Способ получения гамма-l-глутамилгистамина, применение гамма-l-глутамилгистамина, фармацевтическая композиция

 

Использование: в медицине. Сущность изобретения: усовершенствованный способ получения гамма-L-глутамилгистамина (I), заключающийся в ацилировании гистамина гамма-пентафторфеноловым эфиром L-трет.-бутилоксикарбонил-α-бензилового эфира L-глутаминовой кислоты в органическом растворителе с последующим отщеплением защит в кислой среде и гидрогенолизом, изоэлектрическим осаждением и перекристаллизацией. Применение соединения (I) в качестве средства, обладающего антиоксидантным, антирадикальным, липидрегулирующим, гипогликемическим, антиастматическим, гепатопротекторным, противовирусным, антибактериальным, противоопухолевым, антиметастатическим, адаптогенным действием, а также способностью модулировать метаболизм арахидоновой кислоты и другими видами терапевтического действия. Фармацевтическая композиция, обладающая вышеперечисленными свойствами, включающая активное начало - соединение (I) в эффективном количестве и целевые добавки. 3 с. и 1 з.п.ф-лы, 14 табл.

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии и касается усовершенствования метода синтеза γ-L-глутамилгистамина (γ-L-Glu-HA), а также его применения в медицине в качестве потенциального лекарственного средства.

Объектом изобретения является известный псевдопептид формулы (I).

γ-L-Glu-HA был впервые выделен в следовых количествах из нервных тканей крысы и моллюска [Koniski Н., Kakimoto Y. /Formation of γ-glutamylhistamine from histamine in rat brain.// J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp. 1461-1463; Tsuji M., Matsuoka Y., Nakajima T. /Studies of formation of γ-glutamines in rat brain and synthetic and catabolic enzymes.// J. Neurochemistry. -1977. -vol. 29. -pp. 633-638.]. Известен химический способ получения γ-L-Glu-HA, исходя из Z-L-Glu(OEt)OH [Koniski Н., Kakimoto Y. / Formation of γ- glutamylhistamine from histamine in rat brain.// J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp. 1461-1463]. Последний действием гидразин-гидрата в течение 48 часов превращают в соответствующий гидразид Z-L-Glu(N₂H₃)OH с выходом 80%, а затем в азид Z-L-Glu(N₃)OH. Последний вводят в реакцию с гистамином в водно-щелочной среде в соответствии с методикой Какимото [Kakimoto Y. , Nakajima Т. /Isolation of γ-L-Glu-L-Glu acid and γ-L-Glu-L-glutamine from bovine brain. // Biochemica et biophysica Acta. -1964. -vol. 93. -pp. 333-338] . Продукт реакции Z-L-Glu(HA)OH гидрируют для отщепления Z-защиты. Образующийся γ-L-Glu-HA очищают колоночной хроматографией на ионообменнике IR-120 с последующей перекристаллизацией из воды, спирта и ацетона. Конкретной методики с указанием выходов промежуточных и конечных продуктов и условий проведения отдельных стадий синтеза γ-L-Glu-HA [Koniski Н., Kakimoto Y. / Formation of γ- glutamylhistamine from histaimine in rat brain.// J. Neurochem. -1976, -vol. 27. -pp. 1461-1463] не приведено.

Недостатками способа являются длительность стадии гидразинолиза (48 час), неоднозначность протекания реакции аминолиза γ-азида со свободной карбоксильной группой [Шредер Э. , Любке К. Пептиды. -M. -Мир. -1967. -с. 249] , трудоемкость очистки конечного продукта γ-L-Glu-HA [Koniski Н., Kakimoto Y. / Formation of γ-glutamylhistamine from histamine in rat brain.// J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp. 1461-1463], низкие выходы и плохая воспроизводимость азидного метода при синтезе родственных соединений: выходы γ-Glu-β-аминоизобутановой кислоты для D-изомера составляет 17,7%, а для L-изомера- 38,8. γ-L-Glu-HA, синтезированный по известному способу [Koniski Н. , Kakimoto Y. / Formation of γ-glutamylhistamine from histamine in rat brain. // J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp.l461-1463], охарактеризован лишь элементным анализом и кислотным гидролизом, что недостаточно для подтверждения строения и индивидуальности вещества, в том числе отсутствия в нем α-изомера.

Известен химический способ получения γ-L-Glu-HA, исходя из Boc-L-Glu(OH)-OBu^t, близкий к заявляемому и выбранный нами в качестве прототипа [Mc Caman M. W., Stetzler J., Clark В. / Synthesis of γ-Glutamyilopamine and Other Peptidoamines in the Nervous System of Aplysia californica.// J. Neurochem. -1985. -vol. 45. -N 6. -pp. 1828-1835].

Недостатком способа является длительность реакции отщепления α-OBu^t-эфира от Boc-L-Glu(HA)-OBu^t, которая, к тому же, сопровождается образованием побочных продуктов. Кроме того, в публикации [Mc Caman М. W., Stetzler J. , Clark В. / Synthesis of γ-Glutamyldopamine and Other Peptidoamines in the Nervous System of Aplysia californica.// J. Neurochem. -1985. -vol. 45. -N 6. -pp. 1828-1835] не приведены выход и характеристики полученного γ-Glu-HA. Согласно предлагаемому нами способу (схема 1), Boc-L-Glu(OPfp)-OBzl вводят во взаимодействие с гистамином в среде DMF.

Промежуточный продукт Boc-L-Glu(HA)-OBzl очищают перекристаллизацией и гидрируют в метаноле над катализатором - палладием на активированном угле. Далее отщепляют Boc-защиту трифторуксусной кислотой. Выделение и очистку целевого γ-L-Glu-HA проводят изоэлектрическим осаждением при действии органического основания в среде органического растворителя с последующей перекристаллизацией.

Преимуществами способа являются высокие выходы, практическое отсутствие побочных реакций, исключение из синтеза нетехнологичных стадий очистки конечных и промежуточных продуктов колоночной хроматографией, проведение всех стадий синтеза и очистки в органической среде, т.к. известно, что гамма-глутамильная связь чувствительна к действию гидролитических агентов [Шредер Э., Любке К. Пептиды. -М. -Мир. -1967. -с. 249].

Исходный продукт Boc-L-Glu-OBzl коммерчески доступен и продается фирмами, производящими реагенты для пептидного синтеза.

Способ синтеза описан в примерах.

Индивидуальность полученных соединений проверяют методом ТСХ на пластинках "Kieselgel" фирмы "Merck" в системах растворителей : хлороформ-метанол 9: 1 (1), хлороформ-метанол 8:2 (2), н-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:5 (3); изопропанол-вода-25% водный аммиак 6:3:1 (4); на бумаге фабрики им. Володарского в системе растворителей изопропанол-вода-25% водный аммиак 6:3: 1(5).

Хроматограммы проявляют хлор-толидиновым раствором, реактивом Паули и нингидрином.

Температуру плавления веществ определяют на приборе "Boetius" (Германия).

¹Н-ЯМР-спектры снимают на приборе "Brucker WM-250" (Германия) и "Varian XL-400" (Япония) с ТМС в качестве внутреннего стандарта.

Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводят в условиях (1): колонка МПС-270 С-18 (4.0 х 250 мм), 10 мкм, элюция 0.1 М Na₂HPO₄, pH 2.3; в условиях (2) : колонка та же, элюция 0.1 М Na₂HPO₄, pH 2.7.

Пример 1.

ПЕНТАФТОРФЕНИЛОВЫЙ ЭФИР Nα -ТРЕТ.-БУТИЛОКСИКАРБОНИЛ- α- БЕНЗИЛ-L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ (II).

К раствору 0.425 г (1.25 ммоль) Boc-L-Glu-OBzl в 6 мл смеси диоксана и хлористого метилена ( 1:1 ) прибавляют 0.23 г (1.25 ммоль) пентафторфенола в 1.5 мл той же смеси растворителей при перемешивании. Охлаждают до 0^oC и прибавляют 0.258 г (1.25 ммоль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида. Перемешивают 4 ч, осадок DCU отделяют. Растворитель из фильтрата удаляют в вакууме. К маслообразному остатку прибавляют 4 мл гексана, растирают. Осадок отделяют, сушат в вакууме. Выход 0.658г ( 90.0%). Т.пл. 67- 68^oC. R_f 0.8 (1).

