Аналитический набор

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения в крови концентрации лекарственных средств без предварительной экстракции. Способ анализа для определения иммунофилин-связывающего фармацевтического препарата заключается в добавлении к исследуемому образцу связывающего конкурента, вытесняющего определяемый препарат из иммуносупрессант-иммунофилиновых комплексов крови. Кроме указанного, добавляют рецептор, связывающийся с фармацевтическим препаратом и в незначительной степени со связывающим конкурентом. Выделяют образовавшийся комплекс (рецептор - фармацевтический препарат) и определяют в нем количество фармацевтического препарата. Аналитический набор для определения концентрации иммунофилин-связывающего фармацевтического препарата содержит связывающий конкурент и рецептор. При этом для определения концентрации циклоспорина, FK506 или рапамицина набор в качестве конкурента может содержать соответственно [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10] -циклоспорин, рапамицин или FK506-соединение. В качестве рецептора набор содержит соответствующее моноклональное антитело. Использование набора позволяет устранить стадию экстрации при определении иммунофилин-связывающего фармацевтического препарата в крови, увеличив тем самым простоту способа и его точность. 3 с. и 9 з.п.ф-лы, 1 табл.

Изобретение касается способа проведения анализа и набора для использования при определении уровней лекарственных веществ в крови без ее экстракции в присутствии специфических связывающих протеинов. Данный анализ особенно удобен для определения кровяных уровней иммунофилин-связывающих лекарств, например циклоспоринов, рапамицинов или FK506 соединений.

Циклоспорины охватывают класс структурно определенных циклических поли-N-метилированных ундекапептидов, обычно обладающих иммуносупрессивной, противовоспалительной) антивирусной и/или антипаразитической активностью, каждой в большей или меньшей степени. Первым из циклоспоринов, который был идентифицирован, был грибной метаболит Циклоспорин А, или Циклоспорин, а его структура приведена в Merck Index, 11-е изд.; Merck & Co., Inc.; Rahway, Нью Джерси, США (1989) под номером 2759. Идентифицированными позднее циклоспоринами были циклоспорины B, C, D и G, которые также внесены в Merck Index под номером 2759. Известно также большое число синтетических аналогов, и характерные примеры приведены в патентах EP 296123, EP 484281 и GB 2222770.

Рапамицин представляет собой макролидный иммуносупрессант, вырабатываемый Streptomyces higroscopicus, и который, как было обнаружено, является фармацевтически полезным при самых разнообразных применениях, особенно в качестве иммуносупрессанта для использования в лечении и предотвращении отторжения трансплантированного органа и аутоиммунных заболеваний. Структура рапамицина приведена в работе Kesseler, Н., с сотр.; 1993: Helv. Chim. Acta: 76: 117. Было синтезировано большое число производных рапамицина, включая, например, некоторые ацил- и аминоацил-рапамицины (например, пат. США 4316885, пат. США 4650803 и пат. США 5151413), 27-десметил-рапамицин (WO 92/14737), 26-дигидро-рапамицин (пат. США 5138051), некоторые производные пиразола (пат. США 5164399), некоторые производные алкоксиэфиров (пат. США 5233036) и 40-O-алкилированные производные (WO 94/09010). Рапамицин и его структурно подобные аналоги и производные в данном изложении объединены под названием рапамицины.

FK506 представляет собой макролидный иммуносупрессант, который вырабатывается Streptomyces tsukubaensis N 9993. Структура FK506 приведена в приложении к Merck Index как пункт A5. Известно также большое число родственных соединений, которые сохраняют базовую структуру и иммунологические свойства FK506. Эти соединения описаны во многих публикациях, например EP 184162, EP 315973, EP 323042, EP 423714, EP 427680, EP 465426, EP 474126, WO 91/13889, WO 91/19495, EP 484936, EP 532088, EP 532089, WO 93/5059 и т.п. В данном изложении эти соединения объединены под названием "FK506~соединения".

Благодаря своим исключительно полезным фармацевтическим свойствам, циклоспорины (и в особенности Циклоспорины A и G), рапамицины и FK506-соединения имеют широкое применение, например, для предотвращения отторжения трансплантата и в лечении аутоиммунных заболеваний. Однако эти соединения дают побочные эффекты при применении в больших дозах, и потому их концентрацию в крови нужно поддерживать в определенных терапевтических пределах. Биопригодность и скорости метаболического превращения имеют тенденцию быть специфическими для каждого пациента, и, следовательно, дозировка является специфической для каждого пациента. Поэтому необходимо измерять концентрацию этих иммуносупрессантов в крови через регулярные интервалы.

