Контрастные вещества для ультразвуковой эхографии, контрастные средства, содержащие эти вещества, и способы их приготовления

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается инъецируемых веществ для ультразвуковой эхографии. Изобретение заключается в том, что контрастные вещества в форме микропузырьков или полых микрошариков, содержащих по меньшей мере два биосовместимых веществ А и B, газообразных, при температуре тела образующих смесь, которая в суспензии с обычными поверхностно-активными веществами, добавками и стабилизаторами обеспечивает эффективные контрастные средства для ультразвуковой эхографии. По меньшей мере один из компонентов (В) в смеси является газом, мол. масса которого больше 80 Дальтон и растворимость которого в воде ниже 0,0283 мл на мл воды при стандартных условиях. Присутствие первого компонента (В) в контрастном веществе может изменяться от 0,5 до 41 об.%. Другой компонент (А) контрастного вещества является газом или смесью газов, мол. масса которых ниже 80 Дальтон. Второй компонент присутствует в количестве от 59 до 99,5 об.%, предпочтительно выбран из кислорода, воздуха, азота, диоксида углерода или их смесей. Изобретение также относится к способу приготовления контрастного вещества для ультразвуковой эхографии, контрастному средству, к набору, содержащему контрастное средство. Изобретение обеспечивает возможность получения очень эффективных контрастных веществ, обеспечивающих ясные изображения, и является стойкими после инъекции. 7 с. и 17 з.п. ф-лы, 7 табл., 6 ил.

Область техники Изобретение относится к контрастным веществам для ультразвуковой эхографии и инъецируемым ультразвуковым контрастным средствам, содержащим дисперсии микрочастиц (микропузырьков, полых микрошариков или микрокапсул), несущих эти контрастные вещества. Кроме микрочастиц, контрастные средства содержат физиологически приемлемые водные жидкости-носители, включающие в себя поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы. Изобретение относится также к способам приготовления ультразвуковых контрастных веществ и контрастных средств и к способам их применения.

Предпосылки изобретения Признание применимости инъецируемых суспензий микрочастиц газов в качестве ценных ультразвуковых контрастных средств для диагностических целей вызвало значительный рост исследований и развитие их в направлении поиска усовершенствованных дисперсий газозаполненных полых микрошариков или микропузырьков с высокой стабильностью, большей устойчивостью к изменениям давления, хорошей эхогенностью, легкостью приготовления, диапазоном применения и стабильностью при хранении. Для многих ультразвуковых контрастных средств были предложены такие суспензии. Например, водные суспензии, применимые в качестве средств для получения изображения в ультразвуковой эхографии, описаны в WO-A-91/15244 (Sehneider et al.), WO-A-92/1187 (Beller et al) или EP-A-0 077 752 (Schering).

В заявке WO-A/91/15244 описаны суспензии микропузырьков, содержащие образующие пленку поверхностно-активные вещества в ламинарной и/или ламеллярной форме и, дополнительно, гидрофильные стабилизаторы. Эти суспензии получают экспонированием образовавших слои поверхностно-активных веществ с воздухом или газом перед смешиванием их с водной фазой. Превращение образующих пленку поверхностно-активных веществ в ламеллярную форму проводят различными способами, включающими в себя гомогенизацию при высоком давлении или разрушение ультразвуком при акустических (звуковых) или ультразвуковых частотах. Полученная концентрация микроузырьков в этих суспензиях находится в пределах от 10⁸ до 10⁹ пузырьков/мл. Описанные суспензии имеют довольно высокую стабильность при хранении.

В заявке WO-A-94/09829 (Schneider et al) показано, что концентрации ламинарных и/или ламеллярных фосфолипидов, применяемых в препаратах очень стабильных водных суспензий, могут быть настолько низкими, что они соответствуют одному мономолекулярному слою фосфолипида вокруг микропузырьков в суспензии. Стабильные суспензии с низким (до нескольких мкг/мл) содержанием фосфолипида хранились в течение пролонгированных периодов без значительной потери числа микропузырьков или эхогенности.

Способ придания стабильности при изменениях давления суспензии микропузырьков или полых микрошариков, применяемых в качестве ультразвуковых контрастных средств, описан в EP-A-0 554 213 (Scheider et al). Здесь показано, что значительное повышение стабильности микропузырьков при сжатии в результате изменений давления при инъекции может быть достигнуто, если обычно применяемые воздух, азот или другие растворимые газы по меньшей мере частично заменяют газами, растворимость которых в воде, выраженная в литрах воды при стандартных условиях, разделенных на корень квадратный из мол. массы в Дальтонах, не превышает 0,003. Описанными газами, удовлетворяющими указанным выше критериям, являются, например, SeF₆, SF₆, CF₄, C₂F₆, C₂F₈, C₄F₁₀ и т. д. Эти газы, как было обнаружено, образуют длительно сохраняющиеся и очень стабильные in vivo полые микрошарики, которые в свою очередь обеспечивают эхографические изображения высокого качества.

В заявке WO-A-92/17212 и WO-A-92/17213 (Klaveness et al) описаны ультразвуковые контрастные средства, содержащие полые микрошарики, имеющие оболочку, образованную из небелковых сшитых поперечными связями или полимеризованных амфифильных веществ (например, фосфолипидов) и сшитых белков (например, альбумина). Полые микрошарики капсулируют газы, такие как воздух, кислород, водород, азот, гелий, аргон, CH₄, SF₆ или предшественники газа, такие как бикарбонат натрия или аммония.

В заявке WO-A-93/06869 (Mallinckrodt Medical Jnc.) описан способ ультразвуковой томографии теплокровного животного, который предусматривает введение животному фармацевтически приемлемого газа или смеси газов и сканирование этого животного ультразвуковым зондом. Газы или газовые смеси вводят при помощи ингаляции смеси в течение нескольких минут, в кровотоке теплокровных животных образуются микропузырьки и эхографическое изображение ткани изменяется. Описанные газы и газовые смеси включают в себя кислород, оксид азота, C₂H₆, SF₆ ксенон, перфторуглероды и т.д. Применимыми являются те газы и газовые смеси, которые проявляют тенденцию к образованию больших пузырьков в крови и могут быть представлены ксеноном и оксидом азота и другими слабо активными общими анестезирующими средствами, такими как гексафторид серы. Приведенные в качестве иллюстрации смеси содержат либо 20% кислород, 60-80% гексафторид серы и/или 20% азот, ксенон, оксид азота или этилен, либо 20% кислород, 20% азот и 60% ксенон или оксид азота. Способ основан на сравнении ультразвуковых сигналов, полученных во время двух различных сканов: первый, перед ингаляцией газовой смеси, и второй, через некоторое время после ингаляции.

