Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью, и препарат на его основе

 

Описывается новый пептид общей формулы I, где R=H, низший алкил или низший ацил, X - гетероароматическая аминокислота, n=1,2, причем, если остаток RNCH(COOH)(CH₂)_nCO- - остаток глютаминовой кислоты (n=2), то X имеет стереоконфигурацию, отличную от стереоконфигурации α-углеродного атома глютаминовой кислоты, обладающей иммуномодулирующей активностью. Описывается также препарат, обладающий иммуномодулирующей активностью, содержащий пептид и служебные добавки, причем в качестве пептида используется соединение общей формулы I, где значения R и X указаны выше, при следующем соотношении ингредиентов, мас. %: пептид 0,001 - 0,01, служебные добавки - остальное. 2 с.п. ф-лы, 11 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к новым пептидным структурам, обладающим иммуномодулирующими свойствами, и препаратам на их основе.

Известно применение в медицине большого количества иммуностимуляторов, таких как препараты жень-шеня и лимонника, производные никотиновой кислоты, тималин и т.д. /Машковский М.Д. Лекарственные средства, т. 11, М.: Медицина, 1988 г., стр. 169/. Недостатки большинства природных препаратов - невысокая активность в связи с низким содержанием активного начала, наличие побочных эффектов.

Известно значительное количество иммуностимуляторов пептидной природы, например, тактивин /пат. Франции N 2570278, кл. A 61 K 39/41, тимозин /Goldstein A.L. et.al., Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1972, v. 69, p. 1856-1863/, полученных из природного сырья. Эти препараты представляют собой набор полипептидов различной длины, воздействующих на различные звенья иммунного ответа, а также на ряд других физиологических функций организма, что ведет к появлению нежелательных побочных эффектов. Кроме того, практическое использование таких препаратов затруднено в связи со сложностью способов их извлечения из природного сырья, малым выходом, значительной вариабельностью их физико-химических свойств.

Поиск синтетических пептидов с селективной активностью на счет изменений структуры представляется более целесообразным. Синтетическими пептидными иммуностимуляторами являются пептид Glu-Asp-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asp-OH /пат. США N 4478828, кл. A 61 K 37/00, C 07 C 103/52, 1984 г./, аналоги тимопентина /Евр. пат. N 1450798, кл. C 07 K 7/64, 1985 г., пат. США N 5013723, кл. A 61 K 37/02, 1991 г./ и т.п.

Еще больший интерес представляет создание пептидных иммуностимуляторов на основе коротких, селективно действующих высокоактивных пептидов, синтез которых является экономически выгодным.

Прототипом заявляемого изобретения являлся препарат тимоген на основе пептида структуры H-α-L-Glu-L-Trp-OH, недостатком которого является менее высокая иммуномодулирующая активность.

Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящей группы изобретений, являлась разработка более эффективного и безопасного иммуномодулирующего препарата на основе коротких пептидов. Настоящее изобретение является продолжением и дальнейшим развитием работ, связанных с препаратами группы "Бестим" и описанных в заявках о выдаче патента N 95119704 от 29.11.95 и N 95120266 от 06.12.95. При этом, в частности, был получен препарат-иммуномодулятор на основе пептида, имеющего химическую структуру H-γ-L-Glu-L-Trp-OH, более перспективный, чем тимоген.

Было найдено, что поставленная выше задача решается путем использования хотя бы одного из пептидов общей формулы: где n = 1, 2, R: H, низший ацил или низший алкил, X: ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное, например, эфир, амид, гидразид и т.д.

Пептиды получают стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе /J.M. Steward and J.D.Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969/ или путем синтеза в растворе /E.Schroder and K.Lubke, "The Peptides", Vol.I, Academic Press (New York), 1965/ с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта.

В качестве промежуточной защиты α-аминогруппы аминокислот при твердофазном методе синтеза используют трет-бутилоксикарбонильную группу. Для защиты боковых радикалов аминокислот используют следующие группы: для гистидина бензилоксиметильную; для тирозина - 2,6-дихлор-бензильную; для триптофана - формильную и т. д. Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид или те же конденсирующие агенты с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Деблокирование ведут 50%-ным раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, а нейтрализацию 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в хлористом метилене.

Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью безводного фтористого водорода, а очистку гель- и обращенно-фазовой хроматографией.