Были разработаны определенные способы проведения анализов, основанные на жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД), но они либо громоздки при использовании, либо недостаточно специфичны. Для циклоспорина А и FK506 были созданы специальные моноклональные антитела и способы анализов, основанные на этих полученных антителах. Однако, все способы анализов, предложенные до настоящего времени, требуют сначала экстракции пробы крови или плазмы растворителем (таким как метанол), который затем удаляют испарением или разбавлением. После этого к пробе добавляют антитело и проводят радиоиммунный анализ (РИА). Способ проведения анализов, основанный на специфическом моноклональном антителе, работает хорошо, но необходимость стадии экстракции и последующего удаления растворителя может привести к тому, что анализ станет менее чувствительным и менее точным, если не принять мер предосторожности. Поэтому проводить данный анализ должен квалифицированный специалист, и проведение анализа требует значительного времени.

Следовательно, учитывая важность циклоспоринов, рапамицидов и FK506-соединений как фармацевтических средств, необходим простой, чувствительный анализ для определения их концентрации в крови.

В соответствии с этим настоящее изобретение предлагает способ анализа для определения концентрации связывающего иммунофилин соединения в крови, включающий добавление связывающего иммунофилин конкурента, который вытесняет фармацевтический препарат из комплексов иммуносупрессант-иммунофилин в крови; добавление рецептора, который связывает фармацевтический препарат, и лишь в незначительной степени связывает конкурент; выделение комплекса рецептор-фармацевтический препарат из пробы; определение количества фармацевтического препарата.

Было установлено, что доля циклоспорина, рапамицина или FK506-соединения, присутствующих в крови, существует в форме комплекса фармацевтический препарат-иммунофилин. Если фармацевтический препарат вытесняют из комплекса, используя связывающий конкурент, тогда нет необходимости экстрагировать пробу крови, используя метанол, и следовательно, недостатки, связанные с метанольной экстракцией и его удалением, устранены. Полученный в результате способ анализа дает точные результаты, прост и является удивительным прорывом в анализировании циклоспоринов, рапамицинов или FK506-соединений. Например, при этом способе анализа возможно определить такие низкие концентрации как 0,7 нг (циклоспорин А)/мл (цельной крови) с коэффициентом вариации менее 30%. Это намного лучше, чем коммерчески доступный способ анализа циклоспорина А.

Иммунофилины - это семейство внутриклеточных связывающих протеинов, которые связывают циклоспорины, рапамицины или РК506-соединения. В настоящее время известны два различных семейства иммунофилинов: циклофилины, которые связывают циклоспорины, и макрофилины, которые связывают рапамицины и FK50 6-соединения. Структуры некоторых иммунофилинов описаны Walkinshaw с сотр., 1992: Тransplantation Proceedinqs, 24, 4(2), 8-13. Специфическими примерами являются циклоспорин А и макрофилин-12 (часто известный как FKBP-12).

Количество связывающего конкурента, которое используют для вытеснения фармацевтического препарата из комплекса иммунофилин-фармацевтический препарат, вероятно, меняется от одного фармацевтического препарата к другому, и от одного связывающего конкурента к другому. Однако в каждом случае оптимальные границы можно легко определить проведением процедуры анализа при нескольких концентрациях (включая контрольный опыт) фармацевтического препарата и при нескольких концентрациях связывающего конкурента. Затем пробы разбавляют два или три раза и анализ проводят снова для каждого разбавления. Затем сравнивают чувствительность испытаний и отбрасывают те концентрации связывающего конкурента, которые показывают пониженную чувствительность.

Рецептором, который распознает связывание с фармацевтическим препаратом, может быть любое специфически связывающее соединение, которое используют в обычных анализах, например поликлональные, моноклональные или рекомбинантные антитела, фрагменты антител или молекулярно импринтированные полимеры (например, как описывает Vlatakis с сотр., (1993) Nature, 361:645), предпочтительно моноклональное антитело.

