Фрагмент рекомбинантной рнк (варианты), рибонуклеопротеиновый комплекс (варианты), плазмида

 

Изобретение относится к генетической инженерии и касается матриц вирусной РНК. Фрагмент рекомбинантной РНК содержит сайт связывания, специфичный для РНК-зависимой РНК-полимеразы РНК-ового вируса с отрицательной цепью. Сайт функционально связан с гетерологичной РНК-последовательностью, представляющей собой комплементарную последовательность соответствующей матричной РНК. Рибонуклеопротеиновый комплекс включает фрагмент рекомбинантной РНК и очищенную РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса гриппа. Плазмида pIVACAT1 включает 22 нуклеотида, происходящие из 3'- конца NS РНК вируса гриппа. Линкерную последовательность из 8 нуклеотидов, включающую Bg1П сайт рестрикции, кодирующую последовательность гена хлорамфениколацетил трансферазы в негативной полярности. 26 нуклеотидов, происходящих из 3'-конца NS РНК вируса гриппа, операбельно связанные с промотором полимеразы Т7. Изобретение позволяет использовать рекомбинантные вирусные РНК для экспрессии генных продуктов, для конструирования рекомбинантных вирусов и создавать рецептуры вакцин. 6 с. и 10 з.п.ф-лы, 20 ил., 2 табл.

Изобретение касается матриц вирусной РНК с рекомбинантной отрицательной цепью, которые могут быть использованы для экспрессии ксеногенных генных продуктов в надлежащих клеточных системах хозяина и (одновременно или по отдельности) для конструирования рекомбинантных вирусов, которые выражают, содержат и (одновременно или по отдельности) представляют ксеногенный генный продукт. Продукты экспрессии и химерические вирусы могут быть с успехом использованы при создании рецептур вакцин.

Изобретение проиллюстрировано примерами, в которых были сконструированы матрицы рекомбинантной вирусной РНК гриппа, содержащие ксеногенные генные кодирующие последовательности, находящиеся в отрицательной полярности. Эти рекомбинантные матрицы, будучи соединенными с очищенной вирусной РНК-направленной РНК-полимеразой, были инфекционно воспроизведены в надлежащих клетках хозяина и экспрессировали ксеногенный генный продукт в высокой степени. Кроме того, ксеногенный ген был экспрессирован и пакован результирующими рекомбинантными вирусами гриппа.

Ряд ДНК-вирусов был генетически сконструирован, чтобы направить экспрессию у ксеногенных белков в клеточных системах хозяина (например, вирус коровьей оспы, бакуловирус и т.д.). Недавно аналогичные успехи были достигнуты на РНК-вирусах с положительной цепью (например, полиовирус). Можно полагать, что продукты экспрессии у этих конструкций, т.е. ксеногенный генный продукт или химирический вирус, который выражает ксеногенный генный продукт, окажутся потенциально полезными для создания рецептур вакцин (либо на основе субъединицы, либо на основе всего вируса). Одним из препятствий на пути использования вирусов, таких как вирус коровьей оспы, для конструирования рекомбинантных или химерических вирусов, предназначенных для использования в вакцинах, является отсутствие изменчивости у их основных эпитопов. Это отсутствие изменчивости у вирусных штаммов накладывает строгие ограничения на возможность повторного использования химерического вируса коровьей оспы, что заключается в том, что многократные вакцинации ведут к возникновению у хозяина резистентности к штамму, в результате чего инокулированный вирус теряет способность инфектировать хозяина. Инокуляция резистентного индивидуума химерической вакциной не будет, следовательно, индуцировать иммунную стимуляцию.

В противоположность сказанному, вирус гриппа, являющийся РНК-вирусом с отрицательной цепью, обнаруживает широкую изменчивость его главных эпитопов. В самом деле, идентифицированы тысячи вариантов гриппа, причем каждый штамм характеризуется проявлением антигенной изменчивости. Вирусы с отрицательной цепью, такие как вирус гриппа, могли бы оказаться привлекательными для конструирования химерических вирусов, предназначенных для использования в вакцинах, поскольку их генетическая изменчивость обеспечивает возможность конструирования широкого разнообразия вакционных рецептур, которые будут стимулировать появление иммунитета без риска возникновения толерантности. Однако на пути к достижению этой цели препятствие состоит в том, что не удалось пока сконструировать рекомбинантные или химерические РНК-частицы с отрицательной цепью, которые обладали бы инфекционным действием.

2.1. Вирус гриппа.

Семейства вирусов, содержащих заключенную в оболочку одноцепочечную РНК у генома отрицательного характера, классифицируются на группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae), или группы, имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). Семейство Orthomyxoviridae, подробно описанное ниже и использованное в примерах в настоящем описании, содержит только вирусы гриппа типов A, B и C.

Вирионы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеидного ядра (спирального нуклеокапсида), содержащего одноцепочечный РНК-геном, и внешней липопротеидной оболочки, покрытой изнутри матричным белком M. Сегментированный геном гриппа A состоит из восьми молекул (семи у гриппа C) линейной одноцепочечной РНК отрицательной полярности, которые кодируют десять полипептидов, включая РНК-направленные РНК-полимеризаные белки (PB2, PB1 и PA) и нуклеопротеид (NP), который образует нуклеокапсид, матричные белки (M1, M2), два поверхностных гликопротеида, которые защищают от липопротеидной оболочки, а именно, гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA), и неструктурированные белки, функция которых является неизвестной (NS1 и NS2). Транскрипция и репликация генома происходит в ядрах, и сборка осуществляется почкованием на плазматической мембране. Вирусы могут давать рекомбинантные гены при действии смешанных инфекций.

Вирусы гриппа абсорбируются через гемагглютинин на сиалилолигосахаридах, находящихся в клеточных мембранных гликопротеидах и гликолипидах. После эндоцитоза вириона в молекуле гемагглютинина возникает конформационное изменение, происходящее в пределах нахождения клеточной эндосомы, что способствует протеканию мембранного слияния, в результате чего начинает происходить декапсидация. Нуклеокапсид мигрирует к ядру, где происходит транскрибирование мРНК, что является существенным начальным моментом у инфекционного заражения. Вирусная иРНК подвергается транскрибированию по своеобразному механизму, при действии которого вирусная эндонуклеаза отщепляет завершающий 5-конец от клеточных ксеногенных мРНК, которые затем выступают в роли примеров (затравок) при транскрибировании вирусных РНК-матриц вирусной транскриптазой. Концы транскрибированных последовательностей приходятся на сайты, расположенные на расстоянии от 15 до 22 оснований, считая от концов их матриц, где олигоединичные последовательности выступают в роли сигналов для добавления независящих от матрицы полимеразных участков. Из восьми вирусных молекул мРНК, образовавшихся таким способом, шесть несут моноцистронную информацию, которая подвергается трансляции непосредственно в белках, представляющих собой гемагглютинин, нейраминидазу, нуклеопротеид и вирусные полимеразные белки - PB2, PB1 и PA. Другие две матрицы претерпевают сращивание, давая в каждом случае две мРНК, которые подвергаются трансляции с различающимся представлением, в результате чего получаются матричные белки M1 и M2 и неструктурированные белки NS1 и NS2. Иначе говоря, восемь вирусных кислот мРНК кодируют 10 белков: восемь структурированных и два неструктурированных. Сводка генов вируса гриппа и их белковых продуктов приведена ниже в табл. 1.

После транскрипции вторым существенным моментом у инфекции, связанной с вирусами, имеющими РНК с отрицательной цепью, является вирусная геномная репликация. Как и в случае других РНК вирусов с отрицательной цепью, вирусная геномная репликация у гриппа происходит посредством белков, специфические характеристики которых определяются вирусом. Предположительно считается, что большая часть вирусных белков или даже все вирусные белки, которые транскрибируют мРНК-сегменты вируса гриппа, также осуществляют свою репликацию. Все вирусные РНК-сегменты характеризуются наличием общих 3'- и 5'-концов, с чем, по-видимому, связана возможность действия механизма синтеза РНК при одинаковой вероятности распознавания каждого сегмента. Механизм, посредством которого регулируется попеременное использование (т.е. транскрибирование или репликация) одного и того же набора белков (полимеразные белки PB2, PB1, PA и нуклеопротеид NP), четко не идентифицирован, однако, складывается впечатление, что здесь оказываются вовлеченными три формы одного или нескольких нуклеокапсидных белков, в частности, нуклеопротеид NP. Представляется, что ядро является местом репликации вирусной РНК, как и местом транскрипции.

Первыми продуктами репликационного синтеза РНК являются комплементарные копии (т.е. включая и цепи с положительной полярностью) всех геномных РНК-сегментов вируса гриппа (кРНК). Эти копии с цепями положительной полярности (антигеномы) отличаются от мРНК-матриц с цепями положительной полярности по структуре их концов. В отличие от мРНК матриц антигеномные кислоты кРНК не являются закрытыми на конце 5' и метилируются и не являются усеченными на конце 3' и полиаденилируются. Концы у кислот кРНК совпадают с положением их матриц с отрицательной цепью, и кислоты кРНК содержат в каждом геномном РНК-сегменте всю генетическую информацию, представленную в комплементарной форме. Кислоты кРНК выполняют роль матриц при синтезе геномных кислот вРНК с отрицательной цепью.

Геномы вируса гриппа с отрицательной цепью (вРНК) и антигеномы (кРНК) всегда находятся в инкапсидированном состоянии с покрытием из нуклеокапсидных белков, единственными неинкапсидированными РНК-частицами являются вирусные кислоты мРНК. В противоположность другим заключенным в оболочку РНК-вирусам нуклеокапсидное образование возникает, по-видимому, в ядре, а не в цитоплазме. Вирус развивается с отделением от апикальной поверхности клетки, содержащей матричный белок на цитоплазматической стороне или на внутренней поверхности отделяющей оболочки. Гемагглютинин и нейраминидаза становятся гликосилированными и встроенными в липидную оболочку. В клетках, где это допустимо, гемагглютинин в конечном итоге расщепляется, но при этом две образующиеся цепи остаются соединенными дисульфидными мостиками.

Остается неизвестным механизм выбора одной копии из восьми геномных вирусных кислот РНК для вхождения в каждый новый вирион. Часто образуются дефективные мешающие частицы, особенно после появления инфекции с высокой множественностью.

2.2. РНК-направленная РНК-полимераза У вирусов животных РНК-направленные РНК-полимеразы были подвергнуты обширному исследованию по многим аспектам, касающимся строения белков и условий протекания реакций. Однако элементы информационной РНК, которые промотируют оптимальную экспрессию под воздействием полимеразы, могут быть изучены лишь в результате использования существующих вирусных РНК-последовательностей. Такой аналоги действия промотора представляет интерес, поскольку остается неизвестным способ распознавания вирусной полимеразой специфических вирусных кислот РНК среди многих закодированных у хозяина кислот РНК, обнаруживаемых в инфектированной клетке.

Вирусы животных, содержащие геном РНК с цепью положительного характера, могут быть подвергнуты репликации при введении выделенной плазмидой РНК в клетки посредством трансфекции (см. , например, работы Racaniello, et al. 1981, Science 214: 916-919, Legis, et al. 1986, Cell 44: 137-145). В случае полиовируса очищенная полимераза способна воспроизводить геномную РНК в реакциях in vitro, и при трансфекции этого препарата в клетки они оказываются инфекционными (Kaplan, et al., 1985, Proc. Acad. Sci. USA 82-8424-8428). Однако матричные элементы, которые выступают в роли промоторов транскрибирования для закодированной по полиовирусу полимеразы, являются неизвестными, так как могут быть копированы только четные РНК-гомополимеры (Ward, et al., 1988. J. Virol 62: 558-562). Матрицы SP6 были также использованы для получения модельных дефектных мешающих кислот РНК применительно к геному вируса Sindbis. При введении РНК в зараженные клетки она подвергается репликации и упаковке. Было показано, что РНК-последовательности, которые являются ответственными как за распознавание полимеразы вируса Sindbis, так и за попадание генома в вирусные частицы, состоят из 162 нуклеотидов у конца 5' и 19 нуклеотидов у 3'- конца генома (Levis, et al., 1986, Cell 44: 137-145). В случае вируса костерной мозаики (растительный РНК-вирус с положительной цепью) PS6-матрицы были использованы для идентификации промотора, который был идентифицирован как тРНК-подобная последовательность, содержащая 134 нуклеотида у 3'-конца (Dreher, and Hall, J. Mol. Biol. 1988, 201: 31-40). Было показано, что распознавание полимеразы и синтез зависят как от характера последовательности, так и от вторичных структурных особенностей (Dreher, et al., 1984, Nature 311: 171-175).

РНК-вирусы с отрицательной цепью оказались неподатливыми в плане изучения характеристик последовательности у репликазы. Очищенная полимераза вируса визикулярного стоматита является активной в отношении транскрибирования лишь тогда, когда выделенные из вируса рибонуклеопротеидные комплексы (кислоты РНК) включаются в виде матрицы (De and Banerjee 1985, Biochem. Biophys, Res. Commun. 126: 40-49, Emerson and Yu, 1975 Virol 15: 1348-1356, Naito, and Ishihama, 1976, J. Biol. Chem. 251: 4307-4314). Рибонуклеопротеиды были воссозданы из РНК, выделенной из частиц D1 вируса визикулярного стоматита при использовании экстрактов из зараженных клеток в качестве источника белка. Эти рибонуклеопротеиды затем подвергали репликации, вводя их обратно в зараженные клетки (Mirakhur, and Peluso 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7511-7515). Что касается вирусов гриппа, то недавно появилось сообщение, что выделенная РНК, полученная из вируса, была использована для воссоздания рибонуклеопротеидов. Вирусные нуклеокапсидные и полимеразные белки были повергнуты гелевой очистке и ренатурации на вирусной РНК при использовании тиоредоксина (Szewczyk, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7907-7911). Однако эти исследователи ничего не говорят ни о специфической активности препарата в отношении РНК вируса гриппа, ни об анализе данных по промотированию транскрипции.

В ходе действия инфекции вируса гриппа полимераза катализирует три отдельных транскрипционных процесса. Сюда относятся а) синтез субгеномной мРНК, которая содержит 5'-верхушку и 3'-поли-A-хвост, б) синтез полной цепи положительной полярности или антигенома (кРНК), скопированного с геномной РНК, и в) синтез геномной вРНК, синтезированной на основе кРНК полной длины (обзор содержится в Ishihama and Nagata, 1988, CRC Crit. Rev. Biochem. 23: 27-76 и у Krug, Transcription and replication of influenza viruses в книге Genetics of influenza viruses, редакторы Palese, P. and Kingsbury, D.W., New York, Springa-Verley, 1983, p. 70-98). Полагают, что белки PB2, PB1 и PA катализируют все синтезы специфической в отношении вируса гриппа РНК, когда в избытке содержится нуклеокапсидный белок (NP, см. приведенные выше обзоры). Функциональные назначения этих полимераз были изучены при использовании рибонуклеопротеидных нуклеотидов, выделенных из разрушенного моющим средством вируса, и рибонуклеопротеидов, взятых из ядерных экстрактов, выделенных из зараженных клеток. Транскрипция из рибонуклеопротеидов, выделенных из разрушенного вируса, происходит тогда, когда воздействуют затравкой либо в виде динуклеотидного аденилил-(3'-5')-гуанозина (ApG), либо в виде завершенных кислот мРНК. Синтезы мРНК-продуктов с положительной цепью завершались образованием 17-20 нуклеотидов, считая от 5'-конца РНК-матрицы, и завершались добавлением поли-A-хвостов. Эти продукты не могут служить в качестве матрицы для генома в вирусном понимании, поскольку у них отсутствуют концевые последовательности (Hay, et al., 1977, Virology 83: 337-355). Рибонуклеопротеиды, выделенные из ядерных экстрактов, взятых из зараженных клеток, также производят синтез полиаденилированной мРНК, что происходит в присутствии завершенных РНК-полимеров. Однако, если при этих условиях использовать аденилил-(3'-5')-гуанозин, то тогда могут быть получены обе кислоты РНК, полиаденилированная и кРНК полной длины (Beaton and Krug, 1986, Proc. Natl. Acad., Sci, USA 83: 6282-6286, Takeuchi, et al., 1987, J. Biochem. 101: 837-845). Недавно было показано, что репликационный синтез кРНК может идти и при отсутствии экзогенного примера, если ядерный экстракт был выделен в определенные времена после заражения. В этих же самых препаратах наблюдали также протекание синтеза вРНК отрицательного характера из кРНК-матрицы (Shapiro and Krug 1988, J. Virol 62: 2285-2290). Было показано, что синтез кРНК с полной длиной цепи идет независимо от наличия нуклеокапсидного белка, который отсутствовал в растворе (Beaton and Krug, 1986, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 83: 6282-6286, Shapiro and Krug, 1988, J. Virol 62: 2285-2290). Эти результаты дают основания предполагать, что при синтезе регуляция между мРНК и кРНК, связанная с воздействием рибонуклеопротеидного комплекса, сводится к необходимости присутствия избыточного количества растворимого нуклеопротеида (Beaton and Krug, 1986, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 83: 6282-6286).

Еще одно направление исследований сводилось к изучению препарата из полимераза-РНК-комплексов, выделенных из рибонуклеопротеидов, взятых из вируса, разрушенного моющим средством. При центрифугировании рибонуклеопротеидного комплекса через CsC1-глицерольный градиент РНК может быть найдена связанной с тремя полимеразными белками у низа градиента. Вблизи верха градиента может быть найден свободный нуклеопротеидный белок (Honda, et al., 1988, J. Biochem, 104: 1021-106, Kato, et al., 1985, Virus Research 3, 115-127). Очищенный полимераза-РНК-комплекс (низ градиента) является активным в отношении инициирования синтеза РНК при воздействии затравки из аденилил-(3'-5')-гуанозина, но оказывается неспособным удлинять цепь выше 12-19 нуклеотидов. При обратном добавлении фракции, взятых из верхней части градиента, содержащей нуклеопротеидный белок, к полимераза-РНК-комплексу удлинение может инициироваться (Honda, et al., 1987, J. Biochem. 102: 41-49). Из этих данных следует, что инициирование может происходить и при отсутствии нуклеопротеида.

Было показано, что геномная РНК вирусов гриппа обладает круговой конформацией, достигнутой через соединение пары оснований концов с образованием ободка из 15-16 нуклеотидов (Honda, et al., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026, Hsi, et al. , 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8140-8144). Поскольку, как установлено, вирусная полимераза присоединяется к ободку, из сказанного следует, что ободковая структура является необходимой для распознавания вирусной полимеразой (Honda, et al. , 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026). По этой причине в указанных двух сообщениях высказывается гипотеза, что промотором для вирусной РНК-полимеразы является двухспиральная РНК в ободковой конформации.

Описаны вирусные РНК-матрицы с рекомбинантной отрицательной цепью, которые могут быть использованы с очищенным РНК-направленным РНК-полимеразным комплексом для экспрессии ксеногенных генных продуктов у надлежащих клеток хозяина и (одновременно или по отдельности) для спасения ксеногенного гена в вирусных частицах. РНК-матрицы готовили транскрипцией надлежащих ДНК-последовательностей с использованием ДНК-направленной РНК-полимеразы. Образующиеся РНК-матрицы обладают отрицательной полярностью и содержат надлежащие концевые последовательности, которые делают возможным включение механизма синтеза вирусной РНК с распознаванием матрицы.

Как это продемонстрировано на примерах, описанных ниже, РНК-матрицы гриппа с рекомбинантной цепью отрицательного характера могут быть смешаны с очищенными вирусными полимеразными белками и нуклеопротеидом (т.е. с очищенным вирусным полимеразным комплексом) для получения инфекционных рекомбинантных рибонуклеопротеидов. Последние могут быть использованы для экспрессии ксеногенных продуктов у клеток хозяина или для спасения ксеногенного гена в вирусных частицах посредством совместной трансфекции клеток хозяина с рекомбинантными рибонуклеопротеидами и вирусом. Или же рекомбинантные РНК-матрицы и рекомбинантные рибонуклеопротеиды могут быть использованы для трансфекции трансформированных клеточных линий, которые экспрессируют РНК-зависимую РНК-полимеразу и обеспечивают возможность протекания комплементации. Кроме того, описана также для вируса гриппа невирусная зависимая репликационная система. Носители коровьей оспы, экспрессирующие полипептиды вируса гриппа, были использованы в качестве источника белков, которые обладают способностью репликатировать и транскрибировать синтетически полученные рибонуклеопротеиды. Было установлено, что минимальный поднабор белков вируса гриппа, необходимых для осуществления специфической репликации и экспрессии вирусного рибонуклеопротеида, состоит из трех полимеразных белков (PB2, PB1 и PA) и нуклеопротеида (NP). Отсюда следует, что бесструктурные белки NS1 и NS2 не являются абсолютно необходимыми для осуществления репликации и экспрессии вирусного рибонуклеопротеида.

Полученные продукты экспрессии и (одновременно или по отдельности) химерические вирионы могут быть с успехом использованы при составлении рецептур вакцин. Использование рекомбинантного вируса гриппа для этой цели является особенно привлекательным, поскольку грипп демонстрирует громадное разнообразие штаммов, чем обеспечивается возможность создания широкого ассортимента рецептур вакцин. Возможность выбора из многих тысяч вариантов гриппа варианта, пригодного для конструирования химерических вирусов, снимает проблему резистентности хозяина, возникающую при использовании других вирусов, таких как вирус коровьей оспы. Кроме того, поскольку грипп стимулирует проявление сильной секреторной активности и вызывает цитотоксическую T-клеточную реакцию, представление инородных эпитопов в строении вируса гриппа может также инициировать появление секреторного иммунитета и клеточно-опосредованного иммунитета.

В настоящем описании приняты следующие термины: cRNA - антигеномная РНК (мРНК); HA - гемагглутинин (оболочечный гликопротеид); M - матричный белок (линии внутри оболочки); MDCK - собачьи почечные клетки Мейдина Дарби (Madin Darby); MDBK - бычьи почечные клетки Мейдина Дарби; moi - множественность инфекции; NA - нейтраминидаза (оболочечный гликопротеид); NP - нуклеопротеид (связанный с РНК и необходимый для обеспечения полимеразной активности);
NS - неструктурный белок (функция является неизвестной);
nt - нуклеотид;
PA, PB1, PB2 - РНК-направленные РНК-полимеразные компоненты;
RNP - рибонуклеопротеид (RNA, PB2, PB1, PA и NP);
rRNP - рекомбинантный рибонуклеопротеид (рРНП);
vRNA - гемомная вирусная РНК (вРНК);
Вирусный полимеразный комплекс - PA, PB1, PB2 и NP;
WSN - вирус гриппа A/WSN/33.

Вирус WSN - НК-рекомбинантный вирус, содержащий семь генов из вируса WSN и нейтраминидазный ген (NA-ген) из вируса гриппа A/НК/68.

Фиг. 1. Очистка полимеразного препарата. РНК-остовы очищали, извлекая из всего вируса, и затем подвергали CsC1-глицерольному градиентному центрифугированию. Полимеразу очищали от фракций использованием хлорида цезия с концентрацией раствора от 1,5 до 2,0 М. Образцы затем анализировали, подвергая электрофорезу с использованием полиакриламидного геля в условиях линейного изменения градиента у геля в пределах 7-14% в присутствии 0,1%-ного раствора додецилсульфата натрия, после чего проводили окрашивание серебром. Белковые образцы содержали 1,4 мкг всего вируса (полоса 1), 0,3 мкг всего вируса (полоса 2), 5 мкл RNP-остовов (полоса 3) и 25 мкл РНК-полимеразы (полоса 4). Известные названия белков указаны слева.