На базе пептидов был получен препарат, обладающий иммуномодулирующей активностью следующего состава, мас.%: пептид - 0,001-0,01; служебные добавки - 99,99-99,999. В качестве служебных добавок в зависимости от формы введения препарата могут быть использованы растворы, содержащие 0.9% NaCl, 0.5% новокаин для внутривенного и внутримышечного введений, или крахмал, глюкоза, глицин и их смеси для перорального применения.

Получение лекарственного препарата осуществляют по стандартным технологиям получения лекарственных форм фармацевтических препаратов, а именно путем добавок к действующему началу фармацевтически подходящих неорганических и органических кислот, например, хлористоводородной, серной, фосфорной, уксусной, гликолевой, молочной, лимонной и т.д., их солей, неорганических и органических оснований и соответствующего растворителя, не вызывающего нежелательных побочных эффектов, таких, например, как желудочно-кишечные дискомфорты, лихорадки и т.п.

Действие новых препаратов оказалось наиболее эффективным для лечения вторичных иммунодефицитов, развивающихся, например, у больных с хирургической инфекцией и онкологических больных. Под влиянием препарата наблюдается значительное усиление экспрессии Θ-антигена и продукции интерлейкина-2- лимфоцитами, а также увеличение процентного и абсолютного содержания CD3 и CD4 лимфоцитов.

Препараты нетоксичны, так как при 1000-кратном превышении терапевтической дозы (1 мг/кг) летальный исход не был обнаружен ни у одного животного.

Практическая применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез γ-D-глютамил-L-триптофана (I).

0.74 г (0.002 моль) α-бензилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-глютаминовой кислоты растворяют в 12.0 см³ сухого тетрагидрофурана, прибавляют 0.22 мл (0.002 моль) N-метилморфолина и охлаждают до -15^oC. После добавления 0.28 мл (0.002 моль) изобутилхлорформиата реакционную смесь перемешивают в течение 3 мин при -10^oC и добавляют охлажденный раствор 0.93 г (0.002 моль) пара-толуолсульфоната бензилового эфира L-триптофана и 0.22 мл (0.002 моль) N-метилморфолина в 15 мл тетрагидрофурана. Полученный раствор перемешивают в течение 12 ч при 4^oC, фильтруют, промывают 20 мл тетрагидрофурана и упаривают. Остаток растворяют в 50 мл этилацетата, промывают равными объемами воды, 2N серной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия и вновь водой. Раствор высушивают над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляют в вакууме до объема 10 мл. Дибензиловый эфир N-бензилоксикарбонил γ-D-глютамил-L-триптофана выпадает при добавлении 50 мл гексана.

Выход: 820 мг (62%). Rf(A, хлороформ : метанол : уксусная кислота = 90: 8:2): 0.75.

Раствор 0.6 г (0.0009 моль) дибензилового эфира N- бензилоксикарбонил γ-D-глютамил-L-триптофана в 30 мл метанола гидрируют водородом над палладиевым катализатором (10%, 200 мг) в течение 5 ч. Катализатор удаляют фильтрованием и фильтрат упаривают досуха. Полученное масло растворяют в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте и очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте 10-30%-ного ацетонитрила в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте и лиофилизируют. Содержание основного вещества в целевом продукте по данным оптической плотности не менее 97%.

Выход: 190 мг. Rf (B, 2-пропанол : 25% NH₄OH : вода = 50:5:15): 0,5; Rf (C, бутанол : уксусная кислота : вода = 3:1:1): 0.45.

Структура подтверждается данными аминокислотного анализа гидролизата пептида и данными ЯМР. Анализ гидролизата пептида, полученного в результате гидролиза в 3N пара-толуолсульфокислоте, выявил следующее соотношение аминокислотных остатков: Glu - 1.0 (1); Trp - 0.9(1). В протонном и углеродном спектрах ЯМР (Brucker СРХ-300) обнаружены следующие сигналы (см. табл. 1, 2).

Пример 2. Синтез-γ-L-глютамил-D-триптофана (II).

