Способ серологической диагностики туберкулеза у больных с иммунодефицитом

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологической диагностике туберкулеза у больных с иммуннодефицитом. Способ серологической диагностики туберкулеза у пациентов с иммунодефицитом основан на иммуноферментном анализе для определения уровня антител в опытной и контрольной сыворотках к микобактериальному антигену. Дополнительно у больного определяют уровень антител к общему бактериальному антигену, имеющему высокую перекрестную активность с антигенами возбудителей большинства инфекционных заболеваний. При этом постановка реакции с опытной сывороткой и дополнительным контролем осуществляется в том разведении, в котором уровень экстинкции контрольной донорской сыворотки с микобактериальным антигеном соответствует уровню ее экстинкции с общим бактериальным перекрестно реагирующим препаратом. Рассчитывают коэффициент, характеризующий понижение уровня реакции опытной сыворотки по отношению к контрольной при постановке реакции с общим бактериальным антигеном, и уровень реакции повышают путем умножения величины экстинкции опытной сыворотки с микобактериальным антигеном на значение этого коэффициента. Способ позволяет повысить эффективность серологической диагностики туберкулеза у больных с иммунодефицитными состояниями различной природы за счет снижения количества ложноотрицательных результатов.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологической диагностике туберкулеза.

Известен способ серологической диагностики туберкулеза на основании определения уровня антимикобактериальных антител в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе, где в качестве антигена применялся препарат, выделенный из M. H37Rv с молекулярной массой 38, 42, 54 кДа. Положительными считались результаты реакции с опытной сывороткой, превышающие результаты контрольной сыворотки на 3 SD /Khomenko et al. Serodiagnosis of tuberculosis: detection of mycobacterial antigens and antibodies. Tubercle. N 77(6), p. 510-515/. Недостатком этого способа при обследовании больных с иммунологической недостаточностью, несмотря на его высокую специфичность, является то, что в качестве контроля использовалась нормальная сыворотка доноров без иммунных нарушений. Применение данного способа для диагностики туберкулеза у больных с нарушениями иммунитета давало значительное количество ложноотрицательных результатов из-за снижения общего уровня антител в сыворотке больного, причем оценить количественно степень снижения антителообразования у конкретного пациента не представлялось возможным.

Известен и другой способ серологической диагностики туберкулеза, включающий в себя иммуноферментный анализ для определения антител в опытной и контрольной сыворотках по уровню относительной экстинкции, на основании которой судят об уровне положительности реакции у больных с тяжелой психической патологией, часто сопровождающейся иммунодефицитными состояниями /Фишер Ю. Я., Баенский А.В., Федорова И.В. Опыт использования серологических тестов при выявлении туберкулеза у больных с тяжелой психической патологией. Проблемы туберкулеза. N 1, 1996, стр. 19-20/.

В этом случае выявлялся высокий процент ложноположительных результатов, и возникала необходимость дальнейшего клинического обследования больных с подозрением на туберкулез для подтверждения диагноза. Такой метод также малоэффективен при индивидуальных обследованиях, когда требуется верификация диагноза и в то же время выявление у больного иммунодефицита, влияющего на особенности проводимой в дальнейшем специфической противотуберкулезной терапии.

Задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков за счет создания надежного способа серологической диагностики туберкулеза, эффективного при обследовании больных с иммунологической недостаточностью в результате учета снижения антителообразования у больных с иммунодефицитом.

Эта задача достигается посредством того, что в способе серологической диагностики туберкулеза у пациентов с иммунодефицитом, включающем в себя иммуноферментный анализ для определения уровня антител в опытной и контрольной сыворотках к микобактериальному антигену по уровню относительной экстинкции, на основании которой судят о положительности реакции, предложено ввести дополнительный контроль: определение уровня антител к общему бактериальному антигену, имеющему высокую перекрестную активность с антигенами возбудителей большинства инфекционных заболеваний. При этом постановка реакции с опытной сывороткой и дополнительным контролем осуществляется в том разведении, в котором уровень реакции (экстинкция) контрольной донорной сыворотки с микобактериальным антигеном соответствует уровню ее реакции (экстинкции) с дополнительным антигеном - общим бактериальным перекрестно реагирующим препаратом. В случае понижения уровня реакции с этими двумя антигенами рассчитывается коэффициент, характеризующий понижение уровня реакции опытной сыворотки по отношению к контрольной, и уровень положительности реакции повышается путем умножения величины экстинкции опытной сыворотки на значение этого коэффициента.

Способ осуществляется следующим образом.

Планшеты для иммунологических реакций параллельно сенсибилизируются общим перекрестно реагирующим бактериальным антигеном и антигеном, выделенным из M.tuberculosis. Реакцию контрольной сыворотки с микобактериальным антигеном ставят в рабочем разведении и определяют уровень ее экстинкции. Параллельно реакцию этой же сыворотки ставят с общим перекрестно реагирующим антигеном в раститровке и определяют разведение, уровень экстинкции которого соответствует экстинкции этой же сыворотки с микобактериальным антигеном в рабочем разведении. Реакцию опытной сыворотки больного с подозрением на туберкулез ставят также с общим перекрестно реагирующим антигеном в разведении, ранее определенном при раститровке контрольной сыворотки и в рабочем разведении при постановке с микобактериальным антигеном. Рассчитывают коэффициент, характеризующий разницу в экстинкции при определении уровня антител контрольной и опытной сывороток к общему бактериальному перекрестнореагирующему антигену. Экстинкцию опытной сыворотки при постановке реакции с микобактериальным антигеном умножают на величину этого коэффициента. Дополнительная реакция с общим перекрестно реагирующим бактериальным антигеном позволяет выявить уровень снижения антител у больных с иммунодефицитом и значительно уменьшить процент ложноотрицательных результатов при применении способа у данной категории больных. Например, относительная экстинкция контрольной сыворотки с микобактериальным антигеном равна 1,0 в разведении 1: 400, а опытной - 0,7. Такой уровень экстинкции при постановке контрольной сыворотки с общим перекрестнореагирующим антигеном (1,0) достигается в разведении 1 : 1500. При постановке опытной сыворотки с этим антигеном в том же разведении уровень относительной экстинкции составил 0,6. Следовательно, в данном случае имеется снижение уровня реакции за счет уменьшения продукции антител 1,0 : 0,6 в 1,67 раза. За счет этого истинный уровень реакции должен составить 0,7 · 1,66 = 1,16 и она может быть расценена как положительная.

