5-(цитозинил-1-)-1,3-оксатиоланы, способ их получения и фармацевтическая композиция

 

Описываются новые соединения - 5-/цитозинил-1/-1,3-оксатиоланы конфигурации цис(2R, 5S или 2S, 5R) общей формулы I, в которой R - радикал пиридилкарбонил, 1,4-дигидропиридилкарбонил, хинолинилкарбонил или 1,4-дигидрохинолинилкарбонил, возможно замещенный алкилом с 1-10 атомами углерода или радикалом трифторметиламино, а оксиметильная группа в положении 2 находится в цис-положении по отношению к плоскости, определяемой положениями 2 и 5. Соединения общей формулы (I) являются активным началом фармацевтических композиций, например, противовирусного действия. Описывается также их способ получения и фармацевтическая композиция на основе вышеуказанных соединений. 3 с. и 11 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к области органической химии и более конкретно к области синтеза биологически активных соединений, которые могут быть полезны в терапии.

Объектом изобретения являются 2',3'-дидезоксинуклеозиды, замещенные в положении 2 1,3-оксатиолановым циклом.

Более конкретно, объектом изобретения являются 5-(цитозинил-1)-1,3-оксатиоланы конфигурации цис-(2R, 5S или 2S, 5R), отвечающие формуле которую можно представить в виде одного из двух пространственных конфигураций: в которой R является ацильным или аралкильным радикалом, происходящими из моно- или бициклического азотсодержащего гетероцикла, а оксиметильная группа в положении 2 находится в цис-положении по отношению к плоскости, определяемой положениями 2 и 5.

Различные значения заместителя R могут быть следующими: а) никотиновые радикалы, где гетероцикл имеет пиридиновую структуру, а ацильная группа находится в положении 2, 3 или 4 формулы Ia: в которой X является водородом, атомом галоида, нитрогруппой, низшим алкокси или трифторметильным радикалом, n=1, 2, 3, б) дигидропиридиновые радикалы, где гетероцикл является 1,4-дигидропиридином, а ацильный радикал находится в положении 2, 3 или 4 формулы Iб:
в которой R₁ является алкильным радикалом, содержащим 1-10 атомов углерода, X и n имеют указанные выше значения,
в) кватернизованные никотиновые радикалы, в которых атом азота имеет алкильный заместитель и ацильный радикал находится в положении 2, 3 или 4 общей формулы Iв:

в которой A является минеральным или органическим анионом, R₁, X и n имеют указанные выше значения,
г) хинолиновые радикалы, в которых гетероцикл является бициклической структурой, имеющей общую формулу Iг:

в которой карбонильный радикал может быть в положении 2, 3 или 4, X является водородом, галоидом, трифторметильным радикалом, низшим алкокси или нитрогруппой, и n' является целым числом от 1 до 6,
д) дигидрохинолиновый радикал общей формулы Iд:

в которой R₁ и X имеют указанные выше значения, и n' является целым числом от 1 до 6.

е) кватернизованные хинолиновые радикалы общей формулы Iе:

в которой R₁, X и n' имеют указанные выше значения, ацильный радикал находится в положении 2, 3 или 4, и A является минеральным или органическим анионом,
ж) (дигидропиридил)-алкильный радикал общей формулы Iж:

в которой R₁, X и n имеют указанные ранее значения, и m является числом от 1 до 6, а также их соли присоединения минеральной или органической кислоты.

Соединения общей формулы (I) могут быть разделены на их оптические изомеры. Таким образом получают (+)-изомер и (-)-изомер.

Ретровирусные инфекции являются причиной тяжелых заболеваний, в частности, синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), который является вирусным заболеванием и в меньшей степени вызывает гепатиты. Для лечения этих ретровирусных заболеваний в настоящее время в клиниках используют некоторые соединения нуклеозидного или гетеронуклеозидного типа. Ими являются производные АЗТ (3'-азидо-2', 3'дидезокситимидина) (Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 7096-7100, 1985), ддЦ (2',3'-дидезоксицитидин) (Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 1911-15, 1986), д4Т (2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидин) (Biochem. Biophys. Res. Comm. 142, 128-34, 1987), ддИ (2',3'-дидезоксиинозин) (Antiviral. Chem. Chemother 2, 221, 1991), BCH-189 или 3ТЦ (2',3'-дидеокси-3'-тиацитидин), описанные в европейской заявке на патент 90 301335.7 и др. Ограниченное количество этих противовирусных соединений, имеющихся в распоряжении пациентов, и их недостаточная терапевтическая эффективность обуславливают поиск новых соединений, терапевтические свойства которых будут выше, а побочные эффекты ниже.