Как только фармацевтический препарат освобожден из комплекса фармацевтический препарат-иммунофилин, количество этого препарата, связанного с рецептором, можно определить, используя любой способ анализа, предпочтительно анализ, основанный на моноклональном антителе, например, конкурентный анализ, измеряющий способность фармацевтического препарата конкурировать за связывание с антителом или рецептором, или неконкурентный анализ. Предпочтительно используют конкурентный анализ, например меченый фармацевтический препарат (индикатор) как конкурент для данного антитела, в присутствии или в отсутствие испытуемого образца. Индикатор может быть помечен меткой, пригодной для регистрации, например регистрации радиоактивности, флуоресценции, люминесценции или колориметрии, как это принято в технике. В качестве альтернативы конкурентом рецептору может быть немеченный фармацевтический препарат (возможно для выращивания антитела используют фармацевтический препарат-протеин иммуногенный конъюгат), нанесенный на поверхность испытательной камеры, например в твердофазном ферментном анализе (ELISA) или в системе, где антитело для фармацевтического препарата само является меченым. Антитело или рецептор могут быть свободными в анализируемом растворе или покрывать стенки испытательной камеры, в зависимости от используемой системы анализа. В конкурентном анализе регистрируемые данные (например количество индикатора, связанного с антителом или рецептором) обычно обратно пропорциональны количеству фармацевтического препарата в испытуемом образце. Как обычно, можно использовать для стандартизации анализа стандартные растворы, содержащие известные концентрации фармацевтического препарата.

Когда мы упоминаем рецептор, который присоединяется к фармацевтическому препарату и, в незначительной степени, к конкуренту связывания, мы имеем в виду, что протяженность перекрестной реактивности рецептора между фармацевтическим препаратом и конкурентом связывания недостаточна для значительного влияния на чувствительность анализа. Точное количество перекрестной реактивности между конкурентом связывания и фармацевтическим препаратом (и/или конкурентом связывания и индикатором в конкурентном анализе), которое может быть допустимым, конечно меняется в определенной степени в зависимости от относительного сродства конкурента связывания к иммунофилину по сравнению с фармацевтическим препаратом: чем выше сродство, тем ниже концентрация, требующаяся для вытеснения фармацевтического препарата, и тем больше рецепторная перекрестная реактивность, которая, следовательно, может быть допустимой без влияния на точность анализа. На практике, значение перекрестной реактивности лучше всего оценивать сравнением стандартных кривых, используя разные количества связывающего конкурента; как только минимальная концентрация связывающего конкурента, требующаяся для вытеснения фармацевтического препарата, достигнута, стандартные кривые не должны значительно меняться, по мере того как концентрация конкурента связывания увеличивается до высшего уровня, предусмотренного для использования в данном анализе, тем самым демонстрируя, что любая перекрестная реактивность с антителом является несущественной в контексте данного анализа (если перекрестная реактивность с антителом существует, присутствие высокой концентрации конкурента связывания будет стремиться завышать наблюдаемые измерения уровня медикамента, так как в анализе измеряли бы медикамент плюс конкурент связывания). Значение любой вариации между стандартными кривыми в присутствии и в отсутствие связывающего конкурента можно оценить, используя стандартные статистические методы, например t-тест. Как указание, однако, поскольку связывающий конкурент обычно присутствует в значительно более высокой концентрации, чем фармацевтический препарат в исследуемом образце, рецепторная перекрестная реактивность между фармацевтическим препаратом и связывающим конкурентом должна быть, например, ниже 1%, предпочтительно ниже 0,1%, как измерено в конкурентном анализе в буфере.

В одном воплощении настоящего изобретения, фармацевтический препарат представляет собой циклоспорин, а связывающий конкурент представляет собой аналог циклоспорина, который связывает циклофилин. Предпочтительно, когда связывающим конкурентом является [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-Циклоспорин, который описан в EP 296123 и который конкурентно связывает циклофилин А. Предпочтительно, когда рецептор является циклоспориновым специфическим моноклональным антителом, например как описано в WO 86/2080. Примерами циклоспоринов являются иммуносупрессанты циклоспорин A и циклоспорин G, и анти-HIV-репликационное соединение [MeIle4]-Циклоспорин, предложенный в EP 484 281.