Интересная концепция была описана в заявке WO-А-93/05819 (Qnay). Этот документ описывает эмульсии жидкого додекафторпентана или декафторбутана и сорбита в воде, которые при инъекции образуют газообразные микропузырьки, выдерживающие изменения давления и обеспечивающие хороший эхогенный сигнал. Хотя вещества в этих эмульсиях являются жидкими при температуре окружающей среды, они являются высоколетучими и легко испаряются при температуре тела и образуют газовые дисперсии в жидкости-носителе, содержащей добавки и стабилизаторы, такие как сорбит. При инъекции капельки высоколетучего вещества быстро дезагрегируются и генерируют неплохое количество очень стойких микропузырьков. Микропузырьки, которые содержат только выбранное вещество, например, додекафторпентан в чистом виде при исключении воздуха или любого другого газа, стабилизируют при помощи стабилизирующих агентов, например, сорбита, Tween® 20 и соевого масла, которые присутствуют в жидкости-носителе эмульсии. Было обнаружено, что вышеописанный способ применим для ряда других нежидких (газообразных) химических веществ, применимость которых оценивали при помощи критериев, определяемых как отношение между объемной плотностью, растворимостью и коэффициентом диффузии (диффузностью) (коэффициент Q). В вышеуказанной заявке отмечено, что любой биосовместимый газ, коэффициент Q которого больше 5, потенциально применим в качестве эхографического средства. Представлен список приблизительно 180 газов/жидкостей, удовлетворяющих этим критериям. Из данного документа следует, что для достижения желаемых свойств контрастные средства должны быть приготовлены с веществами, коэффициент Q которых более 5. Предложенным критерием является Q = 4,0 ·10^-7 · ρ/C_sD, где ρ обозначает плотность газа, D обозначает коэффициент диффузии газа в растворе и C_s обозначает растворимость в воде газа. Этот результат был получен при помощи простой модели, в которой коэффициенты диффузии и растворимости газов в воде применяли в качестве приближения, наиболее близкого к реальности. Контрастные средства, полученные из чистых, т.е. без смешивания с другими компонентами, веществ, выбранных в соответствии с указанными выше критериями, показали обнадеживающие результаты. При экспериментах с животными эти контрастные средства, как было сообщено, дали обнадеживающие результаты в эхографии миокарда после инъекций в периферические вены (см. Beppu S. et al in Proceldings from 66^th Scientific Session of the American Heart Association, Atlanta, October 1993). В зависимости от дозы было обнаружено, что инъекции 2,2% эмульсии додекафторпентана обеспечивают среднюю непрозрачность во время периода до 85 минут. Однако с дозами, при которых непрозрачность левой стороны сердца была гомогенной, наблюдали уменьшение кислородного насыщения артериальной крови и повышение систолического давления легочной артерии.

Многие предшествующие композиции имеют достоинства и многие находятся в интенсивных клинических испытаниях. Многие из них находятся на различных стадиях разработки. Однако на основании многочисленных публикаций представляется, что до настоящего времени только небольшое число контрастных средств способно использовать полный диапазон диагностических возможностей, обеспечиваемых ультразвуковой эхографией. Действительно, лишь небольшое число контрастных средств реально применимо и помогает медицине получать преимущества от диагностического способа, который в других отношениях представляет собой один из лучших неинвазивных способов анализа органов в теле человека. Немногие средства позволяют использовать полный потенциал ультразвуковой концепции и это препятствует широкому применению этого способа и/или средств для получения изображения. Экспериментирование с известными эхографическими средствами показало, что некоторые из них обеспечивают недостаточное обратное рассеяние для гарантии хорошей интенсивности и контраста или дают качественные изображения только в определенном проценте популяции, что ограничивает их применимость в качестве диагностического инструмента общего применения. Другие, вследствие низкой устойчивости к изменениям давления, являются слишком короткоживущими, для получения значимых измерений или ценных изображений. Обычно контрастные средства, микропузырьки или полые микрошарики которых наполнены газами высокой растворимости в воде, обладают слабой устойчивостью к изменениям давления. Суспензии полых микроорганизмов, оболочка которых сделана из жестких материалов, также неэффективны, т.к. они недостаточно резонируют в ответ на звуковые волны. Достойными внимания контрастными средствами, имеющими высокую устойчивость к изменениям давления, являются средства с применением газов с низкой растворимостью в водном носителе. Прямым следствием низкой растворимости является низкая скорость всасывания и медленное выведение из тела. Томографические средства, приготовленные из таких очень малорастворимых газов, остаются в кровотоке в течение продолжительных периодов, вызывая повторное использование или рециркуляцию микропузырьков газа, что мешает изображениям, полученным во время начальных стадий испытания. Такие контрастные средства обычно применимы для получения изображения левых отделов сердца, но вследствие низкой резорбции или выведения их нельзя использовать эффективно для перфузионных измерений. Перфузионные измерения обычно проводят путем интегрирования эхографической ответной кривой, являющейся типичной функцией Гаусса, появляющейся после "одиночного прохождения" томографического средства. Повторное прохождение или рециркуляция после "одиночного прохождения" является поэтому нежелательными, т.к. повторение будет накладываться и искажать конечный результат. Таким образом, обычно признают, что стойкость в течение определенного периода времени микропузырьков или полых микрошариков, обладающих высоким сопротивлением давлению, является в большей степени мешающей, чем полезной. Эхографические контрастные средства с очень стойкими микропузырьками применимы только для определенных исследований, например, для доплеровских исследований сосудов. Средства для томографии левых отделов сердца и миокарда должны обеспечивать ясные изображения и должны иметь высокое сопротивление изменению давления, но они не должны быть чрезмерно стойкими и не должны нарушать изображения, получаемые сразу же после инъекции. Рециркуляция не является желательным свойством средств, применение которых предназначено для широкого диапазона приложений и для получения ясных изображений. Очевидно, что крайне желательно модулирование устойчивости к давлению или стойкости контрастного средства после инъекции, т.е. применение суспензий пузырьков (или полых микрошариков), обладающих достаточным сопротивлением давлению, но имеющих контролируемое время жизни в кровотоке. Эта потребность выполняется описанным ниже изобретением.

Сущность изобретения Изобретение относится к инъецируемому ультразвуковому контрастному веществу в форме микропузырьков или полых микрошариков, содержащих по меньшей мере два биосовместимых, газообразных при температуре тела вещества A и B, образующих смесь, которая в суспензии с обычными поверхностно-активными веществами, добавками и стабилизаторами обеспечивает ценные контрастные средства для ультразвуковой эхографии. По меньшей мере один из компонентов (В) в этой смеси представляет собой газ, мол. масса которого равна более 80 Дальтон и растворимость которого в воде ниже 0,0283 мл газа на мл воды при стандартных условиях. Во всем описании приведенные в нем растворимости газа соответствуют коэффициентам Бунзена, и мол. массы выше 80 Дальтон рассматриваются как относительно высокие, тогда как мол. массы ниже 80 Дальтон считаются относительно низкими. Поэтому смеси, о которых идет речь в данном изобретении, могут быть определены как смеси, в которых основная часть состоит из газа или газов "относительно низкой" мол. массы, тогда как меньшая часть смеси состоит из газа или газовой смеси "относительно высокой" мол. массы. Количество этого "малого" или активирующего компонента (В) в контрастном веществе практически всегда составляет 0,5-41 об.%. Другой компонент (А) контрастных веществ для ультразвуковой эхографии может быть газом или смесью газов, растворимость которых в воде выше растворимости азота (0,0144 мл/мл воды при стандартных условиях) и количество которых в смеси практически всегда составляет 59-99,5 об.%. Этот "основной" или доминирующий компонент представляет собой предпочтительно газ или газы, мол. массы которых обычно ниже 80 Дальтон и которые выбраны из таких газов, как кислород, воздух, азот, диоксид углерода или их смеси.

В контрастном веществе для эхографии согласно изобретению газа, мол. масса которого выше 80 Дальтон, может представлять собой смесь газов или смесь веществ, которые газообразны при температуре тела, но которые при температурах окружающей среды могут быть в жидком состоянии. Такие газообразные или жидкие вещества могут быть применимы в контрастных веществах по изобретению, если мол. масса каждого такого вещества не более 80 Дальтон и растворимость каждого вещества в воде ниже 0,0283 мл газа на мл воды при стандартных условиях.