Уже известны производные 2-[(1-оксиметил)-1,3-оксатиолан-5-ил]-цитозина, а именно сложные эфиры по оксиметильной функции (европейская заявка на патент 0.382.526) или галоидные производные в положении 5' пиримидинового ядра (R.F. SHINAZI и др. Antimicrob Agents and Chemotherapy 36 (1992) 2423-2431).

Соединения согласно изобретению обладают свойством ингибировать репликацию человеческих ретровирусов, в частности вируса ВИЧ и вируса гепатита B (VHB). Эти соединения, производные BCH-189 или 3ТЦ, включают в свою структуру 1,4-дигидро-1-метил-3-хинолилкарбонильный фрагмент, фиксированный на экзоциклической аминогруппе цитидина. Этот конкретный структурный фрагмент в экспериментальной фармакологии придает свойство повышать и облегчать проход гемато-энцефалитического барьера (Pharmacol, Ther. 19, 337-396, 1983 - Methods Enzymol. 112, 381-396, 1985 - Drug. Des. Del.1, 51-64 (1986) - J. Med. Chem. 31, 244-249, 1988 - J. Med. Chem. 32, 1782-1788, 1989 - J. Med. Chem. 32, 1774-1781, 1989).

Химический синтез этих соединений проводят в соответствии с классическими экспериментальными методиками. Для получения этих новых гетеронуклеозидов в качестве исходного соединения используют производное 2',3'-дидеокси-3'-триацитидина, несколько методов синтеза которого описано в химической литературе (J. Org. Chem. 56, 6503, 1991 - J. Org. Chem. 57, 2217, 1992 - Tet. Lett. 33, 4625, 1992 - Nucleosides and Nucleotides 12, 225, 1993). В настоящей заявке на патент описан синтез соединений, являющихся объектом настоящего изобретения, а также промежуточных соединений синтеза.

Таким образом, изобретение относится к способу получения соединений общей формулы I, который заключается в том, что цис-5-(цитозинил-1)-1,3-оксатиолан подвергают действию функционального производного карбоновой кислоты формулы ROH, где R является ацильным радикалом, производным ароматического или дигидроароматического моно- или бициклического азотсодержащего гетероцикла, или действию активного аралкильного производного формулы R'Z, где R' является аралкильным радикалом, производным ароматического или дигидроароматического моно- или бициклического азотсодержащего гетероцикла, и Z является лабильным легко отщепляемым радикалом.

Более конкретно, функциональное производное кислоты ROH является галогенидом, ангидридом, смешанным ангидридом, образованным с карбодиимидом или реактивным сложным эфиром, например, сложным эфиром фенола.

В случае аралкильного производного Z является атомом галоида или алкильным радикалом или арилсульфонильным радикалом.

Объектом изобретения также является фармацевтическая композиция противовирусного действия, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного начала по крайней мере одно соединение общей формулы I или одну из его солей присоединения минеральной или органической кислоты в смеси с экципиентом или инертным нетоксичным фармацевтически совместимым носителем.

В этих композициях содержание активного начала общей формулы I находится в интервале от 0,1 мг до 100 мг на единичную дозу в зависимости от пути введения.

Пример 1
Цис-изомеры 2-(дифенилтрет. бутилсилилоксиметил)-5-[N⁴- (3''-пиридинилкарбонил)цитозинил-1']-1,3-оксатиолана
(Соединение 1)
При комнатной температуре в атмосфере азота к смеси 7 мл дихлорметана и 2 мл диметилформамида прибавляют 1 экв. (27 мг, 0,21 ммоля) никотиновой кислоты, 1,1 экв. (93 мг, 0,23 ммоля) BOP, 1,1 экв. ОБТ (31 мг, 0,23 ммоля), 1 экв. (39 мг, 0,23 ммоля) 5'-трет-бутилдифенилсилил-2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина, 4 экв. ДИЭА (146 мкл, 0,84 ммоля). Смесь перемешивают всю ночь при комнатной температуре, промывают 10 мл 5%-ого раствора лимонной кислоты, потом 10 мл 5%-го водного раствора бикарбоната натрия. Полученную в результате смесь экстрагируют 3х10 мл этилацетата, сушат над сульфатом натрия и выпаривают. Остаток очищают на пластине с силикагелем. Получают 48 мг чистого соединения.

¹H-ЯМР-спектр: δ (CDCl₃) = 1,1 (с, 9H, трет.-Bu); 3,1-3,6 (м, 2H, CH₂-O); 3,7-4,2 (м, 2H, C₄H₂); 5,25 (т, 1H, C₅-H); 3,1-3,6 (м, 2H, CH₂-O); 5,5 (д, 1H, C_5'-H); 6,35 (к, 1H, C₂-H); 7,4-7,8 (м, 1H, ароматика); 8,0 (д, 1H, C_6'-H); 8,3 (д, 1H, никотинил); 8,8 (д, 1H, никотинил); 8,8 (д, 1H, никотинил); 9,1 (д, 1H, никотинил).

