Мутантный штамм бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis dsm 5480 - продуцент дельта-эндотоксина, способ получения препарата на основе дельта-эндотоксина, пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин, способ борьбы с вредными сельскохозяйственными насекомыми, способ получения мутантных штаммов бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis - продуцентов дельта- эндотоксина

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к средствам биологической борьбы с вредными насекомыми. Получен новый штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, продуцирующий 3282-4169 ВТТ US/г дельта-эндотоксина. Штамм получают путем облучения γ-излучением родительского штамма Bacillus thuringiensis DSM 2830, выращивания на среде, способствующей получению аспорогенных или олигоспорогенных мутантов, с последующим отбором полученных полупрозрачных колоний и пересевом их на среду, не содержащую летучих компонентов. Вновь полученные клетки выдерживают при 90^oC в течение часа, затем их инкубируют при 30^oС до получения аспорогенных колоний. Из них отбирают бактерии, засевают в производственную среду. Затем отбирают бактерии, продуцирующие максимальное количество дельта-эндотоксина. На основе полученного дельта-эндотоксина готовят композиции для борьбы с сельскохозяйственными вредителями. Изобретение позволяет увеличить выход дельта-эндотоксина в 2-3 раза по сравнению с родительским штаммом и повысить эффективность в борьбе с сельскохозяйственными насекомыми. 6 с. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл.

Коммерческие препараты Bacillus thuringiensis широко используются во всем мире как биологическое средство борьбы с вредными насекомыми. Достоинствами этих бактериальных инсектицидов является их высокая селективность по отношению к очень узкому кругу насекомых-мишеней и биологическая разлагаемость.

Коммерческие препараты Bacillus thuringiensis могут использоваться вплоть до сбора урожая, не оказывая при этом вредного действия. Bacillus thuringiensis представляют собой палочкообразные аэробные спорообразующие бактерии, уникальная особенность которых состоит в том, что в процессе споруляции они продуцируют одно или более включений, так называемых параспоральных кристаллов. Эти кристаллы состоят из высокомолекулярных белков, называемых дельта-эндотоксинами. Эти дельта-эндотоксины являются активным компонентом выпускаемых коммерческих препаратов Bacillus thuringiensis.

Идентифицировано большое количество штаммов Bacillus thuringiensis с различным спектром насекомых хозяев. По своим флагеллярным антигенам они разделяются на различные подвиды. Особый интерес представляют подвиды Bacillus thuringiensis kurstaki и aizawai, israelensis и tenebrionis, использующиеся для контроля соответственно чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых вредных насекомых.

Впервые сообщение о выделении токсичных по отношению к жесткокрылым Bacillus thuringiensis было опубликовано в 1983 году (A.Krieg и др., Z. and Ent. 96, 500 - 508, европейский патент EP 0149162 A2).

Этот изолят под названием Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis был депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов под номером DSM 2803. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis был выделен в 1982 году из мертвой куколки мучного червя Tenebrio molitor (Tenebrionidae, Coleoptera). Этот штамм продуцирует в каждой клетке одну спору и один или более инсектицидных параспоральных кристаллов, имеющих форму плоских пластин с кромкой длиной примерно 0,8 - 1,5 мкм. Он относится к серотипу H8a, 8b и прототипу C Bacillus thuringiensis (Krieg и др. , System. Appl. Microbiol. 9, 138-141, 1987, патент США 4766203, 1988).

Он токсичен только по отношению к некоторым питающимся листьями личинками жуков (chrysomelidae), но не оказывает действия на гусениц (Lepidoptera), комаров (Diptera) и других насекомых.

Было показано, что Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis позволяет эффективно контролировать личинок колорадского жука. После поглощения кристаллов и спор, продуцируемых Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, или выделенных кристаллов личинки и до некоторой степени взрослые особи колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) перестают есть. Личинки на стадии развития L1-L3 погибают в течение 1 - 3 дней (Schnetter и др., в Fundamental & applied aspects of invertebrate pathology, под редакцией R.A.Samson и др., Proceeding of the 4th Int. colloguium of Invertebrate Pathology, стр. 555, 1986).

Недавно было обнаружено, что помимо кристаллов, активных по отношению к жесткокрылым, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis продуцирует и другие параспоральные кристаллы, палочкообразной, сфероидальной или пластинчатой формы (A. M. Huger и A.Krieg, J. Appl. Ent. 108, 490-497, 1989). Активность этих вторых кристаллов пока не изучена.