Пример 2.

Nα- ТРЕТ.-БУТИЛОКСИКАРБОНИЛ -α- БЕНЗИЛ-L- ГЛУТАМИЛГИСТАМИН (III).

К раствору 0.250 г (0.48 ммоль) Boc-L- Glu(OPfp)-OBzl в 2.5 мл DMF прибавляют при перемешивании 0.055 г (0.48 ммоль) гистамина, pH реакционной смеси доводят до 8 прибавлением N-метилморфолина. Перемешивают в течение 30 мин при 20^oC и оставляют на 48 час при 0^oC. Диметилформамид удаляют в вакууме, маслообразный остаток растирают с 2 мл сухого эфира. Осадок отделяют, промывают 2 мл эфира и перекристаллизовывают из ацетона. Выход 0.145 г (85.0%). R_f 0.39 (2). Т.пл. 130-132^oC. ИК-спектр (в вазелине), см^-1: 1680 (амид I), 1530 (амид II). ¹H-ЯМР-спектр (CDCl₃, CD₃OD), δ, м.д.: 1.4 (с, 9H, (CH₃)₃C-Boc), 2.1 (м, 2H, β-CH₂), 2.45 (т, 2H, γ-CH₂), 2.85 (т, 2H, β-CH₂-HA), 3.45 (т, 2H, α-CH₂-HA), 4.2 (т, 1H, α-CH), 5.2 (д, 2H, CH₂-Bzl), 7.05 (с, 1H, CH-4-Im), 7.4 (с, 5H, C₆H₅-Bzl), 8.1 (с, 1H, CH-2-Im). Найдено %: C 61.08; H 6.85; N 13.10. C₂₂H₃₀N₄O₅. Вычислено %: C 61.39; H 6.97; N 13.02.

Пример 3.

γ-L- ГЛУТАМИЛГИСТАМИН (I).

К раствору 0.050 г (0.11 ммоль) Boc-L-Glu(HA)-OBzl в 2 мл безводного метанола прибавляют 0.050 г 10%-го палладия на активированном угле, перемешивают 2.5 час, периодически пропуская ток водорода. Катализатор отфильтровывают, промывают 3 мл метанола. Растворитель из фильтрата удаляют в вакууме. Получают 0.040 г (≈100%) прозрачного масла Boc-L-Glu(HA)OH (IV), R_f 0.29 (3). Продукт растворяют в 0.11 мл TFA, выдерживают 1 час при 20^oC и прибавляют 2 мл безводного эфира. Выпавшее масло промывают эфиром при растирании и сушат в вакууме над P₂O₅. Твердый остаток растворяют в 0.4 мл этанола и прибавляют 0.036 мл Et₃N до pH 7. Творожистый осадок отделяют, промывают эфиром, сушат. Выход 0.0235 г (89.0%). После перекристаллизации получают 17.1 мг (65.0%). R_f 0.61 (4), R_f 0.58 (5). ВЭЖХ в условиях (4): один пик, время выхода 3.50 мин.; в условиях (5): один пик, время выхода 3.53 мин. ¹H-ЯМР-спектр в D₂O, δ, м. д. : 1.8 (м, 2H, β-CH₂), 2.13 (т, 2H, γ-CH_2/ ), 2.57 (т, 2H, β-CH₂-HA), 3.18 (т, 2H, α-CH₂-HA), 3.5 (т, 1H, α-CH), 6.73 (с, 1H, CH-4-Im), 7.55 (с, 1H, CH-2-Im).

Биологическая активность.

Ранее, исходя из антиокислительных свойств α-L-Glu-HA- известного наиболее близкого аналога заявляемого соединения - было предложено использовать его для лечения ряда заболеваний, в частности, атеросклероза, аллергии [Seguin М.С., Babizhayev М. / Product de couplage de l'un acide amine, procede de preparation, et applications therapeutigues et cosmetologigues.// Patent Fr. - 2701947. -1994. -C1 C 07 C 237/04. -A 61 K 31/195. -7/48; Babizhayev М., Seguin М.C. / Pseudodipeptide product having on imidazole grouping and applications.// WO 95/12581. -C1 C 07 D 233/64. -C 12 P 17/10. -A 61 K 31/415. -7/42].

Однако эти показания к применению не были подтверждены экспериментально в опытах in vivo. Показано, что α-L-Glu-HA- ингибирует образование супероксиданиона лишь в небольшой степени при высоких концентрациях, не влияя на образование гидроксильного радикала [Babizhayev М., Seguin М.С. / Pseudodipeptide product having on imidazole grouping and applications.// WO 95/12581. -C1 C 07 D 233/64. -C 12 P 17/10. -A 61 К 31/415. -7/42]. Кроме этого, можно прогнозировать большую неустойчивость α-L-Glu-HA- к действию ферментов in vivo, чем у соответствующего γ-аналога. Исходя из этих данных, нами предпринято расширенное исследование биологической активности заявляемого соединения (IV). В результате для него были выявлены неизвестные ранее виды фармакологической активности и предложен механизм действия на основании экспериментов in vitro. Так, было показано, что заявляемое соединение обладает антиоксидантной и антирадикальной активностями при низких концентрациях.

Совокупность вышеотмеченных свойств определяет ценность предлагаемого соединения (IV) в качестве фармакологического средства для лечения ряда заболеваний.

Примеры разнообразных видов биологической активности, проявляемых заявляемым соединением, in vitro и in vivo приведены ниже.

Пример 4.

ВЛИЯНИЕ γ-L-Glu-HA HA ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ.

Изучалось влияние препарата γ-L-Glu-HA на изменение хемилюминесценции (ХЛ), обусловленной образованием гидроксильного радикала (^.OH) и супероксидного анион-радикала (O₂^-), в модельных химических и ферментативных системах.

Активные формы кислорода (АФК) различной природы генерировали в следующих системах: A. гидроксильный радикал - в смеси FeSO₄ с H₂О₂ (реактив Фентона) [Halliwell В. / Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of iron salts.// FEBS Lett. -1978. -vol. 96. -pp. 238-241].

Инкубационная среда состояла из 5 мМ KH₂PO₄ (pH 7,4); 5 мM FeSO₄; 2 мМ люминола. H₂О₂ в конечной концентрации 5 мМ вводили в кювету через диспендер после того, как было зарегистрировано фоновое свечение смеси реагентов. Патентуемое соединение, растворенное в воде, в необходимой концентрации вносили в кювету в объеме 5-10 мкл. Общий объем пробы составлял 0,5 мл.

B. супероксидный анион-радикал - в смеси ксантина и ксантиноксидазы [Afanasev I., Suslova Т., Cheremisina Z. et al. / Study of antioxidant properties of metal aspartates.// Analyst- 1995. -vol. 120. -pp. 859-862].

Инкубационная среда содержала следующие ингредиенты: 5 мМ KH₂PO₄; 0,2 МЕ/мл ксантиноксидазы. Ксантин в концентрации 1 мМ вводили в пробу через диспендер. В качестве сенсибилизатора свечения в данной системе использовали люцигенин (0,2 мМ). Исследуемое вещество вводили аналогично как при исследовании гидроксильного радикала.

В предварительных исследованиях было показано, что заявляемое соединение не влияло на активность ксантиноксидазы.

Измерение ХЛ описанных систем проводили при 25^oC в режиме пульсового (в момент введения реагентов через диспендер) перемешивания. Индикация сигнала ХЛ осуществлялась путем его интегрирования каждые 10 с - 5 мин. Длительность регистрации вспышки ХЛ после смешивания ингредиентов определялась кинетикой конкретного процесса. Для каждой системы определяли светосумму ХЛ (мВ) в контрольных пробах без препарата (I-) и в пробах в присутствии соответствующих концентраций препарата (I+). Для оценки степени ингибирования (активации) ХЛ в изученных системах находили отношение I+/I- (относительные единицы).

