Способы использования фибринового герметика, способ получения состава, составы, наборы

 

Изобретение относится к медицине, в частности к получению и использованию фибриновых герметиков. Применяют фибриновый герметик, а именно состав, свободный от фермента в виде тромбина, который содержит мономер фибрина или состав, содержащий не образующий поперечные связи фибрин. При использовании осуществляют контактирование нужного участка с составом, свободным от фермента в виде тромбина, при этом осуществляют превращение этого мономера в полимер фибрина, образуя тем самым фибриновый герметик. Водный состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий не образующий поперечные связи мономер фибрина, используют в концентрации от 10 до 200 мг/мл. Данный фибриновый герметик обеспечивает использование его без риска вирусного заражения пациента или других вредных воздействий. 10 с. и 60 з.п.ф-лы, 2 табл., 1 ил.

Изобретение относится к фибриновым герметикам, более определенно, к использованию фибринового герметика, отличающегося тем, что состав, включающий фибриновый мономер или состав, включающий не образующий поперечных связей фибрин, используется в качестве компонента фибринового герметика.

Одним из механизмов гемостаза у млекопитающего, т.е. предупреждения потери крови, является образование кровяного сгустка. Образование сгустка у человека, т. е. свертывание крови, достигается целым комплексом реакций, в результате которых осуществляется превращение фибриногена - мономера - посредством тромбина, ионов кальция и активированного фактора XIII с целью образования крайне полифункционального полимера фибрина II, являющегося фибриновым сгустков.

Образование полимера фибрина II, образующего поперечные связи, осуществляется с помощью фибриногена, превращенного тромбином в мономер фибрина I, фибриноген самопроизвольно полимеризуется для образования полимера фибрина I, иногда выступающего в роли растворимого фибрина I, т.к. путем обработки соответствующими химическими средствами полимер фибрина I может быть вновь превращен в мономер фибрина I.

Полимер фибрина I затем превращается тромбином в полимер фибрина II, который иногда принимается за растворимый фибрин II, т.к. путем обработки соответствующими химическими средствами полимер фибрина II может быть превращен в мономер фибрина II. Под влиянием фактора XIIIa, известного как активированный фактор XIII, полимер фибрина II затем связывается поперечными связями с целью образования поперечно связанного фибрина II, представляющего фибриновый сгусток.

Фактор XIII активируется тромбином в присутствии ионов кальция. Связанный поперечными связями фибрин II иногда представлен как нерастворимый фибрин II, т.к. он не может быть превращен в мономер фибрина II.

Следует отметить, что тромбин образуется из протромбина. Протромбин превращается в тромбин с помощью фактора Xa в присутствии кальция и других вспомогательных веществ.

Фибриноген представляет около 2-4 г/л протеина плазмы крови. Фибриноген является мономером, состоящим из трех пар полипептидных цепей связанного дисульфида, обозначенных (Aa)₂, (B_β)₂, γ₂. "A" и "B" представляют два небольших пептида с конечным амином, известных как фибринопептид A и фибринопептид B, соответственно.

Отделение фибринопептидов A от фибриногена в процессе превращения фибриногена с помощью тромбина имеет место в смеси фибрина I, и последующее отделение фибринопептидов B имеет место в смеси фибрина II. Такое отделение фибринопептидов A и B уменьшает молекулярный вес фибриногена на очень малое количество, около 6,000 из 340,000 дальтонов, но зато открывает участки полимеризации.

Для обзора механизмов свертывания крови и структуры фибриногена см. C.M. Jackson, Ann. Rev. Biochem., 49:765-811 (1980) и B. Furie и B.C. Furie, Cell, 53: 505-518 (1988).

Фибриновый герметик представляет собой биологический адгезив, чье действие имитирует конечные стадии свертывания, в результате чего образуется фибриновый сгусток. Традиционные фибриновые герметики состоят из концентрированного человеческого фибриногена, бычьего апротинина и фактора XIII в качестве первого компонента и бычьего тромбина и хлорида кальция в качестве второго компонента.

Применение обычно осуществляется двухсекционным шприцем, который позволяет применять одновременно оба компонента на участке, где желательно образование фибринового сгустка. Апротинин является фибринолитическим ингибитором, добавляемым для обеспечения стабильности фибриновых герметиков.