Фиг. 2. Плазмидные конструкции, использованные для приготовления РНК-матриц. Плазмида обозначается зачерненным блоком, характеризующим pUC-19-последовательности, штрихованный блок характеризует усеченный промотор, специфически распознаваемый полимеразой бактериофага T7 РНК, сплошная линия характеризует ДНК, которая транскрибируется из плазмид, подвергнутых расщеплению реактивом Mbo II. Светлый блок характеризует последовательности, кодирующие сайты распознавания для Mbo II, EcoR1 и Pst1, причем именно в таком порядке. Указаны сайты расщепления ограничительными эндонуклезами. Под диаграммой приведены полные последовательности кислот РНК, которые образуются при синтезе с воздействием РНК-полимеразы T7 из плазмид, подвергнутых расщеплению посредством Mbo II. Кислота V-wt - РНК имеет идентичные 5'- и 3'-концы, как это установлено у РНК-сегмента 8 вирусов гриппа A, разнесенных на 16 "прокладочных" нуклеотидов. Кислоты M-wt-РНК характеризуется наличием в точности обратной цепи, или является "информационно восприимчивой" V-wt-кислотой. Для DraI, EcoR1, Pst1 и Sma1 указаны ограничительные эндонуклеазные сайты. У плазмид, отщепленных этими ферментами, T7-матрицы представляют собой кислоты РНК с нуклеотидной длиной соответственно 32, 58, 66 и 91. Последовательности у V - d5'-РНК показаны на фиг.2. Конструкция плазмиды является в основном такой же, что и использования в случае V - wt-РНК, исключением является лишь то, что иными являются второстепенные изменения у "прокладочной" последовательности. Точечные мутанты у кислот V - d5'-РНК, которые были изучены, указаны в табл. 1.

Фиг. 3. Анализ продуктов у полимеразы вируса гриппа. В случае фиг. 3A полимеразные реакционные смеси, содержащие 0,4 мМ ApG (Аденилил- (3'-5')-гуанозин) или не содержащие пример (полоса 2 в первом случае и полоса 3 во втором), подвергали электрофорезу на 8%-ных полиакриламидных гелях, содержащих мочевину в концентрации 7,7 . Фиг. 3B свидетельствует о том, что РНК в момент образования является резистентной в отношении воздействия односпиральной специфической нуклеазы 1. После проведения стандартной полимеразной реакции растворы разбавляли в нуклеазном S1-буфере (полоса 1) и добавляли фермент (полоса 2). С целью контроля условий S1-расщепления односпиральную V - wt-РНК с радиоактивной меткой обрабатывали нуклеазой S1 (полоса 3) или только буферным раствором (полоса 4). На фиг. 3C показаны результаты проведения рибонуклеазного T1-анализа продуктов взаимодействия, очищенных на геле. Продукты реакции вирусной полимеразы в условиях использования V - wt-РНК-матрицы подвергали электрофорезу на 8%-ном полиакриламидном геле. Наблюдались полоса из 53 нуклеотидов и полоса меньшего размера, и эти цепи элюировали из гелиевой матрицы. Эти кислоты РНК расщепляли рибонуклеазой T1 и анализировали посредством электрофореза на 20%-ном полиакриламидном геле, содержащем мочевину в концентрации 7,7 М. С целью сопоставления T7-копии кислот M-wt- и V-wt-РНК, которые были синтезированы в присутствии -α- ³²P-УТФ, также подвергали анализу с воздействием рибонуклеазы T1. У контрольных кислот РНК показаны предсказанные олигонуклеотиды с радиоактивной меткой. Полоса 1 отвечает продукту с полной длиной в 53 нуклеотида, полоса 2 отвечает продукту с меньшей длиной цепи у РНК, составляющей 40-45 нуклеотидов, полоса 3 отвечает M-wt-РНК, помеченной введением ³²P-УТФ, и полоса 4 отвечает V-wt-РНК, помеченной как и в случае полосы 3.

Фиг. 4. Оптимальные условия взаимодействия для вирусной полимеразы. В случае фиг. 4A реакции с V-wt-матрицей проводили на льду и затем инкубировали при указанных температурах в течение 90 мин. В случае фиг. 4B реакции с V-wt-матрицей проводили параллельно при указанных концентрациях хлорида натрия или хлорида калия и инкубировали при 30^oC в течение 90 мин. В случае фиг. 4C проводили единственную реакцию с V-wt-матрицей, инкубируя при 30^oC, и при указанных временах образцы извлекали и сразу же подвергали экстракции с использованием смеси фенола с хлороформом. Во всех случаях использовали 8%-ные полиакриламидные гели с содержанием мочевины 7,7 М.

Фиг. 5. Матричная специфичность у вирусной полимеразы. Из фиг. 5A следует, что для протекания вирусной полимеразной реакции необходимы 3-концевые промоторные последовательности. При проведении реакций в стандартных условиях использовали разные матричные кислоты РНК. Полоса 1 отвечает V-Pst-РНК, которая является идентичной V-wt-кислоте за исключением того, что у нее на 3'-конце имеется отросток длиной в 13 нуклеотидов, полоса 2 отвечает V-Sma-РНК, протяженность которой на конце 3' составляет 38 нуклеотидов, полоса 3 отвечает V-wt-РНК, полоса 4 отвечает ДНК-полинуклеотиду с идентичной последовательностью, что и у V-wt-РНК, полоса 5 отвечает РНК в 80 нуклеотидов, получаемой воздействием бактериофаговой Т3-ДНК-полимеразой при транскрипции pIBI-31-плазмиды, подвергнутой расщеплению реактивом Hind III. Авторадиограмма наложена с целью иллюстрации отсутствия специфических продуктов реакции, когда используются эти другие матрицы. В случае фиг. 5B 10 нг каждой матричной РНК подвергали инкубированию совместно с вирусной полимеразой, и продукты затем подвергали электрофорезу на 8%-ных полиакриламидных гелях, содержащих 7,7 М мочевины. Полоса 1 отвечает V-wt-РНК, полоса 2 отвечает V-Dra-РНК, полоса 3 отвечает V-Eco-РНК, полоса 4 отвечает M-wt-РНК, и полоса 5 отвечает маркерному олигонуклеотиду длиной в 53 нуклеотида. По вопросу точного различия последовательностей см. фиг. 2 и раздел 6.1, а также последующие разделы.

Фиг. 6. РНК-промотор не требует наличия концевого ободка. Полимеразная реакция идет с использованием двух матричных кислот РНК. В случае каждой реакции содержание V-wt-РНК составляет 5 нг. Что касается второй матрицы, то в реакциях использовали 0 нг (полоса 1), 0,6 нг (полоса 2) и 3,0 нг (полоса 3) кислоты V-d5'-РНК. Результирующие молярные отношения были такими, какие указаны на чертеже. Реакционные продукты анализировали на 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии 7,7 М мочевины. После проведения денситометрического анализа авторадиограмм относительную интенсивность каждого пика исправляли на величину от воздействия радиоактивного УМФ, захваченного каждым продуктом.

Фиг. 7. Специфичность промоторных последовательностей. Кислоты РНК, у которых отсутствует 5'-конец и которые содержат точковые мутации (табл. 2), сопоставляли с V-d5'-РНК, участвующей в стандартных полимеразных реакциях. Правая группа данных относится к отдельной совокупности реакций. Количественное сопоставление проведено в табл. 2.

Фиг. 8. Высококонцентрированные полимеразные препараты являются активными в реакциях синтеза накрытых эндонуклеазных кислот РНК, идущих с участием примера и без него. На фиг. 8A проиллюстрирована примерная специфичность высококонцентрированного фермента. Радиоактивная синтезированная матрица, состоящая из 30 нуклеотидов, дается полосой 1. Реакции с использованием 20 нг V-d5'-РНК и 5 мкл вирусной полимеразы проводили с применением в качестве примера следующих препаратов: пример не использовали (полоса 2), 100 нг BMV-РНК (De and Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 6: 40-49) с концевой структурой 0 (полоса 3), 100 нг кроличьей глобиновой мРНК с концевой структурой 1 (полоса 4) и 0,04 мМ ApG (полоса 5). Полоса 5 при меньшей экспозиции показана в виде полосы 6. На фиг. 8B проиллюстрированы результаты анализа очищенных на геле кислот РНК в условиях воздействия нуклеазы S1. Продукты, полученные при взаимодействии с использованием в качестве примера ApG (полосы 1 и 2), без использования примера (полосы 3 и 4) или при использовании глобиновой мРНК (полосы 5 и 6), подвергали электрофорезу при отсутствии мочевины, и надлежащий кусочек геля отделяли, и РНК элюировали. Эту РНК затем расщепляли нуклеазой S1 (полосы 2, 4 и 6), и продукты подвергали денатурации и анализировали на 9%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7,7 М мочевины.

Фиг. 9. Синтез РНК геномной длины из воссозданных рибонуклеопротеидов. Реакционные продукты, полученные с использованием 10 мкл полимеразы и использованием в качестве матрицы РНК с цепью из 890 нуклеотидов, идентичной последовательности сегмента 8 вируса A/WSN /33, и РНК, экстрагированной из вируса A/PP/8/34, анализировали на 4%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7,7 мочевины. Полосой 1 показана матрица с цепью из 890 нуклеотидов, синтезированная с использованием радиоактивной метки при воздействии РНК-полимеразы T7. РНК, извлеченную из плазмиды длиной 890 нуклеотидов, использовали в качестве матрицы в случае полос 2, 3, 8 и 9. РНК, извлеченную из вируса, использовали в качестве матрицы в случае полос 4, 5, 10 и 11. Матрицу не использовали в случае полос 6 и 7. Пример не использовали в случае полос 2-5, и препарат ApG использовали в качестве примера в случае полос 6-11. Продукты взаимодействия обрабатывали нуклеазой S1 в случае полос 3, 5, 7, 9 и 11.

Фиг. 10. Схематическое изображение метода проведения мутогенеза, направленного полимеразной цепной реакцией, который может быть использован для замены вирусных кодирующих последовательностей в пределах вирусных генных сегментов.

Фиг. 11. На фиг. 11A представлено схематическое изображение представляющих интерес частей цепи pIVCAT1. На фиг. помечены различные области, и ими, слева направо, являются усеченный T7-промотор, нетранслированный 5'-конец сегмента -8 (22 нуклеотида) вируса гриппа A/PP/8/34, связующая последовательность из восьми нуклеотидов, вся кодирующая область CAT-гена (хлорамфениколацетилтрансферазный ген) (660 нуклеотидов) весь нетранслированный 3'-конец сегмента 8 (26 нуклеотидов) вируса гриппа S/PR/8/34 и связующая последовательность, содержащая HgaI-ограничительный ферментативный сайт. Для гена CAT показаны места ограничительного действия ферментов, представляющие интерес, и показаны старт- и стоп-сайты. На фиг. 11B показан РНК-продукт, состоящий из 716 оснований, полученный после расщепления ферментом HgaI и проведения транскрипции pIVACAT1 РНК-полимеразой T7. Последовательности, отвечающие вирусу гриппа, показаны жирными буквами, последовательности, отвечающие гену CAT, показаны обычными буквами, и связующие последовательности показаны закурсивленным шрифтом. Триплеты (в направлении, обратном ориентации), представляющие собой кодоны инициирования и завершения у CAT-гена, указываются стрелкой и подчеркиванием, соответственно.

Фиг. 12. РНК-продукты при проведении транскрипции полимеразой T7 и транскрипции полимеразой вируса гриппа in vitro. Полосы 1-4 характеризуют результаты анализа на полиакриламидном геле T7-полимеразных копий с радиоактивной меткой, снятых с PIVACATI и pHgaNS. Полосы 5 и 6 характеризуют результаты анализа, выполненного на полиакриламидном геле, продуктов с радиоактивной меткой, полученных при проведении транскрипции in vitro под воздействием полимеразного белка вируса гриппа A в условиях использования матриц РНК IVACATI и РНК HgaNS. Полоса 1 отвечает РНК HgaNS с числом нуклеотидов 80. Полосы 2-4 отвечают различным препаратам РНК IVACATI. Полоса 5 отвечает вирусному полимеразному продукту транскрибирования РНК IVACATI. Полоса 6 отвечает вирусному полимеразному продукту транскрибирования РНК HgaNS.

Фиг. 13. Схематическое изображение последовательности проведения опытов по рибонуклеопротеидной трансфекции и переносу.

Фиг. 14. Хлорамфениколацетилтрансферазные анализы (CAT-анализы) клеток, подвергнутых рибонуклеопротеидной трансфекции с РНК IVACATI. На фиг. 14a показан временной ход рибонуклеопротеидной трансфекции в 293 клетках. Клетки подвергали трансфекции рекомбинантным рибонуклеопротеидом, делая это в момент времени - 1 ч, и заражали вирусом в момент времени 0 ч. Клетки собирали в указанные моменты времени и подвергали анализу на CAT-активность. На фиг. 14B указаны условия проведения рибонуклеопротеидной трансфекции 293 клеток Paramaeters, находящихся в реакционных смесях. На фиг. 14C проиллюстрирована рибонуклеопротеидная трансфекция клеток MDCK. Клетки MDCK подвергали трансфекции IVACATI РНК-полимеразой в момент времени, составляющий либо - 1 ч, либо + 2 ч относительно момента заражения вирусом. Клетки собирали и подвергали анализу на CAT-активность в указанные моменты времени. Компоненты и условия проведения реакции были такими, какими они указаны на чертеже. Параметр "время" ("ТЙМЕ") отвечает моменту сбора клеток. Момент времени T=0 отвечает моменту добавления помогающего вируса. Надпись "RNA" отвечает IVACATI-РНК. Надпись "Pol" отвечает белковому комплексу с полимеразой вируса гриппа A/PR/8/34. Надпись "WSN" отвечает вспомогательному вирусу гриппа A/WSN/33. Надпись "Pre-Inc" указывает на проведение предварительной инкубации РНК и полимеразы в транскрипционном буфере при 30^oC в течение 30 мин. Надпись "RNP transafection "(РНП (рибонуклеопротеидная) трансфекция") указывает время проведения рибонуклеопротеидной трансфекции, заданное относительно времени вирусного заражения. Обозначения "+/-" указывают на наличие или отсутствие данного компонента/признака. Обозначение "C" отвечает контрольным анализам, проведенным с использованием выпускаемого промышленностью CAT-фермента (фирма "Боерингер-Маннгейм").

Фиг. 15. CAT-активность у MDCK-клеток, зараженных рекомбинантным вирусом. Для заражения свежих MDCK-клеток использовали надосадочную жидкость, в которой находились РНП-трансфектированные и зараженные вспомогательным вирусом MDCK-клетки. Инокулят удаляли, спустя 1 ч после заражения, клетки собирали, спустя 11 ч, и определяли CAT-активность. Полоса 1 отвечает экстракту клеток, зараженных только вспомогательным вирусом. Полоса 2 отвечает экстракту клеток, зараженных 100 мкл надосадочной жидкости, взятой из раствора, содержащего РНП-трансфектированные и зараженные вспомогательным вирусом MDCK-клетки. Полоса 3 отвечает использованию надосадочной жидкости (80 мкл) от клеток полосы 2. Полоса 4 отвечает тому же случаю, что и полоса 2, исключая лишь то, что к инокуляту добавляли вспомогательный вирус (MOI 4). В противоположность опытам, показанным на фиг. 4, пробы содержали 20 мкл ¹⁴C-хлорамфеникола.

Фиг. 16. Схематическое изображение представляющих интерес частей нейраминидазного (NA) гена, содержащегося в плазмидах, использованных в опытах по трансфекции. Выделенная из pUC19 плазмидная конструкция pT3NAv содержит нейраминидазный ген вируса гриппа A/WSN/33 и усеченный промотор, специфически распознаваемый бактериофаговой T3-РНК-полимеразой. Использованный T3-промотор подвергнут усечению таким образом, чтобы начальный транскрибированный нуклеотид (аденин) соответствовал 5'-аденину (WSN-NA-гена). На 3'-конце-кДНК-копии нейраминидазного гена (NA-гена) сайт, отвечающий действию ограничительного фермента Ksp 6321, вводили таким образом, чтобы сайт расщепления находился сразу за 3'-концом нейраминидазной генной последовательности. Продукт транскрибирования из 1409 нуклеотидов был получен после расщепления ферментом Ksp6321 и транскрипции T3-РНК-полимеразой из PT3NAv (как это описано ниже в разделе 8.1). Показаны 15 5'-концевых нуклеотидов, 52 нуклеотида, отвечающих области, расположенной между ограничительными эндонуклеазными сайтами, отвечающими NcoI и PstI и 12 3'-концевых нуклеотидов. Продукт транскрибирования pT3NAv mut 1 является идентичным таковому у pT3NAv за единственным исключением, которое сводится к отсутствию 11 нуклеотидов при следовании по цепи от 5'-конца РНК немутантного типа. Продукт транскрибирования pT3NAv mut2 является идентичным таковому у pT3NAv, исключая наличие 5 мутаций, расположенных в центральной области (отмечены подчеркиванием). Эти пять мутаций не изменяют аминокислотную последовательность у открытого считываемого остова гена. Сериновый кодон UCC, находящийся в положении 887-889 (РНК с положительной цепью) был в том же самом месте заменен сериновым кодоном AGU. Нумерация нуклеотидов согласуется с таковой у Hiti et al., 1982, J. Virol. 41: 730-734.

Фиг. 17. Результаты проведения на полиакриламидном геле электрофореза кислот РНК, выделенных из спасенных вирусов гриппа, РНК-продукты транскрибирования pT3NAv (фиг. 16) в случае экстрагированной фенолом РНК, выделенной из вируса гриппа A/WSN/33, смешивали с очищенными полимеразными препаратами, после чего следовали методике, описанной ниже в разделе 6.1.1. Эти воссозданные рибонуклеопротеиды были затем подвергнуты трансфекции в MDBK-клетках, которые за час до этого были заражены вспомогательным вирусом WSN-НК. Среду, содержащую 28 мкг/мл плазминогена, собирали через 16 ч и вирус подвергали амплификации и внесению на MDBK-клетки при отсутствии протеазы. Вирус, полученный из бляшек, подвергали затем дальнейшей амплификации в MDBK-клетках, и РНК экстрагировали фенолом из очищенных вирусных препаратов, делая это так, как описано в разделах 6.1 и далее и 7.1 и далее. Кислоты РНК разделяли на полиакриламид (2,8%) - бисакриламидных (0,075%) гелях, содержащих 7,7 М раствор мочевины в TBE-буфере, и визуализировали, окрашивая серебром, как это описано в разделе 6.1 и далее. Полосы 1 и 6 отвечают РНК вируса WSN-НК. Полоса 2 отвечает РНК вирусу, который был извлечен из MDBK-клеток с последующей рибонуклеопротеидной (RNP) трансфекцией при воздействии нейраминидазной РНК, извлеченной из pTXNAv, и заражением вспомогательным вирусным препаратом WSN-НК. Полоса 3 отвечает нейраминидазной РНК, транскрибированной in vitro из pT3NAv. Полоса 4 отвечает РНК, взятой из контрольного WSN-вируса. Полоса 5 отвечает РНК, полученной из вируса, который был извлечен из MDBK-клеток и затем подвергнут рибонуклеопротеидной трансфекции с использованием РНК, экстрагированной фенолом из WSN-вируса и заражению вспомогательным вирусным препаратом WSN-НК.

Фиг. 18. Анализ последовательности у РНК, полученной из выделенного вируса гриппа, содержащего пять сайт-специфических мутаций. После заражения вспомогательным вирусом WSN-НК MBDK-клетки подвергали рибонуклеопротеидной трансфекции с использованием РНК из T3NAv mut2, которая была получена посредством транскрипции из pT3NAv mut2. После проведения инкубации в течение ночи в присутствии 28 мкг/мл плазминогена на среду использовали для размножения и выращивания бляшек на MDBK-клетках в условиях отсутствия протеазы. Вирус, взятый из бляшек, затем подвергали амплификации, и РНК получали после экстракции фенолом из очищенного вируса. Факт попадания мутантного нейраминидазного гена в вирусные частицы подтверждали прямым установлением последовательности у РНК с использованием последовательности 5'-TACGAGGAAATGTTCCTGTTA-3' в качестве примера (соответствующее положение 800-819; Hiti et al., J. Virol. 41: 730 - 734) и обратной транскрипции (Yamashita et al. , 1988, Virol 163: 112-122). Показанные последовательности соответствуют положению 878-930 в нейраминидазном гене (Hiti et al., J. Virol - 41: 730-734). Стрелки и подчеркнутые нуклеотиды показывают изменения у мутантной РНК в сравнении с РНК немутантного типа. Слева показана контрольная РНК, полученная из вируса гриппа A/WSN/33. Справа показана РНК из мутантного вируса, взятого из MDBK-клеток, которые были подвергнуты рибонуклеопротеидной трансфекции с использованием РНК из T3NAv mut2 и заражению вспомогательным вирусом WSN-НК.

Фиг. 19. Хлорамфениколацетилтрансферазная экспрессия (CAT-экспрессия) у клеток, подвергнутых заражению коровьей оспой и рибонуклеопротеидной трансфекции с использованием IVACAT-1. Мышиные клетки линии C127 в количестве примерно 10⁶, находящиеся в чашках диаметром 35 мм, заражали смесями рекомбинантных вирусов коровьей оспы (Smith et al., 1986) при множественности заражения порядка 10 в каждом направлении. По истечении 1,5 ч синтетическую IVACAT-1-РНК трансфектировали в зараженные вирусом клетки, как это описано в литературе (Lutjyes et al., 1989). Клетки инкубировали в течение ночи, собирали и анализировали на CAT-активность, используя стандартные методики (Gorman et al., 1982). Пробы содержали 0,05 мкл ¹⁴C-хлорамфеникола, 20 мкл 40 мМ-ного ацетил-CoA (фирма "Боерингер") и 50 мкл клеточных экстрактов в 0,25 М трис-буфера (pH 7,5). Продолжительность инкубации примерно составляла 4 ч. Обозначения под номерами полос свидетельствуют о характере обработки клеток. Полоса 1 - контрольный опыт, полоса 2 - трансфекция высвобожденной РНК (без дополнения полимеразы), без заражения вспомогательным вирусом, полоса 3 - рибонуклеопротеидная трансфекция, без вспомогательного вируса, полоса 4 - рибонуклеопротеидная трансфекция, вирус гриппа в качестве вспомогательного вируса, полосы 5-11 - рибонуклеопротеидная трансфекция, направления вируса коровьей оспы в качестве вспомогательных вирусов, экспрессия указанных белков вируса гриппа.

Фиг. 20. Тестирование различных клеточных линий. В случае фиг. 20A клетки были заражены вирусами коровьей оспы с направлениями, экспрессируемыми белками PB2, PB1 и PA (полосы 1, 3, 5, 7) или белками PB2, PB1, PA и NP (полосы 2, 4, 6, 8), трансфектированы IVACAT-1-рибонуклеотидом и проанализированы на CAT-активность, как это описано в литературе. Полосы 1 и 2 - собачьи почечные клетки Мейден-Дарби (клетки MDCK), полосы 3, 4 - клетки Гела (Hela), полосы 5, 6 - клетки 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol 36: 59-72), полосы 7, 8 - клетки L. В случае фиг. 20B клеточная линия 3 PNP-4 была использована в качестве клетки хозяина. Под каждой полосой указаны белки вируса гриппа, экспрессированные в каждом образце. В случае рис. 20C клетки 293 были заражены четырьмя необходимыми вирусами коровьей оспы и подвергнуты трансфекции синтетическим рибонуклеопротеидом с использованием IVA-CAT-1-(полоса 1) или IVA-CAT-2(полоса 2) РНК. После инкубации в течение ночи клетки собирали и проводили CAT-тесты.