Образование АФК и влияние на этот процесс предлагаемого соединения регистрировали на приборе Luminometer-1251 (LKB, Швеция).

Результаты экспериментов обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

A. Влияние соединения γ-L-Glu-HA на образование гидроксильного радикала в реактиве Фентона.

При введении H₂O₂ в фосфатный буфер, содержащий сульфат железа, возникала вспышка ХЛ, которая была обусловлена образованием в реакционной смеси преимущественно гидроксильного радикала. Вспышка носила кратковременный характер, максимум интенсивности достигался на 10-й секунде и в течение следующих 10-20 секунд свечение гасло и показатели ХЛ уменьшались до фоновых значений.

В таблице 1 представлены данные исследования действия γ-L- Glu-HA на генерацию гидроксильного радикала в реактиве Фентона. Результаты показывают, что соединение ингибирует образование гидроксильного радикала в изученной системе.

B. Влияние γ-L-Glu-HA на образование супероксидного анион-радикала в системе ксантин-ксантиноксидаза.

Введение ксантина в среду, содержащую ксантиноксидазу и люцигенин, приводило к возникновению вспышки ХЛ, которая достигала максимума за 3-5 минут, после чего в изучаемой системе начиналось очень медленное уменьшение интенсивности хемилюминесценции. Добавление γ-L-Glu-HA в смесь ксантин- ксантиноксидазы принципиально не меняло форму кривой ХЛ-ответа, варьировали только значения максимальной интенсивности ХЛ. Вследствие такой "растянутости" кинетической кривой регистрировалась светосумма хемилюминесценции за первые 3-5 минут, которая отражала суммарное количество квантов света, вырабатываемых в системе до достижения максимальных значений интенсивности ХЛ.

Как видно из представленных данных (табл. 2), γ-L-Glu-HA обладает способностью достоверно ингибировать образование супероксидного анион-радикала.

Пример 5.

ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ γ-L-Glu-HA В ОПЫТЕ IN VIVO.

Эксперимент проведен на 47 беспородных крысах-самцах с исходной массой 190-200 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Поражение печени (экспериментальный гепатит) у животных вызывали введением четыреххлористого углерода (CCl₄) внутрижелудочно в виде 50% раствора в вазелиновом масле в объеме 0,25 мл на 100 г массы тела в течение 3 дней [Венгеровский А.И., Чучалин B.C., Паульс О.В., Саратиков А.С. / Влияние гепатопротекторов на метаболизм липидов при CCl₄ - гепатите.// Бюлл. экспер. биол. -1987. -N 4. -с. 430-432] . γ-L-Glu-HA вводили животным внутрижелудочно в дозах 50 и 500 мкг/кг до поражения печени (3 и 4 группы) в течение 3 дней, а также одновременно с CCl₄ (5 и 6 группы). Животным контрольной группы вводили CCl₄, как описано выше (2 группа). Интактные животные получали перорально физиологический раствор в эквивалентном количестве (1 группа).

Образцы крови и печени брали на анализ через 18 часов после последнего введения CCl₄.

Содержание первичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - диеновых конъюгатов, диеновых кетонов и триенов, определяли методом [Волчегорский И. А., Налимов А. Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р. И. /Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан- изопропанольных экстрактах крови.// Вопр. мед. химии. -1989. -N 1. -с. 127-131]. Расчет содержания продуктов ПОЛ проводили, соотнося величины соответствующих экстинкций к 1 мл исследуемой пробы.

Количество конечных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) - определяли по тесту с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Коробейникова Э.Н. / Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой. // Лаб. дело. -1989. -N7.- с. 8-10]. Концентрацию ТБК-активных продуктов рассчитывали с помощью уравнения регрессии. Содержание МДА в печени экспериментальных животных оценивали модифицированным методом [Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. / Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты.// В кн: Современные методы в биохимии. -М. -Медицина. -1977. -с. 66-69], проводя предварительную экстракцию липидов по Фолчу [Кейтс М. Техника липидологии. -М. -Мир. -1975. -с. 74-76].

Результаты эксперимента обрабатывались статистически с применением t-критерия Стьюдента [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Результаты таблицы 3 свидетельствуют, что введение крысам CCl₄ приводило к накоплению продуктов ПОЛ в сыворотке крови и печени. У животных всех групп, которым вводили γ-L-Glu-HA, отмечалось снижение содержания МДА в сыворотке крови и в печени. Кроме этого, выявлено уменьшение первичных продуктов ПОЛ в печени животных, получавших исследуемое соединение.

Пример 6.

ВЛИЯНИЕ γ-L-Glu-HA НА МЕТАБОЛИЗМ [C¹⁴]-АРАХИДОНОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ГОМОГЕНАТЕ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ.

Исследования проводили на мышах-самцах линии С57В1, находившихся на стандартном рационе вивария. Легкие животных извлекали, замораживали в жидком азоте, затем гомогенизировали стеклянным гомогенизатором фирмы "Wheaton" (США) при +4^oC в 10 объемах 0,05 М трис-HCl буфера. Аликвоты (0,5 мл) супернатанта инкубировали с 0,5 мкКю [C¹⁴] -арахидоновой кислоты ([C¹⁴]-AK, "Amersham", Англия; удельная активность 50-60 мКю/ммоль) при +37^oC в течение 30 мин. Концентрация в инкубационной среде γ-L-Glu-HA составляла 10^-4 М. Экстракцию неметаболизированной [C¹⁴]-AK и продуктов ее метаболизма осуществляли в 20 объемах смеси хлороформа и метанола (1:1), при эффективности экстракции не менее 90%, оцененной с помощью [C¹⁴]-ПГF_2α. Растворители удаляли на ротационном испарителе ("Buchi", Швейцария) при пониженном давлении, сухой остаток растворяли в смеси хлороформа: метанола (1:1). Разделение и идентификацию [C¹⁴] -AK и ее метаболитов осуществляли тонкослойной хроматографией на пластинах Kieselgel 60 ("Merck", Германия), с использованием органической фазы системы растворителей (этилацетат, изооктан, уксусная кислота, вода в соотношении 110: 50:20:100) и меченных стандартов. Авторадиохроматограммы, полученные на рентгеновской пленке X- Omat AR ("Kodak", США) и HS 11 ("ORWO", Германия), денситометрировали на денсикане KS 3 ("Kipp and Zonnen", Голландия). Количественный анализ отдельных эйкозаноидов проведен с помощью радиометрии фракций, полученных высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC-система фирмы "Gilson", Франция; колонка ZORBAX C8 фирмы "Du Pont" США) и элюированием пятен на ТСХ-пластинках.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Результаты эксперимента представлены в таблице N 4. Обращает внимание снижение количества ПГF_2α - на 39%, 6-кето-ПГF_1α на 39% и 12-, 15-НЕТЕ- на 28% в присутствии γ-L-Glu-HA.

Таким образом, введение в инкубационную среду соединения γ-L-Glu-HA приводит к изменению метаболизма арахидоновой кислоты в системе in vitro.

Пример 7.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ γ-L-Glu-HA НА ПРОЯВЛЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО БРОНХОСПАЗМА.

Антиастматическое действие γ-L-Glu-HA изучалось на модели антиген-индуцированного бронхоспазма у активно сенсибилизированных морских свинок по методу Andersson [Andersson P. /Antigen induced bronchial anaphylaxis in actively sensitized guinea pig.// Allergy. -1980. -vol. 35. -pp. 65-71].

Данная модель наиболее адекватна атонической бронхиальной астме, так как спазм бронхов у морской свинки развивается в результате аллергической реакции между антигеном и гомоцитотропными антителами lgE класса.