Пример 2
Цис-изомеры-2-(оксиметил)-5-[N⁴-(3''-пиридинилкарбонил)- цитозинил-1'] -1,3-оксатиолана
(Соединение 2)
Растворяют 25 мг (0,05 ммоля) соединения 1 в 3 мл безводного тетрагидрофурана. К этому раствору прибавляют 3 экв. (135 мкл, 0,15 ммоля) тетрабутиламмонийфторида. Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. После выпаривания растворителя полученный в результате продукт хроматографируют на препаративной пластине с оксидом кремния (элюент: толуол/CH₃OH 15%). Выделяют 13 мг целевого соединения
¹H-ЯМР-спектр: δ (CDCl₃) = 3,1-3,6 (м, 2H, CH₂-O); 3,7-4,2 (м, 2H, C₄H₂); 5,25 (т, 1H, C₅-H); 5,5 (д, H, C_5'-H); 6,35 (к, 1H, C₂H); 7,4-7,8 (м, 1H, ароматика); 8,0 (д, 1H, C_6'-H); 8,3 (д, 1H, никотинил); 8,8 (д, 1H, никотинил); 9,1 (с, 1H, никотинил).

Пример 3
Цис-изомеры-2-(трет-бутилдифенилсилилоксиметил)-5-[N⁴-(3''- тозил)-цитозинил-1']-1,3-оксатиолана
(Соединение 4)
В атмосфере азота при температуре 60^oC к раствору 56 мг (0,12 ммоля) производного 5 в 3 мл пиридина прибавляют 2 экв. (46 мг, 0,24 ммоля) хлорангидрида пара-толуолсульфоновой кислоты. После 20 часов перемешивания при комнатной температуре смесь выпаривают досуха, промывают 10 мл 5%-го раствора лимонной кислоты, потом экстрагируют 3х10 мл этилацетата. Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия и выпаривают. Выделяют 48 мг целевого продукта.

¹H-ЯМР-спектр: δ (CDCl₃) = 1,1 (c, 9H, трет-Bu); 2,45 (с, 3H, CH₃тозил); 3,15-3,55 (м, 2H, C₂-CH₂O); 3,85-4,2 (м, 2H, C₄H₂), 5,25 (т, 1H, C₅-H); 6,3 (т, 1H, C₂-H); 7,3-7,7 (м, 14H, ArH); 8,05 (д, 1H, C_6'-H).

Пример 4
Цис-изомеры-2-(дифенилтрет-бутилсилилоксиметил)-5-[N⁴-(3''- пиридинилкарбонил)-цитозинил-1']-1,3-оксатиолана
(Соединение 3)
К раствору 47 мг (0,075 ммоля) производного 4 в 2 мл лутидина в атмосфере азота при 90^oC прибавляют 6 экв. (46 мкл, 0,45 ммоля) пиридинилметиламина. Смесь нагревают в течение 48 часов при перемешивании. После охлаждения смесь выпаривают, промывают 10 мл 5%-го раствора лимонной кислоты, потом экстрагируют 3х10 мл этилацетатом, сушат над сульфатом натрия. После выпаривания остаток очищают хроматографией на пластине с силкагелем (элюент: EtOAc/MeOH, 10/1).

Пример 5
Цис-изомеры-2-(трет. -бутилдифенилсилилоксиметил)-5-цитозинил-1')-1,3-оксатиолана
(Соединение 5)
Раствор 105 мг (0,45 ммоля) 2',3'-дидеокси-3'-тиацитидина в 6 мл пиридина обрабатывают в атмосфере азота 140 мкл (0,5 ммоля) дифенилтрет.-бутилсилилхлорида. Реакционную смесь перемешивают 24 часа при комнатной температуре. После концентрирования в вакууме прибавляют 30 мл воды и экстрагируют 3х20 мл этилацетата. Объединенные органические фазы тогда сушат над сульфатом натрия и концентрируют досуха, получают 210 мг соединения 5 с количественным выходом в виде белого твердого продукта.

R_f(AcOEt/MeOH 2:1) = 0,62
¹H-ЯМР-спектр (CDCl₃) δ: 1,1 (с, 9H, трет.Bu); 3,1-3,6 (м, 2H, C₂-CH₂-O); 3,7-4,2 (м, 2H, C₄H₂); 5,25 (т, 1H, C₅-H); 5,5 (д, H, C_5'-H); 6,35 (к, 1H, C₂-H); 7,4-7,8 (м, 10H, 2Ph); 8,0 (д, 1H, C_6'-H).