При заполнении контрастным веществом, согласно изобретению, и диспергировании в водном носителе, содержащем поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы, образованные микропузырьки обеспечивают инъецируемое контрастное средство для ультразвуковой томографии с контролируемой устойчивостью к изменениям давления и модулируемой стойкостью после инъекции. Кроме микропузырьков, контрастное средство по изобретению содержит поверхностно-активные вещества, стабилизирующие оболочку быстро исчезающего газа/жидкости микропузырьков, и, иногда, гидрофильные агенты и другие добавки. Добавками могут быть блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена (полиоксамеры), полиоксиэтиленсорбитаны, сорбит, полиалкиленстеарат глицерина, полиоксиэтиленрицинолеат глицерина, гомо и сополимеры полиалкиленгликолей, соевое масло, а также гидрогенизированные производные, простые и сложные эфиры сахарозы или других углеводов с жирными кислотами, жирные спирты, глицериды соевого масла, декстран, сахароза и углеводы. Поверхностно-активные вещества могут быть пленкообразующими и не образующими пленку и могут включать в себя полимеризуемые амфифильные соединения типа линолеиллецитинов или полиэтилендодеканоата. Предпочтительно поверхностно-активные вещества содержат одно или несколько пленкообразующих поверхностно-активных веществ в ламеллярной или ламинарной форме, выбранных из фосфатидной кислоты, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита, кардиолипина, сфингомиелина и их смесей.

Изобретение также относится к способу приготовления контрастных средств путем суспендирования в физиологически приемлемом носителе, содержащем обычные поверхностно-активные вещества и стабилизаторы, заполненных газом микропузырьков или полых микрошариков, содержащих смесь газов, по меньшей мере один из которых является газом, эффективное минимальное количество которого можно определить по выражению: B_C% = K/e^VMwt+C в котором B_C% (по объему) представляет собой общее количество компонента B в смеси, K, C и b обозначают константы с величинами 140, -10,8 и 0,012, соответственно, Mwt обозначает мол. массу компонента B, превышающую 80. Контрастные средства, приготовленные согласно данному способу, содержат суспензии микропузырьков или полых микрошариков с превосходной устойчивостью к изменениям давления и контролируемой скоростью резорбции.

Изобретение относится также к набору, содержащему сухую композицию, которую обычно хранят под смесью газов и/или жидкостей, которые превращаются в газы при температуре тела. При диспергировании в физиологически приемлемой жидкости-носителе сухая композиция со смесью газов и/или жидкостей образует контрастное средство данного изобретения для ультразвуковой эхографии. Способ хранения сухой лиофилизированной композиции в присутствии контрастного вещества для эхографии также описан в изобретении.

Кроме того, изобретение относится к способу приготовления контрастных средств с микропузырьками, содержащими контрастные вещества, а также их применение в томографии органов в теле человека или животного.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 - схематичное изображение ультразвукового контрастного вещества согласно изобретению.

Фиг. 2 - график критического давления (Pc) контрастного вещества в зависимости от количества выбранного газа в смеси.

Фиг.3 - график критического давления (Pc) контрастного вещества, приготовленного с октафторциклобутаном (C₄F₈) (фиг. 3B) и додекафторпентаном (C₅F₁₂) в зависимости от количества газа в смеси.

Фиг. 4 - график минимального количества газа в смеси в зависимости от мол. массы.

Фиг.5 - (непрозрачность левых отделов сердца свиньи после 1Ц инъекции) - графическое изображение in vivo эхографических ответов, полученных в зависимости от времени в левом желудочке сердца после внутривенного введения контрастных веществ, содержащих различные концентрации SF₆.

Фиг. 6 - (непрозрачность миокарда после введения через аорту кролика) графиком in vivo эхографического ответа, полученного в зависимости от времени, с контрастными веществами, содержащими различные концентрации C₄F₈.

Детальное описание изобретения Изобретение основано на обнаружении того, что контрастное вещество для ультразвуковой эхографии, содержащее пузырьки, заполненные смесью по меньшей мере двух биосовместимых газообразных или газообразных при температуре тела вещества А (основной компонент или компонент с относительно низкой мол. массой) и В (активирующий компонент или компонент с относительно высокой мол. массой), обеспечивает в суспензии с обычными поверхностно-активными веществами, добавками и стабилизаторами инъецируемые контрастные средства, которые объединяют желаемую устойчивость к давлению и короткое время жизни в кровотоке, причем оба эти параметра контролируемы по усмотрению. До тех пор, пока по меньшей мере одно из (активирующих) веществ или компонентов в смеси с мол. массой более 80 Дальтон (относительно высокая мол. масса) присутствует в определенном минимальном соотношении и до тех пор, пока его растворимость в воде ниже 0,0283 мл газа на мл воды при стандартных условиях, ультразвуковое контрастное вещество будет обеспечивать эхографические свойства такого же хорошего качества, какие получают при использовании одного чистого вещества. Под термином "активирующий" подразумевают вещество или компонент, которые передают свои физические свойства другим компонентам смеси, сообщая смеси способность, с точки зрения эхогенности и устойчивости к изменениям давления, вести себя так же или почти так же, как ведет себя вещество или компонент отдельно (в чистом виде). Количество первого, активирующего компонента, или компонента с высокой мол. массой, в контрастном веществе в большинстве случаев изменяется от 0,5 об.% (для веществ с высокой мол. массой и низкой растворимостью в воде) до 41 об.%. Эксперименты показали, что вещества с мол. массой ниже 80 Дальтон ("низкая мол. масса") не пригодны в качестве активирующих компонентов и что верхний предел мол. массы трудно установить, поскольку все тестированные соединения были эффективны, пока их мол. масса была относительно высокой, т.е. выше 80. Так, было обнаружено, что соединения с мол. массой приблизительно 240 Дальтон, такие как декафторбутан, или 290 Дальтон, такие как перфторпентан, являются аффективными активирующими компонентами. Также имеются указания на то, что такие вещества, как 1,2,3-нонадекантрикарбоновая кислота (2- гидрокситриметиловый эфир) с мол. массой немного выше 500 Дальтон, могут также быть использованы в качестве активирующего высокомолекулярного компонента. Другой, "основной", компонент присутствует, соответственно, в количестве 59-99,5 об.% и может быть газом или газами, растворимость которых в воде больше, чем растворимость азота (0,0144 мл/мл воды при стандартных условиях). Вторым компонентом предпочтительно является кислород, воздух, азот, диоксид углерода или их смеси и более предпочтительно кислород или воздух. Однако, в качестве компонента А можно также использовать другие, менее распространенные газы, такие как аргон, ксенон, криптон, CHClF₂ или оксид азота. Некоторые из этих газов могут иметь мол. массы, более высокие, чем мол. массы O₂, N₂, воздуха, CO₂ и т. д. , например более 80 Дальтон, однако в этом случае их растворимость в воде будет превышать растворимость газов категории В, т.е. будет выше 0,0283 мл/мл воды.