На основе Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis были разработаны четыре коммерческих продукта для контроля жесткокрылых вредных насекомых: NOVOPOR® (фирма Novo Nordis k A/s). TRIDENT® (фирма Sandor), Di Terra® (фирма Abbott Laboratories Inc.) и Foil® (фирма Ecogen).

В 1986 году было опубликовано сообщение о выделении другого токсичного для жесткокрылых насекомых штамма Bacillus thuringiensis (Hernnstadt и др., Bio/Technology, т. 4, 305-308, 1986, патент США 4764372, 1988). Этот штамм под названием "Bacillus thuringiensis subsp. sorn diego", M7, депонирован в Northern Regional Researeh Laborotory, США под номером NRRL B-15939. На его основе фирмой Mycogen Corp. выпущен коммерческий продукт.

Сравнительные исследования Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, DSM 2803, и Bacillus thuringiensis subsp. san diego", NRRL-B15939, включавшие фенотипическую характеристику вегетативных клеток, характеристику токсического параспорального кристалла и анализ плазмида ДНК, показали однако, что "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" фактически идентичен ранее выделенному штамму DSM 2803, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg и др. , J. Appl. Ent. 104, 417-424, 1987). Кроме того, нуклеотидные последовательности и производные аминокислотные последовательности активных по отношению к жесткокрылым дельта-эндотоксинных генов Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis и "Bacillus thuringiensis suhsp. san diego" также идентичны.

В тех же самых условиях вышеупомянутые кристаллы второго типа "Bacillus thuringiensis suhsp. san diego" (A.M. Huoger & A. Krieg, J. Appl. Ent 108. 490-497, 1989).

Согласно H. de Barjac & E. Frachon (Entomophaga 35 (2), 233-240, 1990) изолят "Sandiego" аналогичен "tenebrionis", и поэтому нет оснований рассматривать их как различные подвиды.

Возможность использования штаммов Bacillus thuringiensis для контроля жесткокрылых вредных насекомых зависит от эффективности и экономичности способа получения активных по отношению к жесткокрылым токсинов и активности получаемого продукта. Последняя в свою очередь зависит от количества дельта-эндотоксинов, которые могут быть получены путем ферментации активных по отношению к жесткокрылым штаммов Bacillus thuringiensis.

B. thurihgiensis уже давно используются для получения инсектицидов. Однако, хотя предпочтительным было бы использование мутантов B. thuringiensis с более высоким выходом дельта-эндотоксинов, однако такие мутанты не были описаны. Мутанты, продуцирующие дельта-эндотоксины с более высоким выходом, позволили бы разработать более экономичные и эффективные способы получения токсинов B. thuringiensis и дали бы возможность получать продукты B. thuringiensis такой же стоимости, но с более высокой активностью. Последнее, в свою очередь, было бы целесообразно и для потребителя с точки зрения хранения и использования меньших количеств пестицидных композиций для обработки определенных площадей. Кроме того, в этом случае потребителю понадобится меньшее количество контейнеров для хранения таких композиций, что ослабит воздействие их на окружающую среду.

В литературе отсутствует описание усовершенствования способов получения дельта-эндотоксинов с помощью Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis путем мутации.

Одна из проблем использования для контроля личинок жуков в частности B. thuringiensis subsp. tehebrinis связана со сравнительно низкой активностью этих композиций, что требует применения довольно больших количеств их для обработки определенных площадей, а именно 5 - 10 л/га по сравнению с 1 - 2 л/га большинства других продуктов B. thuringiensis и других инсектицидов.

Отсюда следует необходимость получения продуктов с более высокой активностью.

Одним из путей решения этой проблемы является получение более концентрированных препаратов. Это однако привело бы к удорожанию их производства, которое не компенсировалось бы экономией при хранении и транспортировке.

Более изящным решением было бы создание мутантов существующих штаммов B. thuringiensis, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов на клетку.

Краткое описание сущности изобретения.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к вариантным или мутантным штаммам Bacillus thuringiensis, способным продуцировать значительно большие количества токсинов, чем родительский штамм.

Настоящее изобретение относится также к таким обладающим высокой продуцирующей способностью варианты или мутантам B. thuringiensis, относящимся к подвидам tenebrionis.

Предметом настоящего изобретения являются также использование таких вариантов или мутантов штаммов Bacillus thuringiensis для получения пестицидных продуктов и пестицидные композиции, включающие в качестве активного компонента дельта-эндотоксины, продуцированные вариантом или мутантом штаммов Bacullus thuringiensis в соответствии с изобретением.