Настоящее изобретение касается конструкции и использования вирусных РНК-матриц с рекомбинантной отрицательной цепью, которые могут быть использованы совместно с вирусной РНК-направленной РНК-полимеразой для экспрессии ксеногенных генных продуктов в надлежащих клетках хозяина и (одновременно или по отдельности) для высвобождения ксеногенного гена у вирусных частиц. РНК-матрицы могут быть приготовлены транскрибированием надлежащих ДНК-последовательностей при использовании ДНК-направленной РНК-полимеразы, такой как бактериофаг T7, T3 или Sp6-полимераза. Используя вирус гриппа, ДНК, например, конструируют так, чтобы происходило кодирование информации, содержащейся у ксеногеной генной последовательности, расположенной за кодоном ATG, что достигается посредством комплемента вирусной полимеразы, связывающей сайт/ промотор вируса гриппа, т.е. комплемента у 3'-конца геномного сегмента вируса гриппа. Для сохранения в вирусных частицах может оказаться предпочтительным соединять ксеногенную кодирующую последовательность с комплементом как 3'-конца, так и 5'-конца геномного сегмента вируса гриппа. После транскрибирования с использованием ДНК-направленной РНК-полимеразы результирующая РНК-матрица будет кодировать отрицательную полярность ксеногенной генной последовательности и будет содержать в РНК-концевые последовательности, обеспечивающие вирусной РНК-направленной РНК-полимеразе возможность распознавать матрицу.

РНК-матрицы с рекомбинантной отрицательной цепью могут быть смешаны с очищенным вирусным полимеразным комплексом, включающим в себя вирусные РНК-направленные РНК-полимеразные белки (белки P) и нуклеопротеид (NP), который может быть выделен из рибонуклеопротеидных (RNP) остовов, приготовленных из всего вируса с целью получения "рекомбинантных РНП" (рРНП). Эти рРНП являются инфекционными и могут быть использованы для экспрессии ксеногенного генного продукта в надлежащих клетках хозяина или для спасения ксеногенного гена в вирусных частицах посредством совместной трансфекции клеток хозяина с рРНП и вирусом. Или же рекомбинантные РНК-матрицы могут быть использованы для трансфекции трансформированных клеточных линий, которые экспрессируют РНК-направленные РНК-полимеразные белки, пригодные для комплементации.

Изобретение демонстрируется посредством рабочих примеров, в которых РНК-продукты транскрибирования клонированной ДНК, содержащей кодирующую область - с ориентацией в отрицательном понимании - хлорамфениколацетилтрансферазного (CAT) гена, присоединенную 22 5'-концевыми и 26 3'-концевыми нуклеотидами неструктурированной РНК вируса гриппа A/PR/8/34, смешивали с выделенными полимеразными белками вируса гриппа A. Этот воссозданный рибонуклеопротеидный (RNP) комплекс трансфектировали в MDCK-клетки (или клетки 293), которые были заражены вирусом гриппа. CAT-активность была незначительной до и сразу после вирусного заражения, но она становилась заметной, спустя 7 ч после вирусного заражения. При использовании клеточной надосадочной жидкости, содержащей вирус, "спасенный" в этом эксперименте, для заражения нового монослоя м СК-клеток CAT-ативность также оказалась обнаруживаемой, свидетельствуя о том, что РНК, содержащая рекомбинантный CAT-ген, подвергалась упаковке в вирусные частицы. Эти результаты демонстрируют возможность успешного использования вирусных РНК-матриц с рекомбинантной отрицательной цепью и очищенной РНК-зависимой РНК-полимеразы для воссоздания рекомбинантной РНП вируса гриппа. Кроме того, из полученных данных следует, что у РНК вируса гриппа A 5'-концевая последовательность из 22 нуклеотидов и 3'-концевая последовательность из 26 нуклеотидов являются достаточными для возникновения сигналов, ведущих к РНК-транскрипции, РНК-репликации и пакованию РНК в частицах вируса гриппа.

При использовании этого подхода была также продемонстрирована возможность сохранения синтетических кислот РНК, выделенных из надлежащих рекомбинантных плазмидных кислот ДНК, в стабильных и инфекционных вирусах гриппа. В частности, РНК, отвечающая нейраминидазному (NA) гену вируса гриппа A/WSN/33 (Вирус WSN) была транскрибирована in vitro из плазмидной ДНК и после добавления очищенного полимеразного комплекса вируса гриппа была трансфектирована в MDBK-клетки. Применение суперинфекции со вспомогательным вирусом, свободным от WSN-нейраминидазного гена, привело к высвобождению вируса, содержащего WSN-нейраминидазный ген. Затем вводили пятиточковые мутации в WSN-нейраминидазный ген, проводя кассетный мутагенез плазмидной ДНК. Из анализа последовательности у спасенного вируса следовало, что геном, содержащий все пять мутаций, присутствует в мутированной плазмиде. Эта методика может быть использована для создания вирусов со сайт-специфическими мутациями, в результате чего могут быть сконструированы вирусы гриппа с определенными биологическими свойствами.

Умение воссоздавать рибонуклеопротеиды in vitro позволяет конструировать ранее неизвестные химерические вирусы гриппа, которые экспрессируют инородные гены. Один из путей достижения этой цели сводится к модифицированию существующих генов вируса гриппа. Например, гемагглютининовый ген может быть модифицирован добавлением инородных последовательностей в его внешние области. Если там ксеногенная последовательность относится к эпитопам или антигенам патогенных микроорганизмов, то тогда эти химетрические вирусы могут быть использованы для инициирования защитной иммунной реакции в отношении болезнетворного организма, из которого были выделены эти детерминанты. Помимо модифицирования генов, кодирующих поверхностные белки, могут быть изменены гены, кодирующие неповерхностные белки. Было показано, что последние гены являются связанными с наиболее существенными клеточными иммунными реакциями и у гриппозной вирусной системы (Townsend et al., 1985, Cell 42: 475-482). Таким образом, включение инородной детерминанты в нуклеопротеидный или бесструктурный протеидный ген вируса гриппа может - при последующем заражении - инициировать возникновение эффективной клеточной иммунной реакции в отношении этой детерминанты. Такой подход может, в частности, оказаться полезным в тех случаях, когда защитный иммунитет в сильной мере зависит от инициирования клеточных иммунных реакций (например, малярия и т.д.).

Еще один подход, который мог бы обеспечивать экспрессию инородных белков (или областей из таких белков) через химерические вирусы гриппа, касается введения полных ксеногенных генов в вирус. Ранее уже были описаны препараты вируса гриппа с числом РНК-сегментов более восьми (Nayak D. et al., в книге Genetics of Influenza Virus, P. Palese and D.W. Kingsbury, редакторы, Springer-Verlay, Vienna, pp. 255-279). Таким образом, могут оказаться ценными химерические вирусы гриппа с девятью и большим числом РНК-сегментов, и может легко происходить правильная паковка таких химерических вирусов.

Изобретение может быть подразделено на следующие этапы, что делается исключительно с целью удобства описания, а не для его ограничения: а) конструкция рекомбинантных РНК-матриц, б) экспрессия ксеногенных генных продуктов при использовании рекомбинантных РНК-матриц и в) сохранение ксеногенного гена в рекомбинантных вирусных частицах. Для простоты обсуждения изобретение описывается в подразделах ниже при использовании вируса гриппа. Может быть использован любой штамм гриппа (например, A, B, C). Однако, принципы могут быть по аналогии распространены на другие РНК-вирусные матрицы с отрицательной цепью и химерические вирусы, включая, но не ограничиваясь только ими, парамиксовирусы, такие как вирусы парагриппа, вирусы кори, респираторный синцитиальный вирус, буниавирусы, аренавирусы и т.д. Особенно интересной вирусной системой, которая может быть использована в соответствии с настоящим изобретением, является ортомиксоподобный вирус насекомых, называемый вирусом Дори (Dhori) (Fuller, 1987, Virology 160: 81-87).

5.1. Конструкция рекомбинантных РНК-матриц.

Ксеногенные генные кодирующие последовательности, состыкованные по краю комплементом из вирусной полимеразы, связывающей сайт/промотор, например, комплемент у 3'-конца вируса гриппа или комплементы у обоих концов 3' и 5' вируса гриппа, могут быть сконструированы с использованием приемов, известных в этой области техники. Рекомбинантные ДНК-молекулы, содержащие эти гибридные последовательности, могут быть клонированы и транскрибированы посредством ДНК-направленной РНК-полимеразы, такой как бактериофаг T7, T3 или Sp6-полимераза и им подобным, что ведет к получению рекомбинантных РНК-матриц, которые обладают надлежащими вирусными последовательностями, чем обеспечивается возможность вирусного полимеразного распознавания и активности.

Один из подходов к конструированию этих гибридных молекул сводится к введению ксеногенной кодирующей последовательности в ДНК-комплемент геномного сегмента вируса гриппа таким образом, чтобы ксеногенная последовательность стыковалась с вирусными последовательностями, необходимыми для проявления вирусной полимеразной активности, т.е. вирусной полимеразы, связывающей сайт и протомор, что далее будут называться вирусным полимеразным связующим сайтом. В случае еще одного подхода олигонуклеотиды, кодирующие вирусный полимеразный связующий сайт, например, комплемент у 3'-конца или у обоих концов вирусных геномных сегментов, могут быть присоединены к ксеногеной кодирующей последовательности, чем обеспечивается создание гибридной молекулы. Место расположения инородного гена или сегмента гена в целевой последовательности ранее определялось наличием надлежащих ограничительных ферментативных сайтов, расположенных в пределах целевой последовательности. Однако, недавние успехи в области молекулярной биологии существенно ослабили роль этой проблемы. Ограничительные ферментативные сайты могут быть легко введены в любое место целевой последовательности посредством использования сайт-направленного мутагенеза (см., например, методики, описанные Канкелем (Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488). Прибегая к вариациям в технике проведения полимеразной цепной реакции описанной ниже, также можно осуществить специфическую вставку последовательностей (т.е. задать положения ограничительных ферментативных сайтов) и можно легко провести конструирование гибридных молекул. Или же полимеразные цепные реакции могут быть использованы для приготовления рекомбинантных матриц без необходимости проведения клонирования. Например, полимеразные цепные реакции могут быть использованы для получения двухспиральных ДНК-молекул, содержащих ДНК-направленный РНК-полимеразный промотор (например, бактериофаг T3, T7 или Sp6-полимеразу), и гибридной последовательности, содержащей ксеногенный ген и полимеразный (из вируса гриппа) связующий сайт. РНК-матрицы могут быть затем транскрибированы непосредственно из этой рекомбинантной ДНК. И в еще одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантные РНК-матрицы могут быть получены соединением кислот РНК, устанавливающих отрицательную полярность у ксеногенного гена, с вирусным полимеразным связующим сайтом при использовании РНК-лигазы. Требования к последовательности в отношении вирусной полимеразной активности и конструкции, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, описаны в подразделах, приведенных ниже.

5.1.1. Вирусный 3'-конец, обеспечивающий полимеразную активность.

Опыты, описанные в разделе 6 и далее, см. ниже, направлены прежде всего на установление промоторных последовательностей для полимеразы РНК-вируса с отрицательной цепью, и было установлено, что специфичность приходится на 3'-концевые 15 нуклеотидов. Эти вирусные полимеразные связующие сайтовые последовательности, а также функционально эквивалентные им последовательности могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Например, могут быть использованы функционально эквивалентные последовательности, содержащие замещения, вставки, пропуски, добавления или инверсии, которые обнаруживают аналогичную активность. Синтез РНК посредством вирусной полимеразы, описанной ниже, является модельным в отношении специфического распознавания и удлинения под воздействием полимеразы вируса гриппа по следующим причинам: а) полимераза обладает высокой активностью, будучи подвергнутой действию примера ApG, что является своеобразной особенностью полимеразы вируса гриппа, б) она обладает оптимальной активностью при температуре и ионных условиях, являющихся, как было показано ранее, эффективными в отношении вирусных рибонуклеопротеидов, в) полимераза является специфической в отношении последовательностей вируса гриппа, имеющихся на модельных РНК-матрицах, г) полимераза является активной в синтезе эндонуклеазной РНК, проводимом в присутствии примера, что является отличительным признаком полимеразы вируса гриппа, д) распознавание РНК с донором на конце является специфической особенностью структур с окончанием 1) и е) сегменты геномной РНК претерпевают специфическое копирование.

5.1.2. Возможность оптимального распознавания и синтеза посредством вирусной полимеразы при отсутствии концевого ободка.

Заявителями ранее было показано, что пара оснований, присутствующих на концах сегментных кислот РНК вируса гриппа, образует ободковые структуры. Этого достигали двумя способами. При использовании сшивающего химически активного производного псоралена ковалентно связывали концы каждого сегмента у интактного вируса или у РНП, извлеченых из зараженных клеток (Hsu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8140-8144). Просматривая под электронным микроскопом, устанавливали, что обработанная РНК характеризуется наличием круговой структуры, образованной посредством сшивания концов. Аналогичным образом было установлено, что РНК-концы у РНП являются чувствительными к воздействию рибонуклеазы V1, которая распознает и расщепляет двухспиральную РНК, и было установлено, что вирусная полимераза присоединяется к обоим концам в конформации ободка (Honda. et al., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026). В этих исследованиях было показано, что у геномной РНК существует ободковая структура, и был сделан вывод, что она играет какую-то роль в полимеразном распознавании. Хотя матричные кислоты РНК, использованные в описанных примерах, изначально и готовили таким образом, чтобы проявлялось специфическое ободковое связывание белков, было установлено, что концевой ободок не играет какую-либо определенную роль в полимеразных реакциях, изученных в настоящем исследовании.

5.1.3. Специфическое копирование матриц с отрицательной цепью при использовании РНК-полимеразного препарата.

Было показано, что вирусная полимераза осуществляет синтез РНК с оптимальной эффективностью, если у матрицы имеется 3'-конец "дикого типа" с отрицательным характером цепи. Было показано, что кислоты РНК неродственной последовательности не подвергаются копированию и что кислоты с избыточными полисвязующими последовательностями, находящимися на 3'-конце, подвергаются копированию со значительно меньшей эффективностью. ДНК правильной последовательности также является неприемлемой для использования в качестве матрицы. Реакция является сильно специфичной, либо M-wt-матрица подвергается репликации лишь при очень низких уровнях. Даже учитывая то, что в рассматриваемом случае источником полимеразы был интактный вирус, этот результат казался очень удивительным, поскольку никогда не утверждалось что полимераза, которая распознает РНК вирусного происхождения, не в состоянии эффективно копировать цепь положительного характера. Ведутся исследования по изучению специфичности полимеразы, выделенной из зараженных клеток в моменты времени после введения инфекции, когда комплементарная РНК копируется в геномные матрицы. Настоящие данные свидетельствуют в пользу справедливости модели, по которой вирусная полимераза, которая копирует вРНК, является функционально отличной от той, которая синтезирует вРНК из кРНК посредством их промоторного распознавания. Возможно, что проведение регулированного модифицирования полимеразы в зараженных клетках удастся провести распознавание 3'-конца у РНК с цепью положительного характера. Проводя анализ промоторных мутантов, заявители исследовали тонкую специфичность реакции и нашли, что единственной мутацией, наблюдаемой в малой степени, является лишь мутация V-A₃-РНК. Кроме того, существенно пониженными являются комбинации двух и более точечных изменений в положениях 3, 5, 8 и 10.

5.1.4. Вставка ксеногенной генной последовательности в белковые генные сегменты PB2, PB1, PA или NP.

Генные сегменты, кодирующие белки PB2, PB1, PA и NP, содержат единственную открытую информационную строку с 24-45 нетранслируемыми нуклеотидами на их 5'-конце и 22-57 нетранслируемыми нуклеотидами на их 3'-конце. Введение инородной генной последовательности в любой из этих сегментов моет сопровождаться либо полной заменой вирусной кодирующей области инородным геном, либо частичной заменой. Полная замена может быть, по-видимому, проще всего осуществлена посредством проведения полимеразной цепной реакции. Принцип, лежащий в основе этого способа проведения мутагенеза, проиллюстрирован на фиг. 10. Кратко, суть метода состоит в следующем. Пример A, участвующий в полимеразной цепной реакции, в области от 5' до 3' должен содержать единственный ограничительный ферментативный сайт, такой как ограничительный ферментативный сайт класса 11S (т.е. должен использоваться фермент- "смещатель", который распознает специфическую последовательность, но при этом расщепляет ДНК-цепь либо выше, либо ниже такой последовательности), всю нетранслируемую 3'-область генного сегмента вируса гриппа и цепочку нуклеотидов, комплементарных к карбоксиконцевой кодирующей части инородного генного продукта. Пример B, участвующий в полимеразной цепной реакции, в области от 5'-конца до 3'-конца должен содержать специфический ограничительный ферментативный сайт, усеченную, но при этом активную фаговую полимеразную последовательность, комплемент всей нетраслируемой 5'-области генного сегмента вируса гриппа в отношении вРНК с отрицательным характером цепи) и цепочку нуклеотидов, отличаеющих кодирующей 5'-части инородного гена. После проведения полимеразной цепной реакции при использовании этих примеров с клонированной копией инородного гена продукт может быть выявлен и клонирован при использовании специфических ограничительных сайтов. Расщепление ферментом класса 11S и транскрипция с использованием очищенной фаговой полимеразы должны давать РНК-молекулу, содержащую точные нетранслированные концы генного сегмента вируса гриппа с инородной генной вставкой. Такая конструкция описана применительно к хлорамфениколацетилтрансферазному (CAT) гену, использованному в примерах, описанных ниже в разделе 7. В другом возможном варианте реализации настоящего изобретения полимеразные цепные реакции, идущие с участием примера, могут быть использованы для получения двухспиральной ДНК, содержащей бактериофаговую промоторную последовательность и гибридную генную последовательность, чем обеспечивается возможность прямого транскрибирования РНК-матриц без проведения клонирования.

В зависимости от полноты инородного генного продукта и цели конструирования может оказаться желательным создание гибридных последовательностей, способных непосредственно экспрессировать соединенные белки. Например, четыре белка вируса гриппа, а именно PB2, PB1, PA или NP, являются полимеразными белками, которые проникают в ядро зараженной клетки через специфические последовательности, присутствующие в белке. Установлено, что в случае нуклеопротеида (NP) этой аминокислотной последовательностью является последовательность вида (записанная одиночными буквами): QLVWMACNSAAFEDLRVLS (Davey et al., 1985, Cell 40: 667-675). Следовательно, если инородный генный продукт желательно направить в ядро (если это не происходит само по себе), то тогда гибридный белок должен быть сконструирован таким образом, чтобы он содержал область, которая будет направлять его туда. Эта область может быть гриппозного вирусного происхождения, но это и не обязательно. Гибридные белки могут быть также и невирусного происхождения, если только они содержат последовательности, необходимые для репликации вируса гриппа (3'-нетранслируемая область и т.д.).

В качестве еще одного примера может быть рассмотрен случай, когда некоторые антигенные области вирусных генных продуктов замещаются инородными последовательностями. Таунсенд (Townsend) и др. , (1985, Cell 42: 475-482) идентифицировали эпитопу в пределах нуклеопротеидной (NP) молекулы, которая обладает способностью вызывать сильную CTL-реакцию (цитотоксическую Т-клеточную реакцию). Эта эпитопа приходится на остатки 147-161 нулкеопротеидного (NP) белка и состоит из аминокислот TYQRTRQLVRLTGMDP. Водя короткую инородную эпитопу вместо этой нуклеопротеидной (NP) последовательности, можно вызвать сильную клеточную иммунную реакцию, направленную против интактного инородного антигена. И, наоборот, экспрессируя инородный генный продукт, содержащий эту область с 15 аминокислотами, можно также способствовать инициированию сильной клеточной иммунной реакции, направленной против инородного белка.

5.1.5. Введение ксеногенной генной последовательности в гемагглютининовые или нейраминидазные генные сегменты.

Гемагглютининовые и нейраминидазные белки, закодированные отдельными генными сегментами, являются основными поверхностными гликопротеидами вируса. Следовательно, эти белки являются основными мишенями для гуморальной иммунной реакции после заражения. Из всех белков вируса гриппа именно они подвергались наиболее широкому изучению, причем у обоих этих белков были установлены трехмерные структуры.

Зная пространственное строение НЗ-гемагглютинина и обладая при этом сведениями об информации, которую несут последовательности на большом числе вариантов, можно выявить антигенные сайты, находящиеся на гемагглютининовой молекуле (Webster et al., 1983, в книге Genetics of Influenza Virus, P.Palese and D.W.Kingsbury, редакторы, Springer-Verlay, Vienna pp. 127-160). Эти сайты попадают в четыре дискретные неперекрывающиеся области, расположенные на поверхности гемагглютинина. Эти области являются сильно изменчивыми и было также показано, что в них могут быть сделаны вставки и пропуски. Следовательно, проводя замещение этих сайтов в пределах гемагглютининовой молекулы (например, сайт A, аминокислоты 122-147 у гемагглютинина вируса гриппа A/HK/68) на часть инородного белка, можно вызвать сильную гуморальную реакцию, направленную против этого инородного пептида. В случае иного подхода инородная пептидная последовательность может быть введена в место нахождения антигенного сайта без удаления каких-либо вирусных последовательностей. Продукты экспрессии у таких конструкций могут оказаться полезными для использования в вакцинах, направленных против инородного антигена, и в силу этого может, в самом деле, появиться возможность обойти проблему, подвергнутую обсуждению ранее и сводящуюся к возможности распространения рекомбинантного вируса в вакционированном хозяине. Интактная гемагглютининовая молекула с замещением только в антигенных сайтах может сохранять гемагглютининовое функциональное назначение и, тем самым, оказаться пригодной для конструирования жизнеспособного вируса. Следовательно, этот вирус может быть получен без необходимости проведения дополнительных вспомогательных операций. Разумеется, вирус во всех отношениях должен быть ослабленным, чтобы исключалась всякая опасность его случайного распространения.

Могут быть созданы и другие гибридные конструкции, предназначенные для экспрессии белков на клеточной поверхности или для обеспечения им возможности высвобождения из клетки. Как и в случае поверхностного гликопротеида, гемагглютинин содержит аминоконцевую отщепляемую сигнальную последовательность, необходимую для обеспечения транспорта к клеточной поверхности и карбоксиконцевую последовательность, необходимую для обеспечения мембранного крепления. Чтобы происходила экспрессия интактного инородного белка на клеточной поверхности, может оказаться необходимым использовать эти гемагглютининовые сигнальные последовательности для создания гибридного белка. С другой стороны, если присутствуют только транспортные сигнальные последовательности и отсутствует мембранная захватывающая область, то тогда белок может оказаться выброшенным из клетки.

В случае нейраминидазного белка пространственное строение является известным, но при этом антигенные сайты являются растянутыми по поверхности молекулы и перекрывающимися. Отсюда следует, что при введении последовательности в нейраминидазную молекулу и экспрессии ее на внешней поверхности нейтраминидазной молекулы она должна быть иммуногенной. Кроме того, играя роль поверхностного гликопротеида, нейраминидаза обнаруживает два поразительных отличия от гемагглютининового белка. Во-первых, нейраминидаза не содержит отщепляемую сигнальную последовательность, в самом деле, аминоконцевая сигнальная последовательность выступает в роли мембранной захватывающей области. Вытекая из сказанного выше, второе различие между нейраминидазой и гемагглютинином состоит в том, что нейраминидаза является ориентированной концевым амином в мембрану, тогда как гемагглютинин является ориентированным в мембрану концевой карбоксигруппой. По этой причине может оказаться привлекательным в некоторых случаях конструировать гибридный нейраминидазный белок, поскольку слитой белок окажется ориентированным в сторону, противоположную направлению ориентации гемагглютининового слитого гибрида.

5.1.6. Введение ксеногенного гена в неструктурированные и матричные белковые генные сегменты.

Своеобразным свойством неструктурированных и матричных белковых сегментов, если проводить сопоставление с другими шестью генными сегментами вируса гриппа, является то, что эти сегменты кодируют, по крайней мере, два белковых продукта. В каждом случае один белок кодируется мРНК, которая является колинеарной геномной РНК, тогда как другой белок кодируется срощенным сообщением. Но поскольку сращиваемый донорный сайт находится в кодирующей области для колинеарного продукта транскрибирования, неструктурированные белки NS1 и NS2 обладают идентичными аминоконцами из 10 аминокислот, тогда как матричные белки M1 и M2 обладают идентичными аминоконцами из 14 аминокислот.