Морские свинки-самцы с исходной массой 250-300 г сенсибилизировались внутримышечной инъекцией 0,5 мл суспензии, содержавшей 20 мкг овальбумина (ОБА, производства фирмы Sigma /grade III/) и 100 мг Al(OH)₃ на животное. Разрешающую дозу 150-200 мкг/кг ОБА вводили внутривенно (v. jugularis) в 0,1 мл физиологического раствора на 26 день после сенсибилизации. Индукция бронхоспазма и измерение параметров внешнего дыхания проводилась по методу, описанному в работе [Yu-Hong L., Barnes P., Rogers D. / Inhibition of neurogenic plasma exudation and bronchoconstriction by a K⁺ chennel activator, BRL 38227, in guinea pig airways in vivo.// Europ. J. Pharmacol. -vol. 239. -pp. 257-259]. Животное наркотизировали внутрибрюшинным введением этаминала натрия (70 мг/кг массы), обнажали трахею, проводили трахеотомию и вставляли в трахею канюлю. Канюля присоединялась через специальный тройник к респиратору (Ugo Basel, модель 7025), который работал в течение эксперимента в постоянном режиме: объем вентилируемого воздуха 8 мл, частота дыхания 70 в минуту. Измерение параметров дыхания осуществлялось с помощью трансдуцера (Ugo Basel, модель 7020), соединенного с канюлей и самописца (Миллихром), регистрировавшего амплитуду дыхания. Величина амплитуды отражала степень сопротивления гладкой мускулатуры бронхов воздушному потоку. После установления у морской свинки нормального ритма дыхания, животному вводили в v. jugularis разрешающую дозу антигена. Через 1-2 минуты развивался бронхоспазм, который выражался в резком увеличении сопротивления бронхов (вследствие их сужения) и амплитуды дыхания в 8-10 раз по сравнению с исходным значением. Динамику бронхоспазма наблюдали в течение 30-60 минут. При оценке эффективности заявляемого соединения определяли изменение величины бронхоспазма.

Исследуемое вещество растворяли в физиологическом растворе и вводили животным трехкратно за 72, 48 и 18 часов до индукции бронхоспазма внутрижелудочно в дозе 50 мкг/кг. В качестве препарата сравнения использован Интал - препарат, получивший широкое распространение при лечении бронхиальной астмы. Интал вводили животным внутрижелудочно в дозе 5 мг/кг по той же схеме, что и γ-L-Glu-HA. Контрольная группа животных получала эквивалентное количество физиологического раствора.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Данные, приведенные в таблице 5, свидетельствуют, что заявляемое соединение достоверно снижает величину бронхоспазма на 40%, по сравнению с контрольными значениями.

Таким образом, γ-L-Glu-HA проявлял активность в отношении снижения величины бронхоспазма, сравнимую с действием препарата сравнения - Интал. Однако действующая доза предлагаемого вещества была на два порядка ниже, чем Интала.

Пример 8.

ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ γ-L-Glu-HA. Гиполипидемическую активность γ-L-Glu-HA изучали на модели экспериментальной гиперлипидемии [Arichi Н., Kumura Н.О. / Effects of stibens compounds of roots of polygonum cuspidatium on the lipid metabolism.// Chem. Pharm. Bull. -1982. -vol. 30. -N 5. -pp.l766-1767] у беспородных крыс-самцов с исходной массой 220-250 г, получавших в течение 10 дней внутрижелудочно на фоне стандартного рациона в масляную суспензию, содержавшую 10% холестерина и 1% холевой кислоты (из расчета 1 мл суспензии на 100 г массы тела). Исследуемое соединение вводили животным перорально в дозах 50 и 500 мкг/кг в течение последних четырех дней эксперимента. В качестве препарата сравнения использовали никотиновую кислоту, которую вводили животным в течение 10 дней на фоне атерогенной нагрузки в дозе 10 мг/кг. Образцы крови брали на анализ через 18 часов после последнего введения препарата, в течение которых у крыс отнимали пищу.

Определяли следующие показатели: холестерин общий (ХС- общий), холестерин липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП), холестерин липопротеидов низкой плотности и липопротеидов очень низкой плотности (ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП), триглицериды (ТГ). Содержание ХС в сыворотке крови определяли методом Илька [Биохимические исследования в клинике.- под. ред. А.А. Покровского. -М. -Медицина. -1969. -с. 300-302], ХС-ЛПВП оценивали в супернатанте после гепарин-марганцевой преципитации ЛПНП+ЛПОНП [Титов В.Н., Бренер Е.Д., Халтаев Н.Г., Задоя А.А., Творогова М.Г. / Метод и диагностическая значимость исследования содержания холестерина в α-липопротеидах.// Лаб. дело. -1979. -N 1. -с. 36-41]. Определение ХС-ЛПНП проводили путем расчета по формуле, представленной в работе Friedewald W.T. et al [Friedewald W.T., Levy K. J., Leus R. /Fat transhort in lipoproteins an integrated approach to mechanism and disoders.// New Eugl.J. Med. -1967. -vol. 276. -p. 32].

Для оценки влияния заявляемого соединения на соотношение атерогенных и антиатерогенных липопротеидов плазмы крови вычисляли холестериновый индекс (K_xc) по формуле, приведенной в работе Климова А.Н. с соавторами [Климов А. Н. , Никульчева Н.Г. Липопротеиды, дислипопротеинемии и атеросклероз. -М. -Медицина. -1984. -165 с.].

Содержание ТГ в сыворотке крови определяли общепринятым методом [Радионова Л. П. /Модификация метода определения содержания триглицеридов в сыворотке крови. / Лаб. дело. -1980. -N 5. -с. 297-299].

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Данные, приведенные в таблицах 6, 7, свидетельствуют о том, что введение животным жировой суспензии сопровождалось достоверным повышением содержания ХС в сыворотке крови за счет атерогенных фракций липопротеидов (ЛПНП и ЛПОНП) на фоне снижения количества антиатерогенной фракции - ЛПВП. Индекс атерогенности возрос в 3 раза. Отмечалось также значительное повышение ТГ в сыворотке крови.

В таблице 7 представлены результаты влияния изучаемого соединения в дозе 50 мкг/кг на липидный состав крови у животных, получавших атерогенную нагрузку. Показано, что при введении γ-L-Glu-HA происходило изменение всех исследованных показателей практически до контрольных значений. У животных, которым вводили соединение в дозе 500 мкг/кг, выявлены аналогичные изменения.

Таким образом, изменения липидного состава сыворотки крови при введении экспериментальным животным исследованного соединения сопоставимы с гиполипидемическим эффектом препарата сравнения - никотиновой кислотой (табл. 6). Однако, действующая доза γ-L-Glu-HA была на два порядка ниже, чем у препарата сравнения, и исследованное соединение вводили в течение 4-х, а не 10 дней, как никотиновую кислоту.

Пример 9.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ АНТИДИАБЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ γ-L-Glu-HA. Исследования проведены на крысах-самцах Вистар массой 250-300 г. Экспериментальный диабет вызывали однократным внутривенным введением стрептозотоцина (кооп. "Синтез" при ИМБГ АН Украины) в дозе 42 мг/кг крысам, предварительно голодавшим в течение 24 часов с допуском к пище сразу после инъекции. Крыс отбирали в опыт через 2 недели после индукции диабета с уровнем гликемии 120-180 мг%. γ-L-Glu-HA вводили внутрижелудочно в течение 4 дней в суточных дозах 50 мкг/кг и 500 мкг/кг в водном растворе из расчета 1 мл на 200 г массы тела. Контрольные животные получали соответствующий объем воды. Животных лишали пищи за 2 часа до забора крови. Эффект оценивали по изменению уровня глюкозы в крови через 2, 5 и 24 часа после последнего введения препарата. Кровь брали из хвостовой вены в объеме 0,1 мл. Содержание глюкозы определяли о-толуидиновым методом.

Содержание глюкозы рассчитывали в мг% по калибровочной кривой с использованием стандартных растворов глюкозы. Далее определяли степень изменения содержания глюкозы по отношению к исходному количеству для каждого животного, выражая ее в процентах от исходного содержания. Окончательный расчет проводили для каждой группы животных.