Совершенно неожиданно было обнаружено, что суспендирование в водном носителе смеси, образованной всего лишь 0,5 об.% вещества, такого как додекафторпентан, или 0,8 об.% декафторбутана в смеси с воздухом, образует микропузырьки, дающие превосходные эхографические изображения и хорошую устойчивость к изменениям давления. Это особенно удивительно, поскольку до сих пор считали необходимым для получения хороших эхографичесхих изображений левых отделов сердца и миокарда применение этих веществ и ряда других веществ при концентрациях 100%, т.е. в чистом виде (без воздуха). Эксперименты со смесями, содержащими различные количества этих веществ с низкой растворимостью в воде и воздух, показали, что эти эхографические изображения так же хороши, как изображения, полученные при сходных условиях с применением эхографических средств, приготовленных только с чистыми веществами.

Ранние исследования показали, что быстрое устранение воздушных пузырьков в кровотоке имеет место, т.к. этот в других отношениях физиологически предпочтительный газ быстро резорбируется путем разбавления, и что быстрое исчезновение микропузырьков может быть уменьшено путем применения поверхностно-активных веществ, добавок и стабилизаторов. В начале разработки в качестве средства для проблемы быстрого исчезновения были предложены полые микрошарики или микропузырьки с оболочкой из определенного материала. Микропузырьки со стенками, выполненными из природных или синтетических полимеров, таких как липидные биослои (липосомы), или денатурированные белки, подобные альбумину, наполненные воздухом или CO₂, были предложены. Плохая устойчивость к изменениям давления и вызванная ею потеря эхогенности ранее известных контрастных средств побудили к поиску газообразных частиц с большей устойчивостью к изменениям давления, наблюдающимся в кровотоке. В результате были предложены такие газы-наполнители, как гексафторид серы или более недавно додекафторпентан. Экспериментирование с этими газами показало, что при инъекции суспензии микропузырьков, приготовленные с этими газами, взятыми в отдельности (без добавок), действительно были очень устойчивыми к давлению в кровотоке. В результате этих начальных исследований были идентифицированы около 200 различных газов, потенциально применимых для приготовления контрастных средств для эхографии. Так, неожиданно было обнаружено, что путем смешивания кислорода или воздуха с некоторыми из этих газов, устойчивых к давлению, можно получить ультразвуковые средства, которые будут физиологически лучше переносимыми и будут иметь более короткий период резорбции, чем чистые гексафторид серы или додекафторпентан, с сохранением хорошей устойчивости к давлению этими газами, обнаруживаемой при их отдельном применении. Установлено, что такое удивительное поведение ультразвукового вещества, соответствующего данному изобретению, проистекает из факта, что в микропузырьках, содержащих газовые смеси, диффузия воздуха в окружающую жидкость замедляется в присутствии больших молекул газа или газов, растворимость которых в воде приблизительно такая же, как у воздуха или кислорода, или более низкая. Хотя причины такого удивительного поведения до сих пор не объяснены, можно утверждать, что молекулы высокомолекулярного газа, даже при очень малых его количествах, действительно "закупоривают дыры" в поверхностях раздела микропузырьков и тем самым препятствуют выходу низкомолекулярного газа путем трансмембранной диффузии. Графическое изображение этой модели показано на фиг 1, где содержащийся в микропузырьке воздух (1), смешанный с газом, мол. масса которого более 80 Дальтон (2), суспендируют в водной среде (3). Быстро исчезающий наружный слой (4), стабилизованный поверхностно-активным веществом, например, фосфолипидом, сохраняет смесь газов внутри объема, определяющего микропузырек. Активирующий или минорный газ B, однородно диспергированный по всему объему микропузырька, будет иметь более медленную диффузию и в конечном счете будет блокировать поры спонтанно образуемой в водном растворе мембрано-подобной оболочки поверхностно-активного вещества, препятствуя быстрому удалению меньшего и обычно более растворимого основного компонента А. С другой стороны, активирующий или меньший компонент (В) обнаруживает большую аффинность в отношении липофильной части поверхностно-активного вещества, примененного для стабилизации временной оболочки, чем кислород или воздух. Так, согласно другой гипотезе, эти газы имеют тенденцию концентрироваться вблизи мембраны предотвращая или замедляя диффузию меньших молекул газа (газов) через мембрану. Как бы то ни было, полученные экспериментальные данные предполагают, что для приготовления эхографических веществ по данному изобретению требуется такое количество активирующего газа в смеси, которое соответствует блокированию пор данного мембранного материала, или количеству, требуемому для образования мономолекулярного слоя на внутренней стенке микропузырьков. Таким образом, минимальное требуемое количество таково, которое необходимо для блокирования пор или покрытия внутренней стенки мембраны для предотвращения ухода и резорбции низкомолекулярного компонента.

Также предполагается, что превосходные свойства контрастного вещества для эхографии, согласно данному изобретению, вытекают из совместного использования азота, диоксида углерода, кислорода или воздуха (в основном смеси кислород/азот) с другими газами. Функционально эти биологически и физиологически совместимые газы обеспечивают важные характеристики обсуждаемых веществ, гарантируя их выгодные особенности. Хотя ультразвуковые контрастные вещества по данному изобретению могут быть приготовлены с рядом других газов, служащих в качестве основного компонента (А), предпочтительны кислород и воздух. В контексте данного документа воздух рассматривается как "однокомпонентный" газ.

Согласно изобретению, ультразвуковые контрастные вещества с высокой устойчивостью к давлению, комбинированной с относительно быстрой резорбцией, т. е. выведением из тела, могут быть получены при использовании газа или газов, мол. массы которых выше 80 Дальтон, в смеси с газом или газами, растворимости которых в воде выше 0,0144 мл/мл воды и мол. массы которых обычно ниже 80 Дальтон. Газы, такие как кислород или воздух, смешанные с веществами, которые являются газами при температуре тела, но при температурах окружающей среды могут быть в жидком состоянии, будут обеспечивать получение эхографических веществ, которые будут обладать всеми преимуществами газов в данной смеси. Другими словами, эти смеси при инъекции в виде суспензий микропузырьков обеспечат ясные и четко очерченные изобретения с резкими контрастами (типичными для микропузырьков с хорошей устойчивостью к изменениям давления) так же легко, как если бы они были наполнены только воздухом или кислородом. Таким образом путем комбинирования воздуха, азота, диоксида углерода или кислорода с определенным контролируемым количеством какого-либо известного биосовместимого высокомолекулярного вещества, которое при температуре тела является газом, получены контрастные вещества для ультразвуковой эхографии с важными и совершенно неожиданными преимуществами. Как объяснено выше, эти вещества обеспечивают лучшие свойства каждого из компонентов, т.е. хорошую устойчивость к изменениям давления одного компонента и относительно быструю резорбцию другого компонента, и в то же время устраняют соответствующие недостатки каждого компонента, проявляемые при их отдельном применении в этих веществах. Это особенно удивительно, т.к. можно было бы ожидать усреднение свойства этих компонентов, взятых по отдельности.

До тех пор, пока мол. масса таких биосовместимых веществ (B) больше 80 Дальтон и их растворимость в воде ниже 0,0283 мл газа на мл воды при стандартных условиях, такие вещества в газообразном или жидком состоянии применимы для получения контрастных веществ по данному изобретению. Хотя в соединении с подходящими поверхностно-активными веществами и стабилизаторами, в категории B можно применять такие газы, как гексафторид серы, тетрафторметан, хлортрифторметан, дихлордифторметан, бромтрифторметан, бромхлордифторметан, дибромдифторметан, дихлортетрафторэтан, хлорпентафторэтан, гексафторэтан, гексафторпропилен, октафторпропан, гексафторбутадиен, октафтор-2-бутен, окафторциклобутан, декафторбутан, перфторциклопентан, додекафторпентан и более предпочтительно гексафторид серы и/или октафторциклобутан, вещества согласно данному изобретению предпочтительно содержат в качестве газа B газ, выбранный из гексафторида серы, тетрафторметана, гексафторэтана, гексафторпропилена, октафторпропана, гексафторбутадиена, октафтор-2-бутена, октафторциклобутана, декафторбутана, перхлорциклопентана, додекафторпентана и, более предпочтительно, гексафторида серы и/или октафторциклобутана.