Следствием наличия такой своеобразной структуры является то, что рекомбинантные вирусы могут конструироваться посредством замены одного генного продукта внутри сегмента при оставлении интактным второго продукта. Например, заменяя основную часть NS2- или M2 кодирующей области инородным генным продуктом (при сохранении сращиваемого акцепторного сайта), можно экспрессировать интактный NS1- или M1- белок и слитый белок вместо белков NS2 или M2. Или же инородный ген может быть вставлен в генный сегмент неструктурированного белка без воздействия на экспрессию либо NS1, либо NS2. Хотя у большинства неструктурированных белковых генов и наблюдается перекрытие считывающих последовательностей NS1 и NS2, у некоторых природных неструктурированных белковых генов это не происходит. Заявители проанализировали неструктурированный белковый генный фрагмент, взятый у вируса гриппа A/Ty/Or/71 (Norton et al. , 1987, Virology 156: 204-213), и нашли, что у этого конкретного гена белок NS1 оканчивается в нуклеотидном положении 409 на неструктурированном белковом генном фрагменте, тогда как сращиваемый акцепторный сайт, отвечающий NS2, приходится на нуклеотидное положение 528. Следовательно, инородный ген может быть помещен между концевым кодоном, NS1 - кодирующей области и сращиваемым акцепторным сайтом NS2 - кодирующей области, причем без какого-либо воздействия на любой из этих белков. Может возникнуть необходимость расположить сращиваемый акцепторный сайт на 5'-конце инородной генной последовательности, чтобы происходило продуцирование белка (эта конструкция должна кодировать гибридный белок, содержащий аминоконцевую группу у NS1). В этом случае рекомбинантный вирус не должен быть дефектным и должен обладать способностью воспроизводиться без необходимости проведения вспомогательных операций.

Хотя известно, что геном вируса гриппа состоит из восьми функциональных генных сегментов, остается неизвестным, сколько всего сегментов фактически содержится в вирусной упаковке. Было высказано предложение, что в упаковке вируса гриппа может содержаться более восьми сегментов и, возможно, их число доходит до 12 (Lamb and Choppin, 1983, Ann. Rev. Biochem. 52: 467-506). Чтобы способствовать размножению рекомбинантного вируса, можно было бы в согласии со сказанным выше сконструировать "девятый" генный сегмент, обеспечивающий экспрессию инородного генного продукта. Хотя этот "девятый" сегмент и может быть введен в некоторые вирусы, при росте вируса он вскоре должен оказаться утерянным, если только не проводится некоторая селекция. Сказанное может быть достигнуто: "разобщением" неструктурированного белкового или матричного белкового генного продукта. Кодирующая часть у неструктурированного белка NS2 может быть удалена из неструктурированного белкового генного сегмента и наложена на генный сегмент, кодирующий инородный белок (наряду с надлежащими сращиваемыми сигнальными последовательностями). С другой стороны, может быть сконструирована бицистроновая мРНК, позволяющая осуществлять внутреннее инициирование "расшивания" этих вирусных последовательностей, что, например, может быть достигнуто использованием последовательностей, описанных Пеллетьером (Pelletier) и др. (1988, Nature 334: 320-325). Образующийся рекомбинантный вирус с "неспаренным" неструктурированным белковым или матричным белковым геном должен обладать способностью самовоспроизводиться и, кроме того, должен обязательно, удерживать "девятый" генный сегмент, чем обеспечивается возможность экспрессии инородного гена.

5.2. Экспрессия ксеногенных генных продуктов при использовании рекомбинантной РНК-матрицы.

Рекомбинантные матрицы, приготовленные как было описано выше, могут быть использованы многими способами для экспрессии ксеногенных генных продуктов в надлежащих клетках хозяина или для создания химерических вирусов, экспрессирующих ксеногенные генные продукты. В случае одного из вариантов реализации настоящего изобретения рекомбинантная матрица может быть соединена с вирусным полимеразным комплексом, очищенным, как это описано ниже в разделе 6 с целью получения рекомбинантных рибонуклеопротеидов, которые являются зараженными. С другой стороны, рекомбинантная матрица может быть смешана с вирусным полимеразным комплексом, полученным способами, реализуемыми с использованием рекомбинантной ДНК (см., например, Kingsbury et al., 1987, Virology 156: 396-403). Такие рекомбинантные рибонуклеопротеиды, будучи использованными для трансфекции клеток хозяина, могут при высоких уровнях непосредственно экспрессировать ксеногенный генный продукт. Клеточные системы хозяина, обеспечивающие экспрессию при высоких уровнях, содержат непрерывные линии клеток, обеспечивающие проявление вирусных функций, такие как линии клеток, суперинфектированные вирусом гриппа, линии клеток, сконструированных для комплементирования гриппозных вирусных функций и т.д.

В ином варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантные матрицы или рекомбинантные рибонуклеопротеиды могут быть использованы для трансфекции клеточных линий, которые экспрессируют вирусные полимеразные белки, что необходимо для обеспечения экспрессии ксеногенного генного продукта. С этой целью в качестве надлежащих клеток хозяина могут быть использованы трансформированные клеточные линии, которые экспрессируют все три полимеразных белка, таких как 3P-38 и 3P-133 (Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2709-2713). Клетки хозяина могут быть сконструированы аналогичным образом, чем обеспечивается получение других вирусных функций или дополнительных функций, таких как нуклеопротеидная.

5.2.1. Очистка вирусной полимеразы.

Вирусные полимеразные белки, используемые для получения рекомбинантных рибонуклеопротеидов, могут быть очищены от диссоциировавших рибонуклеопротеидных остовов, выделенных из всего вируса. В общем случае рибонуклеопротеидные остовы могут быть получены использованием стандартных методов (Plotch et al. , 1981, Cell 23: 847-858, Rochavansky, 1976, Virology 73: 327-338). Объединенные рибонуклеопротеидные остовы могут быть затем подвергнуты центрифугированию на втором градиенте из хлорида цезия (1,5-3,0 М) и глицерола (30-45%), как это описано у Хонда (Honda) и др. (1988, J. Biochem. 104: 1021-1026). Фракции активной вирусной полимеразы могут быть выделены из верхней части градиента, т.е. в области нахождения градиента, коррелирующегося со значениями концентраций хлорида цезия, лежащими в диапазоне от 1,5 до 2,0 М, и соответствующего фракции Хонда и др., обозначенной как NP ("нуклеопротеид"). Поразительным оказывается то, что эта фракция содержит все вирусные полимеразные белки, необходимые для образования активного комплекса. Более того, P-белки, которые могут быть извлечены из нижней части градиента, не являются необходимыми и, действительно, не обеспечивают транскрипцию вирусной РНК полной длины. Таким образом, складывается впечатление, что так называемая фракция NP помимо нуклеопротеидов содержит еще и активные формы белков PB2, PB1 и PA.

5.2.2. Необходимость высоких концентраций полимеразы для синтеза РНК, накрытой примером.

При высоких концентрациях вирусного полимеразного комплекса удается катализировать эту вирусно специфическую транскрипцию с эндонуклеазным концевым примером. Было установлено, что при условиях, оговоренных ниже в разделе 6, примерно 50 нг нуклеопротеида NP совместно с 1200 пг трех P-белков оптимально взаимодействуют с 5-10 нг реагирующей РНК. Было замечено, что, хотя in vivo нуклеопротеид NP и производит избирательную инкапсидацию гриппозных в РНК или к РНК, in vitro связывание нуклеопротеида NP с РНК носит неспецифический характер (Kingsbugy, et al., 1987, Virology, 156: 396-403, Scholtissek and Becht 1971, J. Gen. Virol. 10: 11-16). Можно думать, что для обеспечения распознавания вирусной полимеразой вирусных матричных кислот РНК в реакции, проводимой in vitro, они должны быть капсидированы нуклеопротеидом NP. Следовательно, добавление накрытого мРНК-примера должно оказывать сильное конкурирующее воздействие на матричную РНК в отношении связывания нуклеопротеида NP. Поскольку отсутствуют основания ожидать, что динуклеотидный ApG (аденилил-(3'-5')-гуанозин) станет связываться с нуклеопротеидом NP, полимеразу при низкой концентрации можно использовать только тогда, когда короткие матрицы взаимодействуют с ApG. В пользу справедливости этой гипотезы свидетельствует то, что повышенная концентрация полимеразного препарата нейтрализуется добавлением прогрессивно нарастающих количеств либо матричной РНК, либо какой-нибудь неспецифической РНК. Следует также заметить, что необязательная специфичность у концевой структуры 1 вида m7GpppXm, показанная ранее при использовании с вирусными рибонуклеотидами, была обнаружена также при использовании с воссозданными рибонуклеотидами.

5.2.3. Эффективное копирование РНК-матриц геномной длины.

Выделенную из плазмиды РНК, идентичную сегменту 8 вируса A(WSN)33, специфически кодировали полимеразой (при использовании метода полимеразных цепных реакций, проиллюстрированного на фиг. 10). В реакциях, проведенных с использованием РНК, экстрагированной из вируса, копированию были подвергнуты все восемь сегментов, хотя гемагглютининовый ген и копировался в меньшей степени. Фон в этих реакциях был пониженным в сравнении со случаем использования матриц с числом нуклеотидов от 30 до 53, что, по-видимому, было связано с тем, что загрязняющие кислоты РНК, присутствующие в полимеразном препарате, в основном представляют собой дефектные кислоты РНК малого размера. Рекомбинантные матрицы, кодирующие инородные гены, транскрибированные в этой системе, могут быть использованы для сохранения сконструированного гена в вирусной частице.

5.3. Получение химерического РНК-вируса с отрицательной цепью.

Для получения химерического вируса можно воссозданные рибонуклеопротеиды, содержащие модифицированные гриппозные вирусные кислоты РНК или кислоту РНК, кодирующую инородные белки, использовать для трансфекции клеток, которые заражаются также "родительским" вирусом гриппа. Или же воссозданные рибонуклеопротеидные препараты могут быть смешаны с рибонуклеопротеидами родительского вируса немутантного типа и использованы непосредственно для проведения трансфекции. После проведения классификации новые вирусы могут быть выделены, и могут быть идентифицированы их геномы проведением гибридизационного анализа. В других подходах, описанных здесь применительно к получению инфекционного химерического вируса, рекомбинантные рибонуклеопротеиды могут быть подвергнуты репликации в клеточных системах хозяина, которые экспрессируют полимеразные белки вируса гриппа (например, в системах экспрессии вирус/клетка хозяина, в трансформированных клеточных линиях, сконструированных для экспрессии полимеразных белков и т.д.), чем обеспечивается сохранение инфекционного химерического вируса, в этом случае отсутствует необходимость использовать вспомогательный вирус, поскольку эта функция выполняется экспрессированными вирусными полимеразными белками. В особенно привлекательном подходе клетки, зараженные рекомбинантными рибонуклеопротеидами, сконструированными для всех восьми сегментов вируса гриппа, оказываются в состоянии продуцировать инфекционный химерический вирус, который содержит желаемый генотип, тем самым исключается необходимость использования селекционной системы.

Теоретически можно произвести замену любого одного из восьми генных сегментов или части любого одного из восьми сегментов инородной последовательности. Однако, необходимым условием решения этой задачи является способность к воспроизводству у дефектного вируса (он является дефектным, поскольку у него утерян или изменен нормальный вирусный генный продукт). Существует ряд возможных подходов, позволяющих обойти эту проблему. Заявителями было показано, что мутанты вируса гриппа, дефектные в отношении белков PB2 и NP, могут быть выращены до существенно повышенных титров в клеточных линиях, которые специально сконструированы применительно к экспрессии полимеразных и нуклеопротеидных (NP) белков (Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2709-2813). Аналогичные методики могут быть использованы для конструирования клеточных линий, которые, благодаря своему строению, экспрессируют любой ген из генов вируса гриппа. Эти клеточные линии, которые должны экспрессировать вирусный белок, могут быть использованы для получения комплемента дефекта в рекомбинантном вирусе и, тем самым, для его воспроизводства. Или же некоторые системы круга хозяев могут оказаться пригодными для воспроизводства рекомбинантного вируса. Примером этого подхода является случай выделения природного вируса гриппа CR43-3. Этот вирус развивается нормально, если сначала он попадает в почечные клетки цыпленка, но не развивается в собачьих почечных клетках Мейдина-Дарби (Madin-Darby) (клетки MDCK), которые являются естественным хозяином вируса гриппа (Massab and Deborde 1983, Virology 130: 342-350). Анализируя этот вирус, Заявители установили, что у него кодирован дефектный белок NS1, дефектность которого вызвана отсутствием 12 аминокислот. Первичным почечным клеткам цыпленка свойственна некоторая активность, с которой связано либо появление комплемента у дефектного белка NS1, либо полная замена дефектного белка.

Третий подход к проблеме воспроизводства рекомбинантного вируса может сводиться к сокультивированию совместно с вирусом немутантного типа. Сказанное может быть осуществлено просто взятием рекомбинантного вируса и совместным заражением им и еще одним вирусом немутантного типа (желательно вакцинного штамма). Этот вирус немутантного типа должен дополнять дефектный вирусный генный продукт и обеспечивать возможность роста как немутантного, так и рекомбинантного вируса. Здесь наблюдается та же ситуация, что и в случае размножения дефектных мешающих частиц вируса гриппа (Nayak et al., 1983, в книге Genetics of Influenza Viruses P. Palese and D.W. Kingbury, редакторы, Springer-Verlag, Vienna pp. 225-279), в случае дефектных мешающих вирусов условия могут быть модифицированы таким образом, что основным размножающимся вирусом станет дефектная частица, а не вирус немутантного типа. Следовательно, этот подход может оказаться полезным при необходимости получения популяций рекомбинантного вируса высокого титра. Однако, эти популяции будут обязательно содержать некоторое количество вирусов немутантного типа.

Или же синтетические рибонуклеопротеиды могут быть заменены в клетках, подвергнутых совместному заражению с использованием рекомбинантных вирусов, которые экспрессируют полимеразные белки вируса гриппа. В самом деле, этот способ может быть использован для спасения рекомбинантного инфекционного вируса в соответствии с настоящим изобретением. Для этого полимеразные белки вируса гриппа могут быть экспрессированы в любой экспрессионной системе направление /клетка хозяина, включая, но не ограничиваясь, вирусные экспрессионные направления (например, вирус коровьей оспы, аденовирус, бакуловирус и т. д. ) или клеточные линии, которые экспрессируют полимеразные белки (см. например, Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83-2709-2713). Более того, заражение клеток хозяина рекомбинантными рибонуклеопротеидами, кодирующими все восемь белков вируса гриппа, может вести к продуцированию инфекционных химерических вирусных частиц. В случае этой системы отпадает необходимость использования селекционной системы, поскольку все продуцированные рекомбинантные вирусы будут обладать требуемым генотипом. В приведенных здесь примерах дается описание полностью синтетической репликационной системы, в случае которой не прибегая к клеткам, зараженным вирусом гриппа, синтетические рибонуклеопротеиды подвергаются репликации в клетках посредством действия белков вируса гриппа, экспрессированных рекомбинантными направлениями вируса коровьей оспы. Этим способом было показано, что белками вируса гриппа, существенными для транскрипции и репликации рибонуклеопротеида, являются лишь три полимеразных белка и нуклеопротеид.

Следует заметить, что можно сконструировать рекомбинантный вирус, не изменяя жизнеспособность вируса. Эти измененные вирусы должны тогда расти, испытывая компетентность, и для репликации отсутствует необходимость во вспомогательных функциях. Например, изменения у гемагглютининового генного сегмента и неструктурированного белкового (NS) генного сегмента, подвергнутые обсуждению выше, могут быть использованы для конструирования таких жизнеспособных химерических вирусов.

В приведенных ниже примерах описывается конструкция рекомбинантной плазмиды, которая после транскрибирования полимеразой T7 дает РНК-матрицу, которая распознается и транскрибируется гриппозной вирусной полимеразой in vitro. Эта РНК-матрица соответствует неструктурированной белковой (NS) рНК вируса гриппа, исключая лишь то, что в ней вирусные кодирующие последовательности заменены на таковую у хлорамфенилацетилтрансферазного гена (CAT-гена). Эта рекомбинантная вирусная РНК-матрица с отрицательной цепью была затем смешана с очищенной гриппозной вирусной полимеразой с целью воссоздания рибонуклеопротеидного комплекса. Рекомбинантный рибонуклеопротеидный комплекс был трансфектирован в клетки, которые затем были заражены вирусом гриппа, ведущим к экспрессии CAT-активности.

Ряд факторов указывает на то, что эта система представляет собой биологически активный рекомбинантный рибонуклеопротеидный комплекс, который находится в состоянии жесткого управления сигналами на транскрибирование, репликацию и накование гриппозных вирусных кислот РНК. Во-вторых, хлорамфениколацетилтрансферазный ген (CAT-ген) находится при отрицательной полярности в рекомбинантной вирусной РНК, используемой для рибонуклеопротеидной трансфекции. Так, поступающая РНК не может быть транслирована непосредственно в клетке и должна сначала транскрибироваться полимеразой вируса гриппа, чтобы оказались возможными трансляция и экспрессия хлорамфениколацетилтрансферазного гена (CAT-гена). Во-вторых, ни трансфектированная раскрытая рекомбинантная РНК сама по себе в присутствии заражающего вспомогательного вируса, ни рекомбинантный рибонуклеопротеидный комплекс в отсутствие заражающего вспомогательного вируса не в состоянии успешно индуцировать хлорамфениколацетилтрансферазную активность (CAT-активность). Отсюда следует, что гриппозные вирусные белки, поставляемые поступающим рибонуклеопротеидом, а также заражающим вспомогательным вирусом, являются необходимыми для амплификации рекомбинантной РНК-матрицы. И, наконец, после рибонуклеопротеидной трансфекции и заражения вспомогательным вирусом появляются вирусные частицы, которые, очевидно, содержат рекомбинантную РНК, поскольку эти частицы снова оказываются в состоянии индуцировать хлорамфениколацетилтрансферазную активность (CAT-активность) у свежезараженных клеток. Из этих результатов следует, что 26 3'-концевых и 22 5'-концевых нуклеотидов, соответствующих концевым нуклеотидам у неструктурированной белковой РНК вируса гриппа A, оказывается достаточным для появления сигналов на полимеразное транскрибирование и репликацию, а также на пакетирование РНК в частицы.

Приведенные выше результаты, которые определяют цисдействующие последовательности, необходимые для транскрипции, репликации и пакетирования гриппозных вирусных кислот РНК, были расширены добавлением рабочих примеров, приведенных ниже, из которых следует, что рекомбинантные ДНК-методики могут быть использованы для введения сайтспецифических мутаций в геномы инфекционных гриппозных вирусов.

Синтетические кислоты РНК, выделенные транскрибированием плазмидной РНК in vitro, были использованы в рибонуклеопротеидных трансфекционных экспериментах, направленных на спасение инфекционного гриппозного вируса. Для обеспечения возможности селекции этого вируса была выбрана система, которая требует присутствия WSN-подобного нейраминидазного гена у спасенного вируса. Вирусы, содержащие этот ген, могут быть выращены в бычьих почечных клетках Мейдина-Дарби (MDBK-клетках) при отсутствии протеазы в среде (Schulman et al., 1977, J. Virol 24: 170-176). Вспомогательный вирус WSN-НК не растет при этих условиях. Очевидно, что существуют альтернативные системы селекции. Например, для выделения спасенных вирусов, содержащих кислоты РНК, выделенные из плазмидных кислот ДНК, могут быть использованы рассевы антител или условно летательные мутанты. В опытах, описанных ниже, вирусы, которые были WSN-подобными вирусами, подвергали извлечению, Нейраминидазный (NA) ген вируса WSN извлекали из плазмидных кислот ДНК или из очищенной WSN-вирионной кислоты РНК (фиг. 17, полосы 2 и 5). В последнем случае, в условиях использования всей вирионной РНК для рибонуклеопротеидной трансфекции, не было известно, подвергаются ли другие гены также переносу в спасенный вирус, поскольку вспомогательный вирус делит оставшиеся семь генов с WSN-вирусом. Спасенные вирусы обладали ожидаемой схемой распределения РНК (фиг. 17) и вырастали в MDBK- или MDCK-клетках до титров, которые были неотличимы от титров, свойственных WSN-вирусу немутантного типа. Следует заметить, что было невозможным спасение нейраминидазной РНК, содержащей единственный нуклеотидный пробел в 5'-нетранслированной области. Сказанное, опять-таки, иллюстрирует важность регуляторных последовательностей, присутствующих в нетранслированных областях гриппозных вирусных кислот РНК. Был также спасен вирус при использовании РНК, которая была сконструирована таким образом, что она содержала 5'-нуклеотидных изменений в области длиной в 39 нуклеотидов (фиг. 16). Наличие этих мутаций у спасенного мутантного вируса было проверено прямым определением последовательности расположения аминокислотных остатков в РНК (фиг. 18). Эти мутации не сопровождались каким-либо аминокислотным изменением у нейраминидазного белка и, тем самым, не следовало ожидать изменения биологической характеристики вируса. Хотя этот вирус и не подвергали широкому изучению, но выявили, что его закономерности поведения в колониях и его ростовые характеристики являются неотличимыми от таковых у WSN-вируса немутантного типа. При использовании такой методики могут быть произведены мутации, которые приводят к изменению биологических характеристик вирусов гриппа. Эти исследования будут способствовать выявлению точных функциональных характеристик всех вирусных белков, включая белки, относящиеся к неструктурированным белкам. Кроме того, посредством мутагенеза могут быть изучены нетранслированные области генома, что должно привести к лучшему пониманию роли регуляторных сигналов, существующих в вирусных кислотах РНК. Дополнительной областью исследований, представляющих большой интерес, являются исследования, посвященные изучению развития гриппозной вирусной системы в направлении получения вакцины.

5.4. Вакционные рецепторы на основе химерических вирусов.

Фактически любая ксеногенная генная последовательность может быть сконструирована и введена в химерические вирусы, отвечающие настоящему изобретению, применительно к использованию в вакцинах. Желательно, чтобы эпитопы, которые индуцируют защитную иммунную реакцию в отношении какой-либо совокупности патогенных микроорганизмов или антигенов, связывающих нейтрализующие антитела, могли экспрессироваться частью или составлять часть химерических вирусов. Например, ксеногенные генные последовательности, которые могут быть сконструированы в химерических вирусах, отвечающих настоящему изобретению, с целью использования в вакцинах, включают в себя, но не ограничиваются только ими, этитопы вируса человеческого иммунодефицита (HIV), такого как gp120, поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg), гликопротеидов вируса герпеса (например, gD, gE), полиовируса VP1, антигенных детерминант невирусных патогенных микроорганизмов, таких как бактерии и паразиты - вот лишь немногие примеры. В случае еще одного варианта реализации настоящего изобретения экспрессированы могут быть иммуноглобулиновые гены полностью или частями. Например, изменяемые области антиидиотипических иммуноглобулинов, которые имитируют такие эпитопы, могут быть встроены в химерические вирусы, отвечающие настоящему изобретению.

Может быть составлена либо живая рекомбинантная вирусная вакцина, либо инактивированная рекомбинантная вирусная вакцина. Предпочтение может быть отдано живой вакцине, поскольку размножение у хозяина ведет к затягиванию действия стимула подобного рода и достижению величины эффекта, наблюдаемой при действии иммунитет длительного действия. Разработка рецептур такой живой рекомбинантной вирусной вакцины может быть осуществлена при использовании обычных методов, включающих в себя размножение вируса в клеточной культуре или в аллантоисе куриного зародыша с последующей очисткой.