В тех случаях, когда для измерения циклоспорина используют конкурентный анализ, конкурентом для рецептора может быть циклоспорин, связанный со стенкой испытательной камеры (например циклоспорин-протеиновый конъюгат, как описано в WO 86/2080), или меченый циклоспорин (индикатор), например 1) радиоактивный меченый циклоспорин, например меченый тритием дигидроциклоспорин A, или 2) меченое производное [Thr2]-Циклоспорина, [(D)Lys8] -Циклоспорина или [0-2-гидроксиэтил(D)Ser8]-Циклоспорина, например производное, имеющее метку, которая способна давать флуоресцентный, люминесцентный или колориметрический сигнал, например, производные дансила или биотинила, например [-N-биотинил(D)Lys8]-Циклоспорин или[0-(2- биотитилоксоэтил)Thr2]-Циклоспорин. Такие меченые циклоспорины обычно готовят как описано в WO 86/2080, или используя один из многочисленных наборов для меченых соединений, которые имеются в продаже, например от Sigma или Amersham.

Особенно предпочтительный метод для измерения уровней циклоспорина включает покрытие стенок испытательной камеры (например микротитрационного планшета) Циклоспорин-специфическим моноклональным антителом (например посредством покрытия этой камеры козьим антимышиным антителом, а затем созданием возможности Fc-участку Циклоспорин-специфического моноклонального антитела присоединиться к данному козьему антимышиному антителу таким образом, чтобы область связывания Циклоспоринового антитела была свободна). Испытуемый образец (например кровь пациента), конкурент связывания (например, [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]- Циклоспорин), и меченый (например биотин-меченый) циклоспориновый индикатор (например [О-(2-биотинилоксиэтил)Thr2]-Циклоспорин) затем соединяют в испытательной камере и инкубируют в течение фиксированного времени. Период инкубации достаточен, чтобы позволить антителу связаться с фармацевтическим препаратом и индикатором, например по меньшей мере один час, предпочтительно по меньшей мере два часа. Затем испытательную камеру ополаскивают. Уровень связанного индикатора измеряют обычными способами в зависимости от типа использованной метки; биотиновую метку можно распознать, например, используя коммерческий набор со стрептавидином (бактериальный протеин с сильным сродством к биотину), присоединенным к ферменту, например пероксидазе хрена обыкновенного, который расщепляет субстрат с образованием флуоресцентных, люминесцентных или колориметрических эффектов, отмечаемых в показаниях приборов.

В другом воплощении настоящего изобретения фармацевтический препарат представляет собой FK506-соединение) например FK506, а конкурент связывания представляет собой соединение, которое присоединяется к макрофилину 12. Может быть использовано любое подходящее связывающее макрофилин 12 соединение, которое способно вытеснить FK506-соединение. Рапамицин конкурирует с FK506 за связывание с макрофилином 12, и предпочтительно используется в качестве конкурента связывания. Подходящие антитела FK506-соединений могут быть использованы для детектирования; предпочтительно специфические антитела, например как описано в ЕР-А 0293892. В том случае, когда используют конкурентный анализ, конкурентом за данное антитело может быть какое-то FК506-соединение, связанное с аналитическим планшетом, или, предпочтительно, меченое производное FK506, например радиоактивное производное, например меченый тритием FK506, или другое меченое производное, например POD-FK506 (описанное как POD-меченый FR-900506 в EP-А 0293392).