0.99 г (0.0026 моль) α-бензилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-глютаминовой кислоты растворяют в 96.0 см³ диметилфорамида, прибавляют 0.3 г (0.0026 моль) N-оксисукцинимида, охлаждают до минус 5^oC и при сильном перемешивании приливают к реакционной смеси раствор 0.56 г (0.0027 моль) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 3.0 см³ диметилформамида. Смесь перемешивают при 0^oC 1 ч и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, прибавляют к фильтрату 0.64 г (0.0031 моль) D-триптофана и 0.46 см³ (0.0033 моль) триэтиламина и перемешивают реакционную смесь 16 ч при комнатной температуре. Раствор фильтруют, разбавляют 50.0 см³ воды и экстрагируют три раза 20 см³ этилацетата. Объединенные органические экстракты промывают последовательно 20.0 см³ воды, два раза по 20.0 см³ 2N серной кислоты, два раза по 20.0 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и сушат безводным сернокислым натрием. Растворитель удаляют в вакууме до объема 10 мл. Бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил γ-L-глютамил-D-триптофана выпадает при добавлении 50 мл гексана.

Выход: 1,2 г (81%). Rf(A): 0.7.

Раствор 0.6 г (0,0009 моль) бензилового эфира N-бензилоксикарбонил γ-L-глютамил-D-триптофана в 30 мл метанола гидрируют водородом над палладиевым катализатором (10%, 200 мг) в течение 5 ч. Катализатор удаляют фильтрованием и фильтрат упаривают досуха. Полученное масло растворяют в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте и очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте 10-30%-ного ацетонитрила в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте и лиофилизируют. Содержание основного вещества в целевом продукте по данным оптической плотности не менее 97%.

Выход: 180 мг. Rf(B): 0,5; Rfc: 0.45.

Пример 3. Синтез β-D-aспартил-L-триптофана (III).

Для синтеза пептида β-D-аспартил-L-триптофана (загружают в реакционный сосуд 0.1 г трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофил-полимера. Содержание триптофана 0.70 ммоль/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (см. табл. 3).

Если нингидриновый тест положителен, повторяют конденсацию, начиная с п. 5.

Для синтеза пептида в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α-бензиловый эфир N- третбутилоксикарбонил-D-аспарагиновой кислоты.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы, 0.1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 0.1 мл тиоанизола и 0.1 мл метакрезола, охлаждают до температуры -78^oC и в течение 10 мин перегоняют 5 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0^oC и перемешивают в течение 60 мин, затем отгоняют фтористый водород. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизируют.

После обработки 0.2N гидроокисью натрия пептид обессоливают на колонке с Sephadex G-10 и очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте 10-30% ацетонитрила в 0.1%-ной трифтоpуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 96%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 4. Синтез β-L-аспартил-L-триптофана (IV).

Синтез пептида (IV) осуществляется теми же способами, что и пептида (III) из примера 3, за исключением того, что на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α- бенэиловый эфир N-третбутилоксикарбонил-L- аспарагиновой кислоты. Строение вещества доказывается условиями синтеза и аминокислотным составом. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 5. Синтез N-метил-γ-D-глютамил-L-триптофана (V).

Синтез пептида (V) осуществляется теми же способами, что и пептида (III) из примера 3, за исключением того, что на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α- бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил-N-метил-D-глютаминовой кислоты.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. 0.1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 6.5 мл диметилсульфида, 0.8 мл метакрезола и 0.4 мл этандитиола, охлаждают до температуры -78^oC и в течение 10 мин перегоняют 2.5 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0^oC и перемешивают в течение 120 мин, затем отгоняют фтористый водород и диметилсульфид. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизируют.

После обработки 0.2N гидроокисью натрия пептид обессоливают на колонке с Sephadex G-10 и очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте 10-30%-ного ацетонитрила в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 97%. Строение вещества доказывается условиями синтеза и аминокислотным составом. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 6. Синтез N-ацетил-γ-D-глютамил-L-триптофана (VI).

Синтез пептида (VI) осуществляется теми же способами, что и пептида (III) из примера 3, за исключением того, что на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α- бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил D- глютаминовой кислоты. Дипептидил-полимер обрабатывают 50%-ной трифторуксусной кислотой в хлористом метилене (2 раза, 2 и 30 мин), промывают хлористым метиленом (4 раза, по 2 мин) и инкубируют в смеси, содержащей 0.11 мл триэтиламина, 0.28 мл уксусного ангидрида и 5 мл хлористого метилена. По завершении реакции пептидил-полимер промывают хлористым метиленом (6 раз по 2 мин), высушивают в вакууме, деблокируют и очищают, как указано в примере 4 (пептид IV). Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 96%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 7. Синтез γ-D-глютамил-L-триптофил-амида (VII).

Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида осуществляются теми же способами, что и пептида (III) примера 3, за исключением того, что в реакционный сосуд загружают 0.15 г третбутилоксикарбонил-N_in-формил-триптофилметилбензгидриламинополимера, на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α-бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил-D-глютаминовой кислоты и выдерживают реакционную смесь при деблокировании в среде безводного фтористого водорода в течение 2 ч. Содержание формил-триптофана - 0.5 ммоль/г полимера.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 97%. Строение вещества доказывалось условиями синтеза и аминокислотным составом. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Иммуномодулирующая активность заявляемых пептидов оценивалась по их способности влиять на уровень экспрессии маркера дифференцировки T-лимфоцитов Θ-антигена и пролиферацию тимоцитов, по их влиянию на индукцию синтеза главного ростового фактора T-лимфоцитов-интерлейкина-2 и способности активировать функциональный ответ лейкоцитов.

Пример 8. Влияние пептидов на дифференцировку предшественников T-лимфоцитов костного мозга, мышей (in vitro).

Взвесь клеток костного мозга мышей, умерщвленных дислокацией шейных позвонков, получают путем промывания бедренных костей физиологическим раствором. Пептиды в различных концентрациях добавляют к полученным клеткам в среде Игла и инкубируют в течение 1 ч при 37^oC. Уровень экспрессии маркера дифференцировки T-лимфоцитов Θ-антигена определяют методом комплемент зависимого цитолиза с помощью антител к Θ-антигену /Terasabi - P.I. et al. In Manual of Tissue Typing Techniques, National Institute of Health, Bethesda, 1972, p. 50-55/. Данные приведены в табл. 4.

Пример 9. Влияние пептидов на продукцию ингерлейкина-2 мышиными спленоцитами.

Данные по влиянию пептидов на индукцию синтеза главного ростового фактора T-лимфоцитов-интерлейкина-2 /Gillis S.et al., J.Immunol., 1978, v.120, p. 2027-2032/ приведены в табл.5.

Пример 10. Влияние пептидов на фагоцитоз лейкоцитов человека.

Нейтрофилы, выделенные из крови донора центрифугированием в градиенте плотности, переносили в пробирки, обработанные силиконом и содержащие среду Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Конечная концентрация клеток составила 2·10⁶ в мл. После добавления опсонизированных человеческой сывороткой дрожжевых клеток (из расчета 10 клеток на 1 нейтрофил) клеточная суспензия помещалась в CO₂ инкубатор на 40 мин. Клетки отмывали центрифугированием, наносили на стекло и окрашивали по методу Гимза. Количество фагоцитировавших клеток оценивалось визуально под микроскопом. Результаты представлены в табл. 6.

Пример 11. Влияние пептидов на хемотаксис лейкоцитов человека.

Влияние пептидов на хемотаксис лейкоцитов было оценено в тесте миграции под агарозой по Nelson et al. (1972). Агарозу растворяли в среде 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, до концентрации 1% и переносили в чашки для тканевых культур. После образования геля прорезались лунки диаметром 2 мм на расстоянии 3 мм друг от друга. В центральные лунки вносили по 10 мкл среды, содержащей 2.5·10⁴ нейтрофилов. Для оценки спонтанной миграции лунки, оставшиеся с одной стороны, заполняли средой, не содержащей пептидов. Для оценки стимулированной миграции лунки с противоположной стороны заполняли средой, содержащей FMLP в концентрации 10^-7 М. Чашки помещались в CO₂ инкубатор на 120 мин. Исследуемые пептиды добавляли в центральные лунки вместе с лейкоцитами. Клеточная миграция оценивалась под микроскопом и выражалась в виде хемотактического индекса (стимулированная миграция/спонтанная миграция, см. табл. 7).

Пример 12. Влияние пептидов на пролиферацию тимоцитов крыс.

