 436 нм (пик бета-каротина). В каждом препарате весь бетакаротин был связан с липосомами, о чем свидетельствует полное совпадение на хроматограммах пика бета-каротина (1) и пика липосом (2) (фиг. 5 и 6).

Определили содержание бета-каротина в сухих препаратах, полученных по методикам а) и б) спектрофотометрическим способом (Бета-каротин кристаллический. ТУ 9353-041-00481134-96). Содержание бета-каротина было одинаковым и составляло 20±1 мг на 1 г липосом в каждом препарате.

Таким образом, при масштабировании процесса получения липосомального препарата бета-каротина в 1000 раз получен препарат бета-каротина, аналогичный препарату бета-каротина, полученному в малых объемах, по влажности, содержанию бета-каротина в сухом препарате и по степени включения бета-каротина в липосомы.

Пример 5 (исследование влияния составов фосфолипидов на качество липосомальных препаратов бета-каротина).

С использованием различных образцов фосфолипидов в условиях примера 3а были получены 4 образца липосомального препарата бета-каротина.

В качестве фосфолипидов препараты содержали: 1. Яичный лецитин (препарата N 1).

2. Лецитин, холестерин и додецилфосфат в молярном соотношении 10:2:1 (препарат N 2).

3. Суммарные фосфолипиды из мозга крупного рогатого скота (препарат N 3).

4. Суммарные фосфолипиды из микроорганизмов E.coli штамм М-17 (препарат N 4).

Характеристика полученных препаратов приведена в табл. 1.

Данные табл. 1 показывают, что состав фосфолипидов не оказывает влияния на качество липосомальных препаратов бета-каротина, т.е. способ является универсальным и для получения препаратов могут быть использованы отдельные фосфолипиды, искусственные смеси фосфолипидов, суммарные фосфолипиды из сырья различного происхождения.

Пример 5 (влияние концентрации фосфолипидов на качество липосомальных препаратов).

В условиях примера 3а были получены 4 образца липосомального препарата бета-каротина с использованием следующих концентраций фосфолипидов по оотношению к органическому растворителю: 4%, 8%, 16%, 32% (вес/объем). (32% является пределом растворимости суммарных фосфолипидов из семян подсолнечника в хлороформе при температуре 20±2^oC). Определяли содержание бета-каротина в полученных сухих препаратах сразу после изготовления и степень включения бета-каротина в липосомы.

Результаты анализов представлены в табл. 2.

Данные табл. 2 показывают, что при использовании практически любых растворов фосфолипидов в пределах их растворимости в органическом растворителе могут быть получены кондиционные липосомальные препараты.

Пример 6 (влияние природы порошкообразных наполнителей на качество липосомальных препаратов).

По методике примера 3а были получены образцы липосомального препарата бета-каротина с использованием различных порошкообразных наполнителей.

Характеристика полученных препаратов приведена в табл. 3.

Данные табл. 3 показывают возможность получения кондиционных липосомальных препаратов при использовании носителей разной природы.

Пример 7 (исследование эффективности липосомальных препаратов биологически активных веществ, лекарств и антигенов при лечении и профилактике различных заболеваний).

По методике примера 3а были приготовлены липосомальные препараты инсулина (100 ED/г), бета-каротина (20 мг/г), интерферона альфа-2 (3.0·10⁶ ED/г), интерлейкина 1-бета (1 мг/г), интерлейкина-2 (36 млн ED/г) и инактивированной гриппозной вакцины из штамма вируса гриппа A/Nib-31/93/814 (H3N2) (30 мг/г гемаглютинина).

Исследовали степень включения указанных лекарственных веществ и вирусов в липосомы. Результаты исследования представлены в табл. 4.

Данные табл. 4 показывают, что предлагаемый способ обеспечивает высокий процент включения ЛС и антигенов в липосомы.

Лечебную и профилактическую эффективность полученных препаратов изучали на моделях диабета (инсулин), гриппозной инфекции (бета-каротин, интерлейкин 1-бета, гриппозная вакцина), индуцированных опухолей (бета-каротин), инфекционного процесса, вызванного вирусом везикулярного стоматита в культуре клеток человека L-41 (интерферон) и в клинических условиях при лечении токсикозов, вызванных цитостатиками при лечении онкологических больных (бета-каротин).

Результаты исследований представлены в табл. 5-11.