Другой неожиданной и удивительной особенностью данного изобретения является тот факт, что при применении критериев, установленных в заявке WO 93/05819, к веществам по данному изобретению коэффициент Q, полученный для данных газовых смесей, ниже 5. Это удивительно, т.к. согласно заявке WO 93/05819 вещества с коэффициентами Q ниже 5 должны исключаться из списка газов, пригодных для приготовления ценных контрастных веществ для эхографии. Тем не менее было обнаружено, что однородные газовые смеси, хотя и имеющие коэффициент Q гораздо более низкий чем 5, обеспечивают контрастные средства, применимые для ультразвуковой томографии.

При наполнении контрастными веществами по данному изобретению и диспергировании в водном носителе, содержащем обычные поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы, образованные микропузырьками, обеспечивают ценное контрастное средство для ультразвуковой томографии. Кроме микропузырьков, контрастное средство по данному изобретению содержит поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы. Поверхностно-активные вещества, которые могут быть одним или несколькими пленкообразующими поверхностно-активными веществами в ламеллярной или ламинарной форме, применяют для стабилизации оболочки быстро исчезающего газа/жидкости пузырьков. Могут также применяться гидратирующие средства и/или гидрофильные стабилизирующие соединения, такие как полиэтиленгликоль, углеводы, такие как лактоза или сахароза, декстран, крахмал и другие полисахариды, и другие общепринятые добавки, такие как полиоксипропиленгликоль и полиоксиэтиленгликоль, простые эфиры жирных спиртов с полиоксиалкиленгликолями, сложные эфиры жирных кислот с полиоксиалкилированным сорбитаном, мыла, полиалкиленстеарат глицерина, полиоксиэтиленрициолеат глицерина, гомо- и сополимеры полиалкиленгликолей, полиэтоксилированное соевое масло и касторовое масло, а также гидрогенизированные производные, простые и сложные эфиры сахарозы или других углеводов с жирными кислотами, жирные спирты, которые иногда являются полиоксиалкилированными, моно-, ди- и триглицериды насыщенных или ненасыщенных жирных кислот, глицериды соевого масла и сахароза. Поверхностно-активные вещества могут быть пленкообразующими и не образующими пленку и могут включать в себя полимеризуемые амфифильные соединения типа линолеиллецитинов или полиэтилендодеканоата. Предпочтительно, поверхностно-активные вещества являются пленкообразующими и, более предпочтительно, они являются фосфолипидами, выбранными из фосфатидной кислоты, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита, кардиолипина, сфингомиелина и их смесей.

Понятно, что изобретение не ограничивается контрастными средствами, в которых только микропузырьки применяют в качестве носителей ультразвуковых контрастных веществ по данному изобретению. Любая подходящая частица, заполненная ультразвуковым контрастным веществом, например, липосомы или полые микрошарики, имеющие оболочку, образуемую из синтетических или природных полимеров, также может быть использована. Так, было установлено, что полые микрошарики, приготовленные с альбумином, или липосомные носители или пористые частицы из этилового эфира иодипамида при наполнении ультразвуковыми контрастными веществами данного изобретения обеспечивают хорошие эхографические контрастные средства. Суспензии, в которых микропузырьки стабилизированы сорбитом или неионными поверхностно-активными веществами, такими как сополимеры полиоксиэтилена/полиоксипропилена (в торговле известные как Pluronic®), показали одинаково хорошую способность получения изображения по сравнению со способностью исходных композиций, приготовленных с чистыми веществами, взятыми отдельно. Таким образом можно считать, что данное изобретение позволяет получить более обобщенное представление о веществах для ультразвуковой эхографии и дает лучшее понимание проблем ультразвуковой томографии, а также лучший контроль свойств контрастных средств. Эти вещества и контрастные средства, содержащие вещества по данному изобретению, являются, таким образом, продуктами, которые способствуют дальнейшему развитию этого способа.

Изобретение также предусматривает способ приготовления ультразвукового контрастного средства, в котором смесь газов по меньшей мере из двух компонентов суспендируют в физиологически приемлемом водном жидком носителе, содержащем обычные поверхностно-активные вещества и стабилизаторы, с образованием наполненных газом микропузырьков или полых микрошариков, отличающихся тем, что минимальное эффективное соотношение по меньшей мере одного газообразного компонента (B) в смеси газов определяют согласно критериям.

B_c% = K/e^VMwt+C, в котором B_c% (по объему) обозначает общее количество компонента B в смеси, K и C являются константами с величинами, соответственно, 140 и -10,8, Mwt обозначает мол. массу компонента B, превышающую 80, и b обозначает количество, которое является комплексной функцией рабочей температуры и толщины мембраны (липидной пленки), стабилизирующей микропузырьки, однако, поскольку температура тела по существу постоянна и стабилизирующая структура пленки по существу независима от концентрации липидов, то величина b держится в интервале 0,011 - 0,012 и может рассматриваться как постоянная. Контрастные средства, приготовленные согласно данному способу, включают в себя суспензии микропузырьков или полых микрошариков с превосходной устойчивостью к изменениям давления и относительно быстро резорбцией. Оба эти свойства являются контролируемыми до такой степени, что теперь возможны практически изготовленные по заказу эхографические средства. С приведенными выше критериями модно создавать средство с желаемыми характеристиками, исходя из любого коммерчески доступного нетоксичного вещества, которое при температуре тела является газом и которое имеет мол. массу и растворимость в воде, указанные выше.

Данное изобретение включает в себя также сухую композицию, содержащую поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы, хранимую под смесью веществ, которые при температуре тела являются газами, по меньшей мере одно из которых является газом, мол. масса которого больше 80 Дальтон и растворимость которого в воде ниже 0,0283 мл на мл воды при стандартных условиях. Перед инъекцией эту композицию, содержащую лиофилизированные пленкообразующие поверхностно-активные вещества и иногда гидратирующие агенты, подобные полиэтиленгликолю, или другие общепринятые гидрофильные вещества, смешивают с физиологически приемлемой жидкостью-носителем для получения ультразвукового контрастного средства по данному изобретению. Пленкообразующее поверхностно-активное вещество представляет собой, предпочтительно, фосфолипид, выбранный из фосфатидной кислоты, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита, кардиолипина, сфингомиелина и их смесей.

В одном из вариантов стабилизация оболочки газа/жидкости микропузырька может быть обеспечена неионными поверхностно-активными веществами, такими как сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена в комбинации с пленкообразующим поверхностно-активным веществом, таким как дипальмитоилфосфатидилглицерин. Как и прежде, водный жидкий носитель может содержать, кроме того, гидрофильные добавки, такие как глицерин, полиэтиленгликоль, сорбит и т. д. Кроме того, применимые средства по данному изобретению могут быть приготовлены с солевыми растворами, содержащими Tween® 20, сорбит, соевое масло и иногда другие добавки.

