Способ получения биомассы микроорганизмов

 

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности. Задача изобретения - разработка способа получения биомассы микроорганизмов - пищевых дрожжей -на смешанной углеродсодержащей питательной среде. Способ включает культивирование микроорганизмов, преимущественно дрожжей на питательной среде, содержащей источник углерода, источник азота и функционально необходимые минеральные добавки. Его проводят в две стадии на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода неуглеводное сырье, в условиях аэрации на каждой стадии, с последующим отделением биомассы от культуральной жидкости. Культивирование ведут до полной утилизации неуглеводного субстрата и усвояемых продуктах обмена. На второй стадии культивирование дрожжей осуществляют на углеводном сырье в два этапа. На первом осуществляют адаптацию дрожжей к углеродному сырью, на втором - проводят выращивание биомассы до полной утилизации источника углеводного питания. Источник углеводного питания берут в количестве 0,2-1,0% усвояемых редуцирующих веществ, за счет изменения типа обмена веществ микроорганизмов получается экономия углеводного сырья и достигается улучшение качества с возможностью широкого использования получаемой биомассы в качестве источника питания в рационе человека и в качестве белковых добавок для корма животных. 4 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности, а именно к способу получения биомассы микроорганизмов, точнее дрожжевой массы, и может быть использовано для приготовления питательных сред различного назначения при производстве пищевых и витаминных добавок.

Известны различные способы получения биомассы микроорганизмов, основанные на использовании в качестве углеродсодержащего сырья источников углеводного и неуглеводного питания, которые могут применяться в современной пищевой и микробилогической промышленности либо для получения пищевых и витаминных добавок, либо в чистом виде для питания человека и животных.

Биомасса, полученная на углеводах, обладает целым рядом существенных недостатков, в результате чего ее потребление человеком и животными ограничено и не превышает 5 - 10% от общего рациона белка. Это объясняется, прежде всего, тем, что микроорганизмы, выращенные на неуглеводном сырье, отличаются от дрожжевой биомассы, выращенной на углеводном сорбенте, по химическому составу и ферментной активности.

Известно, например, (1), что биомасса дрожжевых микроорганизмов, полученная на н-алканах, по сравнению с биомассой тех же организмов, но при выращивании их на углеводах, содержит значительно больше ДНК, РНК, жирных кислот с нечетным числом атомов углерода в молекуле, а также III и IV фракцией белка, трудно атакуемых пищеварительными ферментами. Это объясняется тем, что при росте дрожжей на н-алканах функционирует глиоксилатный цикл, практически отсутствующий при выращивании на углеводом питании (глюкозе).

Известен способ (2) выращивания дрожжей на питательной среде, содержащей, кроме углеводородов, и другие источники углерода, в частности, на смешанной бардо-углеводородной среде, компоненты которой относятся к различным классам органических соединений. Однако, в этом способе потребление углеродсодержащих компонентов из их смеси протекает с различной последовательностью после периода адаптации при переходе к росту с одного субстрата на другой. Поэтому целенаправленное проведение процесса на смеси углеродистых субстратов для получения биомассы, соответствующей по обмену веществ и химическому составу биомассы, полученной при росте той же самой культуры на одном заданном источнике углеродного питания, не представляется возможным.

Известен также способ (3) получения дрожжевой биомассы, включающий культивирование дрожжей в условиях аэрации на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода неуглеводный углеродосдержащий субстрат, источник азота и другие функционально необходимые компоненты, с последующим выделением биомасы.

Однако, указанный способ культивирования микроорганизмов предусматривает получение их с обменом веществ, характерным для биомассы, выращенной на неуглеводном углеродосодержащем субстрате и, следовательно, полученная биомасса может быть использована в качестве источника питания или кормовой добавки лишь в крайне ограниченном количестве, не более 5-10% по санитарным нормам, поскольку она обладает неуглеводным типом обмена веществ. Кроме того, в этом способе, предусматривающем одновременное использование смеси веществ, относящихся к различным классам, потребление питательной среды микроорганизмами будет идти в соответствии с явлением полиауксии, что приводит к невозможности перевода обмена веществ микроорганизмов на углеводный тип.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения биомассы (4), в котором выращивание дрожжей производится в две стадии на углеводородах, например, парафинах нефти, в условиях аэрации на каждой стадии, с последующим отделением микроорганизмов от культуральной жидкости. Однако указанный способ, принятый за прототип, обладает тем недостатком, что вторая стадия не содержит углеводов, и, следовательно, на этой стадии тип обмена не меняется на углеводный.