В третьем воплощении данного изобретения фармацевтическое производное представляет собой рапамицин, например Рапамицин или 40-0-гидроксиэтил-рапамицин (WO 94/09010), а конкурентом связывания является соединение, которое присоединяется к макрофилину 12. Может быть использовано любое подходящее, связывающее макрофилин 12 соединение, которое способно вытеснить рапамицин. FK506 конкурирует с рапамицином за связывание с макрофилином 12, и его предпочтительно используют в качестве конкурента связывания. Рецептор предпочтительно представляет собой рапамицин-специфическое моноклональное антитело. [Замечание: моноклональное антитело, селективное для рапамицина, не было описано в литературе. Тем не менее, мы получили высокоселективное антитело, используя стандартный метод Koehler-Milstein, в котором данное антитело является иммуногенным конъюгатором рапамицина, например каким-то рапамицином, присоединенным к иммуногенному протеину через одну из гидроксигрупп рапамицина, предпочтительно через гидроксигруппу, расположенную в циклoreксильной части рапамицина (положение 40 Рапамицина) или гидроксигруппу, соответствующую положению 28 в Рапамицине. Этот рапамицин присоединяют к данному протеину, сначала делая рапамицин несущим активированную соединяющую группу, а затем присоединяя активированный рапамицин к данному протеину. Активированная соединяющая группа - это группа, способная к прямой реакции с протеином с образованием ковалентной связи, не требуя использования соединяющего агента (например карбодиимидных реагентов) для того, чтобы сделать возможной, осуществить или начать реакцию с протеином). Например, 40-0-активированный рапамицин О-ацилируют, используя янтарный ангидрид в присутствии ДМАА и пиридина с образованием рапамицин полусукцината (40-0-(3-карбокси)пропионил-рапамицина), который затем активируют N-гидроксисукцинимидом в присутствии EDX, Et3N и CH2Cl2 с образованием сукцинилимидоксисукцинилрапамицина 40-0-(3-карбокси)пропионил-рапамицин N-гидроксисукцинимид эфир). 28-0-активированный рапамицин получают аналогично, сначала защитив 40-гидроксигруппу, затем присоединяют данный протеин с получением 28-0-связанного иммуногенного конъюгата) который можно использовать для получения антитела, имеющего специфичность, отличающуюся от полученной при использовании 40-0-связанного конъюгата, например высокочувствительного к различиям в циклогексильной части рапамицина. В случае использования конкурентного анализа конкурентом за антитело может быть рапамицин, связанный с аналитическим планшетом, или, предпочтительно, меченый рапамицин, например рапамицин с флуоресцентной меткой, полученный, например, взаимодействием активированного рапамицина, как описано ранее, с метящей группой, например биотином или дансилом, или сведением радиоактивной метки в рапамицин, например трития.

Способ анализа в соответствии с настоящим изобретением обладает теми преимуществами, что анализ можно провести быстро и просто, используя стандартное биоаналитическое оборудование с получением точных и воспроизводимых результатов. Кроме того, можно использовать цельную кровь без необходимости экстракции.

Настоящее изобретение предлагает также аналитический набор, пригодный для детектирования количества иммунофилин-связывающего фармацевтического препарата в крови, набор, включающий связывающий конкурент, который вытесняет данное фармацевтическое соединение из комплексов фармацевтический препарат-иммунофилин в крови; и антитело, которое связывает фармацевтический препарат и лишь в незначительной степени связывающий конкурент.

Предпочтительно, когда это антитело представляет собой моноклональное антитело, которое является специфическим для фармацевтического препарата.

Если фармацевтическим препаратом является циклоспорин, то связывающим конкурентом может быть аналог циклоспорина, который присоединяют к циклоспорину. Предпочтительно, когда связывающий конкурент представляет собой [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-Циклоспорин. Предпочтительно, когда это антитело представляет собой Циклоспорин-специфическое моноклональное антитело, как описано в WO 86/2080.

Если фармацевтический препарат является FК506-соединением или рапамицином, то связывающим конкурентом может быть рапамицин или FK506, соответственно, или аналог, который связывает макрофилин 12. Может быть использовано любое антитело, подходящее FК506-соединению или соединению рапамицина; предпочтительно специфические антитела, например полученные как описано ранее для рапамицина, или как описано в EP-A 0293892.

Далее, набор может содержать соответствующим образом меченый индикатор, стандарт и инструкции по применению. Метка для индикатора может быть любой подходящей меткой, например радиоактивной, флуоресцентной или колориметрической меткой. Где это удобно, компоненты набора могут находиться в лиофилизированной форме.

Наконец, в дальнейшем воплощении, данное изобретение предлагает новое использование для иммунофилин-связывающего соединения в качестве конкурента связывания иммунофилина в аналитическом наборе или в способе измерения кровяных уровней другого иммунофилин-связывающего соединения, например использование [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-Циклоспорина в аналитическом наборе или способе измерения кровяных уровней циклоспорина; использование Рапамицина в аналитическом наборе или в способе измерения кровяных уровней FK506-соединения; и использование FK506 в аналитическом наборе или способе измерения кровяных уровней рапамицина.