Предметом настоящего изобретения далее является способ контроля вредных насекомых путем обработки заявляемыми композициями площадей с подлежащими контролю вредными насекомыми, чувствительными к содержащимися в композициях дельта-токсинам.

Предметом настоящего изобретения являются, кроме того, способы селекции или мутации и селекции штаммов B. thuringiensis для получения их вариантов или мутантов, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов, чем их родительский штамм.

Депонирование микроорганизмов В целях подробного описания настоящего изобретения мутант Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, продуцирующий большие количества дельта-эндотоксина, был депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Mascheroderueglb, D-3300 Braunschulig, Федеративная Республика Германия. Это было сделано в целях патентования на указанную ниже дату. DSM, будучи международным депозитарием в соответствии с Будапештским договором, обеспечивает постоянство депонированных микроорганизмов в соответствии с параграфом 9 указанного договора.

Дата депонирования - 10 августа 1989 года Регистрационный номер депозитора - NB 176-1 Обозначение в DSM - DSM 5480 Мутант DSM 5480 был получен путем мутации штамма Basillus thuringiensis subsp. tehibrionis DSM 5526, который также был депонирован в соответствии с Будапештским договором в нижеуказанный срок под нижеуказанным номером.

Дата депонирования - 14 сентября 1989 года Регистрационный номер депозитора - NB 125 Обозначение в DSM - DSM 5526 Подробное описание изобретения Предметом настоящего изобретения являются варианты или мутанты Bacillus thuringiensis, продуцирующие активные дельта-эндотоксины в значительно больших количествах по сравнению с их родительским штаммом.

Под выражением "в значительно больших количествах" в данном описании имеется в виду по меньшей мере в два или большее число раз больших количествах.

И в случае вышеуказанного предмета изобретения в его общем аспекте, и в случае более конкретных его аспектов, о которых будет сказано ниже, дельта-эндотоксины, продуцируемые мутантом B. thuringiensis, активны по отношению к тем же вредным насекомым, что и дельта-эндотоксины, продуцируемые их родительским штаммом, а именно к чешуекрылым (мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. kurstaki и subsp. aizawai), двукрылым (мутанты штамма B. thuringiensis subsp. inraelensis) или жесткокрылым (мутанты штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionis).

Одним из предметов настоящего изобретения является штамм B. thuringiensis, относящийся к подвиду tenibrionis. Продуцируемый им дельта-эндотоксин обладает активностью по отношению к жесткокрылым.

В этом плане по предпочтительному варианту осуществления изобретения вариант или мутант штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionis способны продуцировать более чем в три раза большее количество дельта-эндотоксина по сравнению со штаммом DSM 2803.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретения включает варианты или мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis, способные продуцировать параспоральный кристалл с длиной кромки 2 или более мкм.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение включает варианты или мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis с частотой споруляции в 10-100 или даже в 10⁶ раз меньше частоты споруляции родительского штамма DSM 2803.

В частности, настоящее изобретение относится к депонированному штамму B. thuringiensis subsp. tenebrionsis DSM 5480.

В процессе работы над настоящим изобретением был выделен мутант штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionsis (DSM 5480), продуцирующий в два с лишним раза большее количество дельта-эндотоксина, чем его родительский штамм (DSM 5526). Данные фазоконтрастной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии свидетельствуют о том, что высокая продуцирующая способность этого мутанта связана с изменениями регуляции продуцирования дельта-эндотоксина по сравнению со споруляцией, следствием чего является продуцирование кристаллов белка более чем в пять раз крупных, чем кристаллы, продуцируемые известными штаммами Bacillus thuringiensis, активными по отношению к жесткокрылым. По-видимому, в данном случае пропадает тесная связь между образованием кристаллов и споруляцией, и мутант продуцирует большие количества дельта-эндотоксина до начала споруляции.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения предметом его является использование заявляемых вариантов или мутантом штаммов для получения инсектицидных препаратов на основе B.thuringiеnsis. В соответствии с предлагаемым способом вариант или мутант штамма B. thuringiensis выращивают в подходящей культуральной среде, включающей источники углерода, азота и другие компоненты, известные специалисту в данной области, в течение определенного времени, после чего из среды извлекают образующиеся дельта-эндотоксины.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения полученные вышеописанным образом дельта-эндотоксины B. thuringiensis используют в качестве активного компонента пестицидных композиций.

В таких композициях дельта-эндотоксины в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться как сами по себе, так и в комбинации с другими обладающими биоцидной активностью продуктами.