Результаты опытов обработаны статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Данные, приведенные в таблице 8, свидетельствуют, что 4-дневное внутрижелудочное введение γ-L-Glu-HA в суточных дозах 50 и 500 мкг/кг приводило к достоверному снижению глюкозы в крови через 2 часа после введения препарата животным. Гипогликемический эффект сохранялся через 5 часов после введения, однако был менее выражен и статистически недостоверен.

Таким образом, глюкозопонижающая активность заявляемого соединения выражена в равной степени при его применении как в дозе 50 мкг/кг, так и 500 мкг/кг.

Пример 10.

ВЛИЯНИЕ γ-L-Glu-HA НА СОДЕРЖАНИЕ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ У ИНТАКТНЫХ ЖИВОТНЫХ.

Эксперимент проведен на белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 200-220 г. Животные контрольной группы (1 группа) в течение 3-х дней получали перорально физиологический раствор, животные опытных групп (2 и 3 группы) - раствор γ-L-Glu-HA в дозах 50 и 500 мкг/кг соответственно. В день забора крови животных лишали пищи. За два часа до последнего введения препарата у животных брали кровь из хвостовой вены. Образцы крови брали также через 2 и 5 часов после введения соединения, затем животных переводили на рацион вивария и последний забор крови проводили через 24 часа после последнего введения препарата. Содержание глюкозы в пробах определяли как описано в примере 7.

Результаты обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Данные, представленные в таблице 9, свидетельствуют, что лишение пищи приводило к незначительному, но достоверному снижению содержания глюкозы у животных всех групп с последующим восстановлением до количества, близкого к исходному. Не выявлено достоверных различий между содержанием глюкозы во всех группах в исследованные сроки.

Таким образом, введение γ-L-Glu-HA не влияло на содержание глюкозы в крови у интактных животных.

Пример 11.

ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ γ-L-Glu-HA.

A. Защитный эффект γ-L-Glu-HA при инфекции, вызванной вирусом энцефаломиокардита.

Исследования проводили на беспородных мышах обоего пола с исходной массой 10-11 г. В контрольной и опытных группах использовали по 30 животных. Исследуемое соединение и препарат сравнения Ридостин - индуктор интерферона, вводили однократно, внутрибрюшинно через 24 часа после заражения мышей вирусом энцефаломиокардита в дозах 30 мкг/кг и 5 мг/кг соответственно. Вирус энцефаломиокардита вводили в дозе 100 ЛД₅₀. Противовирусную активность определяли по изменению средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей и степени защиты от смертельной вирусной инфекции.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Полученные результаты представлены в таблице 10. Показано, что γ-L-Glu-HA обладал выраженной противовирусной активностью в дозе на два порядка ниже по сравнению с дозой препарата сравнения.

Б. Влияние γ-L-Glu-HA на течение экспериментальной гриппозной инфекции у мышей.

Исследование проводили на белых беспородных мышах обоего пола массой 8-10 г. Вирус гриппа человека, тип A, штамм Aichi (аллантоисная жидкость), вводили мышам интраназально в дозе 100 ЛД₅₀, γ-L-Glu-HA вводили животным перорально в дозах 50 и 500 мкг/кг в течение 3-х дней до заражения и 10 дней после заражения. В качестве препаратов сравнения использовали Арбидол (специфический препарат) в дозе 100 мг/кг, который вводили за 24 и 2 часа до и 3 дня после заражения, и Тимоген (неспецифический препарат) в дозе 10 мкг/кг, вводившийся животным по той же схеме, что и исследуемое вещество. В каждой группе использовано по 30 животных. Противовирусную активность определяли по изменению СПЖ мышей и степени защиты от смертельной дозы вирусной инфекции.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Результаты исследования представлены в таблице 11. Выявлено, что увеличение СПЖ, выживаемости и степень защиты наиболее выражены при введении исследуемого соединения в дозе 500 мкг/кг. Применение γ-L-Glu-HA в дозе 50 мкг/кг и Арбидола сопровождалось изменением исследованных показателей в равной степени. Действие Тимогена в качестве противовирусного препарата было выражено более слабо.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о выраженном противовирусном действии заявляемого соединения при экспериментальной вирусной инфекции у мышей, вызванной вирусом гриппа человека, тип A. Действие γ-L-Glu-HA было сопоставимо и несколько более выражено, чем Арбидола. Однако эффективность заявляемого соединения отмечена при использовании доз на 3-4 порядка ниже по сравнению с препаратом сравнения - Арбидолом.

В. Влияние γ-L-Glu-HA на репродукцию вируса иммунодефицита человека при острой инфекции лимфобластоидных клеток.

Исследование проводили на культуре лимфобластоидных клеток человека МТ-4. В эксперименте использовали вирус иммунодефицита человека, тип 1, изолят ВИЧ-1/ИВ17 из коллекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского. γ-L-Glu-HA испытывали в концентрациях: 1,0; 0,1 и 0,01 мкг/мл. Препарат сравнения - азидотимидин, в дозе 0,05 мкМ/мл. Вещества вносили в культуру клеток МТ-4 за 1 час до внесения вируса в дозе 1000 ТЦИД₅₀.

Основным параметром эффективности действия веществ являлась жизнеспособность клеток.

В предварительных экспериментах было показано, что γ-L-Glu-HA малотоксичен для лимфобластоидных клеток в концентрациях от 1,0 мкг/мл и менее.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Результаты, представленные в таблице 12, показывают, что исследованное соединение обладало выраженным защитным эффектом от цитодеструктивного действия ВИЧ-1 в концентрациях 1,0 и 0,1 мкг/мл, сопоставимым с действием препарата сравнения - азидотимидином.

Пример 12.

ВЛИЯНИЕ γ-L-Glu-HA НА РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЖИВОТНЫХ К МИКРОБНЫМ ИНФЕКЦИЯМ.

В эксперименте использованы нелинейные белые мыши массой 18-22 г. γ-L-Glu-HA препарат сравнения - Нуклеинат натрия вводили перорально в течение 3 суток до и после заражения (схема -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, где 0 - день заражения). Для инфицирования животных использовалась суточная культура Salmonella sp., выращенная на агаре Хоттингера. Для приготовления суспензии клеток применяли физиологический раствор. Условия заражения отработаны в предварительных экспериментах. Суспензию клеток Salmonella sp. вводили подкожно в дозе 5·10⁸ кл/мышь в 0,5 мл. γ-L-Glu-HA вводили перорально в дозах 150 и 500 мкг/кг, а препарат сравнения - Нуклеинат натрия, в дозе 50 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора.

Результаты эксперимента обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Введение исследуемого соединения в дозе 150 и 500 мкг/кг достоверно увеличивало среднюю продолжительность жизни инфицированных Salmonella sp. мышей (табл. 13), оказывая защитное действие в жестких условиях эксперимента (100% летальность в контрольной группе).

Защитный эффект γ-L-Glu-HA был сравним с действием Нуклеината натрия, известного стимулятора иммунологических реакций, в том числе фагоцитоза [Лазарева Д. Л. , Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. -1985. -286 с]. Выживаемость животных на вторые сутки после заражения в группе мышей, получавших исследуемое вещество в дозе 150 мкг/кг, составила 70%, и в дозе 500 мкг/кг - 80%, тогда как в контрольной группе только 50%.

Таким образом, γ-L-Glu-HA обладает выраженным защитным эффектом против микробной инфекции.

Пример 13.

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ γ-L-Glu-HA НА РОСТ ОПУХОЛИ.

Ростмодифицирующее действие препарата изучали на модели аденокарциномы подчелюстной слюнной железы КТ-6. В опыте использованы мыши-самки линии DBA/2, полученные из питомника "Столбовая". Штаммы опухоли КТ-6 перевивали взвесью опухолевой ткани в среде 199 (1:10) подкожно. γ-L-Glu-HA в дозе 50 мкг/кг вводили парентерально, а препарат сравнения - индометацин в дозе 1500 мкг/кг - перорально. Первое введение препаратов было через 24 часа после перевивки опухолей. Введение соединений животным с опухолью КТ-6 -28 дней.