Фибриногенный компонент фибринового герметика приготавливается из консервированной человеческой плазмы. Фибриноген может быть законсервирован из человеческой плазмы путем осаждения в условиях низких температур и осаждения с применением различных реагентов, например полиэтиленгликоля, эфира, этанола, сульфата аммония или глицина.

Для полного обзора фибриновых герметиков см. M.Brennan, Blood Reviews, 5: 240-244. (1991); J.W.Gibble и P.M.Ness, Transfusion, 30: 741-747 (1990); H. Matras, J.Oral Maxillofac Surg., 43:605-611 (1985) и R.Lerner и N.Binur, J. of Surg. Research, 48:165-181 (1990).

В настоящее время наблюдается интерес к приготовлению фибриновых герметиков, которые используют собственный фибрин. Собственный фибриновый герметик - это фибриновый герметик, отличающийся тем, что фибриногенный компонент фибринового герметика извлекается из собственной крови пациента.

Желательно использовать собственный фибриновый герметик, т.к. он устраняет риск заражения инфекциями, передаваемыми через кровь, например гепатит B, гепатит ни A, ни B и синдром приобретенного иммунодифицита (СПИД), которые могут иначе присутствовать в фибриногенном компоненте, полученном из консервированной человеческой плазмы.

См. : L.E.Silberstein и др., Transfusion, 28:319-321 (1988); K.Laitakari и J.Luotonen, Laryngoscope, 99:974-976 (1989) и A.Dresdale и др., The Annals of Thoracic Surgery, 40:385-387 (1985).

Инфекция может быть передана фибриновым герметиком не только с помощью фибриногена, но также посредством бычьего апротинина и компонентом бычьего тромбина. Известно, что бычий тромбин является носителем инфекционного фактора бычьего губчатого энцефалита (B E) и других вирусов, присущих млекопитающим. Более того, бычий тромбин является сильно действующим антигеном, который может вызвать реакции иммунного характера у человека.

Следовательно, применение бычьего тромбина может оказать вредное действие на получателя. См.: D.M.Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (Supplement A): 141-146 (1991), S.B.Prusiner и др., Cornell Vet, 81 N 2:85-96 (1991) и D.Matthews, J. Roy, Soc. Health, 3-5 (February 1991).

Исходя из этого, возникает необходимость в фибриновом герметике, который может быть использован без риска вирусного заражения пациента или других вредных воздействий.

Предмет изобретения относится к способу применения фибринового герметика, который включает: (а) контактирование нужного участка составом, включающим фибриновый мономер; и (б) превращение указанного фибринового мономера в фибриновый полимер одновременно с этапом контактирования, тем самым образуя фибриновый сгусток.

Предмет изобретения относится также к способам приготовления такого состава и составов и наборов, включающих такой мономер фибрина.

Другим аспектом предмета изобретения является способ применения фибринового герметика, который включает: (а) контактирование нужного участка составом, включающим фибрин, не образующий поперечных связей; и (б) превращение этого не образующего поперечных связей фибрина в фибрин, образующий поперечные связи одновременно, с этапом контактирования, в результате чего образуется фибриновый сгусток.

Предмет изобретения также предлагает способы приготовления такого состава и составов и наборов, включающих не образующий поперечных связей в фибрин.

Согласно предмету изобретения используются следующие определения: Фибрин. Фибрин обозначает любую форму фибрина. Неограниченные примеры фибрина включают фибрин I, фибрин II и ВВ фибрин.

Фибрин может быть в мономерной или полимерной форме, где полимерная форма или образует поперечные связи или нет.

Мономер фибрина. Мономер фибрина включает любую форму фибрина, например фибрин I, фибрин II или ВВ фибрин, где фибрин находится в мономерной форме или олигомерной форме, которая может быть растворена в составе, включающем мономер фибрина, и где мономер фибрина может быть превращен в полимер фибрина.

Полимер фибрина. Полимер фибрина включает любую форму фибрина, например фибрин I, фибрин II или ВВ фибрин, где фибрин находится в полимерной форме, образующей поперечные связи или нет.

Фибрин, не образующий поперечный связей. Фибрин, необразующий поперечных связей, включает любую форму фибрина, например фибрин I, фибрин II или ВВ фибрин, где фибрин не образует поперечных связей, но может быть превращен в фибрин, образующий поперечные связи.

Не образующий поперечных связей фибрин может быть мономером фибрина или же не образующим поперечные связи полимером фибрина.