Настоящее изобретение относится далее к таким пестицидным композициям или препаратам, включающим дельта-эндотоксин в соответствии с настоящим изобретением в смеси с приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства разбавителями или носителями.

Предметом настоящего изобретения, кроме того, являются такие пестицидные композиции или препараты, включающие дельта-эндотоксин B. thuringiensis, в жидкой форме с активностью не менее 15000 BTTU/г, что соответствует концентрации инсектицидного по отношению к жесткокрылым кристаллического белка как минимум 3 весов.%, или в твердой форме с активностью не менее 50000 BTTU/г, что соответствует концентрации инсектицидного по отношению к жесткокрылым кристаллического белка как минимум 10 весов.%.

Предметом настоящего изобретения, в частности, являются пестицидные композиции на основе DSM 5480, имеющие по меньшей мере вдвое большую активность по сравнению с пестицидными композициями на основе DSM 2803 или других активных по отношению к жесткокрылым штаммов Btt.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены в любой форме, используемой при получении агрохимикатов, например, в форме суспензии, дисперсии, водной эмульсии, порошка для опыливания, диспергируемого порошка, концентрата эмульсии или гранулята. Кроме того, они могут выпускаться в виде препаратов, готовых для непосредственного употребления, или в виде концентратов или первичных композиций, которые перед употреблением необходимо разбавлять определенным количеством воды или другого разбавителя.

Концентрация обладающих инсектицидной активностью дельта-эндотоксинов B. thuringiensis в композициях в соответствии с настоящим изобретением при использовании их индивидуально или в комбинации с другими пестицидами для обработки растений предпочтительно находится в пределах от примерно 0,5 до примерно 25, наиболее предпочтительно 1-15 весов.%.

Предметом настоящего изобретения является также способ контроля вредных насекомых, по которому зараженные такими насекомыми площади обрабатывают пестицидной композицией в соответствии с изобретением.

Указанными вредными насекомыми, в частности, являются насекомые, относящиеся к группе чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых, предпочтительно к жесткокрылым, таким как колорадский жук.

По предпочтительному варианту осуществления изобретения контроль вредных насекомых может осуществляться путем обработки площадей жидкими (из расчета 1,14 л/0,4 га) или твердыми (из расчета 227 г/0,.4 га) пестицидными композициями.

Активные препараты или композиции B. thuringiensis в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться непосредственно для обработки растений, например, путем опрыскивания или опыливания, в момент появления на них вредных насекомых. Предпочтительным способом обработки является опрыскивание. Как правило, желательно производить обработку на ранних стадиях развития личинок, так как в это время ущерб, наносимый растениями, является минимальным.

По одному из способов мутации штаммов Bacillus thuringiensis и селекции мутантов, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов, чем их родительские штаммы, родительский штамм; I) обрабатывают мутагеном;
II) обработанные мутанты выращивают на среде, подходящей для селекции аспорогенных и/или олигоспорогенных штаммов;
III) отбирают полупрозрачные колонии и выращивают их в среде, не летучей при нагревании; и
IV) отбирают истинно аспорогенные штаммы, подвергая колонии термообработке.

По предпочтительному варианту этого способа отобранные таким образом колонии выращивают в обычной производственной питательной среде и окончательно отбирают штаммы, способные продуцировать большие количества дельта-эндотоксина.

На стадии (I) указанного способа в качестве мутагена можно использовать любой подходящий химический мутаген, например N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин или этилметансульфонат. По другому варианту родительский штамм может быть подвергнут электромагнитному облучению, например γ-, рентгеновскому или УФ-облучению.

На стадии (II) подходящей средой может быть модифицированная питательная споруляционная среда, включающая фосфат (NSMP-среда), описанная Johnson'om и др. в "Spores VI" под ред. P. Gerhardt'a и др., стр. 248-254, 1975.

На стадии (IV) предлагаемого способа в качестве подходящей среды можно использовать среду NSMP с добавкой MgCl₂ и Gelrite, Kelco.

По другому варианту обеспечивающие высокие выхода варианты или мутанты в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены путем выращивания родительского штамма в жидкой среде и отбора спонтанных мутантов или вариантов после распыления культуральной жидкости на агарной среде, пригодной для селекции аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов.

В качестве других методов выделения, обеспечивающих высокий выход вариантов или мутантов в соответствии с настоящим изобретением можно упомянуть отделение массы таких мутантов непосредственно путем центрифугирования или с помощью других средств, используемых для разделения масс.