Далее описаны примеры настоящего изобретения путем демонстрации примеров, а не ограничений. Специалисту будет понятно, что отклонения в точных концентрациях реагентов и условий реакции допустимы, пока эти отклонения повторяются от анализа к анализу. Другие аналитические системы, использующие связывающий конкурент для вытеснения фармацевтического препарата из комплекса иммунофилин-фармацевтический препарат, рассматривают как входящие в сферу данного изобретения; как только фармацевтический препарат освобожден из связывающего иммунофилин-фармацевтический препарат комплекса, его можно, конечно, измерить любым удобным способом.

Пример 1 - Анализ Циклоспорина А.

Калибровочные образцы: 16 мкг Циклоспорина A добавляют к 1 мл 70%-ного по объему водного раствора этанола и хранят при 4oC. 50 мкл раствора Циклоспорина A разбавляют в 1 мл человеческой крови (полученной из Blutspendezentrum Basel) с получением раствора Циклоспорина А концентрации 800 нг/мл. Затем готовят калибровочные образцы концентраций 400 нг/мл, 200 нг/мл, 100 нг/мл, 50 нг/мл, 25 нг/мл, 12,5 нг/мл, 6,2 нг/мл, 3,1 нг/мл, 1, 6 нг/мл, 0,8 нг/мл и 0,4 нг/мл, последовательно разбавляя 500 мкл раствора Циклоспорина А в 1 мл человеческой крови. В качестве контрольного приготовляют образец крови без Циклоспорина A.

Кондиционированные титрационные микропланшеты. Каждая лунка нескольких титрационных микропланшетов на 96 лунок покрыта 100 мкл козьего антимышиного антитела (GaM lgG Fc неконъюгированный, Pierce 31170), разбавленного до 10 мкг/мл в фосфатном буферном физиологическом растворе (ФБФР). Титрационные микропланшеты инкубируют в течение ночи при 4oC, Козье антимышиное антитело отбрасывают, и добавляют в каждую лунку 200 мкл блокирующего раствора (2 г альбумина бычьей сыворотки в 100 мл ФБФР). Титрационные микропланшеты инкубируют в течение 2 ч и затем моют в планшетомойке, используя 3х300 мкл раствора ФБФР/Tween 20 (0,5 г Tween в 1 л ФБФР). Кондиционированные титрационные микропланшеты хранят при 4oC.

Планшет антитела: 1 мл раствора ФБФР/Tween 20 добавляют в сосуд с Циклоспорин А -специфическим моноклональным антителом в лиофилизированной форме. Данное антитело описано в WO 86/2080 и составляет часть коммерчески доступного набора Sandimmun@. Затем раствор антитела разбавляют 1:10 раствором ФБФР/Tween 20 и пипетируют 100 мкл в выбранные лунки кондиционированного титрационного микропланшета. В оставшиеся лунки пипетируют 100 мкл раствора ФБФР/Tween 20. Титрационный микропланшет инкубируют в течение ночи при 4oC.

Индикатор циклоспорина. Пробирку, содержащую 1 мл радиоактивного дигидрогенированного Циклоспорина А в 96%-ном по объему водном растворе этанола получают из коммерчески доступного набора Sandimmun@. Раствор конкурента: 4,2 мг [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-Циклоcпopинa, полученного как описано в EP 296123, растворяют в 1 мл метанола и хранят при 4oC.

125 мкл каждого калибровочного образца (включая контрольный) пипетируют в лунку некондиционированного титрационного микропланшета. 125 мкл испытуемых образцов крови пипетируют в каждую из оставшихся лунок. В каждую лунку добавляют 100 мкл раствора ФБФР/Tween 20 и 25 мкл индикатора циклоспорина. Титрационный планшет встряхивают в течение 5 мин и затем инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавляют в каждую лунку 3 мкл раствора конкурента, титрационный планшет встряхивают в течение 5 мин, и обработанные калибровочные образцы и обработанные образцы крови инкубируют в течение ночи при 4oC.