Фибрин, образующий поперечные связи. Фибрин, образующий поперечные связи, включает любую форму фибрина, например фибрин I, фибрин II или ВВ фибрин, где фибрин является полимером фибрина, образующего поперечные связи.

Состав, включающий мономер фибрина Согласно предмету изобретения, фибриновый состав, включающий мономер фибрина, это состав, который содержит любую форму мономера фибрина, который может быть превращен в полимер фибрина.

Неограниченные примеры мономера фибрина включают мономер фибрина I, мономер фибрина II или мономер ВВ фибрина, при этом предпочтение отдается мономеру фибрина I. Конечно, могут присутствовать смеси мономера фибрина.

Целью настоящего изобретения является полимер фибрина, который включает любой полимер, полученный в результате полимеризации мономера фибрина. Так, например, превращение мономера фибрина I в полимер фибрина может получиться в полимере фибрина I, образующего поперечные связи или не образующего, и/или в полимере фибрина II, образующего поперечные связи или не образующего, и/или в полимере фибрина II, образующего поперечные связи или не образующего, в зависимости от того, как проходит этап превращения.

Предпочтение отдается мономеру фибрина I, так как, в противоположность фибриногену, он может быть легко превращен в полимер фибрина без применения тромбина или фактора XIII. Действительно, мономер фибрина I может самопроизвольно образовать полимер фибрина I, который может действовать как фибриновый сгусток, несмотря на то, образует ли полимер фибрина I поперечные связи или нет, или же будет ли он превращен в полимер фибрина II.

Следовательно, так как образование полимера фибрина I из мономера фибрина I происходит самопроизвольно, полимер фибрина I может быть образован без тромбина и фактора XIII, тем самым избегая проблем, связанных с тромбином крупного рогатого скота. (Следует отметить, что если мономер фибрина I используется таким образом, что и мономер фибрина I контактирует с кровью пациента, например, в ране, тромбин пациента и фактор XIII могут превратить полимер фибрина I в полимер фибрина II, образующий поперечные связи).

Состав, включающий не образующий поперечных связей фибрин, это состав, который содержит любую форму фибрина, не образующего поперечных связей. Неограниченными примерами не образующего поперечных связей фибрина являются не образующий поперечных связей фибрин I, не образующий поперечных связей фибрин II и ВВ фибрин, причем предпочтение отдается не образующему поперечных связей фибрину I.

Конечно, могут присутствовать смеси не образующего поперечных связей фибрина. К тому же, в целях настоящего изобретения, "образующий поперечные связи" фибрин включает любую форму фибрина, полученную в результате превращения не образующего поперечных связей фибрина I в фибрин, образующий поперечные связи.

Следовательно, образующий поперечные связи фибрин, например, полученный в результате превращения не образующего поперечных связей фибрина I в фибрин, образующий поперечные связи, может быть образующим поперечные связи фибрином I и/или образующим поперечные связи фибрином II, в зависимости от того, как проходит этап превращения.

Предпочтение отдается не образующему поперечных связей фибрину I, так как он может легко превращен в образующий поперечные связи фибрин по сравнению с фибриногеном. В действительности, считается, что фибрин I может образовать образующий поперечные связи фибрин I, который может действовать как фибриновый герметик.

Следовательно, образование образующего поперечные связи фибрина I из не образующего поперечных связей фибрина I может проходить без тромбина, чем устраняются проблемы, связанные с бычьим тромбином, хотя активированный фактор XIII может быть необходимым. (Следует отметить, что если не образующий поперечных связей фибрин I применяется таким образом, что не образующий поперечных связей фибрин I контактирует с кровью пациента, например, в ране, тромбин человека и фактор XIII могут превратить фибрин I в образующий поперечные связи фибрин II).

Также не образующих поперечных связей фибрин может быть полимером, олигомером или мономером, хотя предпочтение отдается олигомеру или мономеру, т. е. мономеру фибрина. Это связано с тем, что не образующий поперечных связей фибрин в полимерной форме является обычно гелем, и, следовательно, очень трудно привести его в контакт с нужным местом и обеспечить тесный контакт с клетками нужного участка.

Напротив, полученный не образующий поперечных связей фибрин в олигомерной или мономерной форме является растворимым и, следовательно, может быть легко доставлен к нужному участку и иметь тесный контакт с клетками. Разумеется, состав может содержать смесь таких форм не образующего поперечных связей фибрина.