Пример 1
Выделяли мутант B. thuringiensis subsp. tenebrionis, обеспечивающий получение дельта-эндотоксина в два с лишним раза большем количестве. Фазоконтрастная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия свидетельствует о том, что высокая продуцирующая способность этого мутанта связана с изменениями регуляции продуцирования дельта-эндотоксина по сравнению со споруляцией, что приводит к продуцированию кристаллов белка в пять с лишним раз более крупных, чем кристаллы, продуцируемые известными активными по отношению к жесткокрылым штаммами Bacillus thuringiensis. По-видимому, в этом случае исчезает тесная взаимосвязь между образованием кристаллов и споруляцией, и мутант продуцирует большие количества дельта-эндотоксина до споруляции.

Получение обладающего высокой продуцирующей способностью мутанта
Споры штамма DSM 5526 B. thuringiensis subsp. tenebrionis облучали γ-излучением дозой 7 кГи. Облученные споры распределяли на агаровых пластинках NSMP (модифицированная питательная споруляционная среда, включающая фосфат, описанная Johnson'om и др. в "Spore VI", под ред. P. Gerhardt'a и др., стр. 248-254, 1975) - среде, подходящей для отделения аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов.

Пластинки агара NSMP инкубировали при 30^oC в течение 2 - 3 дней, отбирали полупрозрачные колонии и переносили их на гельритовые пластины NSMP (среда NSMP с добавкой 0,57 г/л MgCl₂ и 20 г/л Gelrite, Kelco).

Гельритовые пластины NSMP инкубировали в течение часа при 90^oC и затем в течение 1 - 2 дней при 30^oC.

Отбирали хорошо развивающиеся в этих условиях на гельритовых пластинах NSMP мутанты. Таким образом удавалось отсеивать все аспорогенные мутанты, так как они переставали размножаться после термообработки.

Отобранные мутанты выращивали во встряхиваемых колбах с производственной питательной средой. Количество продуцируемого дельта-эндотоксина определяли иммунологическими методами, описание которых приведено ниже.

Отбирали только мутанты, продуцирующие значительно большие количества дельта-эндотоксина, чем родительский штамм.

Морфологию выделенных мутантов на твердой среде и в жидких средах изучали с помощью фазоконтрастной микроскопии (х 2500) и сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Подсчитывали количество образующихся спор и кристаллов и определяли размер кристаллов белка.

Из полученных мутантов был выделен один (DSM 5480), отличающийся исключительной способностью продуцировать дельта-эндотоксин.

Количество дельта-эндотоксина, продуцируемого мутантом DSM 5480, сравнивали с количеством дельта-эндотоксина, продуцируемого DSM 2803, исходным изолятом Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, штаммом DSM 5526 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, используемым для получения NOVODOR®, штаммом NB178 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, выделенным из продукта фирмы Sandoz TRIDENT® 1989 на основе Bacillus thuringiensis tenebrionis, штаммом NB 198, выделенным из продукта фирмы Sandoz TRIDENT® 1990 на основе B. thuringiensis subsp. tenebrionis, штаммом NRRL-B-115939 "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" и штаммом NB 197, выделенным из продукта фирмы Mycogen Mo-ONE® от 1990 на основе B. thuringiensis subsp. san diego". Как видно из таблицы 1 примера 2, мутант повышенной эффективности в отношении выхода в соответствии с настоящим изобретением продуцирует в 2 - 3,5 раза большее количество дельта-эндотоксина, чем известные активные по отношению к жесткокрылым штаммам Bacillus thuringiensis.

Пример 2
В данном примере сравнивались количества дельта-эндотоксина, продуцируемого мутантом DSM 5480 Bacullus thuringiensis subspecies tenebrionis и штаммами Bacullus thuringiensis subspecies tenebrionis DSM 2803 (исходный изолят Bacullus thuringiensis subsp. tenebrionis), DSM 5526 (производственный штамм фирмы Novo-Nordisk) и NB 178 и NB 198 (производственные штаммы фирмы Sandoz), а также Bacullus thuringiensis subsp. san diego, штаммами NRRL-B 15939 и NB 197 (производственные штаммы фирмы Mycogen) в производственной среде. Каждый из перечисленных штаммов выращивали в течение 17 часов при 30^oC на косячках агара следующего состава (в г/л дистиллированной воды):
пептон, Difco - 5 г
мясной экстракт, Difco - 3 г
агар, Difco - 20 г
pH - 7,0
5 мл суспензии клеток каждого штамма переносили затем в baffle-донные колбы Эрленмейера на 500 мл со 100 мл производственной питательной среды. Производственная питательная среда имела следующий состав (количества компонентов указаны в г на л водопроводной воды):
соевая мука - 50 г
гидролизованный крахмал - 40 г
KH_PPO₄ - 1,77 г
K₂HPO₄ - 4,53 г
pH - 7,0
Инокулированное содержимое колб инкубировали при 30^oC при встряхивании (250 об. /мин). После инкубации в течение 96 часов культуральную жидкость анализировали на содержание дельта-эндотоксина иммуногологическими методами.