Пример 6
Цис-изомеры-иодида-2-(оксиметил)-5-[N⁴-(1''-метил-3''- пиридинилкарбонил)-цитозинил-1']-1,3-оксатиолана
(Соединение 6)
В атмосфере азота прибавляют к 1 экв. (46 мг, 0,14 ммоля) соединения 2, растворенному в 4 мл безводного ацетонитрила, 9 экв. (1,25 ммоля, 77 мкл) метилиодида. Полученный в результате раствор нагревают при 50^oC в течение 48 часов. После выпаривания растворителей остаток очищают флэш-хроматографией, элюируя с помощью BuOH/H₂O/уксусная кислота (5:2,5:2,5). Получают 55 мг желтого твердого продукта.

¹H-ЯМР-спектр: (ДМСО d₆) δ = 3,25 (т, 2H, CH₂-4); 3,90 (дд, 2H, C₂-CH₂); 4,45 (c, 3H, N⁺-CH₃); 5,25 (т, 1H, CH-5); 6,30 (т, 1H, CH-2); 6,92 (д, 1H, CH-6'); 7,30 (д, 1H, никотинил); 7,85 (д, 1H, никотинил); 8,05 (д, 1H, CH-5'); 8,20 (д, 1H, никотинил); 7,85 (д, 1H, никотинил); 9,01 (д, 1H, никотинил).

Масс-спектр: (FAB⁺) 349 (M-1)⁺
Пример 7
Цис-изомеры 2-(оксиметил)-5-[N⁴-(1''-метил-1'',4''-дигидро-3''- пиридинилкарбонил)-цитозинил-1']-1,3-оксатиолана
(Соединение 7)
В 3 мл дегазированного раствора метанола, содержащего 10% воды, растворяют 30 мг (0,06 ммоля) соединения 6. К этому раствору прибавляют 15 мг бикарбоната натрия и 60 мг дитионита натрия. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере азота в течение 3 часов. Раствор становится оранжевым. Выпаривают растворитель, потом повторно суспендируют соли в минимальном количестве метанола и фильтруют. Фильтрат очищают препаративной хроматографией на тонком слое (1 мм). (Элюент: толуол: метанол 1:1), получают 6 мг твердого бело-желтого продукта.

Масс-спектр: (FAB⁺) 349 (M-1)⁺.

Пример 8
Цис-изомеры-2-оксиметил-5-[N⁴-(3''-хинолинилкарбонил)- цитозинил-1'] -1,3-оксатиолана
(Соединение 8)
К 2 мл безводного диметилформамида добавляют 74,4 мг (0,43 ммоля) 3-хинолинкарбоновой кислоты, потом 96 мг (0,47 ммоля) 1,3-дициклогексилкарбодиимида и 63,4 мг (0,47 ммоля) гидрата оксибензотриазола. Смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре в атмосфере азота. Появляется белый осадок дициклогексилмочевины, тогда прибавляют 100 мг (0,44 ммоля) 2', 3'-дидеокси-3'-тиацитидина. Смесь перемешивают всю ночь. Потом выпаривают диметилформамид при пониженном давлении, остаток гидролизуют 10 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия. Остаток экстрагируют 2х10 мл этилацетата. Объединяют органические фазы, сушат над сульфатом магния, потом фильтруют. Растворитель упаривают. Продукт очищают флэш-хроматографией (Элюент: этилацетат : метанол 98:2), чтобы получить 78 мг (0,2 ммоля) белого твердого продукта, выход 46,5%.

Т.пл. = 116-118^oC - ИК-спектр = 1656 см^-1 (карбонил амидной функции);
[¹H] -ЯМР-спектр (ДМСО d₆) δ = 11,75 (c, 1H, NH); 9,40 (д, 1H, CH-2''); 9,15 (д, 1H, CH-4''); 8,65 (д, 1H, CH-5';); 8,20 (м, 2H, CH-8'' и CH-5''); 8,0 (м, 1H, CH-6''); 7,80 (м, 1H, CH-7''); 7,45 (д, 1H, CH-6'); 6,35 (т, 1H, CH-2); 5,55 (т, 1H, CH-5); 3,98 (т, 2H, C₂-CH₂-4);
[¹³С]-ЯМР (ДМСО d₆) δ = 37,14 (C-4); 61,95 (CH₂O-C₂); 87,28 (C-2); 88,29 (C-5); 95,85 (C-5'); 122,21 (C-3''); 126,28 (C-6''); 127,71 (C-5''); 129,63 (C-10''); 129,87 (C-7''); 132,08 (C-8''); 137,65 (C-4''); 138,89 (C-6'); 148,91 (C-9''); 149,29 (C-2''); 163,16 (C-2'); 164,51 (C-4').