Результаты исследования эффективности липосомального препарата инсулина, полученного по предлагаемому способу показали, что полученный препарат обладает хорошей лечебной эффективностью и обеспечивает нормализацию уровня глюкозы в крови животных, больных диабетом, в течение 24 часов после однократного перорального применения в дозе 2ED на животное. Однократное интраназальное введение липосомального инсулина в дозе 0,2 ED/мышь нормализует уровень глюкозы у животных с диабетом в течение 20 часов после введения. Коммерческий препарат инсулина при пероральном применении в дозах 2ED и 20ED на животное не оказывал действия на снижение уровня глюкозы у экспериментальных животных, больных диабетом.

Липосомальный интерлейкин 1-бета обладает выраженной профилактической эффективностью и при однократном пероральном применении в дозе 100 нг защищает 80-100% животных от летательной гриппозной инфекции. Липосомальный бета-каротин обладает хорошей профилактической эффективностью и при пероральном применении в дозе 0,02 мг в день в течение 5 дней защищает 50-80% животных от смертельного вируса гриппа. Коммерческие нелипосомальные препараты интерлейкина 1-бета и бета-каротина обладают более слабой защитной эффективностью, чем их липосомальные аналоги.

Анализ эффективности иммунизации лабораторных животных липосомальной гриппозной инактивированной вакциной показал, что после пероральной иммунизации мышей вакциной на основе вируса гриппа A/Nib-31/93/814 (H3N2) максимальные титры антител к гомологичному вирусу составляли 1:42. Кроме этого, иммунизация липосомальной вакциной на основе вируса группы A2 (H3N2) приводила к формированию иммунитета и к гетерологичным вирусам группы A (Киев) 3304/84 (H1N1) и A/Ленинград/325/88 (H0N1), что свидетельствует о высокой иммуногенности липосомальной вакцины.

Липосомальная гриппозная инактивированная вакцина на основе штамма вируса гриппа A/Nib-31/93/814 (H3N2) обладала выраженной защитой эффективностью и обеспечивала защиту от заражения гетерологичным вирусом гриппа A/PR/8/34/ (H0N1).

Результаты профилактического применения липосомального препарата бета-каротина, изготовленного по предлагаемому способу, при индуцированном раке легких у мышей показывают, что профилактическое пероральное применение липосомального бета-каротина обеспечивает уменьшение частоты возникновения злокачественных опухолей, индуцированных канцерогеном уретаном, на 36% и множественности опухолей на 57%, в том числе частоты возникновения и множественности опухолей легких на 37% и 57% и частоты возникновения и множественности прочих опухолей на 21% и 65% соответственно.

Данные по противовирусной активности липосомального препарата интерферона альфа-2 при инфицировании культуры клеток человека L-41 вирусом везикулярного стоматита показывает, что липосомальный интерферон обладает выраженной активностью и инактивирует вирус везикулярного стоматита в культуре клеток в минимальной концентрации 2,4 ME интерферона в 1 мл.

Данные клинического изучения эффективности применения липосомального препарата бета-каротина, изготовленного по предлагаемому способу, при лечении осложнений химиотерапии онкологических больных показывают, что применение липосомального бета-каротина в дозе 10 мг три раза в день в течение 30 дней существенно улучшает субъективные и объективные симптомы осложнений комплексной химиотерапии больных раком IV стадии. При применении липосомального бета-каротина наблюдается улучшение аппетита у 56% больных, уменьшение слабости у 28% больных, изменение частоты тошноты и рвоты у 32% больных. Количество лейкоцитов в крови больных, на фоне лечения липосомальным бета-каротином, увеличивается на 50% при умеренной лейкопении и на 44% при выраженной лейкопении. У больных уменьшаются случаи анемии (на 29%) и тромбоцитопении (на 20%). Через 30 дней после применения липосомального бета-каротина больные поправились в среднем на 1.8 кг.

Данные представленные в примерах, показывают, что предлагаемый способ значительно упрощает и удешевляет приготовление липосомальных препаратов, содержащих различные типы БАВ и других ЛС, обеспечивает высокий процент включения их в липосомы и создает возможность масштабирования процесса в промышленном производстве.

Лекарственные и вакцинные препараты, изготовленные по предлагаемому способу, обладают высокой лечебной и профилактической активностью при различных заболеваниях.

Формула изобретения

1. Способ получения липосомальных препаратов на основе смешивания в емкости биологически активного вещества, фосфолипидов и растворителя, отличающийся тем, что в смесь дополнительно вводят порошкообразный наполнитель и после достижения однородности массы растворитель при перемешивании отгоняют в условиях пониженного давления.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фосфолипиды и растворитель вводят в емкость в виде раствора.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 27.05.2006        БИ: 15/2006

---