Изобретение также раскрывает двухкомпонентный набор, содержащий в качестве первого компонента сухую композицию поверхностно-активных веществ, добавок и стабилизаторов, хранящуюся под смесью газов, и в качестве второго компонента физиологически приемлемую жидкость-носитель, который при приведении в контакт с первым компонентом обеспечивает ультразвуковые контрастные вещества. Этот набор может содержать систему из двух отдельных флаконов, каждый из которых содержит один из компонентов, которые взаимосвязаны таким образом, чтобы их было удобно соединить друг с другом перед использованием контрастного средства. Ясно, что флакон, содержащий сухую композицию, будет одновременно содержать ультразвуковое вещество по данному изобретению. Удобно, чтобы набор мог быть в форме заранее наполненного шприца с двумя секциями и, кроме того, мог содержать средства для присоединения иглы на одном из его концов.

Далее, изобретение предусматривает способ приготовления контрастных средств с микропузырьками, содержащими ультразвуковые контрастные вещества, а также их применение в томографии органов в теле человека или животного.

При применении для томографии органов в теле человека или животного контрастное вещество по данному изобретению вводят больному в форме водной суспензии в описанном выше физиологически приемлемом носителе-жидкости и больного сканируют при помощи ультразвукового зонда, получая изображение органа или части тела, с которых снимают изображение.

Следующие примеры иллюстрируют далее изобретение.

Пример 1.

Мультиламеллярные пузырьки (MLV) готовили растворением 120 мг диарахидоилфосфатидилхолина (ДАРС из Avanti Polar Lipids) и 5 мг дипальмитоилфосфатидной кислоты (DPFA acid form из Avanti Polar Lipids) в 25 мл смеси гексан/этанол (8/2, об./об.) с последующим выпариванием растворителей досуха в круглодонной колбе с применением роторного испарителя. Оставшуюся липидную пленку сушили в вакуумном эксикаторе и после добавления воды (5 мл) смесь инкубировали при 90^oC в течение 30 минут при перемешивании. Полученный раствор экстрагировали при 85^oC через 0,8 мкм поликарбонатный фильтр (Nucliopore® ). Этот препарат добавляли к 45 мл раствора 167 мг/мл декстрана 10000 (мол. масса) (Fluka) в виде. Раствор тщательно смешивали, переносили в круглодонную колбу на 500 мл, замораживали при -45^oC и лиофилизировали под 13,33 Nt/м² (0,1 Torr. ). В течение ночи получали полную сублимацию льда. Аликвоты (100 мг) полученного лиофилизата вводили в стеклянные флаконы на 20 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками и воздух удаляли из флаконов при помощи вакуума. Смеси воздуха с различными количествами гексафторида серы вводили во флаконы через иглу, проходящую через пробку.

Суспензии пузырьков получали инъецированием в каждый флакон 3% растворов глицерина в воде с последующим интенсивным смешиванием. Полученные суспензии микропузырьков считали при помощи гемоцитометра. Средний размер пузырьков был 2,0 мкм. Проводили измерения in vitro (как описано в EP-A-O 554 213) критического давления (Pc), эхогенности (т.е. коэффициента обратного рассеяния) и счет пузырьков для различных проб (см. таблицу 1).

Как можно видеть из этих результатов, микропузырьки, содержащие 100% воздух (проба А), имеют низкую устойчивость к давлению. Однако, всего лишь с 5% SF₆ устойчивость к давлению значительно увеличивается (проба B). С 25% SF₆ устойчивость к давлению почти равна устойчивости при 100% SF₆. C другой стороны, концентрации пузырьков, средний размер пузырьков и коэффициенты обратного рассеяния почти не зависят от процента SF₆.

Полученные суспензии инъецировали внутривенно в свиней (Pitman Moore) при дозе 0,5 мл на 10 кг и изображения полости левого желудочка регистрировали на видеомагнитофоне. Эхографические измерения in vivo выполняли при помощи ультразвуковой системы ACUSON XP128 (Acuson Corp USA) и секторного преобразователя 7 МГц. Интенсивность контраста измеряли при помощи видеоденситометрии с применением анализатора изображений (Dextra Inc). Фиг. 5 показывает видеоденситометрические записи в левых отделах сердца. Опять наблюдается значительное различие между вариантом 100% воздуха (проба A) и вариантом 95% воздуха (проба B). В частности, с 5% SF₆ максимальная интенсивность уже почти достигается и период полувыведения в кровотоке также обнаруживает очень быстрое увеличение. С 10% SF₆ нет дополнительного увеличения в интенсивности, но наблюдается только пролонгирование периода полувыведения. Из этого примера следует, что применение более 10-25% SF₆ в смеси газов не дает преимущества. Интересно отметить, что величины коэффициента Q, полученные для этих смесей, значительно ниже критической величины 5, оговоренной в WO-A-93/05819.

Пример 2.

Аликвоты (25 мг) лиофилизата PEG/ДАРС/ДРРА, полученные как описано в примере 1 (с применением PEG 4000 вместо декстрана 10000), вводили в стеклянные флаконы на 10 мл. Мешки для взятия проб Tedlar наполняли воздухом и октафторциклобутаном (C₄F₈). Известные объемы брали из мешков при помощи шприцев и их содержимое смешивали при помощи системы с трехходовым краном. Затем выбранные смеси газов вводили в стеклянные флаконы (предварительно откачанные). Затем лиофилизаты суспендировали в 2,5 мл солевого раствора (0,9% NaCl). Результаты, представленные ниже, показывают устойчивость к давлению, концентрацию пузырьков и коэффициент обратного рассеяния этих суспензий. В случае 100% C₄F₈ устойчивость к давлению достигала 225 мм Hg (по сравнению с 43 мм Hg в случае воздуха). Опять значительное увеличение в устойчивости к давлению наблюдали уже всего лишь при 5% C₄F₈ (Pc = 117 мм Hg).

После инъекции через аорту в кроликов (0,03 мл/кг) небольшое пролонгирование действия контраста в миокарде было замечено уже с 2% C₄F₈ (по сравнению с воздухом). Однако с 5% C₄F₈ продолжительность контраста увеличивалась значительно, как если бы устойчивость к давлению была выше пороговой величины, и стойкость пузырьков увеличивалась очень сильно (см. фиг. 6).

Здесь также эта комбинация газов обеспечила очень хорошие изображения при 5% газа B в смеси, тогда как превосходные изображения левых отделов сердца были получены со смесями, содержащими до 25% октафторциклобутана.

Соответствующий график критического давления в зависимости от C₄F₈ в смеси с воздухом дается на фиг. 2. Этот пример также показывает, что применение смеси газов позволяет значительно улучшить устойчивость к давлению пузырьков воздуха просто путем добавления небольшого процента газа с высокой мол. массой и низкой растворимостью. Этот рисунок также показывает, что путем соответствующего выбора газовой смеси становится возможным получение любой желаемой устойчивости к давлению.

Пример 3.