Результаты экспериментов обрабатывались статистически [Гублер Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. -М. -Наука. -1978. -365 с].

Показано (табл. 14), что γ-L-Glu-HA достоверно ингибировал рост опухоли КТ-6 у животных, получавших заявляемое соединение, был достоверно более низким по сравнению с контрольной группой животных.

Таким образом, γ-L-Glu-HA достоверно снижает интенсивность роста исследованной опухоли.

Результаты проведенных экспериментов показывают высокую биологическую активность соединения γ-L-Glu-HA.

Как видно из приведенных результатов (пример 4), заявляемое соединение достоверно ингибирует образование гидроксильного радикала и супероксидного анион-радикала (O₂^-) в системах in vitro. Особенно ценен тот факт, что снижение образования гидроксильного радикала (^.OH), так как в живом организме нет ферментов, способных их обезвреживать. В норме существуют механизмы эффективного удаления перекиси водорода и супероксидного анион-радикала, что делает образование ^.OH невозможным [Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. -М. -Мир. -1988. -568 с.]. Однако, в стрессовых ситуациях возможно образование гидроксильного радикала, что, в свою очередь, увеличивает перекисное окисление липидов (ПОЛ) и может приводить к повреждению ДНК.

Общим звеном в патогенезе большого круга патологических состояний (стресс, радиационное поражение, аллергические заболевания, атеросклероз и сопутствующие заболевания, сахарный диабет и другие) является активация ПОЛ. Это приводит к нарушению структуры мембраны (повреждению липидного бислоя), что вызывает нарушение функционирования мембраносвязанных ферментов. Нормализация ПОЛ может служить важным параметром при лечении названных заболеваний [Скакун Н.П., Шманько В.В., Охрилович Л.М. Клиническая фармакология гепатопротекторов. -Тернополь. -Збруч. -1995. -272 с.].

Известно, что введение четыреххлористого углерода (CCl₄) приводит к характерным изменениям печени с признаками патобилиарного цирроза, повышению перекисного окисления липидов и является общепризнанной моделью поражения печени, сопровождающейся активацией ПОЛ [Kapil A., Koul LB., Suri О.Р./ Antihepatotoxic Effects of Chlorogenic Acid from Anthocephalus- Cadamba.// Phytother Res. -1995. -vol.9. -Iss 3. -pp. 189-193]. Действие CCl₄ связано прежде всего с повреждением эндоплазматического ретикулума, лизосом и других мембранных структур клетки, вследствие активации ПОЛ, индуцированного образованием свободнорадикальных метаболитов CCl₄ [Венгеровский А.И., Чучалин В. О. , Паульс О.В., Саратиков А.О. / Влияние гепатопротекторов на метаболизм липидов при CCl₄ - гепатите.// Бюлл. экспер. биол." 1987. -N 4. -с. 430-432; Долгов А.В., Душкин М.И., Морозов А.В., Морозова И.Ю. /Изменение содержания липидов печени, плазмы крови, аорты и активности холестеролэстераз печени крысы при воздействии тетрахлорметана.// Вопр. мед.химии. -1986. -N 1. -с. 55-5 8] . При поражении печени CCl₄ подавляются ферментные механизмы утилизации супероксидных радикалов и гидроперекиси, что способствует накоплению активных форм кислорода (в том числе, гидроксильных радикалов) и проявлению их токсического действия на мембранные структуры гепатоцитов [Матюшин Б.Н., Логинов А.С., Шустова С.Г., Рослова Е.М. /Энзимная утилизация активных форм кислорода и липидный состав печени при ее токсических поражениях./ VI Симпозиум по биохимии липидов. Тез. докл. -М. -1995. -с. 64].

Антиоксидантное и гепатопротекторное действие γ-L-Glu-HA в опыте in vivo изучалось на модели поражения печени при введении животным CCl₄ (пример 5). Выявлено, что при введении животным заявляемого соединения достоверно снижается содержание малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови во всех группах животных, а в печени - у крыс, получавших γ-L-Glu-HA до введения CCl₄. Наблюдается также уменьшение в печени диеновых коньюгатов и диеновых кетонов и триенов под влиянием заявляемого вещества.

Полученные результаты позволяют рекомендовать применение γ-L-Glu-HA при воздействии на организм таких факторов, как стресс и радиация, для профилактики побочных явлений при радиотерапии, для активации процессов репарации; при лечении заболеваний печени, например циррозов и гепатитов различной этиологии; состояний, связанных с интоксикацией веществами, активирующими перекисное окисление липидов, например, при алкогольной интоксикации; в качестве профилактических препаратов на производствах, связанных с получением химических препаратов и при контактах с токсическими веществами.

Известно, что процессы старения также связаны с окислительным стрессом, сопровождающимся повышением ПОЛ и, как следствие этого, образованием МДА, который, взаимодействуя с лизином, образует липофусциноподобный пигмент, что ускоряет липофусциноз и вызывает необратимые морфологические сдвиги в органах. Снижение содержания МДА (пример 5) уменьшает вероятность образования данного соединения, что может приводить к понижению вероятности развития возрастных заболеваний. Окислительный стресс в нервной ткани (увеличение ПОЛ) является одним из звеньев патогенеза ряда заболеваний нервной системы, в частности болезни Паркинсона. Комплекс геронтологических заболеваний включает такие патологические состояния, как старческие психозы, катаракта, старческие изменения кожных покровов. На основании полученных данных можно предложить применение заявляемого препарата при лечении перечисленных заболеваний, а также болезни Паркинсона.

Известно, что арахидоновая кислота (АК) является предшественником многих биологически активных соединений, таких как простагландины (ПГ) и лейкотриены (ЛТ) [Ленинджер А. Основы биохимии. -М. -Мир. -1985. -т. 3. -с. 779-809] . В наших экспериментах показано, что γ-L-Glu-HA изменяет метаболизм АК (пример 6). При этом выявлено изменение соотношения ПГЕ₂ и ПГF_2α, обладающих противоположным действием на гладкую мускулатуру бронхов и сосудов, что может служить одним из объяснений снижения тяжести проявлений экспериментального бронхоспазма (пример 7). Кроме того, снижение синтеза 12-НЕТЕ является фактором, уменьшающим развитие канцерогенеза [Honn K.V., Tang D.G., Gao X. , Butovich I.A., Liu B., Timar J., Hagmann W./12-lipoxygenases and 12(S)- HETE: role in cancer metastasis.// Cancer and Metastasis Reviews. -1994. -vol. 13. -Iss 3-4. -pp. 365-96. -Ref: 195].

Как было отмечено выше, γ-L-Glu-HA обладает выраженным антиоксидантным действием (примеры 4, 5). Снижение тяжести бронхоспазма под влиянием заявляемого соединения (пример 7) патогенетически также может быть связано и с его антиоксидантным действием, так как известно, что у больных бронхиальной астмой при контакте с аллергеном происходит накопление свободных радикалов и активируется перекисное окисление липидов (ПОЛ). В период ремиссии выявлено значительное снижение перекисного окисления липидов у больных данной группы [Федосеева Г.Б. Механизмы обструкции легких. -Санкт-Петербург. -Медицинское информационное агенство. -1995. -334 с. -с. 129-132].

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать γ-L-Glu-HA в качестве потенциального лекарственного средства при лечении бронхиальной астмы.

