Способ экспресс-выявления облученных пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций

 

Изобретение относится к клеточной биологии, может быть использовано в экспериментальной и клинической практике. Сущностью изобретения является упрощение способа за счет того, что аномалии ядер интерфазных лимфоцитов типа "хвостов" в мазках крови используют как маркер выявления пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций после радиационных воздействий, по повышенной частоте встречаемости таких лимфоцитов (0,8% и выше) выявляют пациентов с повышенной частотой хромосомных аберраций. Технический результат - ускорение выявления последствий воздействия мутагенных факторов. 8 ил.

Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к медицине, а точнее к способам выявления последствий воздействия мутагенных и, в первую очередь, радиационных факторов на организм человека.

Целью изобретения является разработка метода выявления хромосомных аберраций дицентрического типа, возникающих преимущественно после радиационных воздействий. В настоящее время такой тип аберраций выявляется с помощью метафазного и анафазного методов учета хромосомных аберраций (Бочков и др., 1972). Предложенный метод основан на определении частот встречаемости клеток с определенными типами морфологических аномалиий ядер, которые, в свою очередь, появляются в клетках после завершения митозов (ана-и телофаз) с хромосомными мостами, сформированными дицентрическими хромосомами.

Сущность известного способа, взятого в качестве прототипа, заключается в следующем: в популяциях двухядерных лимфоцитов после культивирования in vitro и цитохалазинового блока определяют частоту встречаемости клеток с микроядрами. Микроядра являются одной из форм аномалий ядер интерфазных клеток и свидетельствуют о частоте возникновения клеток с измененными кариотипами (хромосомными аберрациями, геномными мутациями). Таким образом, микроядерный метод основан на определении частоты встречаемости клеток с микроядрами, которые указывают на факт свершившихся кариотипических нарушений (Fenech, Morley 1985, Muller, Streffer, 1995).

Известный способ-прототип применяется с целью выявления спонтанных и индуцированных различными факторами частот хромосомных аберраций.

В результате применения известного способа (микроядерного метода) были выявлены мутагенные свойства факторов различной природы и установлены факты воздействия ионизирующей радиации (см. обзор Muller, Streffer, 1995).

Известно, что после воздействия ионизирующей радиации на организмы возникают клетки с дицентрическими хромосомами, которые являются радиационными маркерами (Lloyd et al., 1980). Вместе с тем, известно также, что дицентрические хромосомы в результате завершения митозов формируют ана-и телофазные мосты (Бочков и др., 1972). Завершением митозов с хромосомными мостами может быть формирование интерфазных клеток с хромосомными мостами (Алов, 1972) и (или), если происходит разрыв мостов - формирование клеток с полумостами, иначе говоря, с "хвостатыми" ядрами (Прокофьева-Бельговская, 1961). Выявлена положительная корреляция между показателями "частота клеток с "хвостатыми" ядрами" с одной стороны, "частота ана-и телофаз с хромосомными мостами" и "частота клеток с хромосомными мостами" - с другой, в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы крыс (Прошин и др., 1997).

В литературе не известны работы, в которых аномалии ядер типа "хвостов" использовались как маркер хромосомных аберраций и в целях биоиндикации лучевых воздействий на организм человека.

Целью изобретения является экспресс-выявление пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций (дицентрических хромосом), основанное на определении частоты встречаемости аномалий ядер типа "хвостов" в популяциях лимфоцитов периферической крови для проведения экспресс-диагностики лучевых воздействий.

Известно, что для выявления последствий воздействия ионизирующей радиации используется метафазный метод определения хромосомных аберраций. Однако для проведения этого метода требуются стерильные условия для взятия и культивирования крови из вены, определенное лабораторное оборудование и реактивы, а также значительные затраты времени квалифицированного персонала. По этой причине далеко не все пациенты из числа свыше 800 000, подвергшихся радиационному воздействию вследствие аварии на ЧАЭС, обследованы на предмет хромосомных аберраций. Сказанное справедливо и для метода-прототипа - микроядерного теста в популяциях двуядерных лимфоцитов после их культивирования in vitro.