Масс-спектр: (Fab⁺) 385 (M+1)⁺, 769 (2M+1)⁺.

Пример 9
Цис-изомеры иодида 2-оксиметил-5-[N⁴-(1''-метил-3''- хинолинилкарбонил)-цитозинил-1']1,3-оксатиолана
(Соединение 9)
Готовят раствор 78 мг (0,20 ммоля) соединения 8 в 4 мл ацетонитрила. Прибавляют 112 мкл (1,8 ммоля) метилиодида и нагревают смесь при 40^oC в атмосфере азота в течение 24 часов. Отгоняют растворитель и сырой остаток затем растворяют в минимальном количестве ацетонитрила. Снова осаждают его добавлением эфира. Таким образом получают твердое оранжевое вещество (60 мг), выход 55%.

Т.пл. 156-159^oC.

¹H-ЯМР-спектр: (СД₃ОД) δ = 3,32 (т, 2H, CH₂-4); 3,99 (дд, 2H, C₂-CH₂); 4,80 (с, 3H, ⁺N-CH₃); 5,38 (т, 1H, CH-5); 6,0 (д, 1H, CH-6'); 6,33 (т, 1H, CH-2); 8,13 (м, 1H, CH-7''); 8,39 (м, 1H, CH-6''); 8,60 (м, 2H, CH-8''); 8,72 (д, 1H, CH-5'); 9,79 (д, 1H, CH-4''); 9,95 (д, 1H, CH-2'').

Масс-спектр: (Fab⁺) 399 [M-1]⁺, 799 [2(m-1)]⁺.

Пример 10
Цис-изомеры 2-оксиметил-5-[N⁴-(1''-метил-1'',4''-дигидро-3''- хинолинкарбонил)-цитозинил-1']-1,3-оксатиолана
(Соединение 10)
К раствору 30 мг (0,057 ммоля) соединения 9 в 3 мл водного дегазированного метанола (3 мл содержат 10% воды) прибавляют 15 мг бикарбоната натрия и 60 мг дитионата натрия. Смесь перемешивают в течение часа в атмосфере азота. Выпаривают растворитель и сырой остаток очищают препаративной хроматографией (Элюент: этилацетат : метанол 1:1). В результате получают 10 мг твердого желтого стекловидного продукта с выходом 46%.

¹H-ЯМР-спектр: (Д₂О) δ = 3,24 (м, 3+2H, NCH₃+CH₂-4''); 3,48 (м, 2H, CH₂-4); 3,93 (м, 2H, C₂H₂); 5,29 (т, 1H, CH-5); 6,96 (д, 1H, CH-6'); 7,13 (м, 2H, CH-6''+CH-7''); 7,27 (м, 2H, CH-5'' + CH- 8''); 7,45 (д, 1H, CH-2''); 8,23 (д, 1H, CH-5').

Масс-спектр: (Fab⁺) 399 (M-1)⁺.

Пример 11
Цис-изомеры 2-оксиметил-5-[N⁴-(2-(а,а,a-трифтор-м-толуидино)- никотинил)-цитозинил-1']-1,3-оксатиолана
(Соединение 11)
К раствору 50 мг (0,20 ммоля) 2',3'-дидеокси-3'-тиацидина в 5 мл безводного ДМФ прибавляют 1 экв. ВОР (93 мг, 0,23 ммоля), 1 экв. нифлумовой кислоты [2-(а,а,a-трифтор-м-толуидино)-никотиновая кислота] и 4 экв. ДИЭА (146 мкл, 0,84 ммоля). Смесь перемешивают всю ночь при комнатной температуре, промывают 10 мл 5%-го раствора лимонной кислоты, потом 5%-м водным раствором бикарбоната натрия (10 мл). Полученную смесь экстрагируют 3х10 мл этилацетата, сушат над сульфатом натрия, затем выпаривают. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (элюент: этилацетат : толуол 1:9). Получают белый твердый продукт (49 мг), выход 48%.

Испытания на противовирусную активность
Тесты Анти-ВИЧ. Протокол эксперимента
а) Общие положения
Аппаратура: Используют ультрацентрифугу типа Бекман ТЛ 100. Подсчет радиоактивных частиц проводят на приборе Хьюлетт Паккард Три-Карб Модель 1600. Соклетия наблюдают в инверсионном микроскопе Лабовер. Состав буфера для лизиса NTE: Трис-оксиметиламинометан (10 мМ), NaCl (100 мМ), ЕДТА (1 мМ)
б) Тест на уровень противовирусной активности на клеточной культуре
Уровень противовирусной активности определялся на изучении цитопатогенного действия вируса ВИЧ-1 на клеточную линию МТ4. Линия МТ4 происходит из Т-клеток, изолированных из пациента, трансформированных вирусом VTLH-1. Цитопатогенное действие вируса ВИЧ-1 проявляется через образование многоядерных гигантских клеток, называемых "соклетия", видимых в микроскоп. Этот эффект ВИЧ-1 наблюдается через 4-5 дней после заражения, затем клетки погибают.