Использовали лиофилизат, описанный в примере 5. Газовую фазу готовили из додеканфторпентана (C₅F₁₂) и воздуха C₅F₁₂ представляет собой жидкость при комнатной температуре с точкой кипения 29,5^oC. Стеклянные флаконы на 24 мл, содержащие по 50 мг лиофилизата PEG/DSPC/DPFG, полученного, как описано в примере 5, помещали под вакуум, закрывали крышками под вакуумом, затем нагревали при 45^oC. Небольшие объемы (несколько микролитров) C₅F₁₂ инъецировали во флаконы при 45^oC через пробку. Затем вводили воздух для восстановления атмосферного давления во флаконах. После охлаждения при комнатной температуре солевой раствор (5 мл) инъецировали через пробку и флаконы интенсивно перемешивали. Истинный процент C₅F₁₂ в газовой фазе рассчитывали на основе предположения полного испарения введенной жидкости. Это завышенная оценка, так как при этой температуре часть жидкости будет не в газообразном состоянии. Как показано на фиг. 3, увеличение в устойчивости к давлению можно было детектировать уже всего лишь с 0,5% C₅F₁₂ в воздухе. При 1,4% C₅F₁₂ устойчивость к давлению превышала 130 мм Hg. Такие суспензии также инъецировали внутривенно в минисвиней (0,5 мл на 15 кг). Интенсивность измеряли видеоденсиметрически, как описано в примере 1. Как показано в таблице 3, максимальная интенсивность была получена уже с 1,4% C₅F₁₂. Более высокие проценты C₅F₁₂ приводят к прологнированию периода полувыведения и увеличению AUC. Период полувыведения (t_1/2) определяли как время, прошедшее между инъекцией и временем, при котором интенсивность падала до 50% ее максимальной величины. Площадь под кривой (AUC) измеряли до t_1/2.

Примеры 1-3 также показывают, что вопреки утверждениям, сделанным в WO-A-93/05819, можно получить превосходные усиливающие контраст средства из газовых смесей, величины которых меньше и в определенных случаях гораздо меньше чем 5.

Пример 4.

58 мг диарахидоилфосфатидилхолина (ДАРС), 2,4 мг дипальмитоилфосфатидной кислоты (ДРРА) из Avanti Polar Lipids (USA) и 3,94 г полиэтиленгликоля (PEG 4000 из Siegfried) растворяли при 60^oC в трет-бутаноле (20 мл) в круглодонном стеклянном сосуде. Прозрачный раствор быстро охлаждали при -45^oC и лиофилизировали. Аликвоты (25 мг) белого осадка вводили в стеклянные флаконы на 10 мл.

Мешки для взятия проб газа Tedlar® наполняли газами, один воздухом и один гексафторидом серы (SF₆). Предварительно определенные объемы газов брали из каждого мешка через перегородку при помощи двух отдельных шприцев и содержимое смешивали при помощи трехходового крана. Полученные газовые смеси вводили в стеклянные флаконы на 10 мл, которые были откачаны, и закрывали флаконы резиновыми пробками под вакуумом. 7 флаконов содержали газовые смеси воздуха и SF₆ в различных соотношениях. Концентрация SF₆ была между 0 и 100%. Истинное процентное содержание SF₆ было в газовой фазе, что подтверждали при помощи декситометрии (А.Рааг денситометр). Затем солевой раствор (0,9% NaCl) инъецировали через пробку в каждый флакон (5 мл на флакон) и порошок растворяли интенсивным встряхиванием. Полученные суспензии микропузырьков оценивали in vitro и in vivo. Устойчивость к давлению Pc определяли при помощи нефелометрического теста и коэффициент обратного рассеяния измеряли при помощи устройства импульсного отраженного сигнала (оба способа описаны в EP-A-0-554 213). Концентрацию пузырьков и средний размер пузырьков определяли путем анализа при помощи Coulter Multisizer 11 (Coulter Electronics Ltd). Полученные результаты фактически одинаковы с результатами, данными для примера 1.

Пример 5 Лиофилизат PEG/ДSPC/ДPFG готовили, как описано в примере 4 с использованием 30 мг дистеароилфосфатидилхолина (ДSPC) и 30 мг дипальмитоилфосфатидилглицерина (ДPPG) оба из SYG ENA, Switzerland). Аликвоты (25 мг) полученного осадка вводили в стеклянные флаконы на 10 мл. Различные газовые смеси вводили в разные флаконы путем оттягивания подходящих объемов из мешков Tedlar®, наполненных разными газами. Таблица 4 показывает исследованные газовые смеси, их мол. массы и их растворимости (выраженные а виде коэффициентов Бунзена) и устойчивость к давлению полученных микропузырьков. Особенно интересно отметить, что газы с высокой растворимостью, такие как CO₂, ксенон, CHClF₂, которые в отдельности обладают очень слабой способностью к образованию стабильных и устойчивых пузырьков, тем не менее способны давать повышенное количество высокостабильных пузырьков при условии небольшого процента такого газа, как SF₆ или C₄F₈, добавленного к ним.

Пример 6
Способ данного изобретения был применен к суспензии микропузырьков, приготовленной, как описано в примере 1 WO 92/11873. 3 г Pluronic® F68 (сополимер полиоксиэтилена- полиоксипропилена с мол. массой 8400), 1 г дипальмитоилфосфатидилглицерина и 3,6 г глицерина добавляли к 80 мл дистиллированной воды. После нагревания приблизительно при 80^oC получали прозрачный гомогенный раствор. Раствор ПАВ охлаждали до комнатной температуры и объем доводили до 100 мл. Суспензию пузырьков получали при помощи двух шприцев, соединенных трехходовым клапаном. Один из шприцев наполняли 5 мл раствора поверхностно-активного вещества, а другой наполняли 0,5 мл воздуха или смеси воздуха с C₄F₈ (см. таблицу 5). Трехходовой клапан заполняли раствором ПАВ перед его соединением с содержащим газ шприцем. Путем альтернативного манипулирования двумя поршнями раствор ПАВ переносили туда и обратно между двумя шприцами (5 раз в каждом направлении) и получали суспензии молочного цвета. После разбавления (1/50) дистиллированной водой, насыщенной воздухом, определяли устойчивость к давлению (Pc). Аликвоты инъецировали внутривенно в анестезированных кроликов (0,03 мл/кг) и регистрировали эхографические изображения левого желудочка. Определяли площади под кривой (AUC) и период полувыведения (t_1/2). Значительное увеличение периода полувыведения и AUC наблюдали при использовании 5% C₄F₈ (по сравнению с воздухом). Подобные результаты получали с 5% C₅F₁₂.

Пример 7
Суспензию микропузырьков получали, как описано в WO-A-93/05819 c применением смесей воздуха и октафторциклобутана C₄F₈. Готовили водный раствор, содержащий сорбит (20 г) NaCl (0,9 г), соевое масло (6 мл), Tween 20 (0,5 мл), и доводили до 100 мл дистиллированной водой. 10 мл этого раствора набирали в шприц на 10 мл. Второй шприц на 10 мл наполняли смесью воздуха и C₄F₈. Два шприца соединяли через трехходовой кран. Путем действия попеременно каждым из двух поршней (всего 20 раз) получал молочные суспензии. Эти суспензии испытывали на их устойчивость к давлению. Аликвоты также инъецировали внутривенно в анестезированных кроликов (0,1 мл/кг) и реагировали эхографические изображения левого желудочка. Интересно, что не обнаружили контраста в левом желудочке с 1% или даже с 5% C₄F₈. Однако непрозрачность левого желудочка была получена с 1% или даже с более 5% C₅F₁₂.