В связи с этим существует необходимость разработки экспресс-метода, с помощью которого можно достаточно точно выявлять частоты хромосомных аберраций и особенно частоты дицентрических хромосом, т.к. они являются одним из хромосомных радиационных маркеров. Таким методом может послужить определение частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови in vivo (в мазке крови из пальца).

Сущность заявленного способа заключается в том, что у пациентов берут обычным способом каплю крови из пальца, получают из нее мазок, фиксируют его и окрашивают по Гимза. С помощью светового микроскопа определяют частоту встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в выборках не менее чем из 500 клеток.

В качестве материала для исследования предложенным методом могут использоваться мазки периферической крови из пальца или из вены, окрашенные различными методами, выявляющими хроматин и идентифицирующими лимфоциты.

Критерием метода является повышенная частота лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами. Если частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами у обследуемых пациентов превысит 0,8%, то у таких пациентов следует ожидать повышенную частоту хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови.

При проведении исследования предложенным методом 160 облученных пациентов (156 из которых к моменту исследования были облучены 6-10 лет назад вследствие аварии на ЧАЭС дозами до 0,25 Gy, а 4 - дозами свыше 1,5 Gy вследствие аварийных ситуаций), было отобрано 22 человека, у которых частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами составила от 0,8% и выше. Дальнейший цитогенетический анализ метафазным методом выявил повышенную частоту хромосомных аберраций (дицентрических хромосом) у 17 человек из этой отобранной группы.

Отличительными признаками заявленного решения являются следующие признаки: использование в качестве биоматериала для исследования мазков периферической крови из пальца, т.е. проведение анализа в условиях in vivo, а не in vitro; критериями, указывающими на хромосомные аберрации в лимфоцитах, являются аномалии ядер типа "хвостатых" ядер; значительно меньшая продолжительность проведения одного анализа по времени.

Существенным признаком является определение частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови in vivo. В результате исследования, проведенного предложенным методом, удалось отобрать пациентов с высокой частотой хромосомных аберраций (дицентрических хромосом), представляющих группу генетического риска.

Преимущество предлагаемого метода заключается в следующем: использование в качестве объекта исследований легко доступного материала (мазков крови), малые, по сравнению с другими цитогенетическими методами, затраты времени для проведения анализа, дешевизна и простота метода, не требующая высокой квалификации медперсонала. Перечисленные преимущества позволяют проводить анализ предлагаемым методом в полевых условиях, ретроспективно - на мазках крови, находящихся в архивах, и осуществлять, таким образом, широкомасштабный прескрининг и мониторинг на предмет хромосомных аберраций.

Наличие "хвостатого" ядра в лимфоците, вероятнее всего, указывает на тот факт, что в митозе, в результате которого этот лимфоцит образовался, дицентрическая хромосома проявилась в виде хромосомного моста и изменила в последующем форму ядра этой клетки. Исходя из этого информативность показателя "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови in vivo" при оценке цитогенетического гомеостаза популяций лимфоцитов в организме включает следующее.

Во-первых: показатель "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами" указывает на то, с какой интенсивностью клетки, имеющие хромосомные аберрации делятся в организме in vivo. Другие методы ("комет", метафазный, микроядерный тест в блокированных цитохалазином B лимфоцитах и т.п.) прямо такой информации не дают. В связи с угрозой риска возможных злокачественных перерождений после облучения более актуальным может быть не вопрос о том есть ли в организме аберрантные клетки, а вопрос о том, насколько интенсивно эти аберрантные клетки делятся в отдаленные сроки после мутагенных воздействий.

Во-вторых: по показателю "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами" можно судить о том, что в популяциях лимфоцитов были (и с большой вероятностью еще остаются) дицентрики. Возможно, что в популяциях лимфоцитов с высокой частотой встречаемости "хвостатых" ядер идут процессы "разрыв-слияние-мост". Необходимо отметить, что в пролиферирующих клеточных популяциях сильную корреляцию между показателями "частота хвостов" и "частота дицентриков" следует ожидать в том случае, если сначала регистрируется частота дицентриков, а затем (после митоза) - частота "хвостатых" ядер. В ситуации, когда сначала определяют частоты "хвостатых" ядер, а затем частоты дицентриков, такая корреляционная связь должна быть слабее.