В этом отношении использование генетически сконструированного вируса (направлений) применительно к изготовлению вакцины может потребовать присутствие ослабленных характеристик у этих штаммов. Существующие живые вирусные вакцинные препараты, пригодные для использования у людей, являются либо адаптированными к холоду и восприимчивыми к воздействию температуры, либо претерпевающими такое воздействие, что они дают несколько (шесть) генов из авианвирусов, что сопровождается ослаблением. Создание надлежащих мутаций (например, пробелов) в матрицах, используемых для проведения трансфекции, может вести к образованию новых вирусов с ослабленными характеристиками. Например, специфические миссенс-мутации, которые связываются с температурной чувствительностью или адаптацией к холоду, могут быть реализованы в мутациях делеции. Эти мутации должны быть более стабильными, чем точковые мутации, связанные с чувствительностью мутантов к холоду или температуре, и частоты реверсии должны быть исключительно низкими.

Или же могут быть сконструированы химерические вирусы с "суицидными" характеристиками. Такие вирусы могут проходить лишь один или несколько более раундов репликации у хозяина. Например, расщепление гемагглютинина является необходимым условием реинициирования репликации. Следовательно, производя изменения у сайта расщепления гемагглютинина, можно получить вирус, который будет подвергаться репликации в надлежащей клеточной системе, но не у хозяина-человека. При использовании в качестве вакцины рекомбинантный вирус будет проходить через одиночный репликационный цикл и будет индуцировать иммунную реакцию достаточной силы, но он при этом не будет претерпевать дальнейшее развитие у хозяина-человека и вызвать заболевание. Рекомбинантные вирусы, у которых отсутствуют один или несколько существенных гриппозных вирусных генов, не будут в состоянии проходить последовательные раунды репликации. Такие дефектные вирусы могут быть получены проведением совместной трансфекции воссозданных рибонуклеопротеидов, утерявших специфический ген (гены) в клеточных линиях), которые неизменно экспрессируют этот ген (гены). Вирусы с отсутствующим существенным геном (генами) будут подвергаться репликации в этих клеточных линиях, но, попав к хозяину-человеку, не будут в состоянии завершить раунд репликации. Такие препараты могут транскрибировать и транслировать - в этом неполном цикле - такое число генов, которое является достаточным для инициирования иммунной реакции. Или же могут быть введены повышенные количества штаммов, чтобы эти препараты служили в качестве инактивированных (убитых) вирусных вакцин. В случае инактивированных вакцин желательно, чтобы ксеногенный генный продукт экспрессировался в виде вирусного компонента, в результате чего генный продукт оказывался бы связанным с вирионом. Преимущество от использования таких препаратов состоит в том, что они содержат естественные белки и не подвергаются инактивации при обработке формалином или другими веществами, используемыми при изготовлении убитых вирусных вакцин.

В еще одном варианте реализации этой стороны настоящего изобретения инактивированные вакцинные рецептуры могут быть приготовлены использованием обычных методик "убивания" химерических вирусов. Инактивированные вакцины являются "мертвыми" в том смысле, что их инфекционная способность является нарушенной. В идеальном случае инфекционная способность вируса должна быть нарушена без воздействия на его иммуногенность. С целью получения инактивированных вакцин химерический вирус может быть выращен в клеточной культуре или аллантоисе куриного зародыша, подвергнут очистке посредством зонального центрифугирования, инактивирован формальдегидом или β- пропиолактоном и собран. Полученную вакцину обычно инокулируют внутримышечно.

Инактированные вирусы могут быть соединены с подходящим адъювантом, чем обеспечивается усиление иммунологической реакции. К таким адъювантам могут относиться но не только они, минеральные гели, например, гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, множественные полиатомные спирты, полианионы, пептиды, масляные эмульсии и потенциально полезные человеческие адъюванты, такие как транскортин (BCG) и Corynebacterium parvum.

Могут быть использованы многие способы введения вакционных рецептур, описанных выше, к ним относятся, но не только они, оральный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный и внутриносовой способы. Предпочтительным способом введения химерической вирусной вакционной рецептуры может оказаться естественный способ заражения патогенным микроорганизмом, для которого предназначена вакцина. При использовании живого химерического вирусного вакционного препарата предпочтительным способом введения рецептуры может оказаться естественный путь попадания инфекции, связанной с вирусом гриппа. С успехом может быть использована способность вируса гриппа инициировать сильную секреторную и клеточную иммунную реакцию. Например, заражение дыхательного тракта химерическими вирусами гриппа может инициировать сильную секреторную иммунную реакцию например, в мочеполовой системе, с сопутствующей защитой в отношении некоторого данного заболевания, вызываемого вводимым веществом.

6. Пример промоторного анализа гриппозной вирусной РНК-полимеразы.

В примерах, описанных ниже, полимеразу, которая является обедненной по геномной РНК, готовили из верхних фракций, полученных при проведении CsCl-глицерольного градиентного центрифугирования. Эта полимераза обладает способностью копировать короткие модельные матрицы, которые получаются при транскрибировании надлежащей плазмидной РНК T7-бактериофаговой РНК-полимеразой по специфическому в отношении последовательности способу. Концы у этой модельной РНК- являются идентичными 3'-концу с 15 нуклеотидами и 5'-концу с 22 нуклеотидами, сохранившимися в сегменте 8 от всех кислот РНК вируса гриппа A. Манипулируя плазмидой с целью получения различных кислот РНК, выполняющих роль матрицы, удалось показать, что распознавание и синтез из этой модельной РНК носят специфический характер в отношении промотора, находящегося на 3'-концевой последовательности и, не требуют наличия ободка. Кроме того, сайт-специфический мутагенез выявляет нуклеотидные положения, ответственные за протекание под воздействием вирусной полимеразы синтеза из матриц в геномном понимании по РНК в комплементарном духе. Были также установлены условия, при которых с использованием модельных кислот РНК можно наблюдать эндонуклеазный примерный РНК-синтез. Кроме того, воссозданная система делает возможным протекание вирусноспецифического синтеза из кислот РНК геномной длины, выделенных либо из плазмид, либо из РНК, извлеченной из вируса посредством проведения фенольной экстракции.

6.1. Материалы и методы.

6.1.1. Очистка вирусной РНК-полимеразы.

Рибонуклеопротеидные остовы готовили из всего вируса, используя стандартные методы (Plotch, et al., 1981, Cell 23: 847-858, Rochavansky 1976, Virology 73: 327-338). От 2 до 3 мг вируса разрушали инкубированием в растворе, содержащем 1,5% тритона N-101, 10 мг/мл лизолицитина, 100 мМ трис-HCl (pH 8,0) 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 5% глицерола и 1,5 мМ ди-тиотреитола. Образец фракционировали центрифугированием на 30-70%-ном глицерольном (по весу на объем) ступенчатом градиенте в присутствии 50 мМ трис-HCl (pH 7,8) и 150 мМ NaCl. Нуклеотидный препарат центрифугировали при скорости 45000 об/мин в устройстве SW 50.1, делая это в течение 4 ч при 4^oC. Фракции, обогащенные рибонуклеопротеидом, идентифицировали, подвергая белковые образцы, взятые из каждой фракции, электрофорезу на полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, и окрашивая серебром. Нуклеотидные фракции затем подвергали второму градиентному центрифугированию, как это описано у Хонда (Honda) и др. (1988, J. Biochem. 104: 1021-1026). Этот второй градиентный слой обладает ступенчатым строением со ступенями, содержащими 0,5 мл 3,0 М CsCl и 45% (по весу на объем) глицерола, 1,75 мл 2,5 М CsCl и 40% глицерола, 1,25 мл 2,0 М CsCl и 35% глицерола и 1,0 мл 1,5 М CsCl и 30% глицерола. Все ступени подвергали воздействию буферной смеси, состоящей из 50 мМ трис-HCl (pH 7,6) и 100 мМ NaCl. Рибонуклеопротеидные остовы, взятые в количестве 0,5 мл, наносили слоем поверху, и образец центрифугировали при 45000 об/мин на устройстве типа SW 50.1 в течение 25 ч при 4^oC. Полимеразные фракции опять-таки идентифицировали, подвергая белковые образцы электрофорезу на полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, и окрашиванию серебром. Активные полимеразные фракции в общем случае находили в области существования градиента, коррелирующегося с содержаниями CsCl, находящимися в диапазоне от 1,5 до 2,0 М. Эти фракции собирали и затем подвергали диализу в растворе, содержащий 50 мМ трис-HCl (pH 7,6), 100 мМ NaCl и 10 мМ MgCl₂, и концентрировали в трубках из центрикона-110 (амикон) или фракции подвергали диализу в мешках относительно раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 7,6), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 2 мМ дитиотреитола и 50%-ный глицерол.

6.1.2. Приготовление плазмиды.

Конструкция плазмиды показана на фиг. 2. Вставку ДНК для pV-wt-плазмиды готовили, используя ДНК-синтезатор прикладных биосистем. "Верхняя" цепь представляла собой 5-GAAGCTTAATACGACTCACTATAAGTAGAAAGAAGGGTG TTTTTTCATATCATTTAAACTTCACCCTGCTTTTGCTGAATTCATTCTTCTGCAGG-3'. "Низ" цепи синтезировали посредством продления примером с использованием цепи 5'-CCTGCAGAAGAATGA-3' в качестве примера. Кислоту ДНК, состоящую из 95 пар оснований, расщепляли ферментами Hind III и Pst I и очищали, проводя экстракцию смесью фенола с хлороформом, осаждали в этаноле и пропускали через ионообменную колонку с NACS-набивкой (лаборатория "Бетесда ризерч лабораториз"). Эту ДНК вводили в последовательность pUC-19, которая была подвергнута расщеплению ферментами Hind III и Pst I и затем использована для трансформации вида E.coli штамма DH5-α, который был сделан компетентным использованием стандартных методик. Бактерии распространялись по агаровым пластинам, содержащим X-гал и IPTG и устанавливали, что голубые колонии обладают плазмидой, содержащей предсказанную вставку, поскольку небольшая вставка сохраняет последовательность считывания IacZ и не содержит концевой кодон. Плазмида pM-wt была приготовлена аналогичным образом за исключением того, что обе цепи синтезировали химическим способом, причем верхняя цепь обладала последовательностью 5'-GAAGCTTAATACGACTCACTATAAGCAAAAGCAGGGTGAAGTTTAAATGATATG AAAAAACACCCTTGTTTCTACTGAATTCATTCTTCTGCAGG-3'.

Плазмиду pV-d5' (фиг. 2) готовили, используя олигонуклеотиды 5'-AGCTTAATACGACTCACTATAAGATCTATTAAACTCTCACCCTGCTTTTGCTGAATTCATT CTTCTGCA-3' и 5'-GAAGAATGAATTGAGCAAAAGCAGGGTGAAGTTTAATAGATCTTATAGTGAGTCGTATTA-3'. Кислоты ДНК подвергали ренатурации и вводили в последовательность pUC-19, расщепленную Hind III и Pst I и устанавливали, что белые колонии содержат правильную плазмиду, поскольку введение этой последовательности ведет к сдвигу последовательности считывания у IcaZ-гена. Точковые мутанты выделяли после расщепления последовательности pV-d5' ферментами Bg III и Pct I и легирования линеаризованной плазмиды односпиральным олигонуклеотидом смешанного состава. Поскольку фермент Bg III отделяет 5'-продолжение последовательности, а фермент Pst - 3'-продолжение, для образования вставки необходим был всего лишь единственный олигонуклеотид. Тогда клетка хозяина оказывалась в состоянии устранить пробелы, вызванные отсутствием комплементарного олигонуклеотида. Олигонуклеотиды конструировали с учетом возможности исправления сдвига у последовательности считывания в IacZ-гене, в силу чего бактерии, которые содержали мутантные плазмиды, выбирали по их голубому цвету.

Плазмидную последовательность pH gaHS, которая была использована для приготовления РНК, идентичный сегменту 8 у вируса гриппа A (WSN) 33, готовили, используя примеры вида 5'-CCGAATTCTTAATACGACTCACTATAAGTAGAAACAAGGGTG-3' и вида 5'-CCTCTAGACGCTCGAGAGAGCAAAAGCAGGTG-3' в полимеразной цепной реакции отрыва кДНК-клона. Продукт затем клонировали в зазоре, образованном ферментами XbaI и EcoRI у последовательности pUC19.

6.1.3. Приготовление РНК-матриц.

Плазмидные кислоты ДНК подвергали расщеплению ферментом Mbo II или другими надлежащими эндонуклеазами (см. фиг. 2) и линеаризованную ДНК транскрибировали, используя бактериофаговую-T7 РНК-полимеразу. Продукты транскрибирования РНК обрабатывали ДНКазой 1, свободной от РНКазы, и затем РНК очищали от белков и свободных нуклеотидов, используя ионообменные колонки с набивкой из материала тип-5 (фирма "Киаген, инк."). После осаждения в этаноле очищенные кислоты РНК вновь суспендировали в воде, и образец анализировали, проводя электрофорез и затем окрашивание серебром полиакриламидного геля, в результате чего количественно определяли выход РНК.

6.1.4. Гриппозные вирусные полимеразные реакции.

Примерно 30 мкг нуклеопротеида и 200 пг (в сумме) трех полимеразных белков смешивали в объеме с полной величиной 25 мкл с 10 нг матричной РНК, и раствор доводили до конечной концентрации, установленной при добавлении 50 мМ гепеса (pH 7,9) 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреитола, 0,05% NP-40, 0,4 мМ аденилил-(3'-5')-гуанозилового (ApG) динуклеотида (фирма "Фармация"), 0,5 мМ аденозинтрифосфата (АТФ) 0,5 мМ гуанозинтрифосфата (ГТФ), 0,5 мМ цитидинтрифосфата (ЦТФ) и примерно 0,6 мкМ α-³²P-УТФ (уридинтрифосфат) (40 мкКи при 300 Ки/ммоль, изготовитель "Нью-Ингланд нуклеар"). Реакции проводили на льду и затем сосуд переносили в водяную баню с температурой 30^oC, где выдерживали в течение 90 мин. Реакции завершали добавлением охлажденной льдом смеси, содержащей 0,18 мл 0,3 М раствора ацетата натрия и 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), и затем проводили экстракцию смесью фенола с хлороформом (взятыми в объемном отношении 1:1). После проведения первой экстракции в качестве носителя добавляли 15 мкг поли-1-поли-C-РНК, и образец снова экстрагировали смесью фенола с хлороформом. Образцы затем экстрагировали простым эфиром и осаждали в этаноле. После центрифугирования РНК-осадок от центрифугирования промывали дважды 70%-ным этанолом и затем сушили под вакуумом.

При проведении реакций с высокой концентрацией полимеразы условия были идентичными описанным выше, исключая лишь то, что матричную РНК добавляли в количестве 20 нг. При проведении реакций с использованием кислот РНК геномной длины количество вводимой полимеразы удваивали, использовали 50 нг матричной РНК, и концентрацию УТФ повышали до 2,06 мкМ.

Кислоту РНК ресуспендировали в красящей смеси, содержащей 78% формамида, 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), 0,1% ксилолцианола и 0,05% бром фенольного голубого красителя. В типичных случаях образец этой РНК подвергали электрорфорезу, который проводили на 8%-ном полиакриламидном геле без введения мочевины, остаток денатурировали нагреванием до 100^oC, с выдержкой при этой температуре в течение 1,5 мин, и аликвоту наносили 8%-ный полиакриламидный гель, содержащий 7,7 М мочевины. Гели фиксировали в два этапа, делая это сначала - в 10%-ной уксусной кислоте, а затем в смеси, содержащей 25% метанола и 8% уксусной кислоты. Гели сушили на фильтровальной бумаге, и затем экспонировали пленку, чувствительную к рентгеновскому излучению.

При тестировании различных кислот РНК с целью использования их в качестве матрицы разные РНК-препараты всегда анализировали на полиакриламидных гелях и окрашивали серебром таким образом, чтобы использовались равные количества каждой матрицы. С целью количественного определения содержания продукта гели экспонировали с наложением пленки, чувствительной к рентгеновскому излучению, без использования усиливающего экрана, чем улучшали линейность денситометрических показаний. Авторадиограммы анализировали, используя сканирующий денситометр типа FB910 (фирма "Фишер биотех"), и пики оценивали, используя компьютерное программное обеспечение, поставляемое фирмой "Фишер биотех".

6.1.5. Нуклеазный анализ продуктов реакции.

При проведении T1-рибонуклеазного анализа двух основных РНК-продуктов продукты реакции подвергали анализу на 8%-ном полиакриламидном геле, проводя электрофорез (без использования мочевины) и гель не обрабатывали фиксирующим раствором. Влажный гель подвергали экспозиции с использованием пленки, чувствительный к рентгеновскому излучению, и надлежащие кусочки геля локализовали и выделяли. Этот кусочек геля разрушали в 0,3 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-буфера, поддерживающего величину pH 7,5 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), 0,1% додецилсульфата натрия и 1 мкг кислоты тРНК, используемой в качестве носителя. Кислота РНК диффундировала в этот раствор в течение 3 ч, и затем гель переводили центрифугированием в осадок, надосадочную жидкость доводили по ацетату натрия до концентрации 0,3 М. Затем надосадочную жидкость дважды экстрагировали смесью фенола с хлороформом и один раз экстрагировали простым эфиром, после чего проводили осаждение в этаноле. Кислоту РНК, находящуюся в виде осадка от центрифугирования, ресуспендировали в 5 мкл формамида, денатурировали в кипящей воде в течение 1,5 мин и затем разбавляли добавлением 0,1 мл 10 мМ трис-HCl (pH 7,5) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК). Добавляли рибонуклеазу T1 (50 единиц, фирма Боерингер-Маннгейм биокемикалз) и образцы инкубировали в течение 60 мин при 37^oC. Кислоты РНК V-wt и M-wt, синтезированные с использованием РНК-полимеразы T7 в присутствии α-³²P-УТФ (уридинтрифосфат), аналогичным образом расщепляли посредством РНКазы T1. Продукты реакции экстрагировали смесью фенола с хлороформом и осаждали в этаноле, а затем анализировали на 20%-ных полиакриламидных гелях, содержащих 7,7 М мочевины.

Нуклеазный S1-анализ продуктов реакции проводили на транскрибированной РНК сперва завершением стандартной полимеразной реакции, для чего добавляли S1-буферный раствор, доводя объем до 0,2 мл, с введением 0,26 М NaCl, 0,05 М ацетата натрия (величина pH 4,6) и 4,5 мМ сульфата цинка. Образец делили на две части по 0,1 мл, и в одну пробирку добавляли 100 единиц S1-нуклеазы (фирма "Сигма кемикал компани"). Образцы инкубировали в течение 60 мин при 37^oC. После инкубации добавляли этилендиаминтетрауксусную кислоту (конечная концентрация 10 мМ) и 15 мкг поли-1-поли-C-РНК, и образец подвергали экстракции смесью фенола с хлороформом и осаждали в этаноле. Образцы затем подвергали электрофорезу на полиакриламидном геле.

6.2. Результаты.

6.2.1. Приготовление гриппозной вирусной РНК-полимеразы и матричной РНК.

Рибонуклеопротеидные цепи вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 готовили разрушением вируса в лизолецитине и тритоне N-101 с последующим проведением глицерольного градиентного центрифугирования (Rochavansky, 1976, Virology, 73: 327-338). Фракции, содержащие остовы, затем подвергали второму центрифугированию в CsCl - глицерольном ступенчатом градиентном слое (Honda, et al., 1988, J. Biochem 104: 1021-1026). Фракции, содержащие полимеразу, идентифицировали проведением на образцах электрофореза на геле с последующим окрашиванием серебром. На фиг. 1 показан полимеразный препарат, полученный после центрифугирования с использованием хлорида цезия. Для предотвращения потери белка во время диализа добавляли альбумин бычьей сыворотки. Результаты проведения денситометрического сканирования полосы 4 в сопоставлении с известными количествами всего вируса в полосах 1 и 2 позволяют считать, что белки в полосе 4 состоят из 150 нг нуклеопротеида (NP) и примерно 1 нг (в сумме) трех полимерных белков. В случае каждой реакции для получения этого геля использовали одну пятую часть препарата.

Полная конструкция плазмид, использованных в этом исследовании для приготовления матричных кислот РНК, изображена на фиг. 2. Всю вставку готовили использованием олигонуклеотидов, взятых из ДНК-синтезатора, которые затем клонировали в полиобразование вида pUC 19. Вставка содержал усеченную промоторную последовательность, распознанную T7-бактериофаговой РНК-полимеразой (Studier and Dunn 1983, Cold Spning Harbor Symposia on Quantitative Byology XLVII, 999-1007), в результате чего первыми синтезированными нуклеотидами были 22-нуклеотидные концевые последовательности, сохранившиеся от 5'-конца геномной РНК. При вырезании плазмиды ограничительной эндонуклеазой Mbo II (которая отрезает 7 оснований при следовании от распознанного сайта вверх) РНК, которая образуется при T7-РНК-полимеразном транскрибировании, заканчивалась концевыми 3'-нуклеотидами гриппозной вирусной последовательности. В последовательность также входил участок поли-U, примыкающий к 5'-концу сохраненного конца, который, как полагают, составляет, по крайней мере, часть сигнала окончания - полиаденилирования (Robertson, et al., 1981, J. Virol 38, 157-163). Полная длина этой модельной геномной РНК составляет 53 нуклеотида, поскольку 16 нуклеотидов занимают промежуток между концевыми сохраненными последовательностями. Модельная РНК, у которой оба конца являются идентичными таковым у вРНК, была названа кислотой V-wt. У РНК-кислоты M-wt закодирована совершенно аналогичным образом цепь, комплементарная цепи кислоты V-wt, в результате чего концы оказываются в согласии с концами комплементарной РНК (кРНК). Кислоты V-wt и M-wt конструировали в качестве модельных в отношении гриппозных вирусноспецифических кислот в РНК и кРНК, соответственно.

6.2.2. Вирусный полимеразный каталитический синтез полномерной копии матрицы.

При проведении реакции с использованием гриппозной вирусной полимеразы, V-wt-матрицы и ApG-примера получали продукт, который на денатурирующих гелях мигрировал совместно с РНК, состоящей из 53 нуклеотидов. Просматривается также РНК (фиг. 3A, полоса 2), мигрирующая в виде дублета и попадающая в положение с числом нуклеотидов примерно от 40 до 45. Как показано ниже, этот более короткий продукт представляет собой РНК, которая обрывается в месте нахождения аденозинов, присутствующих между нуклеотидами 43-48 у матрицы в вирионном понимании. Помимо матричных специфических продуктов транскрибирования просматривается общий фон из легких полос, которые соответствуют усеченным РНК-продуктам, транскрибированным из вирусной геномной РНК, которые не были удалены на стадии проведения CsCl-глицерольного центрифугирования. Без использования примера не просматриваются специфические продукты транскрибирования (фиг. 3A полоса 3). Из дополнительно проведенных опытов следует, что глобиновая мРНК, содержащая концевую завершающую структуру 1, не является активной в качестве примера при использовании начальных препаратов полимеразы.

Если полимеразная реакция завершается добавлением избыточного количества буфера, способствующего S1-нуклеазному расщеплению, и добавляется нуклеаза, то тогда продукт, содержащий радиоактивную метку, оказывается устойчивым к расщеплению (фиг. 3B, полоса 2). В противоположность этим условиям очень эффективно расщепленную V-wt-РНК с одиночной цепью синтезировали с введением радиоактивной метки при воздействии T7-РНК-полимеразы (фиг. 3B, полосы 3 и 4). Эти данные, отвечающие нуклеазе S1, свидетельствуют о том, что противоположная цепь действительно синтезировалась в этих реакциях. Продуктом реакции могла быть и двухспиральная РНК при этом, однако, нельзя утверждать, что продукт фактически был односпиральным и позже подвергся ренатурации до матричной РНК в присутствии высокого содержания соли, использованной в нуклеазной реакции.