Тимоциты, полученные из тимусов белых беспородных крыс, культивировали в присутствии различных концентраций тестируемых пептидов в течение 72 ч в CO₂ инкубаторе в 96-луночных плоскодонных культуральных микропланшетах (Флоу) в среде Игла с добавлением 1% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 80 мкг/мл гентамицина и 5 мкг/мл полимиксина В. В качестве индуктора пролиферации использовали конканавалин А в концентрации 0,5 мкг/мл. На последние 16 ч культивирования в среду вносили ³H-тимидин. После окончания культивирования клетки переносили на стекловолоконные фильтры с помощью автоматического харвестера. Количество включенного ³H-тимидина оценивали в сцинтилляционном В-счетчике и выражали в импульсах в 1 мин. Результаты представлены в табл. 8.

Пример 13. Получение препарата на основе пептидов.

Препарат получали по стандартным методикам получения лекарственных препаратов ("Технология лекарственных форм", под ред. Л.А.Ивановой.- М.: Медицина, 1991). Инъекционная форма содержит 0,1 мг пептида, растворенные в 1 мл стерильного физиологического раствора. Таблетки, применяемые перорально, имеют следующий состав: 0,1 мг пептида, 98,9 мг глицина, 1 мг стеарата магния.

Пример 14. Влияние препарата γ-D-глютамил-L-триптофана на продукцию интерлейкииа-2 (in vivo).

По методике примера 13 препарат был приготовлен в виде инъекционной формы с содержанием пептида в дозах от 10,0 до 0,00001 мкг/мл. Полученные растворы вводили мышам перорально. Группа из 5 животных была использована для каждой исследованной дозы. Через 24 ч животные были умерщвлены, селезенки удалены и спленоциты инкубировались дополнительные 24 ч в присутствии конканавалина А (5 мкг/мл). Уровень интерлейкина-2 в культуральной жидкости оценивался в по степени влияния на пролиферацию интерлейкин-2-зависимой клеточной линии CTLL-2. Результаты эксперимента представлены в табл. 9.

Пример 15. Использование препарата γ-D-глютамил-L- триптофана для коррекции иммунодефицита у онкологических больных.

А. Больной Е-в, 56 лет, находился в ГКБ N 26 г. Санкт-Петербурга с диагнозом "Рак толстой кишки". У больного отмечено иммунодефицитное состояние, развившееся на фоне основного заболевания. Препарат применен в виде курсовой терапии (пять ежедневных приемов таблеток, содержащих 0.1 мг натриевой соли пептида) через 1 месяц после радикального хирургического вмешательства. Результаты лечения приведены в табл. 10.

Б. Больной А-н, 67 лет, находился в ГКБ N 26 г. Санкт-Петербурга с диагнозом "Рак толстой кишки". У больного отмечено иммунодефицитное состояние, развившееся на фоне основного заболевания. Препарат применен в виде курсовой терапии (пять ежедневных приемов таблеток, содержащих 0.1 мг натриевой соли пептида) через 1 месяц после радикального хирургического вмешательства. Результаты лечения приведены в табл. 11.

Формула изобретения

1. Пептид общей формулы n = 1, 2; R - водород, низший ацил или низший алкил; X - гетероароматическая аминокислота, причем, если остаток

- остаток глютаминовой кислоты (n = 2), то X - имеет стереоконфигурацию, отличную от стереоконфигурации α- углеродного атома глютаминовой кислоты, обладающей иммуномодулирующей активностью.

2. Препарат, обладающий иммуномодулирующей активностью, содержащий пептид и служебные добавки, отличающийся тем, что в качестве пептида содержит вещество общей формулы

n = 1, 2;
R - водород, низший ацил или низший алкил;
X - гетероароматическая аминокислота, причем, если остаток

- остаток глютаминовой кислоты (n = 2), то X - имеет стереоконфигурацию, отличную от стереоконфигурации α- углеродного атома глютаминовой кислоты, при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
Пептид - 0,001 - 0,01
Служебные добавки - Остальное

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма Верта" (RU), Общество с ограниченной ответственностью "Цитокин" (RU)

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Федеральное государственное унитарное предприятие научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (RU)

Договор № 20983 зарегистрирован 25.03.2005

Извещение опубликовано: 27.05.2005        БИ: 15/2005

* ИЛ - исключительная лицензия        НИЛ - неисключительная лицензия