В-третьих: по частоте встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами, а также по степени их морфологического разнообразия можно судить об интенсивности предшествующих мутагенных (лучевых) воздействий, и точность такой оценки будет обратно пропорциональна времени, прошедшему с определенного момента после этих воздействий.

В способе-прототипе используется культивирование лимфоцитов in vitro, критерием хромосомных аберраций являются микроядра, которые часто элиминируются из цитоплазмы клеток (Ford et al., 1988, Кравцов и др., 1991) и индуцируются широким спектром мутагенов, а не преимущественно ионизирующей радиацией (Muller, Streffer, 1995).

Исследование частот хромосомных аберраций, вызванных радиационными факторами, заявляемым методом позволит расширить масштабы цитогенетических исследований в радиационно загрязненных регионах, повысит эффективность выявления пациентов (главным образом ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС и людей, пострадавших от этой аварии) с высокими частотами хромосомных аберраций.

Предлагаемый способ может применяться в практической медицине: в районных поликлиниках, в которых ведется наблюдение за облученными пациентами, а также в медицинских кабинетах предприятий, связанных с загрязнениями потенциально мутагенными факторами.

Пример конкретного выполнения.

Опытную группу составили 160 человек (мужчины) в возрасте от 30 до 70 лет, подвергавшиеся воздействию ионизирующей радиации 6 - 10 лет назад. 156 человек из опытной группы были участниками ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, а 4 были облучены в результате аварийных ситуаций. По данным истории болезни 156 человек из этой группы получили малые дозы облучения (до 0,25 Gy) и 4 получили большие дозы облучения (более 1,5 Gy).

Контрольные группы составили 89 здоровых мужчин в возрасте от 19 до 60 лет, 50 женщин в возрасте от 20 до 60 лет и 37 детей в возрасте от 3 до 6 лет, не подвергавшихся ранее (по анкетным данным) радиационному воздействию. Обследованные пациенты (за исключением 3 человек) и лица контрольных групп в течении 5 последних лет проживают в Северо-Западном и Волго-Вятском районах РФ. Во время проведения исследования у всех обследованных пациентов и лиц контрольной группы инфекционных заболеваний не наблюдалось.

Гематологические препараты периферической крови приготавливали обычным способом: на чистые обезжиренные предметные стекла наносили каплю и с помощью стекла с отшлифованным краем делали мазок средней толщины. При этом исследуемые клетки крови располагались равномерно одним слоем на 1/3 площади мазка. Полученные мазки крови высушивали, фиксировали 96% этиловым спиртом, а затем окрашивали по Гимза.

Частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами, с мостами и с микроядрами определяли в выборках из 500 лимфоцитов.

Для определения частот встречаемости лимфоцитов с аномальными ядрами использовали по 3-4 препарата от каждого пациента. Не учитывались малые лимфоциты и лимфоциты, расположенные на периферии мазков. Перечисленные аномалии ядер регистрировались в том случае, если лимфоцит не имел признаков дегенерации и повреждений, а его цитоплазма была ровной округлой формы.

Препараты метафазных хромосом лимфоцитов человека получали через 48 ч культивирования in vitro по методике, предложенной Moorhead еt al., 1961 с некоторыми модификациями. У каждого исследуемого пациента анализировали от 100 до 300 метафаз.

Статическую достоверность различия сравниваемых значений частот оценивали с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Коэффициент корреляции определяли по Спирмену.

"Хвосты" ядер лимфоцитов представляют собой морфологические аномалии интерфазных ядер. При этом ядро имеет тонкий вырост в пространство цитоплазмы. Часто такой вырост завершается расширением тела "хвоста" на конце. Длина ядерных "хвостов" варьирует от 2 мкм до 7 мкм. Цвет, хроматиновая структура и интенсивность окрашивания "хвостов" соответствует характеру окрашивания ядер лимфоцитов в которых они наблюдаются.