Полученные РНК-продукты подвергали очистке электрофорезом на 8%-ном геле, выявляли участки, элюировали из геля и затем расщепляли, воздействия рибонуклеазой T1. Продукты анализировали посредством электрофореза, и результаты сопоставляли со схемами распределения, полученными при расщеплении РНКазой T1 контрольных проб M-wt и V-wt, содержащих внутреннюю метку. Как можно видеть на фиг. 3C, полномерная РНК (полоса 1) характеризуется схемой распределения, идентичной таковой у M-wt-РНК положительного направления (полоса 3), и не характеризуется схемой распределения, отвечающей V-wt-РНК (полоса 4). Наблюдаемые схемы распределения оказываются существенно идентичными схемам, которые могут быть предсказаны из РНК-последовательности, и тем самым свидетельствуют о том, что полимераза верно копирует V-wt-матрицу. Меньший РНК-продукт, дублетный большинству матриц, также подвергался расщеплению РНКазой T1. Его схема распределения была аналогичной схеме, отвечающей полномерному РНК-продукту (фиг. 3C полоса 2), за исключением того, что отсутствовал 14-основный олигонуклеотид. Вместо него просматривался слабый 13-основный олигонуклеотид, в результате чего конец короткой РНК картировался в положении 44, т.е. в сайте, где должны находиться два уридиновых соединения. Поскольку количество меньшего РНК-продукта падает при повышенных концентрациях уридинтрифофата и продукт исчезает, если в качестве метки используют цитидинтрифосфат, эти полосы являются, по-видимому, ложными и обусловленными низкими концентрациями уридинтрифосфата, присутствующего в полимеразной реакции.

6.2.3. Условия протекания полимеразных реакций при использовании модельных РНК-матриц.

Было установлено, что белковые образцы, содержащие примерно 30 нг нуклеопротеидного (NP) белка и примерно 200 пг (в сумме) трех белков P, способны реагировать оптимально с 5-10 нг РНК. Использованием холодного РНК-конкурента, а именно поли-1-поли-C, было установлено, что избыточная РНК неспецифически ингибирует транскрипцию, возможно, неспецифически связывая нуклеопротеидный (NP) белок (Kingsbury, et al., 1987, Virology 156: 396-403, Scholtissek and Becht 1971, J. Gen. Virol 10: 11-16). В условиях отсутствия неспецифического конкурента изменения в количестве матрицы в пределах от 1 до 10 нг мало сказываются на эффективности протекания синтеза РНК. Нуклеопротеидный (NP) белок и РНК присутствуют примерно при равных молярных концентрациях, и каждая из них примерно в тысячу раз превышает мольное содержание комплекса (в предположении справедливости соотношения 1:1:1), образованного тремя P-балками в типичной реакции.

Поскольку эти воссозданные рибонуклеотиды допускали возможность использования ApG, но не глобиновой мРНК, в качестве примера, эти модельные рибонуклеопротеиды тестировали на воздействие других переменных параметров реакции транскрибирования. Во всех других отношениях, как это было установлено тестированием, воссозданные рибонуклеопротеиды ведут себя в растворе подобно рибонуклеопротеидам, выделенным из вируса, разрушенного моющим средством. Оптимальная температура проведения синтеза РНК составляет 30^oC (фиг. 4A, полоса 2), как это неоднократно устанавливали для вирусной полимеразы (Bishop, et al., 1971, J. Virol, 8: 66-73, Takeuchi, et al., 1987, J. Biochem 101-837-845, Ultmanen, et al., 1983, J. Virol 45: 27-35). Кроме того, наиболее активные условия отвечают содержанию соли в 60 мМ NaCl (фиг. 4B. полоса 2), что опять-таки находится в согласии с условиями, использованными несколькими исследовательскими группами (Bishop, et al., 1971, J. Virol, 8: 66-73, Honda et al., 1988, J. Biochem 104:1021-1026, Shapiro and Krug 1988, J. Virol 62: 2285-2290). На фиг. 4C показан временной ход эксперимента. Глубина протекания реакции синтеза РНК возрастает, по-видимому, примерно линейно в течение первых 90 мин, как это было установлено для вирусных рибонуклеопротеидов (Takeguchi, et al., 1987, J. Biochem. 101: 837-845).

6.2.4. Специфичность реакции удлинения
Различные кислоты РНК подвергали тестированию с целью определения их пригодности для использования в качестве матриц для РНК - полимеразы вируса гриппа. Плазмидный клон pV-wt подвергали расщеплению посредством использования либо EcoRI, либо PstI, либо SmaI и T7-полимеразу использовали для транскрибирования РНК. Сказанное приводило к получению кислот РНК, идентичных кислоте V-wt, за исключением того, что на 3'-конце происходило добавление 5, 13 и 38 нуклеотидов. На фиг. 5A показана полученная наложением авторадиограмма, из которой следует, что продукты транскрибирования с интенсивностью, превышающей фоновую, отсутствуют в реакциях, которые проводили с использованием в качестве матрицы двух кислот РНК, идентичных кислоте V-wt, но дополнительно содержащих избыточную последовательность с числом нуклеотидов 13 и 38 на 3'-конце (полосы 1 и 2), одноцепочечной ДНК с последовательностью, идентичной таковой у V-wt (полоса 4) и неродственной РНК с числом нуклеотидов 80, генерированной транскрибированием полисвязующей последовательности p1B1-31 посредством T3-РНК-полимеразы (полоса 5). При этом, однако, V-Eco-матрицы, содержащая пять избыточных нуклеотидов на 3'-конце, могла распознаваться и верно транскрибироваться, хотя эффективность и составляла при этом одну треть от эффективности, наблюдаемой в случае V-wt - РНК немутантного типа (фиг. 5B, полоса 3). Представляется интересным то, что место инициирования на последовательности V-Eco-РНК при воздействии гриппозной вирусной полимеразы приходится, по-видимому, на надлежащее основание, поскольку транскрибированная РНК обладала тем же размером, что и продукт, образующий V-wt-матрицу.

6.2.5. Анализ промоторной области в отношении вирусной РНК-полимеразы.

Исходная конструкция, использованная при проведении этих исследований, содержала последовательности из обоих РНК-концов геномных кислот РНК, которые могли образовывать пару оснований и, тем самым, образовывать ободок. Вызвано это было тем, что, как было показано, в РНК в вирионах и рибонуклеопротеидах, присутствующая в зараженных клетках, находится в круговой конформации, образуя ободок, состоящий из 15-16 нуклеотидов (Honsa et al., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026, Hsu, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 8140-8144). Далее было показано, что вирусная полимераза присоединяется к двухспиральной структуре (Honda, et al., 1988, J. Biocnem 104: 1021-1026), откуда можно предполагать, что промотором в отношении РНК-синтеза является ободок. С целью проверки предложения о безусловной необходимости ободка для распознавания использовали следующие матрицы: плазмидную pV-wt-последовательность расщепляли ферментом DraI до транскрибирования с воздействием T7-полимеразы (фиг. 2). Сказанное должно сопровождаться получением РНК-молекулы из 32 нуклеотидов, содержащей только вирусноспецифические последовательности, взятые от 5'-конца РНК. При использовании этой РНК в качестве матрицы не получали требуемый продукт (фиг. 5B полоса 2). Следовательно, для протекания этой реакции был необходим 3'-конец вирионной РНК. Этот вывод находился в согласии с данными, из которых следует, что инициирующий сайт на 3'-конце у V-wt-последовательности отсутствует у V-Dra. Был приготовлен второй плазмидный клон, у которого отсутствовали 5'-концевые последовательности, но оставался интактным 3'-конец. Этот клон с обозначением pV-d5', подвергнутый расщеплению ферментом MboII и использованный для транскрибирования T7-полимеразой, давал основной продукт транскрибирования, состоящий из 30 нуклеотидов, и второстепенные продукты транскрибирования, состоящие из 29 и 31 нуклеотидов. К удивлению, эта матрица оказалась распознанной и копировалась гриппозной вирусной полимеразой. Из фиг. 7, полоса 1, следует, что продукту взаимодействия вирусной РНК-полимеразы с последовательностью V-d5' отвечают множественные полосы, отражающие характер введенной РНК. При элюировании из гелей продуктов, показанных на фиг. 7, полоса 1, и проведении анализа с использованием РНКазы T1 наблюдается ожидаемая для V-d5' схема распределения продукта транскрибирования. Поскольку V-d5'-РНК-матрица претерпевала копирование, не требовался ободок для вирусного полимеразного связывания и синтеза.

Хотя 5'-конец и не требовался для протекания синтеза под воздействием полимеразы, не исключалась явная возможность того, что V-wt-РНК могла представлять собой более предпочтительную матрицу в сравнении с последовательностью V-d5'. Для проверки этого предложения проводили реакции, в которых матрицы были смешанными. В каждой реакции кислота V-wt-РНК присутствовала в количестве 5 нг. Последовательность отсутствовала (фиг. 6, полоса 1) или присутствовала с молярным отношением 1/5 (фиг. 6, полоса 2) или молярным отношением 1/1 (фиг. 6, полоса 3). Относительные интенсивности полос от каждой РНК определяли денситометрированием авторадиограммы. Полученные значения исправляли на содержание радиоактивного нуклеотида уридинтрифосфата (УТФ), которое могло быть захвачено каждым продуктом, и величину нормировали таким образом, чтобы уровень синтеза в каждой полосе устанавливался равным единицы. Уровень копирования у V-wt уменьшался с ростом уровня у V-d5'. Когда V-d5' присутствует в молярном отношении 1/5, исправленный уровень у синтеза составляет примерно 1/4 от такового у последовательности V-wt (фиг. 6, полоса 2). Когда две матрицы присутствуют в эквимолярных количествах, то уровень синтеза от V-wt составляет примерно 60% от полной величины (фиг. 6, полоса 3), что, возможно, попадает в ожидаемый диапазон экспериментальной ошибки при эквивалентных уровнях синтеза. Аналогичные результаты были получены при неизменном количестве кислоты V-d5' и изменяемом количестве кислоты V-wt-РНК. Отсюда делается вывод, что кислота V-wt-РНК с ободком не обладает каким-то существенным преимуществом в сравнении с матричной РНК, содержащей лишь надлежащий 3'-конец.

6.2.6. Невозможность вирусного полимеразного копирования РНК-матриц, содержащих концы положительной полярности.

Как говорили выше, гриппозная РНК-полимераза обладает тремя раздельно проявляющимися активностями в ходе заражения. Два вида активности сводятся к транскрибированию РНК в геномном понимании, и третий вид - к копированию РНК в комплементарном смысле в вРНК. По этой причине конструировали РНК-матрицу, которая в комплементарном понимании содержала 5'- и 3'-концы РНК у сегмента 8 (последовательность M-wt, фиг. 2).

При использовании M-wt-РНК в качестве матрицы наблюдали слабое протекание синтеза (фиг. 5B, полоса 4). В двух экспериментах, проведенных для количественной оценки, средний уровень синтеза у M-wt-РНК составлял 4% от такового у V-wt-. Из сопоставления V-wt и M-wt-РНК-промоторов следует, что последовательность M-wt характеризуется наличием только трех транзиционных изменений и одной точковой вставкой в пределах 3-конца из 15 нуклеотидов. Сюда относится изменение G на A в положении 3, изменение U на C в положении 5, изменение C на U в положении 8 и вставка U между девятым и десятым нуклеотидами (см. табл. 2, приведенную ниже). С целью определения воздействия на специфичность этих четырех точковых различий у 3'-концов были приготовлены многие из этих комбинаций, и была оценена их эффективность при использовании в качестве матрицы (фиг. 7). Эти матрицы являлись производными от последовательности V-d5', поскольку они не содержали 5'-конец. Результаты денситометрических сканирований, отвечающих нескольким экспериментам, приведены в табл. 2.

Как показано в табл. 2, отдельные точковые изменения у последовательности V-d5', одинаково хорошо копируются в сравнении с самой последовательностью V-d5', исключая кислоту V-A₃-РНК, которая копируется с эффективностью 40% (фиг. 7, полоса 10, табл. 2). При тестировании кислот РНК с двумя изменениями оказывалось, что в общем случае активность падает до очень низких уровней (фиг. 7, полосы 3, 4 и 5). Следовательно, эти эксперименты свидетельствуют о том, что специфичность реакций у V-wt в сравнении с M-wt обусловлена сочетанием нуклеотидных изменений, имеющих место на 3'-конце у последовательности M-wt.

6.2.7. Синтез РНК с участием концевого эндонуклеазного примера.

Способ очистки вирусной полимеразы был модифицирован с целью уменьшения потерь белка при диализе. Вместо использования амикон-центрикон-10-диализной системы фермент подвергали диализу на стандартных мембранах, получая повышенные концентрации всех четырех вирусных остовных белков. Схема распределения у белкового геля этого препарата была идентичной показанной на рис. 1, полоса 4, за исключением того, что отсутствовала полоса, связанная с бычьим сывороточным альбумином. Было установлено, что этот препарат, взятый в количестве 5 мкл и содержащий 150 нг нуклеопротеида NP и 5 нг (в сумме) трех полимеразных белков, взаимодействует оптимальным образом с 10-40 нг модельной РНК-матрицы. Однако использование повышенных уровней белка сопровождается возрастанием фона, вызванным, по-видимому, повышенными уровнями содержания загрязняющих кислот 0 РНК (вирионных кислот РНК, неудаленных центрифугированием в присутствии хлорида цезия), дающих продукты размерного класса вблизи 50-75 нуклеотидов, что усложняет анализ РНК-матриц, содержащих последовательность длиной в 50 нуклеотидов.

Этот высококонцентрированный полимеразный препарат оказывался теперь активным в отношении концевого эндонуклеазного примерного РНК-синтеза (фиг. 8A, полоса 4), а также в отношении независящей от примера репликации матричной РНК (фиг. 8A, полоса 2). При использовании глобиновой мРНК в качестве примера для транскрибирования, проводимого из V-d5'-матрицы с числом нуклеотидов 30, в виде продукта просматривались триплетные полосы (фиг. 8a, полоса 4), отвечающие последовательностям с числом нуклеотидов, лежащим примерно в области от 42 до 44, что находилось в согласии с представлением об отщеплении концевой структуры, отстоящей примерно на 12 нуклеотидов от 5'-конца мРНК, и использовании этого нуклеотида для инициирования синтеза из модельной матрицы, содержащей 30 нуклеотидов. Поскольку избыточные количество РНК ингибируют синтез РНК, что, по-видимому, происходит за счет неспецифического связывания нуклеопротеида NP in vitro, как об этом говорили выше, оптимальное количество концевой донорной РНК составляет, как было установлено, 100 нг, что оказывается значительно меньше количества, обычно используемого при взаимодействии с предварительно сформированными рибонуклеопротеидными структурами (см., например, Bouloy, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3952-3956). Наиболее эффективным примером оказался пример ApG (фиг. 8A, полоса 5 и с меньшей выдержкой полоса 6). Продукт мигрирует медленнее, чем таковой из введенной матрицы (фиг. 8A, полоса 1) или продукт при отсутствии примера (рис. 8A, полоса 2) или, что, по-видимому, обусловлено тем, что 5'-конец а ApG-продукта является нефосфорилированным. Интенсивность полосы, отвечающей ApG-примерному продукту, оказывается примерно в десять раз выше в сравнении с таковой у концевого примерного продукта, при этом, однако, при концентрации 0,4 мМ молярное содержание ApG оказывалось в 60000 раз выше концентрации концевых доноров. Таким образом, хотя интенсивность у полосы продукта, образующегося с использованием концевого примера, и была примерно в 10 раз ниже, чем таковая при использовании ApG примера, реакция, идущая с участием концевого примера, оказывалась на молярной основе примерно в 6000 раз более эффективной. Эта величина возрастания эффективности оказывается примерно схожей с величиной 4000, найденной ранее для вирусной полимеразы (Bouloy, et al., 1980 - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3952-3956). Ранее было показано, что концевые донорные кислоты РНК, содержащие концевую структуру 0, как это имеет место в случае РНК костерного мозаичного вируса, являются примерно в 10 раз менее активными при воздействии примером на гриппозную вирусную полимеразу (Bouloy, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3952-3956). Эта необычная концевая специфичность одинаково наблюдается у воссозданных рибонуклеопротеидов, изученных в настоящем исследовании, поскольку выход специфического продукта из модельной РНК сильно падает в реакциях, идущих с использованием в качестве концевого донора костерной мозаичной вирусной РНК. Продукт, содержащий 30 нуклеотидов, наблюдаемый в полосах 2-4, обусловлен, по-видимому, протеканием беспримерной репликации модельной матрицы.

Тот факт, что образующиеся кислоты М РНК обладают обратным характером в сравнении с введенной матричной последовательностью V-d5', был продемонстрирован SI-нуклеазным анализом (фиг. 8B). РНК- продукты, полученные с использованием примера ApG (фиг. 8B, полосы 1 и 2) и без использования примера (фиг. 8B, полосы 3 и 4), и оказывались существенно стойкими в отношении нуклеазы. Продукт реакции, проведенной с использованием концевого примера (фиг. 8B, полосы 5 и 6), оказывался частично чувствительным к воздействию нуклеазы, так как от продута отщеплялось примерно 12 нуклеотидов. Эти результаты в наибольшей мере согласуются с представлением, что 12 5'-концевых нуклеотидов происходят из мРНК, как это было многократно показано для гриппозного вирусноспецифического синтеза мРНК.

Было установлено, что промоторная специфичность этого полимеразного препарата в реакциях, идущих с участием примера ApG, является в основном идентичной таковой в случае использования фермента с пониженной концентрацией. Однако, попытки, имевшие место до настоящего времени, проведения аналогичных анализов промоторной специфичности при протекании реакций без использования примера и с использованием концевого примера оказались безуспешными из-за сравнительно высоких уровней фона, чем затруднялось проведение количественного анализа.

6.2.8. Репликация РНК-матриц геномной длины.

Полимерная РНК-последовательность из 890 нуклеатидов, идентичная последовательности сегмента 8 у вируса гриппа A/WSN/33, была приготовлена T7-РНК-полимеразной транскрипцией плазмидной ДНК pHgaNS, которая была подвергнута расщеплению ограничительным эндонуклеазным ферментом HgaI. Эту РНК копировали проведением реакций с участием примера ApG при содержании высококонцентрированной полимеразы в количестве 10 мкл (фиг. 9, полоса 8). То, что РНК была фактически копией матрицы, было продемонстрировано ее стойкостью в отношении нуклеазы 1 (фиг. 9, полоса 9). Аналогичный продукт наблюдали при отсутствии примера (фиг. 9, полосы 2 и 3). Подтверждение того, что эти полученные кислоты РНК были полномерными копиями матрицы, было получено приведением T1-РНКазного анализа. Вирионную РНК, очищенную из экстрагированного фенолом вируса гриппа A/PR/8/34, подвергали аналогичному копированию в реакции с использованием примера ApG (фиг. 9, полосы 10 и 11) и без использования примера (фиг. 9, полосы 4 и 5). Любопытно, что продукт, полученный при репликации гемагглютининового гена, получался при значительно пониженных уровнях. У этой РНК 3'-конец отличается от такового у сегмента 8 лишь нуклеотидами 14 и 15, откуда следует, что эти нуклеотиды играют важную роль у промотора в случае РНК-синтеза. Кроме того, было установлено, что при использовании в воссозданных рибонуклеопротеидах полной вирусной РНК уровень счета у осажденной кислоты составляет примерно 70% от такового, наблюдаемого при использовании естественных рибонуклеопротеидов. Вирусная полимераза также обладала способностью копировать эти полномерные кислоты РНК, когда в реакции с концевым примером использовали глобиновую мРНК.

7. Пример экспрессии и пакетирования инородного гена рекомбинантным вирусом гриппа
Описывается экспрессия хлорамфениколтрансферазного гена (CAT-гена) при использовании рекомбинантных рибонуклеопротеидов. Рекомбинантные рибонуклеопротеиды готовили, используя последовательность pIVACAT (первоначально названную как pCATcNS), т.е. рекомбинантную плазмиду, содержащую CAT-ген. Плазмида pVIACAT представляет собой плазмиду pUC 19, содержащую в последовательности T7-промотор, 5'-некодирующую (в вирусном понимании) боковую последовательность РНК-сегмента 8 вируса гриппа A/PR/8/34 (кодирует неструктурированные белки), BgIII - клонирующий сайт, полную кодирующую последовательность хлорамфениколтрансферазного гена (CAT-гена), записанную в обратном и комплементарном порядке, 3'-некодирующую (в вирусном понимании) неструктурированную РНК-последовательность и несколько ограничительных сайтов, позволяющих прекращать транскрипцию матрицы. Последовательность PIVACAT может быть транскрибирована при использовании T7 полимеразы с образованием РНК с боковыми последовательностями, свойственными вирусу гриппа A, которые располагаются вокруг CAT-гена с обратной ориентацией.

В опытах in vivo, описанных в подразделах ниже, использовали рекомибинантную РНК-молекулу, описанную выше и содержащую последовательности, отвечающие нетранслированным 3'- и 5'-концевым последовательностям неструктурированной РНК вируса Гриппа A/PR/8/34, примыкающим к обратно ориентированной открытой последовательности считывания хлорамфениколтрансферазного гена (CAT-гена). Эту РНК смешивали с очищенным гриппозным вирусным полимеразным комплексом и трансфектировали в MDCK-клетки (или клетки 293). После заражения вирусом гриппа A/WSN/33 хлорамфениколтрансферазную активность (CAT-активность) измеряли в рибонуклеопротеиднотрансфектированных клетках, и устанавливали амплификацию гена. Кроме того, рекомбинантный ген вируса гриппа паковали в вирусные частицы, после чего CAT-активность демонстрировали у клеток, подвергнутых заражению рекомбинантным вирусным препаратом.

7.1. Материалы и методы.

Для получения боковых последовательностей неструктурированной РНК, присоединяемых к кодирующей последовательности хлорамфениколтрансферазного гена (CAT-гена), поступали следующим образом. Выбирали два подходящих внутренних сайта ограничения, расположенных вблизи старт- и стоп-кодона CATN-гена, чем обеспечивалась возможность замены последовательностей, примыкающих к CAT-гену у плазмиды pCМ7, 3'- и 5'-неструктурированными РНК-последовательностями. На 5'-конце был выбран SfaNI-сайт (где отделяется 57 нуклеотидов от кодона ATG) и на 3'-конце -ScaI-сайт, где происходит отделение 28 нуклеотидов, считая от конца гена (включая стоп-кодон). Затем, используя ДНК-синтезатор прикладных биосистем, готовили четыре синтетических олигонуклеотида, необходимых для образования двух двухспиральных ДНК-фрагментов с надлежащими накрытиями для клонирования. Вокруг старт-кодона эти олигонуклеотиды образовывали кусок ДНК, содержащий XbaI-сайт, после чего следовали HgaI-сайт и PstI-сайт, причем 3'-NS-последовательность (в вирусном понимании) сразу сопровождалась CAT-последовательностью, идущей от старт-кодона к SgaNI-выступающей последовательности (указывается подчеркиванием). Кроме того, была включена молчащая мутация, введенная для приближения AccI-сайта к старт-кодону, чем обеспечивалась возможность проведения последующего модифицирования.

Вокруг стоп-кодона два других олигонуклеотида образовывали кусок ДНК следующего вида: тупоконечный ScaI-сайт, CAT-последовательность от этого сайта до и включая стоп-кодон (дается подчеркиванием) с последующим BgIII-сайтом и Xba-1-выступающей последовательностью.

Используя единственный внутренний EcoRI-сайт, находящийся в CAT-последовательности, SfaNI/EcoRI-фрагмент и Eco RI/ScaI-фрагмент от последовательности pCM7 независимо вырезали и очищали от акриламидных гелей. Фрагмент SfaNI/EcoRI затем соединяли с синтетическим ДНК-фрагментом, полученным ренатурацией олигонуклеотидов 1 и 2 в PUC19-плазмиду, вырезанную фрагментами XbaI и EcoRI. Фрагмент EcoRI/ScaI аналогичным образом клонировали в XbaI- и EcoRI-расщепленную pUC19-плазмиду, используя олигонуклеотиды 3 и 4. Связанную с ДНК-трансформировали в компетентные DH5a-бактерии, амплифицировали, выделяли и сортировали, проводя ограничительный анализ по стандартным методикам.