Количество дельта-эндотоксина, продуцируемого тем или иным штаммом, определяли с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Лауреллу (RIE) и фотометрического иммуноанализа (RIA), с использованием антител по отношению к очищенным кристаллам белка из Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.

Отбирали по 400 мг культуральной жидкости из каждого опыта, добавляли к отобранным пробам по 7 мл тринатрийфосфатного буфера (0,125 М, pH 12) и встряхивали суспензии в течение часа для солюбилизации дельта-эндотоксионных белков.

Пробы затем центрифугировали при 3500 об. /мин в течение 15 минут и анализировали надосадочную жидкость на содержание дельта-эндотоксина с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Лауреллу в сыворотку по отношению к очищенным кристаллам белка B. thuringiensis subsp. tenebrionis. Для определения количества дельта-эндотоксина использовали стандарты с известным содержанием кристаллов белка.

Концентрацию кристаллического белка также определяли с помощью фотометрического иммуноанализа. Кристаллические белки растворяли в щелочном растворе. Растворенные белки осаждали их антителами. Скорость реакции определяли турбодиметрически. Для определения количества дельта-эндотоксина использовали стандарты с известным содержанием кристаллического белка.

Используемые в ходе анализа для получения антител кристаллические антигены получали из кристаллов, выделенных из B. thuringiensis subsp. tenebrionis.

Поликлональные антитела индуцировали путем инъекции кроликам подкожно раз в две недели 0,25 мл кристаллического антигена.

Полученные результаты приведены в нижеследующих таблицах 1a и 1b. Выхода дельта-эндотоксина выражали в BTTU/г (единицы на г культуральной жидкости, определенные с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Лауреллу (RIE) или фотометрического иммуноанализа (RIA)). Величина, полученная для чистого кристаллического белка B. thuringiensis subsp. tenebrionis, равна 50000 BTTU/г. Величины, приведенные в таблице 1a (см. в конце описания), представляют собой средние из 6 - 7, а в таблице 1b - из 3 независимых опытов по ферментации.

Из таблиц Ia и Ib видно, что DSM 5480 продуцирует в три с лишним раза больше дельта-эндотоксина, чем родительский штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (DSM 2803) и "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" штамм NRRL-B 15939) и в два с лишним раза больше, чем используемые в настоящее время для получения коммерческих продуктов штаммы Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.

Фазоконтрастная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, мутанта DSM 5480, показали, что кристаллы белка, продуцируемые этим мутантом, намного крупнее соответствующих кристаллов белка, продуцируемых штаммами Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198, а также штаммами "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" NRRL-B 15939 и NB 197.

Культуральную жидкость мутанта Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480 испытывали на активность по отношению к личинкам колорадского жука. Большее количество дельта-эндотоксина, продуцированного мутантом DSM 5480 (это было установлено с помощью иммунологических методов) отражалось на биологической активности по отношению к личинкам колорадского жука.

Пример 3
В данном примере сравнивались процессы споруляции и образования параспоральных кристаллов под действием штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198 и мутанта DSM 5480, а также штаммов "B. thuringiensis subsp. san diego" NRRL-B 15939 и NB 197 на твердой и в жидкой средах.

Каждый из перечисленных штаммов выращивали в течение 2 дней при 30^oC на агаровых пластинах следующего состава (в г на л дистиллированной воды):
пептон, Difco - 5 г
мясной экстракт, Difco - 3 г
агар, Difco - 20 г
pH - 7,0
Каждый из перечисленных штаммов выращивали также в жидкой среде. Все штаммы выращивали на агаровых косячках в течение 17 часов при 30^oC. По 5 мл суспензии клеток каждого из штаммов переносили затем в baffle-донные колбы Эрленмейера на 500 мл со 100 мл питательной среды.