В предлагаемом изобретении была поставлена задача разработки способа получения биомассы микроорганизмов - пищевых дрожжей - на смешанной углеродсодержащей питательной среде, в котором за счет изменения типа обмена веществ микроорганизмов обеспечивается экономия углеводного сырья и достигается улучшения качества биомассы с возможностью широкого использования получаемой биомассы в качестве источника питания в рационе человека и в качестве белковых добавок для корма животных.

Поставленная задача решена путем разработки предлагаемого способа получения биомассы микроорганизмов, преимущественно пищевых дрожжей, включающего культивирование дрожжей на питательной среде, содержащей источник углерода, источник азота и функционально необходимые минеральные добавки, который проводят, по меньшей мере, в две стадии, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода неуглеводное сырье, в условиях аэрации на каждой стадии, с последующим отделением биомассы от культуральной жидкости, причем на первой стадии культивирование дрожжей ведут до полной утилизации ими неуглеводного субстрата и усвояемых продуктов обмена, а на второй стадии - на углеводном сырье в два этапа, на первом из которых осуществляют адаптацию дрожжей к углеводному сырью, а на втором этапе проводят выращивание биомассы до полной утилизации источника углеводного питания, причем источник углеводного питания берут в количестве 0,2-1,0% усвояемых редуцирующих веществ.

Согласно изобретению, на первой стадии выращивания биомассы дрожжевых микроорганизмов с использованием углеводного сырья начинается перестройка обмена веществ с неуглеводного типа обмена на углеводный, и к концу второй стадии культивирования, проводимой в два этапа, эта перестройка типа обмена полностью завершится. Раздельное культивирование биомассы ведут в две стадии, сначала на неуглеводной, а затем на углеводной питательной среде, причем вторую стадию осуществляют в два этапа, на первом из которых проводится адаптация микроорганизмов к углеводному сырью, а на втором этапе - микроорганизмы полностью утилизируют источник углеводного питания, например, мелассу. При этом устраняется явление полиауксии и происходит экономия ценного углеводного сырья. Переводу обмена веществ микроорганизмов с неуглеводного на углеводный способствует именно то, что в начале процесса в ферментер вводят неуглеводный источник углеродного питания и процесс ведут на первой стадии до определенного содержания углевода в биомассе, а именно до 0,001 - 0,019% к массе сухого вещества, т.е. практически до полной утилизации неуглеводного субстрата и усвояемых продуктов обмена, и только после этого полученную биомассу на второй стадии культивируют на углеводном источнике углеродного питания в два этапа: сначала, на первом этапе, осуществляют адаптацию их к углеводному сырью, а потом, на втором этапе, - до полной утилизации этого сырья, путем добавления углеводов в определенном количестве, а именно 0,2 -1,0% в пересчете на редуцирующие сахара.

При этом было установлено, что выращенная биомасса на первой стадии с содержанием углерода в биомассе в пределах 0,001-0,019% способна перейти на второй стадии, протекающей в два этапа, на углеводный тип обмена при последующем добавлении определенного количества питания 0,2 - 1,0% в пересчете на редуцирующие сахара.

В предлагаемом способе на первой стадии выращивания почти полностью завершается перестройка обмена веществ с неуглеводного на углеводный, заканчивается она к концу второй стадии, т.е. после добавления в определенных количествах источника углеводного питания.

Данный способ выращивания применим при периодическом и непрерывном процессах культивирования. При периодическом способе выращивания процесс ведут в одном ферментере с добавлением углеводных источников питания. При непрерывном способе выращивания процесс ведут как минимум в пяти последовательно соединенных ферментерах: в IV-м происходит адаптация и переход к использованию нового источника углеводного питания, а в V-м - завершается полная перестройка обмена веществ на углеводный тип.

Как видно из описания изобретения и приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет улучшить качество получаемой биомассы. Исследования полученной биомассы показали, что в ней отсутствует, в частности, глиоксилатный цикл (спирты, Н-парафины), характерный для микроорганизмов с неуглеводным типом обмена. Такая биомасса отличается от биомассы с неуглеводным типом обмена по количеству связанных аминокислот, по аминокислотному составу белка и т.д.

В дальнейшем способ поясняется примерами.

Выращивание проводили в ферментерах с рабочим объемом 5 л в аппарате непрерывного культивирования микроорганизмов типа АНКУМ-2, последовательно соединенных в батареи из 5-и ферментеров при 800 об/мин, аэрации 2,5 л/мин, 30^oC, pH 5,0 проточным способом.