Рекомбинанты с SfaNI-содержащей вставкой вырезали ферментами XbaIO и EcoRI и плазмиды с ScaI-вставкой вырезали ферментами EcoRI и BgIII. Фрагменты очищали от акриламидного геля и клонировали совместно в последовательность направления pPHV, которая была вырезана ферментами XbaI и BgIII. После трансформации выращивали белые колонии, анализировали посредством эндонуклеазного расщепления, и выбранные клоны тестировали на последовательность расположения оснований. Конечный клон pCATcNS2 выращивали в больших количествах и подвергали тестированию на последовательность расположения оснований, начиная от боковых pUC-последовательностей и до 300 нуклеотида в пределах CAT-гена, не обнаруживали расхождений с предполагаемой последовательностью за исключением транзиции G в A в CAT-гене, которая представлялась молчаливой.

7.1.1. Вирусы и клетки.

Вирусы гриппа A/PR/8/34 и A/WSN/33 выращивали в яйцах с развивающимся эмбрионом и в MDCK-клетках, соответственно (Ritchey, et al., 1976, J. Virol. 18: 736-744, Sugiura, et al., 1972, J. Virol. 10: 639-647). Рибонуклеопротеидные трансфекции осуществляли на человеческих клетках 293 (Graham, et al. , 1977, J. Gen. Virol 36: 59-72) и на собачьих почечных клетках Мейдина-Дарби (Madin-Darby) (MDCK-клетках) (Sugiura, et al., 1972, см. выше).

7.1.2. Конструкция плазмид.

Плазмида pIVACATI, выделенная из последовательности pUC19, содержит кодирующую область хлорамфениколацетилтрансферазного гена (CAT-гена), по краям состыкованную с некодирующими последовательностями РНК-сегмента 8 вируса гриппа A/PR/8/34. Эта конструкция подвергается управлению T7-полимеразным промотором таким образом, что РНК-продукт транскрибирования IVACATI оказывается состоящим в области от 5'-конца до 3'-конца из следующих последовательностей: 22 нуклеотида, выделенных от 5'-конца гриппозной вирусной неструктурированной (NS) РНК, связующая последовательность из 8 нуклеотидов, включающая BgIII - ограничительный сайт, CAT-ген в отрицательной полярности и 26 нуклеотидов, выделенных от 3'-конца гриппозной вирусной неструктурированной (NS) РНК (фиг. 11).

Плазмиду pIVACATI конструировали следующим образом. Чтобы получить надлежащий 5'-конец у последовательности pIVACATI, EcoRI - ScaI-фрагмент у CAT-гена, выделенного из плазмиды pCM7 (Фирма "Фармация"), присоединяли к ДНК-фрагменту, образованному двумя синтетическими олигонуклеотидами. Последовательности у этих олигонуклеотидов были следующими: 5'-ACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATAGAT-3' (верхняя цепь) и 5'-CTAGATCTATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGT-3' (нижняя цепь). В случае 3'-конца вставки в плазмиду pIVACATI SfaNI-EcoRI-фрагмент CAT-гена соединяли с ДНК фрагментом, приготовленным из синтетических олигонуклеотидов: 5'-CTAGACGCCCTGCAGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGAG AAAAAAAATCACTGGGTATACCACCGTTGATATATCCCAATCGCATCGTAAA-3' (верхняя цепь) и 5'-GTTCTTTACGATGCGATTGGGGATATATCAACGGGTGG TATACCCAGTGATTTTTTTCTCCATTATGTCTTTGTCACCCTGCTTTTGCTGCAGGGCGT-3' (нижняя цепь). Олигонуклеотиды синтезировали на ДНК-синтезаторе прикладных биосистем. Эти 5'- и 3'-конструкции выделяли в переносчиках последовательности pUC19, расщепляли ферментами XbaI и EcoRI, выращивали, вырезали ферментами EcoRI/BgIII (5'-область) и XbaI/EcoRI (3'-область) и вводили в плазмиду pPHV, вырезанную ферментами BgIII/XbaI. Последняя плазмида была аналогична последовательности pV-wt, описанной ранее в разделе 6, за исключением того, что она содержала BgIII-сайт, который разделял некодирующие концевые последовательности неструктурированного РНК-сегмента вируса гриппа A. Выращивали конечный клон pIVACATI (фиг. 1), и ДНК частично тестировали на последовательность расположения оснований начиная с боковых pUC-последовательностей и кончая CAT-геном. Не обнаруживали изменений в сравнении с ожидаемыми последовательностями за исключением присутствия молчаливой транзиции G в A в CAT-гене в положении 106, считая от начала РНК плазмиды IVACATI.

7.1.3. T7-РНК-транскрипция.

Плазмиду pIVACATI подвергали расщеплению ферментом HgaI (фиг. 11), чем прекращали транскрипцию. Последовательность из пяти нуклеотидов, образовавшуюся под воздействием этого фермента, вводили с ферментом Кленоу (KIenow) (Лаборатория биологических исследований), и ДНК очищали на вращаемой колонке (фирма "Боерингер"). Реакцию с полимеразой T7 проводили по стандартным методикам в присутствии рназина (фирма "Промега)". Матричную ДНК извлекали из ДНКазы 1, свободной от РНКазы (фирма "Промега"), РНК очищали на тип 5'-колонках фирмы "Киа ген" (фирма "Киаген, инк.") и подвергали количественной оценке, используя 4%-ные полиакриламидные гели, которые подвергали окрашиванию серебром. Неструктурированную (NS) РНК готовили аналогичным образом на плазмиды pHgaNS.

Очистка полимеразы вируса гриппа A в транскрипции in vitro.

РНК-полимеразный комплекс выделяли из вируса гриппа A/PR/8/34, как это было описано выше в разделе 6. Транскрипции in vitro РНК-матричной последовательности IVACATI и HgaNS проводили в условиях, которые были описаны выше в разделе 6. Продукты транскрибирования, содержащие радиоактивную метку, анализировали на 4%-ных акриламидных гелях.

7.1.5. Рибонуклеопротеидная трансфекция клеток MDCK и 293.

Содержимое чашек диаметром 35 мм, в которых было примерно 10⁶ клеток, обрабатывали 1 мл раствора, состоящего из 300 мкг/мл диэтиламиноэтилдекстрина и 0,5%-ного диметилсульфоксида в фосфатно-солевом буферном растворе с желатином (0,1 мг/мл), в течение 30 мин при комнатной температуре. После удаления этого раствора к клеткам добавляли 200 мкг/мкл фосфатно-солевого буферного раствора с желатином, содержащего 1 мкг IVACATI-РНК (1-2 мкл), 20 мкл очищенного полимеразного препарата и 4 мкл рназина, и инкубировали в течение 1 ч при 37^oC. Затем добавляли очищенный в градиентных условиях вирус гриппа A/WSN/33 (множественность инфекции при 37^oC добавляли 2,5 мл либо среды из DMEM- с 10%-ной сывороткой плода коровы (клетки 293) либо среды MEM (MDCK-клетки). В некоторых экспериментах MDCK-клетки сначала заражали, а затем подвергали рибонуклеопротеидной трансфекции. Сбор клеток проводили в NET-буферном растворе или в средах, используя стирательную резину (MDCK-клетки) или воздействуя мягкой суспензией (клетки 293). Клетки центрифугировали и осадки от центрифугирования ресуспендировали в 100 мкл 0,25 М трис-буфера с величиной pH 7,5. Образцы затем замораживали и размораживали три раза, и клеточную суспензию центрифугировали, получая осадок. Надосадочную жидкость использовали при проведении CAT-анализов.

7.1.6. Выделение вируса из клеток, подвергнутых рибонуклеопротеидной трансфекции
Клетки MDCK заражали вспомогательным вирусом и через два часа подвергали рибонуклеопротеидной трансфекции, как это было описано выше. По прошествии одного часа клетки и среды собирали, и клетки центрифугировали. Надосадочные среды в количестве 100 мкл, содержащие вирус, добавляли к MDCK-клеткам, находящимся в чашках диаметром 35 мм. По прошествии 12 ч эти клетки и среды собирали и анализировали на CAT-активность. Вирус, находящийся в этих надосадочных средах, использовали в последующих операциях по заражению MDCK-клеток, находящихся в чашках диаметром 35 мм.

7.1.7. CAT-анализ
CAT-аналзи проводили по стандартным методикам, взятым с видоизменениями у Gorman, et al., 1982, Mol, Cell, Biol. 2: 1044-1051. Пробы содержали 10 мкл ¹⁴C-хлорамфеникола (0,5 мкКи, 8,4 нМ, NEN), 20 мкл 3 40 мМ ацетил-CoA (фирма "Боерингер") и 50 мкл клеточных экстрактов в 0,2 М трис-буфере (величина pH 7,5). Времена инкубации составляли 16-18 ч.

7.2. Результаты.

Матрицы рРНК готовили из расщепленных ферментов HgaI закрытых на конце и линеаризованных плазмид pCATcNS, используя T7-бактериофаговую РНК-полимеразу, описанную в разделе 6. Матрицы pРНК соединяли с вирусным РНК-полимеразным комплексом, приготовленным как это было описано в разделе 6.1.1, и образовавшиеся рибонуклеопротеиды использовали для трансфекции линий MDCK-клеток и клеток 293, которые были суперзаражены вирусом гриппа A (WSN) 33. В каждой клеточной линии, трансфектированной рекомбинантными рибонуклеопротеидами, по истечении шести часов после введения инфекции получали высокие уровни экспрессии хлорамфениколацетилтрансферазной (CAT) активности. Кроме того, вирусные штаммы, полученные по истечении 24 ч после заражения, давали высокие уровни CAT-фермента после последующего введения в MDCK-клетки. Хлорамфениколацетилтрансферазный рибонуклеопротеид паковали в вирусные частицы.

7.2.1 Синтез IVACATI-матричной РНК.

С целью изучения природы транскрипционных и репликационных сигналов у кислот РНК вируса гриппа A in vivo была сконструирована плазмида pIVACATI (фиг. 11), которая направляет протекание синтеза неструктурированного РНК-подобного продукта транскрибирования. Эта РНК находится между 22 5'-концевыми и 26 3'-концевыми нуклеотидами, представляя собой неструктурированную (NS) РНК вируса гриппа A/PR/8/34, и содержит - вместо кодирующих последовательностей для белков NS1 и NS2-последовательности для полномерного хлорамфениколацетилтрансферазного (CAT) белка. С целью клонирования она также содержит восемь дополнительных нуклеотидов, включая BgIII-сайт, расположенных между стоп-кодоном CAT-гена и U-продолжением у 5'-некодирующей области. Промотор T7, примыкающий к 5'-некодирующим последовательностям, и HgaI-сайт, расположенный ниже 3'-конца, создают условия для установления точного положения 5'- и 3'-концов. Проводя транскрипцию с использованием T7-полимеразы, образуют РНК длиной 716 нуклеотидов. Из фиг. 12, полосы 2-4 следует, что эта РНК обладает дискретной длиной и ее протяженность не превышает протяженность маркерной неструктурированной (NS) РНК, длина которой составляет 890 нуклеотидов и которая была синтезирована проведением T7-транскрипции плазмиды pHgaNS (полоса 1).

7.2.2. Трансфекция IVACATI-РНК in vitro РНК-полимеразой вируса гриппа A.

В примерах, описанных в разделе 6, было показано, что синтетические кислоты РНК, содержащие на 3'-конце 15 3'-концевых нуклеотидов у РНК-сегмента 8 вируса гриппа, могут быть транскрибированы in vitro при использовании очищенной РНК-полимеразы вируса гриппа A. Была произведена проверка возможности аналогичного транскрибирования IVACATI-РНК, не содержащей метки. Из фиг. 12, полоса 5, видно, что при проведении реакции транскрибирования in vitro образуется РНК дискретной длины и размера, такого же, что и у продукта реакции T7-транскрибирования, свидетельствуя о протекании синтеза полномерного продукта.

7.2.3. Рибонуклеопротеидная трансфекция и хлорамфениколацетилтрансферазная активность.

Поскольку рекомбинантная хлорамфениколацетилтрансферазная (CAT) РНК может быть транскрибирована in vitro, была создана система, предназначенная для проверки возможности распознавания и репликации этой РНК in vivo (фиг. 13). Рекомбинантную РНК смешивали с очищенной полимеразой, чем создавали условия для образования вирусных рибонуклеопротеидноподобных частиц. Для содействия ассоциации смесь РНК с полимеразой перед проведением рибонуклеопротеидной трансфекции инкубировали в транскрипционном буферном растворе без нуклеотидов в течение 30 мин при 30^oC. В некоторых экспериментах эту стадию предварительной инкубации опускали. Рибонуклеопротеидную трансфекцию проводили либо до, либо после заражения вирусом гриппа A /WSN/ 33, поскольку, как полагали, для эффективной амплификации гена необходимо наличие вирусного полимеразного белка. Использовали либо MDCK-клетки, которые являются легковосприимчивыми к вирусной инфекции гриппа A/WSN/33 либо человеческие клетки 293, которые заражаются с меньшей скоростью.

Для определения возможности амплификации и транскрибирования IVACATI-РНК отрицательного характера in vivo проводили опыт на клетках 293. Клетки трансфектировали рибонуклеопротеидом, через один час заражали вирусом и собирали через различные промежутки времени после заражения. Из рис. 14A видно, что при малых промежутках времени, прошедшего после заражения, обнаруживаются лишь фоновые уровни CAT-активности (полосы 5, 7 и 9). Однако, значительные уровни CAT-активност появляются через 7 ч после заражения (полоса 11). Аналогичный уровень CAT-активности обнаруживается и через два часа (полоса 13). Фоновые уровни у CAT-активности в случае MCK-трансфектированных клеток наблюдали в любой временной точке (полосы 6, 8, 10, 12 и 14) и в случае контрольных клеток, не подвергнутых заражению вирусом гриппа A/WSN/33 (полосы 1-4).

Для успешного протекания рибонуклеопротеидной трансфекции не является необходимой предварительная инкубация РНК и полимеразного комплекса. Как следует из фиг. 14B, полосы 2 и 3, предварительная инкубация может даже вести к понижению CAT-активности, что, по-видимому, связано с деградацией РНК во время предварительной инкубации. В еще одном контрольном эксперименте проводили заражение вспомогательным вирусом клеток, трансфектированных рибонуклеопротеидом (фиг. 14B, полосы 4 и 5). Поскольку эти полосы свидетельствуют об отсутствии CAT-активности, был сделан вывод, что IVACATI-РНК подвергается амплификации специфическим образом под воздействием белка, вырабатываемого вспомогательным вирусом. В дополнительном контрольном опыте чистую РНК трансфектировали в клетки, которые затем заражали вспомогательным вирусом или ложным вирусом. И у этих образцов опять не наблюдали CAT-активность (фиг. 14B полосы 6-9). И, наконец, зараженные вирусом клетки, которые не были подвергнуты трансфекции рекомбинантным хлорамфениколацетилтрансферазным рибонуклеопротеидом, также не проявляли эндогенную ацетилированную активность (фиг. 14B, полоса 10). Таким образом складывается впечатление, что добавление очищенной полимеразы к рекомбинантной РНК, а также заражение клеток вспомогательным вирусом являются важными факторами в достижении успешной экспрессии CAT-фермента.

Эксперименты проводили также с использованием MDCK-клеток, тканевая культура которых является обычной клеткой-хозяином у вируса гриппа (фиг. 14C). При трансфекции в течение одного часа до заражения воссозданного рекомбинантного хлорамфениколацетилтрансфераза-рибонуклеопротеидного комплекса (CAT-RNP-комплекса) наблюдали небольшую CAT-активность через 7 ч после вирусного заражения (фиг. 14С, полоса 1). Если рибонуклеопротеидную трансфекцию проводили через 2 ч после заражения вирусом, то тогда через 7 ч после заражения наблюдали сильно повышенную экспрессию хлорамфениколацетилтрансферазы (фиг. 14C. полоса 3). Следовательно, MDCK-клетки также являются приемлемыми клетками-хозяином для этих экспериментов.

7.2.4. Пакование хлорамфениколацетилтрансфераза-рибонуклеопротеидного комплекса в вирусные частицы.

Поскольку рекомбинантная хлорамфениколацетилтрансферазная РНК может быть подвергнута репликации при функциональном участии вспомогательного вируса, была исследована возможность присутствия хлорамфениколацетилтрансферазного гена в вирусно-продуцированных клетках, подвергнутых рибонуклеопротеидной трансфекции и заражению вспомогательным вирусом. В этих экспериментах использовали MDCK-клетки, поскольку они дают более высокие титры инфекционного вируса, чем клетки 293. MDCK-клетки заражали вирусом гриппа A/WSN/33, через два часа подвергали рибонуклеопротеидной трансфекции и оставляли для инкубации на ночь. По истечении 14 ч после заражения среду собирали, и клетки осаждали центрифугированием. Затем вирусную надосадочную жидкость использовали для заражения новых монослоев MDCK-клеток. Инокулят удаляли по прошествии часа и клетки собирали через 12 ч после заражения и определяли CAT-активность. На фиг. 15 видно, что вирусный препарат индуцирует уровень CAT-активности (полосы 2 и 3), который значительно превышает таковой в контрольном опыте (полоса 1). В этом случае добавление вспомогательного вируса к инокуляту не сопровождается повышением CAT-активности (полоса 4). Последующее перенесение вируса, содержащегося в надосадочной жидкости, на свежие MDCK-клетки не сопровождается измеримым индуцированием CAT-активности. Этому не следует удивляться, поскольку ответствует избирательное воздействие, направленное на удерживание CAT-гена в этих вирусных препаратах. Возможность переноса исходного РНК/полимеразного комплекса исключали, проводя предварительную обработку инокулятов РНКазой. Эта обработка ведет к разрушению вирусных рибонуклеопротеидов вируса гриппа (Pons et al., 1969, Virology 39: 250-259, Scholtissek and Becht, 1971, J. Gen. Virol 10: 11-16).

8. Спасение инфекционных вирусов гриппа использованием РНК, выделенной из специфических рекомбинантных кислот ДНК
Опыты, описанные в последующих подразделах, демонстрируют возможность спасения инфекционных гриппозных вирусов посредством использования РНК, выделенных из специфических рекомбинантных кислот ДНК. Кислоты РНК, соответствующие нейраминидазному (NA) гену вируса гриппа A/WSN/33 (WSN-вирус), транскрибировали in vitro из надлежащих плазмидных кислот ДНК и, добавив очищенный гриппозный вирусный полимеразный комплекс (как это описано ранее в разделе 6.1.1), подвергали трансфекции в MDBK-клетки, как это описано ранее в разделе 7. Суперинфекция вспомогательным вирусом, свободным от нейраминидазного (NA) гена WSN-вируса, приводила к высвобождению вирусов, содержащих нейраминидазный (NA) ген WSN-вируса. Таким образом, следуя этой методике, можно было конструировать инфекционные гриппозные вирусы, используя кДНК-клоны и проводя сайт-специфический мутагенез их геномов. Далее, эта методика давала возможность конструировать инфекционные химерические гриппозные вирусы, которые могли быть использованы в качестве эффективных носителей генной экспрессии в тканевой культуре животных и человека.

Из опытов, описанных ранее в разделах 6 и 7, следует, что 15 3'-концевых нуклеотидов кислот РНК с отрицательной цепью вируса гриппа оказывается достаточно для обеспечения протекания транскрипции in vitro в условиях использования очищенных полимеразных белков вируса гриппа. Кроме того, из исследований, проведенных с использованием хлорамфениколацетилтрансферазы (CATN) репортер-гена, следует, что 22 5'-концевых и 26 3'-концевых нуклеотидов вирусных кислот РНК содержат всю сигнальную информацию, необходимую для осуществления транскрипции, репликации и пакетирования кислот РНК вируса гриппа. На основании этих результатов была сконструирована плазмида pT3NAv, которая содержала полный нейраминидазный (NA) ген вируса гриппа A/WSN/33, расположенный за усеченным T3-промотором (фиг. 16). Следовательно, при проведении развернутой транскрипции этой плазмиды с отрезанием по Ksp 6321-сайту получается РНК, которая является идентичной истинному геномному нейраминидазному (NA) гену WSN-вируса, (фиг. 17, полоса 3). Эту РНК затем инкубировали совместно с очищенной полимеразой (очищенной как это было описано в разделе 6.1.1) и использовали в эксперименте с проведением рибонуклеопротеидной (RNP) трансфекции, направленной на спасение инфекционного вируса посредством использования вспомогательного вируса, который не содержал нейраминидазу WSN-вируса. Выбор вспомогательного WSN-НК-вируса обусловлен необходимостью использования сильной селекционной системы, посредством которой происходит выделение спасенного вируса. Ранее было показано, что WSN-НК-вирус может образовывать бляшки на MDBK-клетках только тогда, когда к среде добавлена протеаза. Сказанное находится в явном отличии от поведения WSN-вируса (изогенного WSN-НК-вирусу за исключением нейраминидазного гена), который и при отсутствии протеазы легко репликатирует в MDBK-клетках и образует зрительно ощутимые бляшки (Schulman et al., 1977, J. Virol 24: 170-176).

8.1. Материалы и методы.

8.1.1. Вирусы и клетки.

Вирус гриппа A/WSN/33 и A/WSN/-НК-вирус выращивали в почечных собачьих клетках Мейдина-Дарби (Madin-Darby) (MDCK-клетки) и в яйцах с развивающимся эмбрионом, соответственно (Sugiura et al. , 1972, J. Virol 10: 639-647, Schulman et al., 1977, J. Virol 24: 170-176). Вирус гриппа A/PR/8/34 также выращивали в яйцах с развивающимся эмбрионом. Почечные бычьи клетки Мейдина-Дарби (Madin-Darby) (MDBK-клетки) использовали для проведения опытов по трансфекции и для селекции спасенного вируса (Sugiura et al., 1972, J. Virol 10: 639-647).

8.1.2. Конструкция плазмид.

Плазмиды pT3NAv, pT3NAv mut1 и pT3NAv mut 2 конструировали, проводя направленный полимеразный цепной реакцией мутагенез с использованием клонированной копии нейраминидазного (NA) гена WSN-вирукса, который получали по стандартным методикам (Buonagurio et al., 1986, Science 232: 980-982). Для построения плазмиды pT3NAv использовали следующие примеры: 5'-CGGAATTCTCTTCGAGCGAAAGCAGGAGTT-3' и 5'-CCAAGCTTATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAGGAGTTT-3'. После проведения 35 циклов в устройстве термической циклизации (тип М1, фирма "Кой лэб продактс") продукт, образовавшийся при протекании полимеразной цепной реакции, подвергали расщеплению ферментами EcoRI и Hind III и клонировали в последовательность pUC19. Плазмиду pT3NA mut 1 конструировали аналогичным образом за исключением того, что последовательность у примера носила измененный характер (фиг. 16). Плазмиду pT3NAv mut 2 конструировали посредством проведения кассетного мутагенеза путем расщепления pT3NAv ферментами PstI и NcoI и нового связывания в присутствии синтетических олигонуклеотидов следующего вида:
5'-CATGGGTGAGTTTCGACCAAAATCTAGATTATAAAATAGGATACATATGCA-3' и 5'-AATGTATCCTATTTTATAATCTAGATTTTGGTCGAAACTCACC-3'. Олигонуклеотиды синтезировали на ДНК-синтезаторе прикладных биосистем. Выращивали конечные клоны pT3NA, pT3NAv mut1 и pT3NAv mut2, и кислоты ДНК частично тестировали на последовательность расположения аминокислот, начиная с боковых pUC19-последовательностей и кончая кодирующими последовательностями нейраминидазного (NA) гена. Тестированием последовательности расположения аминокислот было также подтверждено наличие мутаций у плазмиды pT3NAv mut2.

8.1.3. Очистка полимеразы вируса гриппа и рибонуклеопротеидная трансфекция в MDBK-клетки.