Нарушение липидного обмена, характеризующееся повышением содержания триглицеридов, общего холестерина (ХС), холестерина в составе липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП) и снижением содержания холестерина в составе липопротеидов высокой плотности, приводит к развитию таких широко распространенных заболеваний, как атеросклероз и ожирение, и как следствие - ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, а также служит фактором риска манифестации сахарного диабета. Следует также отметить, что причиной нарушения обмена холестерина может служить изменение структуры ЛПНП и ЛПОНП, а также активности клеточных рецепторов. Выявлено, что у больных атеросклерозом и сахарным диабетом в ЛПНП повышено содержание триглицеридов, а в ЛПОНП - холестерина. С другой стороны, показано, что у лиц с повышенным содержанием глюкозы в крови активно происходит процесс гликозилирования ЛПНП, а при повышении содержания продуктов ПОЛ, например, МДА, образуются перекисно-модифицированные липопротеиды, в первую очередь - ЛПНП. Последние в силу своей цитотоксичности могут повреждать эндотелиальный покров сосудов. Выявлена положительная корреляция между содержанием продуктов ПОЛ в ЛПНП и площадью поражения коронарных сосудов. Авторы считают, что именно модифицированные ЛПНП обладают наиболее высокой атерогенностью [Климов А.Н., Никульчева Н. Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. -Питер. -Санкт-Петербург. -1995. -302 с.].

Известно, что изменение содержания и соотношения липидов в плазме отражает их изменения в мембранных структурах паренхиматозных органов. Состав мембран клетки, например, микросомальных, прямо зависит от состава рациона экспериментальных животных [Reichen J., Buters J.T.M., Sojcic Z., Roos F.J./ Abnormal Lipid-Composition of Microsomes from Cirrhotic Rat-Liver - Does It Contribute to Decreased Microsomal Function.// Experientia. -1992. -Vol. 48. -Iss 5. -pp. 482-486]. Введение животным холестерина вызывает накопление его в мембранах клеток, уменьшая ее текучесть, что, в свою очередь, приводит к изменению функционального состояния ферментов [Wade A., Harred W. / Effect of dietary lipid on drug-metabolising.// Feder. Proct. -1976. -vol. 55. -pp. 2475-2479; Buters J. T. M., Zysset T., Reichen J./ Metabolism of Antipyrin in-Vivo in 2 Rat Models of Liver-Cirrhosis - Its Relationship to Intrinsic Clearance in-Vitro and Microsomal Membrane Lipid Composition.// Biochem. Pharmacol. -1993. -vol. 46. -Iss 6. -pp. 983-991].

Моделирование нарушений обмена липидов, как правило, связано с добавлением в рацион животных тех или иных жировых композиций или повышенного количества холестерина. Использованная в наших исследованиях модель гиперхолестеринемии (пример 6) вызывает значительные изменения количества и соотношения липидов в крови: повышение триглицеридов (ТГ) общего холестерина (ХС), холестерина липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП - "атерогенные" липопротеиды), холестеринового индекса (K_XC) и снижение холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП - "антиатерогенные" липопротеиды). Эти изменения липидного состава крови сходны с изменениями у больных атеросклерозом, ожирением и сахарным диабетом [Климов А. Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. -Питер. -Санкт-Петербург. -1995. -302 с.; Татонь Я.Н. Ожирение патофизиология, диагностика, лечение. -Варшава. -Польское Медицинское издательство. -1981. -364 с.; Балаболкин М.И. Сахарный диабет. -М. -Медицина. -1994. -384 с.].

При изучении эффективности действия γ-L-Glu-HA на показатели липидного обмена выявлено (пример 8) достоверное снижение содержания ТГ, общего ХС, ХС-ЛПНП, ХС-ЛПОНП и K_XC и увеличение количества ХС-ЛПВП. Особо следует подчеркнуть важность того факта, что под влиянием γ-L-Glu-HA происходит достоверное увеличение ЛПВП, так как известно, что данная фракция липопротеидов оказывает защитное действие при развитии атеросклероза и ишемической болезни сердца. Протективное действие ЛПВП связывают с тем, что они участвуют в транспорте ХС из тканей в печень, снижая его накопление в стенке сосудов [Ohkuwa Т. , Sato Y., Naoi М. /Hydroxyl Radical Formation in Diabetic Rats Induced by Streptozotocin// Life Sci. -1995. -Vol 56. -Iss 21. -pp. 1789-1798] , а также задерживают образование перекисно-модифицированных ЛПНП [Климов А. Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. -Питер. -Санкт-Петербург. -1995. -302 с]. Кроме того, ЛПВП предотвращают образование тромбов на поверхности атеросклеротических бляшек. ЛПВП могут также блокировать рецепторы ЛПНП, после чего снижается накопление ХС в клетках. В эксперименте показано, что даже при повышенном содержании ХС в сыворотке крови наличие высокого количества ЛПВП предотвращает образование атеросклеротических бляшек в сосудах [Ohkuwa Т., Sato Y., Naoi М. /Hydroxyl Radical Formation in Diabetic Rats Induced by Streptozotocin// Life Sci. -1995. -Vol 56. -Iss 21. -pp. 1789-1798.].

Следует особо выделить снижение содержания ТГ в сыворотке крови при введении γ-L-Glu-HA, так как известно, что ТГ могут являться независимым фактором риска развития ишемической болезни, оказывая токсическое действие на эндотелий сосудов, приводящее к повышенной агрегации тромбоцитов и снижению фибринолитической активности крови [Ohkuwa Т., Sato Y., Naoi М. /Hydroxyl Radical Formation in Diabetic Rats Induced by Streptozotocin// Life Sci. -1995. -Vol 56. -Iss 21. -pp. 1789-1798].

Липидрегулирующее действие γ-L-Glu-HA, по-видимому, может быть связано с его антиоксидантными свойствами (примеры 2, 3), так как нарушение липидного обмена, как правило, сопровождается повышением ПОЛ.

Таким образом, γ-L-Glu-HA может быть использован при лечении атеросклероза и сопутствующих заболеваний (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда), ожирения и сахарного диабета, для профилактики тромбообразования.

В ходе дальнейших исследований было показано, что γ-L-Glu-HA достоверно снижает содержание глюкозы в крови у животных с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом (пример 9), не изменяя данного показателя у здоровых животных (пример 10). По-видимому, уменьшение количества глюкозы в крови животных с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом связано с нормализацией липидного обмена и снижением перекисного окисления липидов у этих животных, а также способностью γ-L-Glu-HA снижать образование гидроксильного радикала, играющего важную роль в формировании патологического процесса /39/. Результатом действия препарата, вероятно, является разрыв порочного круга, наблюдаемого при сахарном диабете, когда изменение метаболизма углеводов влечет нарушение обмена липидов и, наоборот, так как известна тесная взаимосвязь этих двух сторон обмена веществ в организме [Соколов Е.И. Сахарный диабет и атеросклероз. -М. -Наука. -1996. -405 с.].

Таким образом, данные результаты подтверждают, что γ-L-Glu-HA стабилизирует гомеостаз организма, что дает основание рекомендовать его для лечения сахарного диабета.

Результаты экспериментов (пример 11) свидетельствуют, что предлагаемое соединение повышает резистентность животных к вирусным инфекциям (вирус энцефаломиокардита и вирус гриппа), а также оказывает защитное действие в культуре клеток от цитодеструктивного действия вируса иммунодефицита - ВИЧ-1/ИВ17. Антивирусное действие γ-L-Glu-HA может быть связано с его антиоксидантными свойствами, так как ранее выявлено, что вещества, обладающие данным действием, обладают антивирусными свойствами [Орлова Т.Г., Воронина Ф. В. , Никифоров Г. А. , Ершов В.В., Бурлакова Е.Б. /Антивирусная активность препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами.// III Росс. национал. конгресс. -Человек и лекарство. -М. -1996. -с. 41].

Кроме этого, данные, приведенные в примере 12, показывают, что γ-L-Glu-HA достоверно увеличивает среднюю продолжительность жизни животных, инфицированных Salmonella sp. и получавших исследуемое соединение.

Таким образом, предлагаемый препарат можно рекомендовать при лечении бактериальных и вирусных инфекций, в том числе при лечении ВИЧ-инфекции.

Выявлено, что введение γ-L-Glu-HA животным с перевиваемой опухолью приводит к достоверному снижению интенсивности роста изученной опухоли (пример 13). Следует отметить, что патентуемое соединение влияет на рост опухоли аналогично препарату сравнения - Индометацину, который используется в практической медицине при лечении онкологических заболеваний [Lundholm К., Gelin J., Hyltander А., Lonnroth С., Sandstrom R., Svaninger G., Korner U., Gulich M., Karrefors I., Norii B. /Anti- inflammatory treatment vay prolong survival in undernourished panients with metastatic solid tumors.// Cancer Res. -vol. 54. -N 21. -pp. 5602-5606], однако доза патентуемого соединения была на порядок ниже.