Цитопатогенное действие непосредственно коррелирует с заражением клеток вирусом, его внутриклеточной репликацией и экспрессией вирусных антигенов клетками. Ингибирование этого эффекта, следовательно, соответствует ингибированию размножения вируса ВИЧ-1.

Клетки МТ4 находятся в концентрации 3·10⁵ клеток/мл среды RPMI 1640, содержащей: 10% фетальной сыворотки теленка, декомплементированной в течение 30 минут при 56^oC (гормоны, сывороточные факторы роста...), 1% глутамина, 1% пенициллина, стрептомицина и 2 мкг/мл полирена, который благоприятствует адгезии вируса к клеткам.

Действие противовирусного агента является постоянным. Действительно, противовирусный агент присутствует до, во время и после вирусного заражения. Проводят последовательные разбавления 10%-й фетальной сыворотки теленка, чтобы можно было культивировать MT4 в течение 8 дней и наблюдать образование "соклетий".

Тест MT4
Перед заражением: Распределяют 3·10⁶ клеток/100 мкл в микропластинке с 96 лунками и центрифугируют 3 минуты при 2000 об/мин. Затем осадок предварительно инкубируют в течение часа при 37^oC со 100 мкл испытуемого противовирусного агента в различных концентрациях.

Заражение: Заражение проводят в микролунках, внося туда 100 TCIU (единиц заражения) вируса ВИЧ-1 (титр этого вируса ВИЧ-1 вызывает образование соклетий за 4 или 5 дней). При заражении и разбавлении вируса до 100 TCIU всегда присутствует противовирусный агент.

После заражения: после инкубации в течение 1 часа при 37^oC линию клеток MT4 промывают 3 раза с помощью среды RPMI 1640 и культивируют из расчета 3·10⁵ клеток в 1 мл каждой из концентраций испытуемого соединения, засевая 24 лунки. При проведении пассажа на третий день J₃ клетки MT4 разбавляют на 1/3. Концентрацию противовирусного агента сохраняют. Каждый день наблюдают за возникновением соклетий в микроскопе, чтобы определить возможную задержку по отношению к контролю ВИЧ-1. На восьмой день J₈ проводят определение обратной транскриптазы. Если клетки не заражены, следовательно, имеется защита, обеспечиваемая испытуемым противовирусным агентом.

Определение обратной транскриптазы
Обратная транскриптаза является РНК зависимой ДНК-полимеразой. Этот фермент обеспечивает репликацию ретровируса. Благодаря этому, РНК вируса, скопированная в ДНК, интегрируется в геном клетки. Провирусная ДНК транскрибируется ферментами клетки в вирусную ДНК.

Для определения активности обратной транкриптазы концентрируют в 100 раз 1 мл надосадочной культуральной жидкости ультрацентрифугированием в течение 5 минут при 95000 об/мин, полученный вирусный осадок от центрифугирования снова суспендируют в 10 мкл буфера NTE + TRITON 0,1% (полиоксиэтиленовый простой эфир); он служит для лизиса и высвобождения обратной транскриптазы. Активность обратной транкриптазы определяют в тесте in vitro. Этот фермент использует синтетическую поли А матрицу, имеющую начало олиго dT из 12-18 остатков. Радиоактивный субстрат этой реакции представляет собой [³H]dTTP (радиоактивный трифосфатированный тимидин с 1 мКю/мл); новообразованные тритированные макромолекулы осаждают трихлоруксусной кислотой и отделяют от свободного [³H] TTP фильтрованием. Ферментную активность обратной транскриптазы измеряют по радиоактивности, введенной в комплексы поли-rA/поли-dT. Эту радиоактивность определяют в счетчике частиц после добавления сцинциллирующей жидкости, выполняющей функцию амплификатора.