ПРИМЕР 1 Дрожжи Pichia guiellermondii культивировали на парафинсодержащей среде следующего состава: Питательная среда, г/л KH₂PO₄ - 1,0 MgSO₄ - 0,5 NaCl - 0,1 (NH₄)₂SO₄ - 3,5 CaCl₂ - 0,1 микроэлементы, мг/л KJ - 20
H₃BO₄ - 20
MnSO₄ - 20
(NH₄)₆MO₇O₂₄·7H₂O - 20
Fe₂(SO₄)₃ - 100
витамины, мг/л
Тиамин - 0,2
Рибофлавин - 0,2
Пантетеновая к-та - 0,2
Р-аминобензонат - 0,2
Никотиновая к-та - 0,2
Пиридоксин - 0,2
Инозит - 0,01
Биотин - 0,02
Коэффициенты разбавления в 1,2,3,4,5 ферментерах были равны, соответственно: 0,10; 0,12; 0,14; 0,16; 0,18 ч^-1.

В 1 ферментер подавали Н-парафин и соли, во 2-й и 3-й ферментеры - минеральные соли, в 4-й и 5-й - соли и глюкозу.

Концентрация подаваемых парафинов в 1-й ферментере равна соответственно 1,5%, а концентрация глюкозы в 4-м и 5-м ферментерах равна 0,2 и 0,5%.

В качестве контроля использовали 3-й ферментер из трехступенчатой батареи ферментеров, причем культивирование в 1-м, 2-м и 3-м ферментерах осуществляли на глюкозе и солях, а 3-й ферментер данной трехступенчатой батареи работал в том же режиме, что и 5-й ферментер 5-ступенчатой батареи при росте на Н-парафинах (табл. 1,2 и 3). Условия культивирования 3-ступенчатой батареи те же, что и 5-ступенчатой, а концентрация глюкозы в протоке во всех 3-х ферментерах одинакова и составила 0,7%.

Показатели процесса работ 5-ступенчатой батареи и третьего (контрольного) ферментера 3-ступенчатой батареи приведены в таблицах 1-3.

Как видно из данных таблицы 3, на первой стадии подачи глюкозы в ферментер 5-ступенчатой батареи (ферментер 4) перестройка обмена веществ неуглеводного типа обмена на углеводный не завершена: общее количество липидов, общее количество жирных кислот с четным числом атомов углевода в молекуле и общее количество жирных кислот с нечетным числом атомов углерода в молекуле в 4-м ферментере составило в % соответственно: 4,2; 67,32 и 32,63, в то время как в контроле эти величины составили соответственно 3,3; 95,4 и 4,6%.

Активность изоцитратлиазы в 4-м ферментере составила 0,114 мк. моль/мин/мг белка, в то время как ее активность в контроле была 0,024 мк. моль/мин/мг белка, т. е. практически не функционировала. И только после вторичной подачи глюкозы в 5-й ферментер 5-ступенчатой батареи все вышеперечисленные параметры практически совпадают с контролем, т.е. перестройка обмена веществ с неуглеводного типа обмена на углеводный завершена полностью, т. е. сняты ограничения для применения этих дрожжей в питании человека, сельскохозяйственных животных и птиц.

Кроме того, при последовательном выращивании дрожжей на Н-алканах и после полной их ассимиляции на усвояемых продуктах обмена и на глюкозе потребовалось 7 г глюкозы и полученного при этом 10,8 г биомассы дрожжей, в то время как для получения этого же количества биомассы дрожжей, выращенных на глюкозе в качестве единственного источника углеродного питания, необходимо затратить 21,9 г глюкозы, т.е. в 3,1 раза больше.

Следовательно, применение данного способа позволит значительно сократить расход мелассы, продуктов брожения и т.д.

ПРИМЕР 2.

Выращивание проводили в ферментерах с рабочим объемом 5 л, в аппарате непрерывного культивирования микроорганизмов (АНКУМ-2), последовательно соединенным в батареи из 7-и ферментеров при 800 об/мин, аэрации 0,7, а в 6-м и 7-м аппаратах -0,5 л/мин, 30 С, pH 5,0, проточным способом.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae раса 14 культивировали на этанолсодержащей среде следующего состава:
Питательная среда, г/л
MnSO₄ - 0,7
NaCl - 0,5
(NH₄)₂SO₄ - 2,0
KH₂PO₄ - 1,0
K₂HPO₄ - 0,13
микроэлементы, мг/л
FeSO₄ - 16
CaCl₂·2H₂O - 0,66
ZnSO₄·6H₂O - 0,18
CuSO₄·5H₂O - 0,15
MnSO₄·4H₂O - 0,15
CoCl₂·6H₂O - 0,18
витамины, мг/л
Тиамины - 0,4
Биотин - 0,1
Коэффициенты разбавления 1,2,3,4,5,6 и 7 ферментерах равны соответственно 0,08; 0,12; 0,16; 018; 0,18; 0,20 и 0,22 ч^-1. В первые 3 ферментера поступают соли и этанол, в 4-й и 5-й ферментеры поступают соли, а в 5-й и 6-й ферментеры поступают соль и глюкоза. Концентрация подаваемого этанола в 1,2 и 3 ферментерах была равной соответственно 1,5; 2; 1,5 % вес., а концентрация глюкозы, подаваемой в 5-й ферментер для адаптации дрожжей к углеводному сырью - глюкозе и 6-й ферментер - 0,20 и 0,5%, в котором происходит полная утилизация глюкозы.