РНК-полимеразный комплекс очищали от вируса гриппа A/PR/8/34 так, как это было описано ранее в разделе 6.1.1, и затем использовали для проведения рибонуклеопротеидной трансфекции в MDBK-клетки по способу, описанному ранее в разделе 7, за исключением того, что WSN-НК-вирус использовали в качестве вспомогательного вируса при множественности инфекции, равной единице. Кислоты РНК, использованные для проведения рибонуклеопротеидной и трансфекции, получали, проводя фенольную экстракцию очищенного вируса или проводя транскрибирование (с использованием T3-полимеразы) pT3NAv, pT3NAv mut1 и pT3NA mut2. Все плазмиды расщепляли ферментом Ksp 6321, дополняли на конце ферментом Кленоу (Klenow) (Лаборатория биологических исследований) и затем транскрибировали, проводя реакцию с развертыванием, как это описано выше в разделе 7.

8.2. Результаты.

8.2.1. Спасение инфекционного вируса гриппа в MDBK-клетках при использовании РНК, выделенной из рекомбинантной плазмидной ДНК.

Плазмиду pT3NAv конструировали таким образом, чтобы она содержала полный нейраминидазный (NA) ген гриппозного WSN-вируса за усеченным промотором T3 (фиг. 16). Проведением развертываемой транскрипции плазмиды с обрезанием на Ksp6321-сайте получали РНК, которая по длине оказывалась идентичной истинному нейраминидазному (NA) геномному гену WSN-вируса (фиг. 17, полоса 3). Эту РНК затем инкубировали с очищенной полимеразой и использовали в рибонуклеопротеидном (RNP) трансфекционном эксперименте по спасению инфекционного вируса посредством использования вспомогательного вируса. Выбор WSN-НК-вируса в качестве вспомогательного вируса был вызван необходимостью создания сильной селекционной системы, посредством которой обеспечивалась изоляция спасенного вируса. Ранее было показано, что WSN-HN-вирус может образовывать бляшки в MDBK-клетках только тогда, когда к среде добавлена протеаза (Schulman et al. , 1977, J. Virol 24: 170-176). Сказанное находится в явной противоположности с WSN-вирусом (изогенным WSN-НК-вспомогательному вирусу за исключением нейраминидазного гена), который и при отсутствии протеазы легко репликатирует в MDBK-клетках и образует большие легко различимые бляшки (Sugiura et al. , 1972, J. Virol 10: 639-647). MDBK-клетки сначала заражали вспомогательным WSN-НК-вирусом и подвергали рибонуклеопротеидной трансфекции по истечении часа после заражения вирусом. После инкубации на протяжении ночи в присутствии 20 мкг/мл плазминогена надосадочную жидкость, состоящую из этих клеток, подвергали амплификации, и в MDBK-клетках при отсутствии протеазы в среде выращивали бляшки. Внешний вид бляшек, образовавшихся в MDBK-клетках (Schulman et al., 1972, J. Virol 10: 639-647), указывает на присутствие вируса, который содержит нейраминидазный ген WSN-вируса, поскольку надосадочная жидкость, полученная в контрольных экспериментах на клетках, зараженных только WSN-НК-вирусом, не давала бляшек. В типичном эксперименте, проведенном с использованием чашки диаметром 35 мл для проведения рибонуклеопротеидной трансфекции, наблюдали 2,5 · 10² бляшек.

В еще одном контрольном опыте использовали синтетическую нейраминидазную (NA) РНК, полученную из плазмиды pT3NAv mut1 (фиг. 16). Эта РНК отличается от нейраминидазной РНК немутантного типа, полученной из плазмиды pT3NAv единственным нуклеотидным пропуском, находящимся в нетранслируемой области 5'-конца (фиг. 16). Рибонуклеопротеидная трансфекция MDBK-клеток с этой РНК и суперинфектирование WSN-НК-вирусом не ведут к образованию спасенного вируса. Этот отрицательный результат может быть легко объяснен тем, что, как было показано ранее в пределах 6 и 7, существенные последовательности, необходимые для распознавания вирусной РНК вирусными полимеразами, а также для подачи паковочных сигналов, располагаются в пределах 3'-концевой и 5'-концевой последовательностей вирусных кислот РНК. При этом, однако, не может быть исключена возможность того, что спасение вируса с использованием этой мутантной РНК в действительности происходит, хотя и с необнаруживаемой частотой.

8.2.2. РНК-анализ спасенного вируса.

Вирус, полученный в эксперименте по спасению, был очищен от бляшек, амплифицирован в MDBK-клетках, и РНК была экстрагирована из этого препарата. РНК затем анализировали, проводя электрофорез на полиакриламидном геле. На фиг. 17 показаны РНК вспомогательного WSN-НК-вируса (полоса 1) и синтетическая нейраминидазная РНК (полоса 3), которая была транскрибирована T3-полимеразой из плазмиды pT3NAv. Миграционная картинка у кислот РНК спасенного вируса (полоса 2) является идентичной таковой у контрольного WSN-вируса (полоса 4). Кроме того, нейраминидазные кислоты РНК, приходящиеся на полосы 2 и 4, мигрируют в то же положение, что и нейраминидазная РНК, выделенная из кДНК (полоса 3) и быстрее, чем нейраминидазная кислота НК-вируса у вспомогательного WSN-НК-вируса (полоса 1). На основании этих опытов может быть сделан вывод, что в результате протекания рибонуклеопротеидной трансфекции образуется инфекционный вирус, содержащий нейраминидазную РНК WSN-вируса, выделенную из кДНК.

8.2.3. Спасение инфекционного вируса гриппа использованием вирионной РНК.

В еще одном эксперименте по трансфекции использовали РНК, экстрагированную из очищенного WSN-вируса. При трансфекции этой чистой РНК совместно с полимеразными белками в клетки, зараженные вспомогательным вирусом, у спасенного WSN-вируса наблюдали способность подвергаться репликации в MDBK-клетках. Кислоту РНК, выделенную из амплификационной бляшки, полученной в этом эксперименте, подвергали анализу в полосе 5, показанной на фиг. 17, и устанавливали, что полоса является неотличимой от таковой у контрольного эксперимента, проведенного с использованием WSN-вируса, которому соответствует полоса 4.

8.2.4. Введение сайт-специфических мутаций в вирусный геном.

В опытах, описанных выше, осуществляли спасение гриппозного WSN-вируса. Поскольку синтетическая РНК, использованная в этих экспериментах, является идентичной подлинному нейраминидазному гену WSN-вируса, не может быть полностью исключена возможность загрязнения WSN-вирусом немутантного типа. По этой причине вводили пять молчаливых точковых мутаций в кодирующую область нейраминидазного гена плазмиды pT3NAv. Эти мутации вводили посредством кассетного мутагенеза путем замены короткого NcoI/PstI фрагмента, присутствующего в нейраминидазном гене. Пять мутаций у кДНК включали в себя изменение C на T в положении 901, изменение C на A в положении 925, образование нового XbaI-сайта и разрушение исходного PstI-сатйа, соответственно. Кроме того, весь сериновый кодон, находящийся в положении 887-889 кДНК-клона, был заменен на альтернативный сериновый триплет (фиг. 17). Рибонуклеопротеидная трансфекция этой мутагенизированной РНК (pT3NAv mut2) и заражение вспомогательным вирусом MDBK-клеток снова вели к спасению WSN-подобного вируса, который вырастал в MDBK-клетках без добавления протеазы. При тестировании РНК этого вируса на последовательность расположения аминокислот было установлено, что все пять точковых мутаций, присутствующих в плазмидной ДНК (фиг. 16) наблюдаются и в вирусной РНК (фиг. 18). Поскольку представляется крайне маловероятным, чтобы эти мутации находились в гриппозном WSN-вирусе дикого типа, делается вывод, что успешное спасение инфекционного гриппозного вируса, содержащего пять сайт-специфических мутаций, было достигнуто посредством рибонуклеопротеидной трансфекции сконструированной РНК.

9. Пример синтетической репликационной системы.

В опытах, описанных ниже, использован кДНК-клон, который может давать гриппозную вирусоподобную вРНК-молекулу, кодирующую репортер-ген. Эта получающаяся РНК представляет собой NS-подобную (неструктурированного типа) вРНК, которая содержит обратную кодирующую область у хлорамфениколацетилтрансферазного гена (CAT-гена) вместо обратных кодирующих областей у неструктурированных белков NS1 и NS2 (Lutjyes et al., 1989, Cell, 59: 1107-1113). Эту рекомбинантную РНК (IVACAT-1) инкубировали с очищенными рибонуклеопротеидными белками вируса гриппа и использовали для создания репликационной системы, независящей от вируса гриппа. Мышиные фибробластовые клетки C127 заражали смесями рекомбинантных вирусов коровьей оспы (Smith et al., 1987, Virology, 160: 336-345) и трансфектировали по прошествии часа IVAACAT-1-рибонуклеопротеидом. Использовали смеси носителей, экспрессирующих три полимеразы (PB2, PB1 и PA) и нуклеопротеид. Репликацию и транскрипцию синтетического рибонуклеопротеида оценивали, анализируя клетки на CAT-активность после инкубации в течение ночи. На фиг. 19 проиллюстрирована CAT-активность, имеющая у клеток, зараженных многими из возможных смесей четырех рекомбинантных вирусов коровьей оcпы. На фиг. 19 полоса 4 отвечает контрольному опыту положительного характера, в котором вирус гриппа A/WSN/33 был использован вместо рекомбинантных вирусов коровьей оспы. CAT-активность присутствует у этого образца, а также у клеток, зараженных всеми четырьмя направлениями коровьей оспы (фиг. 19, полосы 8 и 10). Клетки, экспрессирующие любые поднаборы, составленные из этих четырех белков, не дают обнаруживаемые количества CAT-белка (фиг. 19, полосы 5-7, 9, 11, неопубликованные данные). Кроме того, подвергнутая трансфекции РНК, не инкубированная с очищенной полимеразой, также давала отрицательный результат в отношении CAT-экспрессии (Lutjyes, et al. , 1989). Таким образом, присутствие белков PB2, PB12, PA и NP - это все, что необходимо и достаточно для рибонуклеопротеидной экспрессии и репликации в этой системе. Уровни CAT-активности, полученные в клетках, зараженных носителями коровьей оспы, оказываются воспроизводимо повышенными в сравнении с клетками, зараженными вирусами гриппа, использованными в качестве вспомогательного вируса. В качестве наиболее вероятного объяснения этого факта можно привести следующее соображение: в клетках, зараженных вирусом гриппа, хлорамфениколацетилтрансфераза-рибонуклеопротеидный комплекс (CAT-RNP-комплекс) конкурирует с эндогенными вирусными рибонуклеопротеидами за право взаимодействовать с активной полимеразой, тогда как в системе, задействованной от вируса коровьей оспы, хлорамфеникол ацетилтрансфераза-рибонуклеопротеид (CAT-RNP) представляет собой всего лишь вирусоподобную молекулу.

Затем в качестве хозяина для этой системы, задействованной от вируса коровьей оспы, был тестирован ряд других линий клеток. На фиг. 20A показаны результаты, полученные с использованием клеток MDBK, Hela, 293 и L. В каждом случае не наблюдали CAT-активность при заражении клеток носителями, экспрессирующими лишь три полимеразных белка, однако, наблюдали значительную CAT-активность, если дополнительно вводили также носитель вируса коровьей оспы, экспрессирующий нуклеопротеид NP.

Ранее была сконструирована линия клеток (обозначенная как 3PNP-4), которая в силу своего строения экспрессирует низкие уровни PB2, PB1 и PA и высокие уровни белка NP. Эти клетки могут комплементировать рост температурно чувствительных мутантов, картируемых либо PB2-, либо NP-генными сегментами (Krystal et al., 1986, Li et al., 1989). Поскольку репликация через направления рекомбинантного вируса коровьей оспы зависит лишь от этих белков, вполне возможно, что эта линия клеток окажется способной амплифицировать и экспрессировать синтетический хлорамфениколацетилтрансфераза - рибонуклеопротеидный комплекс (CAT-RNP-комплекс) и при отсутствии любой вирусной инфекции. Однако, попытка проведения этого эксперимента не привела к получению обнаруживаемой CAT-активности (данные не показаны). Для выяснения причин отсутствия репликации у этой линии клеток использовали смеси рекомбинантных вирусов коровьей оспы для заражения клеток 3RNP-4. Как и ожидали, добавление четырех полимеразных белков привело к появлению экспрессии у CAT-активности (фиг. 20B, полоса 2). Из фиг. 20B, полоса 3, видно, что минимальная смесь направлений, необходимых для индуцирования CAT-активности у клеток 3PNP-4, составляется из направлений, экспрессирующих только белки PB1 и PA. Следовательно, стационарные уровни белков PB2 и NP в клетках 3PNP-4 являются вполне достаточными, но при этом уровни содержания белков PB1 и PA оказываются ниже пороговой величины, необходимой для проявления CAT-экспрессии при отсутствии вспомогательного вируса. Сказанное находится в согласии с поведением комплементационного фенотипа, проявляемого этими клетками, поскольку при неразрушающей температуре можно наблюдать только рост BP2- и NP-мутантов, а не мутантов PB1 и PA (Desselberger et al., 1980).

Поскольку синтетическая IVACAT-1-РНК обладает отрицательной полярностью, хлорамфениколацетилтрансфераза может быть синтезирована лишь посредством транскрипционного развертывания рибонуклеопротеидной молекулы. Теоретически, обнаруживаемые уровни хлорамфениколацетилтрансферазы могут быть получены либо посредством транскрипционного развертывания трансфектированного введенного рибонуклеопротеида (что эквивалентно проведению транскрипции с использованием примера), либо посредством сначала амплификации рибонуклеопротеида, а затем траскрипции (обуславливающей необходимость проведения рибонуклеопротеидной репликации) или посредством сочетания обоих процессов. Однако, из проведенной ранее работы, выполненной с использованием заражения вирусом гриппа для инициирования экспрессии у хлорамфениколацетилтрансферазного белка, следует, что обнаруживаемая экспрессия происходит лишь тогда, когда подвергается репликации введенный хлорамфениколацетилтрансфераза- рибонуклеопротеидный комплекс (Lutjyes et al., 1989). Это было показано использованием второй CAT-РНК вида IVACAT-2, которая содержала три мутации в цепочке из 12 оснований на 5'-конце вирусной РНК (Lutjyes et al., 1989). Эта область из 12 оснований сохраняется среди всех восьми генных сегментов у всех вирусов гриппа A (Desselberger, et al., 1980). Эта синтетическая рибонуклеопротеидная последовательность IVACAT-2 является компетентной в отношении транскрипции полимеразой вируса гриппа, но не претерпевает репликацию и при трансфекции в клетки, зараженные вирусом гриппа, CAT-активность остается необнаруженной (Lutjyes et al. , 1989). Следовательно, при транскрипции с участием примера введенной РНК не образуются обнаруживаемые уровни белка в клетках, зараженных вирусом гриппа. В соответствии со сказанным, эта мутантная РНК была использована для изучения возможности инициирования CAT-активности гриппозными белками, экспрессирующими вирусные направления коровьей оспы, исключительно посредством транскрибирования с участием примера поступающего рибонуклеопротеида или возможности амплификации посредством репликации и последующей транскрипции. Клетки C127 были заражены рекомбинантными вирусами коровьей оспы и затем трансфектированы рибонуклеопротеидами, генерированными либо IVACAT-1 либо IVACAT-2. Из фиг. 20C видно, что в клетках, трансфектированных IVACAT-2-рибонуклеопротеидом, могут быть обнаружены низкие уровни CAT-активности (полоса 2). При количественных определениях 0,5-1% хлорамфеникола переходили в ацетилированную форму в сравнении с 0,2-0,4% у недостаточно трансфектированных полос (не показаны). Однако значительно более высокие активности наблюдаются у клеток, трансфектированных CAT-1- рибонуклеопротеидом (полоса 1, обычно степень превращения хлорамфеникола составляла 15-50%), указывая на то, что в этих клетках происходит амплификация. Следовательно, эта рекомбинантная система, инициированная вирусом коровьей оспы, характеризуется наличием последовательности со специфическими свойствами, и рибонуклеопротеиды подвергаются репликации.

В описанных опытах для протекания рибонуклеопротеидной репликации не требовались ни белок NS1, ни белок NS2. Хотя их функция и является неизвестной, высказывалось предположение, что эти белки могут играть важную роль в репликации, поскольку оба белка синтезируются в больших количествах и присутствуют в ядре (Krug et al., 1989, Young et al., 1983, Greenspan et al., 1985, Lamb et al., 1984). Основываясь на представленных данных, можно утверждать, что эти белки не являются абсолютно необходимыми для протекания геномной репликации. Можно предполагать, что эти белки фактически играют какие-то вспомогательные роли в отношении репликации рибонуклеопротеида, такие как взаимодействие с факторами, свойственными хозяину, регуляция экспрессии у вирусных генов или некоторой функции, связанной с паковкой рибонуклеопротеида в инфекционные вирионы. Однако не может быть сделан вывод, что функция этих NS-белков может быть комплементирована белком вируса коровьей оспы, хотя при обследовании и было установлено отсутствие очевидной схожести между любым из белков NS1 или NS2 и известными белками вируса коровьей оспы. Схожие свойства этих двух белков также свидетельствуют против возможности существования комплементирующего характера у белка вируса коровьей оспы, поскольку вирус коровьей оспы представляет собой большой двухспиральный ДНК-вирус, репликатирующий исключительно в цитоплазме, тогда как вирус гриппа представляет собой РНК-вирус отрицательного характера, репликатирующий исключительно в ядре. Кроме того, репликация синтетических рибонуклеопротеидов происходит даже в присутствии цитозинарабинозида (ара-C, данные приведены), являющегося ингибитором поздней генной экспрессии и у вируса коровьей оспы (Oda et al., 1967, Kaverin et al., 1975, Cooper et al., 1979).

Эта схема зависимости от направлений рекомбинантного вируса коровьей оспы обладает рядом преимуществ в сравнении с использованием вируса гриппа для инициирования репликации синтетической РНК. Например, поскольку экспрессия вирусных белков носит совершенно искусственный характер, она может быть использована для точной остановки процессов, входящих в репликацию. Репликация включает сначала синтез матрицы с положительной цепью из геномной РНК отрицательного характера. Эта кРНК положительного характера затем подвергается копированию с целью амплификации рибонуклеопротеида геномного характера, который затем используют для экспрессии белка и пакования (Krug et al., 1989). Система, описанная здесь; свидетельствует о том, что для обнаружения экспрессированного белка и для репликации рибонуклеопротеида необходимы лишь белки PB2, PB1, PA и NP вируса гриппа. Еще одно преимущество этой репликационной схемы, приводимой в действие носителем коровьей оспы, состоит в том, что поскольку гриппозные полимеразные белки экспрессируются из кДНК, встроенной в вирус коровьей оспы, мутагенез полимеразных белков становится приемлемым и мощным методом проведения дальнейшего анализа структурно-функциональных взаимосвязей, существующих у вирусных полимеразных белков. Кроме того, в настоящее время предпринимаются попытки спасти инфекционный гриппозный вирус посредством трансфекции смесей воссозданных вирусных рибонуклеопротеидов. Этот подход, если он окажется успешным, позволит легко конструировать определенные рекомбинантные вирусы посредством добавления определенных рибонуклеопротеидов либо природного, либо искусственного происхождения. Эта методика окажется также пригодной для проведения анализа и диссекции репликационных образований у других вирусов с отрицательной цепью.

10. Хранение микроорганизмов в банке данных
Клеточная линия E.coli, содержащая плазмиду pIVACAT, находится на хранении в Собрании сельскохозяйственных исследовательских культур (Национальная научно-исследовательская и справочная лаборатория (NRR)), г. Пеория шт. Иллинойс, США, и имеет следующий инвентарный номер: Штамм Плазмида Инвентарный номер E.coli (DH5a) pIVACAT NRRL B-18540.

Настоящее изобретение не ограничивается по объему описанными специфическими вариантами реализации, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации отдельных аспектов изобретения, и всякие конструкции, вирусы или ферменты, которые являются функционально эквивалентными, находятся в рамках настоящего изобретения. В самом деле, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в настоящем документе, становятся очевидными работающим в этой области специалистам из приведенного выше описания и приложенных чертежей. Такие модификации должны подпадать под приложенные пункты формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Фрагмент рекомбинантной РНК с отрицательной цепью, содержащий сайт связывания, специфичный для РНК-зависимой РНК-полимеразы РНК-ового вируса с отрицательной цепью, функционально связанный с гетерологичной ДНК-последовательностью, представляющей собой комплементарную последовательность соответствующей матричной РНК.

2. Фрагмент по п.1, отличающийся тем, что сайт связывания с РНК-полимеразой получен из 3'-некодирующей фланкирующей последовательности любого из 8 геномных сегментов вируса гриппа.

3. Фрагмент по п.1, отличающийся тем, что сайт связывания с РНК-полимеразой содержит 15 концевых нуклеотидов 3'-концевой последовательности любого из 8 геномных сегментов вируса гриппа.

4. Фрагмент по п.2, отличающийся тем, что 3'-некодирующая фланкирующая последовательность имеет следующую структуру:
5'-CACCCUGCUUUUGC-3'.

5. Фрагмент по п.2, отличающийся тем, что 3'-некодирующая фланкирующая последовательность имеет следующую структуру:
5'-CACCCUGCUUUCUGCU-3'.

6. Фрагмент по п.2, отличающийся тем, что 3'-некодирующая фланкирующая последовательность имеет следующую структуру:
5'-CACCCUGUUUUGCU-3'.

7. Фрагмент по п.2, отличающийся тем, что 3'-некодирующая фланкирующая последовательность имеет следующую структуру:
5'-CACCCUGCUUUUUGC-3'.

8. Фрагмент рекомбинантной РНК с отрицательной цепью, содержащий гетерологичную последовательность РНК, представляющую комплементарную последовательность соответствующей матричной РНК, оперативно связанную с 3'-некодирующей фланкирующей последовательностью любого из 8 сегментов генома вируса гриппа, содержащей сайт связывания с вирусной полимеразой, и с 5'-некодирующей фланкирующей последовательностью любого из 8 сегментов вируса гриппа.

9. Фрагмент по п.8, отличающийся тем, что 5'-некодирующая фланкирующая последовательность содержит первые 22 нуклеотида 5'-концевой последовательности любого из 8 геномных сегментов вируса гриппа.

10. Фрагмент по п.8, отличающийся тем, что 5'-некодирующая фланкирующая последовательность любого из 8 геномных сегментов вируса гриппа имеет следующую структуру:
5'-AGUACAAAGAAGGGUGUUUUUU-3'.

11. Рибонуклеопротеиновый комплекс, содержащий фрагмент рекомбинантной РНК по п.1 формулы и очищенную РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса гриппа.

12. Рибонуклеопротеиновый комплекс, содержащий фрагмент рекомбинантной РНК по п.2 формулы и очищенную РНК-полимеразу вируса гриппа.

13. Комплекс по п. 12, отличающийся тем, что содержит РНК-полимеразу, полученную в результате фракционирования рибонуклеопротеинов вируса гриппа в градиенте концентрации CsCl и очищенную из области градиента со значениями концентрации CsCl 1,5 - 2,0 М.

14. Рибонуклеопротеиновый комплекс, содержащий фрагмент рекомбинантной РНК по п.8 формулы и очищенную РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса гриппа.

15. Комплекс по п. 14, отличающийся тем, что содержит РНК-полимеразу, полученную в результате фракционирования рибонуклеопротеинов вируса гриппа в градиенте концентрации CsCl и очищенную из области градиента со значениями концентрации CsCl 1,5 - 2,0 М.

16. Плазмида PIVACAT1, включающая следующие последовательности в направлении от 5'- к 3'-концу: 22 нуклеотида, происходящие из 3'-конца NS РНК вируса гриппа, линкерную последовательность из 8 нуклеотидов, включающую Bg 1П сайт рестрикции, кодирующую последовательность гена хлорамфениколацетилтрансферазы в негативной полярности, 26 нуклеотидов, происходящих из 3'-конца NS РНК вируса гриппа, операбельно связанные с промотором полимеразы Т7.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23