Питательная среда имела следующий состав (в г на л водопроводной воды):
Жидкая среда
дрожжевой экстракт - 5 г
триптон - 5 г
глюкоза - 1 г
KH₂PO₄ - 0,8 г
pH - 7,0
Инокулированное содержание колб инкубировали при 30^oC в течение 96 часов при встряхивании (250 об./мин).

Морфологию штаммов на твердой среде и в жидкой среде изучали ежедневно с помощью фазоконтрастной микроскопии (х 2500). Подсчитывая количество спор и кристаллов, а также определяли размер параспоральных кристаллов. Отдельные пробы изучали, кроме того, с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии.

Все штаммы B. thuringiensis subsp. tenebrionis (DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198) и "B. thuringiensis subsp. san diego" (NRRL-B 15939 и NB 197) хорошо спорулировались в обеих средах. Перед лизисом каждая клетка содержала спору и параспоральный кристалл. К моменту лизиса клетки длина кристаллов находилась в пределах от 0,4 до 0,9 - 1,1 мкм. Средняя длина кристаллов равнялась 0,6 - 0,7 мкм.

Мутант DSM 5480 продуцировал лишь небольшое количество спор (< 10⁶ спор/мл) на твердой среде и в вышеуказанной жидкой среде. Перед лизисом в большинстве клеток находился огромный кристалл, но не было спор. Размер кристаллов белка находился в пределах от 0,4 - 0,7 до 5,0 мкм. В среднем длина кристалла составляла 2,2 - 2,3 мкм.

Ультраструктурный анализ клеток, выращенных в этих средах, выполненный с помощью просвечивающей электронной микроскопии, показал, что процесс споруляции в мутанте начался, но не закончился к моменту лизиса клеток. В различных клетках процесс споруляции дошел до разных стадий. В клетках, в которых процесс споруляции достиг лишь стадии 11 (образование предспоры Septum), кристаллы белка заполнили весь объем клеток.

В производственной питательной среде (пример 2) указанный мутант продуцировал большее количество спор (10⁷ - 10⁸ спор/мл). В этой среде частота споруляции мутанта в 10 - 100 раз меньше, чем в случае родительского штамма.

Таким образом, мутант сохранял свою способность продуцировать нормальные споры. Однако частота споруляции, по всей видимости, сильно зависит от состава питательной среды.

Размеры кристаллов белка, продуцируемых отдельными штаммами, приведены в таблицах IIa и IIb (см. в конце описания).

Из таблиц IIa и IIb видно, что мутант DSM 5480 продуцирует значительно более крупные кристаллы белка, чем любой из известных штаммов B.t., активных по отношению к жесткокрылым.

Из полученных данных следует, что регуляция продуцирования дельта-эндоксина в отношении споруляции претерпела изменение в мутанте.

По-видимому, мутант продуцирует кристаллы белка до развития спор, благодаря чему клетки оказываются в состоянии продуцировать дельта-эндотоксин в течение более длительного времени. В результате к моменту лизиса клеток продуцируются значительно более крупные кристаллы, чем в случае родительского штамма.

В зависимости от наличия в питательной среде тех или иных питательных веществ и размера кристаллов белка к моменту споруляции нормальные споры начинают развиваться до лизиса клеток.

Пример 4
В данном примере мутант Btt DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью использовался для получения высокоактивных продуктов для контроля личинок колорадского жука.

Ферментацию DSM 5480 осуществляли в описанной в примере 2 производственной питательной среде в аэрируемом промышленном фенментере с перемешивающим устройством. Через 96 часов культуральную жидкость отделяли путем центрифугирования в непрерывной центрифуге.

Концентрированную расслоившуюся эмульсию, содержащую активные кристаллы белка, стабилизировали путем добавления микробных консервирующих добавок и pH ее устанавливали равным 5,0.

Часть этой эмульсии высушивали в распылительной сушилке и затем использовали для получения смачивающегося порошка. Оставшуюся часть эмульсии непосредственно использовали для получения двух водных текучих концентратов (FC).

Смачивающийся порошок имел состав, приведенный в таблице Ш. Состав обеих жидких текучих композиций приведен в таблице IV (см. в конце описания).

Поверхностно-активные вещества были выбраны из большого числа суспензий вспомогательных добавок и смачивателей, обычно использующихся при получении пестицидов для сельского хозяйства.

В качестве антислеживающего агента использовали гидрофильный диоксид кремния, а инертный носитель был выбран из числа обычно использующихся инертных наполнителей, таких как бентониты, неорганические соли и глины.