Различные морфологические типы "хвостов" ядер, наблюдаемых в лимфоцитах периферической крови у человека, систематизированы и представлены на фиг. 1 (схема) и на фиг. 2 (фотографии). Обнаруживаются несколько основных типов: 1-3 это "хвосты", имеющие относительно толстую ножку с расширением на конце. Хроматин этих "хвостов" как и у ядра слабоконденсированный без уплотнений и признаков пикнотизации. Типы 1-3 различаются только по длине (длинные - от 1/2 до 1/3 диаметра ядра, средние - от 1/3 до 1/4 диаметра ядра и короткие - менее 1/4 диаметра ядра).

4 - "хвосты" вытянутой формы без перетяжки у основания ядра и расширения на конце. Хроматин различной степени конденсации. Длина не менее 1/4 диаметра ядра, а толщина не менее 1/6 диаметра ядра.

5 - по размерам и форме схожи с типом 4, но отличаются наличием перетяжки у основания ядра.

6-8 - "хвосты" этих типов имеют тонкую ножку различной длины и расширение на конце в виде каплевидного или круглого микроядра, в которых хроматин, как правило, конденсирован по периферии, а в центре наблюдается просвет. Типы 6-8 различаются между собой только по длине аналогично типам 1-3.

9 - отличается от типов 6-8 только наличием разрыва хроматина в ножке.

10 - "хвосты" тонкие и длинные без расширения на конце.

11 - в месте прикрепления "хвоста" имеется деформация ядра, 12 - "хвосты" с двумя последовательно расположенными расширениями.

13 - "хвосты" на тонкой раздвоенной ножке с расширениями на конце.

14 - "хвосты", имеющие одно расширение в виде каплевидного или круглого микроядра, связанного двумя ножками с ядром.

15 - у "хвостов" этого типа за расширением в виде микроядер имеется продолжение тонкого хроматинового тяжа.

16 - ядра с двумя "хвостами" любых перечисленных выше типов.

Следует отметить, что в клетках со всеми перечисленными типами "хвостов" ядер встречаются и микроядра.

Важно отметить, что радиационный фактор индуцирует фенотипическое разнообразие "хвостов" ядер. У облученных пациентов наблюдаются "хвосты" всех 16 типов. Напротив, у здоровых доноров преобладают "хвосты" типов 6-8.

Очевидно, что во всех случаях "хвосты" ядер представляют один хроматиновый тяж (типы 1-12, 15, 16) или 2 хроматиновых тяжа (типы 13 и 14). Из 500 наблюдаемых нами "хвостатых" ядер лимфоцитов человека, случаи, когда "хвосты" включали более 2 хроматиновых тяжей, не зарегистрированы. В профазных клетках (на 44-й - 46-й час после культивирования in vitro) "хвосты" ядер выглядят как два хроматиновых тяжа, слепо заканчиваясь в цитоплазме.

Таким образом, феномен "хвостатых" ядер проявляется в виде ограниченного числа морфологических типов, спектр которых расширяется после облучения.

Данные исследования частот встречаемости в периферической крови лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами у облученных пациентов и здоровых доноров приведены на гистограммах (фиг. 4-6). Во всех контрольных группах (мужчины, женщины, дети) модальный класс представлен лицами, у которых "хвостатые" ядра в лимфоцитах не были встречены, а размах изменчивости исследуемого признака составил от 0% до 0,6%. Средняя частота лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в контрольной мужской выборке составила 0,14%, в контрольной женской - 0,13%, а в контрольной детской - 0,04%.

Таким образом, условной верхней границей нормы показателя "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами" для периферической крови человека можно считать 0,6%.

"Хвостатые" ядра в лимфоцитах были встречены у большинства облученных пациентов (фиг. 6) и при этом максимальная частота лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами составила 3,2%, а средняя - 0,56%. Различие между группой облученных пациентов и контрольными группами по исследованному показателю было достоверным (p < 0,001, во всех случаях). Эти данные позволяют сделать вывод о повышенной частоте лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами у облученных пациентов.