Планшет с антителом промывают 3 раза по 300 мкл раствора ФБФР/Tween 20 и в каждую лунку добавляют 100 мкл обработанного калибровочного образца или обработанного образца крови. Титрационный планшет инкубируют в течение 3 ч при 4oC, и затем промывают 3 раза в 300 мкл раствора ФБФР/Tween 20. В каждую лунку добавляют 100 мкл раствора, полученного растворением 1 г додецилсульфата натрия в 100 мл воды, титрационный планшет встряхивают в течение 5 мин при комнатной температуре и затем инкубируют в течение 5 мин при 37 °С, Затем 100 мкл раствора из каждой лунки анализируют, используя жидкостный сцинтилляционный анализатор Packard 2000CA.

По результатам, полученным из калибровочных образцов, строят калибровочную кривую. Эта кривая представлена как процент связывания антитело-индикатор, в сравнении с контрольным опытом, против логарифма концентрации Циклоспорина A.

Коэффициент вариации для этих результатов меньше 30% в границах от 0,7 нг Циклоспорина А/мл крови до 400 нг Циклоспорина А/мл крови. Этот рабочий интервал показывает, что высокая точность может быть получена даже при очень низких концентрациях.

Воспроизводимость данного анализа подтверждается повторением. 100 нг и 400 нг Циклоспорина A каждый вновь введен в 1 мл человеческой крови с получением концентраций 100 нг/мл и 400 нг/мл. Каждый образец анализировали четырежды, используя методику, описанную в примере 1 для определения концентрации. Эти результаты приведены в табл.1 (в конце описания).

Для 100 нг/мл общее среднее значение составляет 97,6 нг/мл, давая среднее отклонение 2,4%. Для 400 нг/мл общее среднее значение составляет 417,6 нг/мл, давая среднее отклонение 4,4%.

Эти результаты показывают, что высокая степень точности достижима постоянно.

Пример 2 - FK506-анализ.

Приготовление титрационного микропланшета. Каждую лунку покрывают 100 мкг/мл козьего антикроличьим антителом в фосфатно-буферном физиологическом растворе (ФБФР). Титрационные планшеты инкубируют в течение ночи при 4oC. Козье антикроличье антитело отбрасывают и добавляют в каждую лунку 200 мкл блокирующего раствора (2 г бычьего сывороточного альбумина растворяют в 100 мл ФБФР). Титрационные планшеты инкубируют в течение 2 ч при 37oC и затем моют в планшетомойке, используя 3 раза по 300 мкл раствора ФБФР/Tween 20 (0,5 r Tween 20 в 1 л ФБФР). Титрационные микропланшеты хранят при 4oC.

В каждую лунку добавляют 100 мкл кроличьего анти-FK506 антитела, разбавленного в 1000 раз раствором ФБФР/Tween 20. Титрационный микропланшет инкубируют в течение ночи при 4oC.

Калибровочные образцы. FK506 разбавляют либо в человеческой цельной крови, либо в ФБФР/Tween 20 до концентраций 200 мкг/мл, 20 мкг/мл и 2 мкг/мл. Приготовляют также, как контрольный, кровяной образец без FK506.

Раствор конкурента. Меченый тритием FK506 разбавляют для получения 10000 импульсов в минуту в 25 мкл.

Анализ. 125 мкл калибровочного образца в цельной крови или в буфере добавляют и смешивают со 100 мкл раствора ФБФР/Tween 20, содержащими 50, 10, 1 и 0 мкг/мл Рапамицина. В каждую лунку добавляют 25 мкл раствора конкурента. Титрационный планшет инкубируют в течение 3 ч при 4oC и затем трижды промывают по 300 мкл раствора ФБФР/Tween 20. В каждую лунку добавляют 100 мкл раствора, полученного растворением 1 г додецилсульфата натрия в 100 мл воды, и титрационный планшет встряхивают в течение 5 мин и затем инкубируют в течение 15 мин при 37oC. Из каждой лунки отбирают 100 мкл раствора и затем анализируют, используя жидкостный сцинтилляционный анализатор Packard 2000 CA.

Результаты. Анализ, использующий образцы в буфере, дает подобные стандартные кривые с разной концентрацией рапамицина в качестве агента вытеснения. Этот результат показывает, что кроличье анти-FK506 антитело не проявляет перекрестного реагирования с рапамицином.

Анализ, использующий образцы в цельной крови, дает очень слабый сигнал, если не используют Рапамицин в качестве агента вытеснения, так как FK506 связан с протеинами связывания, содержащимися в цельной крови и недоступными для взаимодействия с антителом. В том случае, когда в качестве конкурента связывания макрофилина добавляют Рапамицин, полученные стандартные кривые подобны кривым, полученным в буфере.