Тест анти-VHB. Протокол эксперимента
Среди различных методик, применяемых для оценки активности соединений по отношению к вирусу гепатита В (VHB), используют модель вируса гепатита В утки (Duck HBV) (J. Med. Virology 1990, 31, 82-89; Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 506-509; Hepatology, 1989, 10, 186-191). Материалом для культивирования в тесте "in vitro" на анти-VHB активность соединений являются гепатоциты утки, зараженные вирусом гепатита В утки (DHBV), (Antimicrob. Agents Chemother. 1989, 33, 336-339; J. Med. Virology, 40, 59-64; Antivir, Res. 1993, 21, 155-171; Antimicrob. Agents Chemother. 1993, 37, 1539-1542). Действительно, вирус гепатита В утки признан наиболее близким вирусу гепатита В человека (Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 526-529; Antiviral Research, 1987, 8, 189-199). В стандартизованных условиях (Virology 1989, 171, 564-572) культивирование гепатитов утки обеспечивает полную репликацию DHBV. Противовирусную активность испытуемых соединений измеряют как функцию количества вирусной ДНК, продуцируемой в течение 10 дней культивирования зараженных гепатитов.

Протокол:
Для получения гепатитов используют трехнедельного утенка, пораженного DHBV. Утенка умерщвляют под анестезией и проводят выделение гепатитов по методике Guillouzou (Исследования на выделенных и культивированных гепатоцитах, J. Libbey Eurotex Ltd/INSERM, 1986). Клетки суспендируют в среде Лейбовица и добавляют 5 мкг/мл бычьего инсулина, 7·10^-5 моля гемисукцината гидрокортизона и 1,5% ДМСО. Плотность клеток равна 8·10⁶ клеток, распределенных в чашки для культивирования 100х20 мм. Испытуемые соединения добавляют в культуру после распределения клеток. Среду меняют каждый день в течение 10 дней. Продуцирование вирусной ДНК вируса гепатита В утки в супернатанте клеток оценивают по методу гибридизации "Dot Blot", согласно Fourel et al. (Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 506-509; Hepatology, 1989, 10, 186-191). Ингибирование выражают в процентах количества ДНК, имеющейся в супернатанте клеток, по отношению к культуре, зараженной DHBV, необработанной производным нуклеозида.

Вирусологические результаты
Тесты ВИЧ:
Соединения, синтез которых описан в настоящей заявке на патент, и структуры, приведенные в описании уровня техники, оказывают влияние на ингибирование репликации вируса ВИЧ-1 BRU (BRU: экспериментальный вирусный штамм) в случае, когда зараженные клетки относятся к типу MT4.

В таблице 1 приведены результаты испытаний. В колонке 1 приводится название наиболее репрезентативных изученных соединений, а в колонке 2 приведены величины ИК₅₀ (концентрации соединения, дающей 50% ингибирования репликации вируса ВИЧ в зараженных MT4 клетках, измеренное на седьмой день J₇ после заражения). Величину ИК₅₀ определяют при наблюдении и подсчете количества образовавшихся соклетий по отношению к количеству соклетий, подсчитанных в случае клеток MT4, зараженных, но необработанных противовирусным соединением.

Тест DBHV:
Наиболее соединения были испытаны на их действие на репликацию вируса Duck HBV (DHBV) согласно протоколу, приведенному в экспериментальной части.

В таблице 2 приведены результаты этих испытаний.

Сокращения:
AcOEt: этилацетат
ДНК: дезоксирибонуклеиновая кислота
APTS: пара-толуолсульфоновая кислота
РНК: рибонуклеиновая кислота
АЗТ: 3'-азидо-2',3'-дидедокситимидин или Зидовудин
ВОР: бензотриазолилокситрисдиметиламинофосфоний гексафторфосфат
ТСХ: тонкослойная хроматография
ДЦК: N,N'-дициклогексилкарбодиимид
ДЦМ: N,N'-дициклогексилмочевина
ДИЭА: N,N-диизопропил-N-этиламин
ДМФ: N,N-диметилформамид
DHBV: Диск вирус гепатита В
FAB⁺: "Быстрая положительная атомная бомбардировка"
³HdTTP: Радиоактивный трифосфатированный тимидин с 1 мКю/мл
ОБТ: 1-оксибензотриазол
ИК: инфракрасный
Т.пл.: точка плавления
ЯМР: ядерный магнитный резонанс
СПИД: синдром приобретенного иммунодефицита
МС: масс-спектрометрия
ТБА: тетрабутиламмонийфторид
ТБДФСCl: тетрабутилдифенилсилилхлорид
3-ТЦ: (-)-(2R, 3S)-2-оксиметил-5-(цитозин-1'-ил)-1,3- оксатиолан или Ламивудин
TCIU: единицы заражения
ТГФ: тетрагидрофуран
об/м: обороты в минуту
TSCl: тозилхлорид
УФ: ультрафиолет
ВИЧ: вирус человеческого иммунодефицита
VHB: вирус гепатита В
VTLH: вирус лимфотропных человеческих Т-клеток
Пример 1
Таблетки
активное начало (пример 10) - 100 г
крахмал пшеницы - 50 г
крахмал кукурузы - 62 г
микрокристаллическая целлюлоза - 15 г
этилцеллюлоза - 8 г
стеарат магния - 5 г
на 1000 готовых таблеток средний вес каждой 0,240 г
Пример 2
Желатиновые капсулы
активное начало (пример 2) - 50 мг
лактоза - 65 г
стеарат магния - 5 г
на 1000 готовых желатиновых капсул средний вес капсулы 0,120 г
Пример 3
Таблетки в оболочке
активное начало (пример 7) - 75 г
оксид кремния - 36 г
лактоза - 115 г
карбоксиметилкрахмал в качестве соли натрия - 10 г
тальк - 7 г
стеарат магния - 7 г
на 1000 сердцевин средний вес каждой 250 г
Оболочка:
желатина
пчелиный воск
гуммиарабик
сахароза
диоксид титана
шеллак
карнаубский воск
этилванилина
на 1000 готовых таблеток в оболочке средний вес таблетки 0,350 г.