В качестве консервирующих добавок в FC использовали добавки, применяющиеся в пищевой и косметической промышленности. В качестве регулятора pH использовали неорганическую кислоту.

Пример 5
Для проверки биологической активности мутанта Btt DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью по отношению к основному вредному насекомому, личинкам колорадского жука, были проведены полевые испытания. Для сравнения использовали два коммерческих продукта: Triden® и M-one®. В качестве культуры, на которой проводились испытания, использовали картофель.

Растения картофеля трижды опрыскивали испытуемым препаратом: 20 июля, 27 июля и 3 августа (второе поколение личинок). В конце описания (табл. IVa) приведены используемые препараты и дозировки.

Средний % контроля личинок колорадского жука по сравнению с необработанными контрольными растениями приведен в таблице V. Необработанные контрольные растения были очень сильно поражены колорадским жуком: 370 личинок на 20 растений I-го и 904 личинки на 20 растений 8-го августа.

Приведенные результаты убедительно свидетельствует о том, что препараты, полученные на основе мутанта DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью обладают высокой эффективностью в отношении контроля личинок колорадского жука при полевых испытаниях. Кристаллы белка, продуцируемые штаммом с высокой продуцирующей способностью, проявляют 100%-ную активность при использовании их в виде NOVODOR®FC при расходе 1,71 л, а также дают хорошие результаты при использовании их в виде TRIDENT'а при расходе 4,56 л и M-one' а при расходе 2,28 л.

Формула изобретения

1. Мутантный штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480 - продуцент дельта-эндотоксина.

2. Способ получения препарата на основе дельта-эндотоксина путем выращивания штамма бактерий Bacillus thuringiensis на питательной среде, содержащий источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением продукта, содержащего дельта-эндотоксин, отличающийся тем, что из бактерий Bacillus thuringiensis используют штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что продукт выделяют в индивидуальном виде или в комбинации с клетками бактерий и/или со спорами и смешивают его с наполнителем, приемлемым для сельского хозяйства.

4. Пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин, отличающаяся тем, что она содержит дельта-эндотоксин, полученный из штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.

5. Пестицидная композиция по п.4, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит разбавитель или носитель, приемлемый для сельского хозяйства.

6. Жидкая пестицидная композиция, отличающаяся тем, что она содержит разбавитель и дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, с активностью не менее 15000 ед/г, что соответствует концентрации в препарате эндотоксина, активного по отношению к жесткокрылым насекомым, не менее 3,0 вес.%.

7. Жидкая пестицидная композиция по п.6, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.

8. Твердая пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин и носитель, отличающаяся тем, что она содержит дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, с активностью 50000 ед/г, что соответствует концентрации в препарате эндотоксина, активного по отношению к жесткокрылым насекомым не менее 10 вес.%.

9. Твердая пестицидная композиция по п.8, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.

10. Способ борьбы с вредными сельскохозяйственными насекомыми путем обработки растений препаратом, содержащим дельта-эндотоксин, отличающийся тем, что используют препарат, содержащий дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.

11. Способ получения мутантных штаммов бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis продуцентов дельта-эндотоксина, отличающийся тем, что родительский штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis обрабатывают мутагеном, обработанные мутанты выращивают на среде, способствующей получению аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов, из полученных колоний отбирают полупрозрачные колонии и из них бактерии пересеивают на твердую питательную среду, не содержащую летучие компоненты, выдерживают при температуре 90^oC в течение часа, а затем инкубируют при температуре 30^oC до получения аспорогенных колоний, из них отбирают клетки бактерий, засеивают на производственную питательную среду и отбирают штаммы, продуцирующие наибольшее количество дельта-эндотоксина.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве мутагена используют ультрафиолетовые излучения.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве питательной среды, способствующей получению аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов, используют споруляционную среду, содержащую фосфат.

14. Способ по пп. 11-13, отличающийся тем, что в качестве питательной среды для пересева клеток бактерий используют среду NSMP, дополнительно содержащую 0,57 г/л MgCl₂ и 20 г/л гельрита Kelco.

15. Способ по пп.11-14, отличающийся тем, что в качестве родительского штамма используют штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803.

Приоритет по пунктам:
17.11.89 - по пп.1, 2, 4, 5, 10-15 и п.3, исключая признак, касающийся выделение эндотоксина в комбинации с клетками и/или спорами;
12.12.89 - по пп.6-9 и п.3 - признак, касающийся выделения эндотоксина в комбинации с клетками или спорами.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2