Формула изобретения

1. Способ анализа для определения концентрации иммунофилин-связывающего фармацевтического препарата в крови, при котором добавляют связывающий конкурент, который вытесняет этот фармацевтический препарат из иммуносупресант-иммунофилиновых комплексов в крови: добавляют рецептор, который связывается с данным фармацевтическим препаратом и лишь в незначительной степени со связывающим конкурентом; выделяют этот комплекс рецептор - фармацевтический препарат из образца и определяют количество данного фармацевтического препарата.

2. Способ анализа по п.1, отличающийся тем, что иммунофилин-связывающим фармацевтическим препаратом является циклоспорин, связывающим конкурентом является (Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10) -циклоспорин и рецептор представляет собой моноклональное антитело.

3. Способ анализа по п.1, отличающийся тем, что иммунофилин - связывающий препарат представляет собой FK506, связывающий конкурент представляет собой рапамицин и рецептор представляет собой моноклональное антитело.

4. Способ анализа по п.1, отличающийся тем, что иммунофилин-связывающим фармацевтическим препаратом является рапамицин или 40 - гидроксиэтил-рапамицин, связывающим конкурентом является FK506 и рецептор представляет собой моноклональное антитело.

5. Аналитический набор для детектирования количества иммунофилин-связывающего фармацевтического препарата в крови, включающий в себя конкурент, который вытесняет фармацевтический препарат из комплексов фармацевтический препарат-иммунофилин в крови, и рецептор, который связывается с фармацевтическим препаратом и лишь в незначительной степени со связывающим конкурентом.

6. Аналитический набор по п.5, отличающийся тем, что иммунофилин-связывающий фармацевтический препарат является циклоспорином, связывающий конкурент является (Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10) -циклоспорином и рецептор представляет собой моноклональное антитело.

7. Аналитический набор по п.5, отличающийся тем, что иммунофилин-связывающий фармацевтический препарат представляет собой FK506, связывающий конкурент является рапамицином и рецептор представляет собой моноклональное антитело.

8. Аналитический набор по п.5, отличающийся тем, что иммунофилин-связывающий фармацевтический препарат представляет собой рапамицин или 40-гидроксиэтил-рапамицин, связывающий конкурент представляет собой FK506 и рецептор представляет собой моноклональное антитело.

9. Применение иммунофилин-связывающего соединения в качестве иммунофилин-связывающего конкурента в аналитическом наборе или способе измерения кровяных уровней другого иммунофилин-связывающего соединения.

10. Применение по п.9 (Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10) -циклоспорина в аналитическом наборе или способе измерения кровяных уровней циклоспорина.

11. Применение по п.9 рапамицина в аналитическом наборе или способе измерения кровяных уровней FK506-соединения.

12. Применение по п.9 FK506 в аналитическом наборе или способе измерения кровяных уровней рапамицина.

РИСУНКИ

Рисунок 1



 

Похожие патенты:

Биосенсор // 2138041
Изобретение относится к медицинской технике, а именно к средству для определения ионов тяжелых металлов

Изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням, и предназначено для определения целесообразности использования эмоксипина при лечении больных токсической дифтерией
Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии
Изобретение относится к медицине, в частности к комбустиологии и может быть использовано для лечения больных с тяжелыми ожогами

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в неотложной хирургии у больных пожилого возраста с механическими желтухами

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики воспалительных заболеваний бронхо-легочной системы (БЛС)

Изобретение относится к новой улучшенной композиции альфа-интерферона, характеризующейся специфической активностью, чистотой свыше 95%, и которая при использовании для человека характеризуется значительным уменьшением побочных эффектов, обычно связанных с композициями альфа-интерферона

Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии, и может быть использовано при диагностике и лечении облысения, в частности гнездной алопеции

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и предназначено для оценки тяжести течения инфаркта миокарда

Изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к прижизненной и постмортальной диагностике дифтерийной инфекции

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам диагностики аутоиммунных заболеваний и может быть использовано в ветеринарии, птицеводстве и медицине

Изобретение относится к конъюгантам иммуноглобулина, способу их получения и использованию
Наверх