Формула изобретения

1. 5-(Цитозинил-1)-1,3-оксатиоланы конфигурации цис(2R, 5S или 2S, 5R) общей формулы I

в которой R - радикал пиридилкарбонил, 1,4-дигидропиридилкарбонил, хинолинилкарбонил или 1,4-дигидрохинолинилкарбонил, возможно замещенный алкилом с 1 - 10 атомами углерода или радикалом трифторметилфениламино;
оксиметильная группа в положении 2 находится в цис-положении по отношению к плоскости, определяемой положениями 2 и 5.

2. 5-(Цитозинил-1)-1,3-оксатиоланы по п.1, конфигурации 2R, 5S по п.1 общей формулы I

3. 5-(Цитозинил-1)-1,3-оксатиоланы по п. 1 конфигурации 2S, 5R общей формулы II

4. Соединения по пп.1 - 3, отличающиеся тем, что R является никотиновым производным формулы Ia

в которой X - водород или трифторметильный радикал;
ацильный остаток находится в положении 2 или 3.

5. Соединения по пп.1 - 3, отличающиеся тем, что R является дигидропиридиновым производным формулы Ib

в которой R₁ является алкильным радикалом, имеющим 1 - 10 атомов углерода;
X - водород,
ацильный радикал находится в положении 2 или 3.

6. Соединения по пп. 1 - 3, отличающиеся тем, что радикал R является кватернизованным производным никотина формулы Ic

в которой A является минеральным анионом, таким, как анион галогена;
R₁ является алкильным радикалом, имеющим 1 - 10 атомов углерода;
X - водород;
ацильный радикал находится в положении 2 или 3.

7. Соединения по пп. 1 - 3, отличающиеся тем, что радикал R является производным хинолина формулы Id

в которой карбонильный радикал находится в положении 2 или 3;
X - водород.

8. Соединения по пп. 1 - 3, отличающиеся тем, что радикал R является производным дигидрохинолина общей формулы Ie

в которой R₁ - алкильный радикал, содержащий 1 - 10 атомов углерода;
X - водород.

9. Соединения по пп. 1 - 3, отличающиеся тем, что радикал R является кватернизованным производным хинолина общей формулы If

в которой A является минеральным анионом, таким, как анион галогена;
R₁ - алкильный радикал, имеющий 1 - 10 атомов углерода;
X - водород;
ацильный радикал находится в положении 2 или 3.

10. Соединения по пп. 1 - 9, представляющие собой соли присоединения минеральной кислоты.

11. Соединения по пп.1 - 9, представляющие собой оптические изомеры.

12. Соединение по п.1, или 10, или 11, представляющее собой цис-2-оксиметил-5-[N⁴-(3''-пиридилкарбонил) цитозин-1'-ил]-1,3-оксатиолан и его соли присоединения минеральной кислоты в рацемической или оптически активной форме.

13. Способ получения соединений по одному из пп.1 - 12, заключающийся в том, что цис 5-(цитозинил-1)-1,3-оксатиолан подвергают воздействию функционального производного карбоновой кислоты формулы ROH, в которой R - пиридилкарбонил, 1,4-дигидропиридилкарбонил, хинолинилкарбонил или 1,4-дигидрохинолинкарбонил, возможно замещенный алкильным радикалом, имеющим 1 - 10 атомов углерода или трифторметилфениламинорадикалом.

14. Фармацевтическая композиция противовирусного действия, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного начала по крайней мере одно соединение общей формулы I

или одну из солей присоединения кислоты в рацемической или оптически активной форме в смеси или ассоциации с инертным нетоксичным фармацевтически приемлемым экципиентом.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2