По сравнению с прототипом предложенный способ имеет ряд преимуществ, выражающихся в повышении чувствительности реакции, которые можно проиллюстрировать на следующих примерах.

Пример 1 Больная К. , 1997 г. диагноз: Хроническая почечная недостаточность. Состояние после пересадки почки. Милиарный туберкулез легких. Получала длительную иммуносупрессивную терапию кортикостероидными препаратами, азатиоприном, циклоспорином A. При подозрении на туберкулез легких было проведено определение уровня антимикобактериальных антител в ИФА с антигеном 10 - 14 КдА. Постановка реакции обычным методом показала в рабочем разведении уровень относительной экстинкции 0,4 (в контрольной сыворотке 1.0). Первоначально реакция была расценена как отрицательная. Было проведено дополнительное исследование с общим перекрестно реагирующим антигеном. Показатель относительной экстинкции в данном случае в разведении 1 : 1500 составил 0,3 (контрольной сыворотки 1,0). Коэффициент 1,0:0,3=3,3. Следовательно, предыдущие показания иммуноферментного анализа должны быть увеличены в 3,3 раза за счет наличия снижения продукции антител, подтвержденного во 2-м тесте. В результате истинный уровень реакции по отношению к контрольной сыворотке составил 1,32, и реакция была расценена как положительная. В данном случае имело место резкое снижение уровня продукции специфических антимикобактериальных антител, и поэтому диагностика туберкулеза в ИФА с помощью постановки стандартного теста была невозможна.

Пример N 2 Больной К., 1996 г. Диагноз: Хроническая почечная недостаточность. Состояние после пересадки почки. Подозрение на туберкулезный плеврит. Получал длительную (более 3 лет) иммуносупрессивную терапию кортикостероидами, азатиоприном. При постановке реакции для обнаружения антимикобактериальных антител в иммуноферментном анализе коэффициент составил 1,1, в результате чего она была расценена как сомнительная. При постановке реакции с перекрестно реагирующим бактериальным антигеном уровень реакции составил 0,74. Следовательно, уровень положительности реакции за счет снижения продукции антител должен быть уменьшен до 1,0 : 0,74, т.е. в 1,35 раза. В результате истинный уровень реакции составил 1,1 · 1,35 = 1,45, и она была расценена как положительная. Диагност плеврита туберкулезной этиологии подтвержден положительными результатами посева плевральной жидкости на БК и эффективностью специфической терапии.

Пример N 3 Больной Р., 1997 г. Диагноз: Сахарный диабет, I тип. Диабетическая нефропатия. Хроническая почечная недостаточность. Состояние на программном гемодиализе. Подозрение на туберкулезный плеврит. Не получал иммуносуппресивных препаратов. При постановке иммуноферментного анализа для определения уровня антимикобактериальных антител уровень реакции составил 1,56 по сравнению с контрольной сывороткой (1,0). При постановке реакции с общим перекрестно реагирующим бактериальным антигеном уровень экстинкции составил 0,85 по сравнению с контролем (1,0). Следовательно, истинное значение реакции было понижено за счет иммунодефицитного состояния, связанного с сахарным диабетом и терминальной хронической почечной недостаточностью, в 1,0 : 0,85 = 1,19 раза и должно было составлять 1,56 · 1,19 = 1,85, и реакция должна быть расценена как резко положительная. Диагноз туберкулеза подтвержден данными комплексного клинического и микробиологического обследования.

Данный способ позволяет повысить эффективность серологической диагностики туберкулеза у больных с иммунодефицитными состояниями различной природы за счет снижения количества ложноотрицательных результатов, в итоге предоставляется возможность раннего установления диагноза, повышается эффективность специфического лечения, и соответственно снижается летальность и сокращаются сроки пребывания больных в стационаре.

Формула изобретения

Способ серологической диагностики туберкулеза у больных с иммунодефицитом, включающий в себя иммуноферментный анализ для определения уровня антител в контрольной и опытной сыворотках к микобактериальному антигену по уровню относительной экстинкции, на основании которой судят о положительности реакции, отличающийся тем, что после определения экстинкции контрольной сыворотки с микобактериальным антигеном дополнительно ставят реакцию этой же сыворотки с общим перекрестнореагирующим бактериальным антигеном и уровень экстинкции ее доводят до уровня реакции с микобактериальным антигеном, затем опытную сыворотку ставят в этом же разведении с общим бактериальным антигеном, измеряют величину относительной экстинкции опытной сыворотки, после чего определяют коэффициент, соответствующий разнице в относительной экстинкции между контрольной и опытной сыворотками при постановке реакции с общим бактериальным антигеном, и при постановке реакции опытной сыворотки с микобактериальным антигеном повышают уровень положительности реакции с учетом этого коэффициента.