Пример 8
Лиофилизат PEG/DSPC/DPFG готовили, как описано в примере 4 с применением 30 мг дистеароилфосфатидилхолина (DSPCG) и 30 мг дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPFG) (оба из SYGENA, Switzerland. Аликвоты (25 мг) полученного осадка вводили в стеклянные флаконы на 10 мл. Различные газовые смеси вводили в разные флаконы путем взятия подходящих объемов из мешков Tedlar®, наполненных различными газами. Таблица 7 показывает испытанные газовые смеси и полученную устойчивость к давлению полученных микропузырьков. Заслуживает внимания то, что высокомолекулярный газ может даже быть смесью двух или нескольких газов с высокой мол. массой и растворимостью (выраженной в виде коэффициента Бунзена), которая ниже 0,0283. Отсюда следует, что вместо одного газа (В) можно применять также смеси двух или более активирующих или минорных компонентов-газов. Хотя в этом примере критическое давление пропорционально процентному содержанию более тяжелого из двух компонентов, можно думать, что другие комбинации газов могут далее снижать общее количество нерастворимого газа (газов) в смеси вследствие энергии.

Формула изобретения

1. Инъецируемое контрастное вещество для ультразвуковой эхографии, содержащее биосовместимые газообразные при температуре тела вещества, которые в суспензии в водной жидкости-носителе, содержащей обычные поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы, обеспечивают контрастные средства для .ультразвуковой эхографии, отличающееся тем, что это вещество представляет собой смесь газов А и B, в которой по меньшей мере один из газов B, присутствующий в количестве между 0,5 и 41 об.%, имеет мол.массу более 80 Дальтон и его растворимость в воде ниже 0,0283 мл газа на мл воды при измерении при стандартных условиях, причем балансом смеси является газ А.

2. Контрастное вещество для эхографии по п.1, отличающееся тем, что газ B представляет собой фторсодержащий биосовместимый газ.

3. Контрастное вещество для эхографии по п.2, отличающееся тем, что фторсодержащий газ выбран из группы, состоящей из SF₆, CF₄, C₂F₆, C₂F₈, C₃F₆, C₃F₈, C₄F₈, C₄F₁₀, C₅F₁₀, C₅F₁₂ и их смесей.

4. Контрастное вещество для эхографии по п.3, отличающееся тем, что фторсодержащий газ представляет собой гексафторид серы или октафторциклобутан.

5. Контрастное вещество для эхографии по п. 1, отличающееся тем, что газ А выбран из группы, состоящей из воздуха, кислорода, азота, диоксида углерода и их смесей.

6. Инъецируемое контрастное средство для ультразвуковой эхографии, содержащее суспензию наполненных газом микропузырьков или полых микрошариков в физиологически приемлемом водном носителе, содержащем обычные поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы, отличающееся тем, что этот газ является газовой смесью по меньшей мере двух биосовместимых газов А и В, в которой по меньшей мере один газ (В), присутствующий в количестве между 0,5 и 41 об.%, имеет мол. массу более 80 Дальтон и растворимость в воде ниже 0,0283 мл на мл воды при стандартных условиях, причем балансом смеси является газ А.

7. Контрастное средство для эхографии по п.6, отличающееся тем, что газ В представляет собой фторсодержащий биосовместимый газ.

8. Контрастное средство для эхографии по п.7, отличающееся тем, что фторсодержащий газ выбран из группы, состоящей из SF₆, CF₄, C₂F₆, C₂F₈, C₃F₆, C₃F₈, C₄F₆, C₄F₈, C₄F₁₀, C₅F₁₀, C₅F₁₂ и их смесей.

9. Контрастное средство для эхографии по п.6 или 7, отличающееся тем, что газ А выбран из группы, состоящей из воздуха, кислорода, азота, диоксида углерода или их смесей.

10. Контрастное средство для эхографии по п. 6, отличающееся тем, что поверхностно-активные вещества содержат по меньшей мере одно пленкообразующее поверхностно-активное вещество, присутствующее в ламинарной и/или ламеллярной форме, и, иногда, гидрофильные стабилизаторы.

11. Контрастное средство для эхографии по п. 10, отличающееся тем, что пленкообразующее поверхностно-активное вещество представляет собой фосфолипид.

12. Контрастное средство для эхографии по п.11, отличающееся тем, что фосфолипид выбран из группы, состоящей из фосфатидной кислоты, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерина, фосфатидилинозина, кардиолипина, сфингомиелина и их смесей.

13. Контрастное средство для эхографии по п.11, отличающееся тем, что, кроме фосфолипида, водный носитель содержит сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена и глицерин.

14. Контрастное средство для эхографии по п. 6, отличающееся тем, что поверхностно-активные вещества представляют собой соевое масло, Tween® и/или сорбит.

15. Сухая композиция для контрастного средства для эхографии, содержащая поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы, хранящаяся под смесью веществ, которые при температуре тела являются биосовместимыми газами, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из газов в смеси является газом, мол. масса которого больше 80 Дальтон и растворимость которого в воде ниже 0,0283 мл на мл воды при стандартных условиях.

16. Сухая композиция по п. 15, отличающаяся тем, что газ представляет собой фторсодержащий биосовместимый газ.

17. Сухая композиция по п.16, отличающаяся тем, что фторсодержащий газ присутствует в смеси в количестве между 0,5 и 41 об.%, причем баланс 59-99,5 об.% представляет собой воздух, кислород, азот, диоксид углерода или их смеси.

18. Двухкомпонентный набор, содержащий в качестве первого компонента сухую композицию поверхностно-активных веществ, добавок и стабилизаторов, хранящихся под смесью веществ, которые при температуре тела являются газами, в качестве второго компонента физиологически приемлемую жидкость-носитель, которая при смешивании с первым компонентом обеспечивает в виде суспензии двух компонентов контрастное средство для ультразвуковой эхографии, отличающийся тем, что по меньшей мере один из газов в смеси является газом, мол. масса которого больше 80 Дальтон и растворимость которого в воде ниже 0,0283 мл на мл воды при стандартных условиях.

19. Двухкомпонентный набор по п. 18, отличающийся тем, что газ представляет собой фторсодеращий биосовместимый газ, присутствующий в смеси в количестве между 0,5 и 41 об. %, причем баланс представляет собой воздух, кислород, азот, диоксид углерода или их смеси.

20. Двухкомпонентный набор по п.18 или 19, отличающийся тем, что фторсодержащий газ выбран из группы, состоящей из SF₆, CF₄, C₂F₆, C₂F₈, C₃F₆, C₃F₈, C₄F₆, C₄F₈, C₄F₁₀, C₅F₁₀, C₅F₁₂ и их смесей.

21. Способ приготовления контрастного средства для эхографии по п.6, при котором смесь газов по меньшей мере из двух биосовместимых компонентов A и В суспендируют в физиологически приемлемой жидкости-носителе, содержащей обычные поверхностно-активные вещества, добавки и стабилизаторы, с образованием наполненных газом микропузырьков или полых микрошариков, отличающийся тем, что минимальное эффективное соотношение по меньшей мере одного газового компонента в смеси газов определяют согласно формуле
B_c% = K/e^VMwt_+C,
где B_c% (по объему) представляет собой общее количество компонента В в смеси;
K, C и b являются константами с величинами 140, -10,8 и 0,012, соответственно;
Mwt обозначает мол. массу компонента В, которая больше 80.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что в качестве поверхностно-активного вещества выбирают фосфолипид из группы, состоящей из фосфатидной кислоты, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита, кардиолипина, сфингомиелина их смесей.

23. Инъецируемое контрастное вещество, отличающееся тем, что оно представляет собой вещество по любому из предшествующих пп.1-5 и используется при ультразвуковой томографии тела человека или животного.

24. Контрастное вещество, отличающееся тем, что оно представляет собой вещество по любому из пп.1-5 и используется при приготовлении контрастных средств для ультразвуковой эхографии.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9