Известно, что ингибирование синтеза 12-НЕТЕ приводит к снижению взаимодействия клеток опухоли с эндотелиальными клетками сосудов и уменьшению процесса гематогенного метастазирования [Honn К. V., Tang D. G., Grossi I., Duniec Z. М., Timar J., Renaud C., Leithauser M., Blair I., Johnson C. R., Diglio C.A. /Tumor cell-derived 12(S)- hydroxyeicosatetraenoic acid induces microvascular endothelial cell retraction.// Cancer Research. -1994. -vol. 54. -pp. 565-74; Honn K.V., Grossi I.M., Diglio C.A., Wojtukiewicz M., Taylor J. D./Enhanced tumor cell adhesion to the subendothelial matrix resulting from 12(S)-HETE-induced endothelial cell retraction.// Faseb J. -1989. -vol. 3. -pp. 2285-2293. ], поэтому заявляемое соединение может обладать антиметастатическими свойствами.

В ряде работ показано, что клиническое применение препаратов с антиоксидантной активностью приводит к улучшению функционирования или нормализации иммуно-метаболических систем гомеостаза при онкологических заболеваниях [Коломиец Л.А., Суслова Т.Е. /Возможности антиоксидантной терапии в качестве коррекции иммуно-метаболических нарушений у больных с предраковыми заболеваниями желудка. // II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". -Тез. докл. -1995. -с.199.; Лактионов К.Л., Байкова В.Н. /Значение антиоксидантной терапии при онкогинекологических заболеваниях.// там же.- с. 200].

На основании полученных данных можно рекомендовать предлагаемое соединение при онкологических заболеваниях для снижения интенсивности роста опухоли и степени метастазирования.

Широкий спектр действия предлагаемых препаратов может быть отчасти объяснен тем, что γ-L-Glu-HA действует на определенные системы, стабилизирующие гомеостаз организма. Известно, что в живом организме изменение активности одной системы влечет за собой изменения других и эти изменения принимают каскадный характер. При введении заявляемого соединения в организм наступает нормализация ряда его функций, что позволяет отнести его к адаптогенам.

В заключение следует отметить, что и γ-L-Glu-HA проявляет биологическую активность в дозах на два-три порядка ниже по сравнению с препаратами сравнения при практически одинаковой эффективности. Наряду с этим, при исследовании токсичности не найдена среднесмертельная доза, так как даже введение животным γ-L-Glu-HA в дозе 5000 мкг/кг перорально и 10000 мкг/кг парентерально не приводит к смертельному исходу экспериментальных животных.

γ-L-Glu-HA можно вводить внутримышечно, внутривенно, интраназально, перорально, сублингвально, интраректально и применять в виде ингаляций. Соответственно он может применяться в различных лекарственных формах: в виде инъекционных растворов, таблеток, свечей, мазей. При использовании предлагаемого соединения в виде инъекционных растворов содержание действующего начала в них должно составлять 0,01-0,03 вес.% (0,03-0,15 мкг/кг массы тела). В качестве разбавителя соединения могут быть использованы 0,9% раствор натрия хлорида, дистиллированная вода, раствор новокаина для инъекций, раствор Рингера, раствор глюкозы для инъекций и другие. γ-L-Glu-HA в виде таблеток и свечей содержит действующее вещество в количестве 3,0-6,0 мг на одну таблетку или свечу. Для таблеток и свечей в качестве фармацевтического наполнителя используют любую фармацевтически пригодную основу. Патентуемое соединение в любой форме можно применять в течение 5-10 дней по 1-2 раза в день. γ-L-Glu-HA не обладает побочным действием и не имеет противопоказаний к применению. Готовят лекарственные формы заявляемого соединения общеизвестным методом.

На основании результатов проведенных исследований предлагается использование γ-L-Glu-HA для лечения и профилактики следующих состояний и заболеваний: 1. стрессовые состояния; 2. бронхиальная астма;
3. атеросклероз, ишемическая болезнь, ожирение;
4. сахарный диабет 1 и 2 типа;
5. алкоголизм, алкогольная интоксикация;
6. профилактика тромбообразования;
7. гепатит, цирроз печени;
8. токсические поражения печени;
9. заболевания нервной системы, болезнь Паркинсона;
10. геронтологические заболевания: катаракта, старческое изменение кожных покровов;
11. радиационное поражение, профилактика радиотерапии;
12. вирусные и бактериальные инфекции, в частности, ВИЧ-инфекция;
13. онкологические заболевания.

Список сокращений.

АК - арахидоновая кислота
АФК - активные формы кислорода
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ЛД - летальная доза
ЛО - липоксигеназный путь
ЛПВН - липопротеиды высокой плотности
ЛПНП - липопротеиды низкой плотности
ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности
ЛТ - лейкотриены
МДА - малоновый диальдегид
ОВА - куриный овальбумин
ПГ - простагландины
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СПЖ - средняя продолжительность жизни
ТБК - тиобарбитуровая кислота
ТГ - триглицериды
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ТЦИД - тканевая цитопатическая доза
Ф - фосфолипиды
ФР - физиологический раствор
ХЛ - хемилюминесценция
ХС - холестерин
Bu^t - трет-бутил
Bzl - бензил
Boc - трет-бутилоксикарбонил
DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид
DCU - N,N'-дициклогексилмочевина
DMF - N,N'-диметилформамид
Et₃N - триэтиламин
EtOH - этанол
Glu - глутаминовая кислота
HA - гистамин
5-HETE - 5(S)-гидрокси-6,8,11,14-эйкозатетраеновая кислота
MeCN - ацетонитрил
MeOH - метанол
OBu^t - трет-бутиловый эфир
OPfp - пентафторфенил
TFA - трифторуксусная кислота
Z - бензилоксикарбонилн

Формула изобретения

1. Способ получения гамма-L-глутамилгистамина путем ацилирования гистамина замещенным производным L-глутаминовой кислоты с последующим отщеплением защит, отличающийся тем, что в качестве ацилирующего агента используют гамма-пентафторфениловый эфир N-трет.бутилоксикарбонил-α-бензилового эфира L-глутаминовой кислоты и процесс ведут в органическом растворителе, с последующим отщеплением бензильной защиты гидрогенолизом над палладиевым катализатором в органическом растворителе, а трет.-бутилоксикарбонильной защиты в кислой среде, с последующим изоэлектрическим осаждением из органического растворителя и перекристаллизацией.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию ацилирования проводят в диметилформамиде, отщепление Вос-защиты осуществляют трифторуксусной кислотой, а в качестве растворителя при изоэлектрическом осаждении применяют этанол.

3. Применение гамма-L-глутамилгистамина в качестве средства, обладающего антиоксидантным, антирадикальным, липидрегулирующим, гипогликемическим, антиастматическим, противовирусным, антибактериальным, противоопухолевым, антиметастическим, адаптогенным действием, а также способностью модулировать метаболизм арахидоновой кислоты, предупреждать проявления сахарного диабета, ожирения, ишемической болезни, стрессовых состояний, гепатита, цирроза, токсических поражений печени, алкоголизма, радиационных поражений, геронтологических изменений.

4. Фармацевтическая композиция, обладающая антиоксидантным, антирадикальным, липидрегулирующим, гипогликемическим, антиастматическим, противовирусным, антибактериальным, противоопухолевым, антиметастатическим, адаптогенным действием, а также способностью модулировать метаболизм арахидоновой кислоты, предупреждать проявления сахарного диабета, ожирения, ишемической болезни, стрессовых состояний, гепатита, цирроза, токсических поражений печени, алкоголизма, радиационных поражений, геронтологических изменений, содержащая в качестве активного ингредиента гамма-L-глутамилгистамин или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве и целевые добавки.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21