В мазках периферической крови обследуемых мы наблюдали и двуядерные лимфоциты с хромосомными мостами (фиг. 7). Средняя частота встречаемости таких клеток в группе облученных пациентов составила 0,070%, в то время как лимфоциты с мостами в крови здоровых доноров (мужская контрольная группа) встречались с гораздо меньшей частотой - 0,005%. Таким образом, мы наблюдали и цитологические события, предшествующие и (или) связанные с образованием "хвостатых" ядер. Коэффициент корреляции между признаками "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами" и "частота встречаемости лимфоцитов с хромосомными мостами" в выборке облученных пациентов (N=160) составил 0,43.

Нами были исследованы частоты метафаз с дицентрическими хромосомами у 47 пациентов опытной группы с различными частотами встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами. Положительная корреляция между показателями "частота лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови in vivo" и "частота ФГА-стимулированных лимфоцитов с дицентриками в культуре in vitro" в этой выборке оказалась статистически значимой (p < 0,001), а коэффициент корреляции, вычисленный по Спирмену составил 0,73. Корреляционное поле между этими показателями представлено на фиг. 8.

Повышенные частоты дицентрических хромосом в лимфоцитах (выше 0,1%) были выявлены в 17 из 22 пациентов, с частотами встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами от 0,8% и выше. Частота метафаз с дицентриками в этой группе, включающей 17 пациентов, варьировала от 0,5% до 7,0% (при этом у нескольких пациентов наблюдались и центрические кольца). Таким образом, методом определения частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами нам удалось отобрать пациентов "группы риска", у которых была выявлена повышенная частота дицентриков.

На наш взгляд, представленные данные позволяют предположить, что частота морфологических аномалий типа "хвостатых" ядер в популяциях лимфоцитов в определенной мере отражает частоту дицентриков в этих популяциях.

Список литературы 1. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М., Медицина, 1972, 264 с.

2. Бочков Н. П. , Демин С.Ю., Лучник Н.В. Классификация и методы учета хромосомных аберраций в соматических клетках // Генетика, 1972, т. 8, N 5, с. 133-141.

3. Кравцов В.Ю., Федорова Е.В., Яковлев А.Ф., Вахтин Ю.Б. Отбор на снижение и повышение спонтанной нестабильности кариотипа в клеточных популяциях перевивной миеломы sp2/0 мышей // ДАН СССР, 1991, т. 320, с. 1000-1003.

5. Прокофьева-Бельговская А.А. Радиационные поражения хромосом на ранних стадиях развития лосося. Цитология, 1961, т.3, с. 437-445.

6. Прошин С. Н. , Кравцов В.Ю., Ольнев М.Ю., Яковлев А.Ф., Вахтин Ю.Б. Хромосомные мосты и "хвостатые" ядра в популяциях злокачественных клеток // Генетика, 1997 (принято в печать).

9. Fenech M., Morley A.A. Measurement of micronuclei in lymphocytes // Mutat. Res., 1985, v. 147. p.29-36.

10. Ford J. H. , Schultz C.J., Correll A.T. Chromosome elimination in micronuclei: a common cause of hypoploidy // Am. J. Hum. Genet., 1988, v. 43, p, 733-740.

12. Lloyd D. C. , Purrott R.J., Reeder E.J. The incidence of unstable chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes from unirradiated and occupationally exposed people // Mutat. Res., 1980, v. 72, p. 523-532.

13. Moorhead P.C., Nowell P.C., Mellman W.J., Battip D.M., Hungerford D. A. Chromosome preparation of leukocytes cultered from human peripheral blood // Exp. Cell Res., 1960, v. 20, p. 613-616.

14. Muller W. -U., Streffer C. Micronucleus assay // Advences in Mutagenesis Research 5. Ed G. Obe B. Springer Verlag. 1995, P. 1-108.

Формула изобретения

Способ экспресс-выявления облученных пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций, включающий в себя определение хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют мазки крови in vivo, а в качестве критерия хромосомных аберраций регистрируют лимфоциты с аномалиями ядер типа "хвостов" и по повышенной частоте встречаемости таких лимфоцитов (от 0,8% и выше) выявляют пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций в популяциях лимфоцитов периферической крови.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8