В качестве контроля использовали 3-й ферментер из 3-ступенчатой батареи ферментеров, где выращивание во всех 3-х ферментерах вели на одинаковой среде, содержащей в протоке 0,8% глюкозы и соли.

Коэффициенты разбавления в батарее из 3-х ферментеров равны 0,08; 0,15 и 0,22 ч^-1, а аэрация - 0,5 л/мин. Показатели процесса работы 7-ступенчатой батареи и третьего (контрольного) ферментера 3-ступенчатой батареи приведены в таблице 4.

Как видно и таблицы 4, затраты глюкозы для получения 28,5 г биомассы при выращивании культуры на том же углеводе в качестве единственного источника углеродного питания составляет 57,0 г.

Потребность в глюкозе при последовательном выращивании дрожжей сначала на этаноле, а после полного потребления его и усвояемых продуктов обмена на указанном углеводе в качестве единственного источника питания уменьшилась в 8,1 раза.

Как видно из данных таблицы 4, первая подача глюкозы в 6-й ферментер 7-ступенчатой батареи не приводит к перестройке обмена веществ с неуглеводного типа обмена на углеводный, т.к. активность изоцитратлиазы в 6-м ферментере превышает активность в контроле в 4,6 раза, и только вторая подача углевода в 7-й ферментер изменяет тип обмена на углеводный, т. е. снижает ограничения в применении данной биомассы в питании человека и с/х животных.

При последовательном выращивании культуры сначала на этаноле, а затем, после полного потребления его и усвояемых продуктов обмена на глюкозе в две стадии, затрачено 7 г указанного углевода и получено при этом 28,5 г биомассы дрожжей. Но для получения такого же количества дрожжей при выращивании той же культуры на том же углеводе в качестве единственного источника углеродного питания необходимо затратить 57,0 г глюкозы, т.е. в 8,1 раза больше.

Применение предлагаемого способа позволит достичь определенной экономии дорогостоящего углеводного сырья-мелассы, отходов продуктов брожения и др., по сравнению с прототипом, в котором расход их составляет 5-75% от общего объема, в то время как в предлагаемом способе - 0,2-1,0% в пересчете на нередуцирующие сахара.

Так, в частности, при применении предлагаемого способа будет устранен дефицит ценного древесного сырья, равный примерно 2,7 млн. тонн.

Источники информации.

1. Патент Франции N 2226466, кл. A 23 J 1/18, публ. 1974 г.

2. Остапченко Т. П. и др. "Выращивание кормовых дрожжей на среде, содержащей углеводороды и другие источники углерода". Тезисы докл. На конф. "Микробиологический синтез белка"., Пущино, 1968 г., с.40.

3. Патент Великобритании N 1300087, кл. C 6 F, опубл. 1970 г.

4. Патент США N 3822187 кл. 195-8 R, опубл. 1974.

Формула изобретения

Способ получения биомассы микроорганизмов, преимущественно пищевых дрожжей, включающий культивирование дрожжей на питательной среде, содержащей источник углерода, источник азота и функционально необходимые минеральные добавки, которые проводят по меньшей мере в две стадии на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода неуглеводное сырье, в условиях аэрации на каждой стадии, с последующим отделением биомассы от культуральной жидкости, отличающийся тем, что культивирование дрожжей на первой стадии ведут до полной утилизации ими неуглеводного субстрата и усвояемых продуктов обмена, а на второй стадии культивирование дрожжей осуществляют на углеводном сырье в два этапа, на первом из которых осуществляют адаптацию микроорганизмов к углеводному сырью, а на втором этапе проводят выращивание биомассы до полной утилизации источника углеводного питания, причем источник углеводного питания берут в количестве 0,2-1,0% усвояемых редуцирующих веществ.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3