Источником состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, может быть любой известный источник или тот, который может быть получен, пока мономер фибрина может превращаться в полимер фибрина или же не образующий поперечных связей фибрин может превращаться в фибрин, образующий поперечные связи.

Неограниченными источниками составов, включающих мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, являются: кровь, желательно кровь млекопитающего, еще лучше кровь человека, клеточные структуры, выделяющие фибриноген и рекомбинирующий фибриноген, при этом предпочтение отдается крови. Кровь может быть представлена любой формой, включая всю кровь или приготовленные фибриногенные композиции. Кровь может быть использована для приготовления собственного фибринового герметика.

Замечено, что состав, включающий не образующий поперечных связей фибрин I, или мономер фибрина I, или полимер фибрина I, приготовленные из всей крови, как описано ниже, может быть превращен в образующий поперечные связи фибрин II без добавления тромбина, фактора XIII и других необходимых компонентов для свертывания крови.

Считается, что это факт связан с тем, что состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин I, полученный из всей крови, сохраняет достаточные количества протромбина, фактора XIII и такие другие необходимые вещества из плазмы, что не образующий поперечных связей фибрин I может быть превращен в образующий поперечные связи фибрин II без добавления экзогенного тромбина и фактора XIII.

Эндогенный протромбин и фактор XIII могут быть использованы в фибриновом герметике, согласно предмету изобретения, как компоненты состава, включающего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин.

Однако следует отметить, что не сохраняются достаточные количества этого эндогенного тромбина и фактора XIII, необходимые для превращения фибриногена в образующий поперечные связи фибрин II, при скорости реакции, пригодной для фибринового герметика. Считается, что для превращения фибриногена в образующий поперечные связи фибрин II необходимо больше тромбина, чем для превращения не образующего поперечных связей фибрина I в образующий поперечные связи фибрин II при эквивалентной скорости реакции.

Каждый из этих трех источников содержит фибриноген, который может быть превращен в мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин.

Кроме этого этапа превращения, полученный состав, который содержит мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, должен быть в концентрированной форме. Желательно, чтобы концентрация мономера фибрина была не меньше, чем примерно 10 мг/мл, предпочтительно - от примерно 20 мг/мл до 200 мг/мл, более предпочтительно - от 20 мг/мл до 100 мг/мл и наиболее предпочтительно - от 25 мг/мл до 50 мг/мл.

Кроме того, предпочитается, чтобы мономер фибрина или не образующих поперечных связей фибрин были нединамичными. В настоящем изобретении нединамичный состав, включающий не образующий поперечных связей фибрин, обозначает то, что не образующий поперечных связей фибрин в таком составе не образует поперечных связей в течение по крайней мере 1,5 минут, желательно - в течение примерно 3 минут и более желательно - в течение по крайней мере примерно 30 минут после получения такого состава. Нединамичный состав, содержащий мономер фибрина, обозначает то, что мономер фибрина в таком составе не полимеризуется в течение по крайней мере примерно 1,5 минут, предпочтительно - около 3 минут, более предпочтительно - около 30 минут и наиболее предпочтительно - в течение по крайней мере около 2 часов после получения состава.

Фактически, следует отметить, что состав, содержащий мономер фибрина, может быть нединамичным в течение по крайней мере нескольких дней, т.е. около 72 часов после его приготовления.

Состав, включающий мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, может быть получен из крови. Способ может привести к полимеру фибрина, связанного водородом, который представляет собой форму не образующего поперечных связей фибрина. Затем такой полимер может быть использован в качестве компонента фибринового герметика или же быть превращенным в мономер фибрина посредством способа, называемого повышением растворимости; эти способы будут описаны ниже.

Также желательно, чтобы состав, содержащий мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, приготавливался в стерильных условиях.

Составы, содержащие мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, могут быть получены из всей крови путем взятия ее у донора и желательно в присутствии антикоагулянта. Может быть использован любой антикоагулянт. Неограниченными примерами антикоагулянтов являются гепарин, гирудин, цитрат или любой другой агент, который может прямо или косвенно предотвратить образование тромбина, при этом предпочтение отдается цитрату.

Плазма, содержащая фибриноген, затем отделяется от всей крови. Может быть использована любая технология отделения, например осаждение, центрифугирование или фильтрация. Центрифугирование может осуществляться при скорости 3,000 г в течение 10 минут.

Однако, если нужно получить плазму, богатую пластинами, центрифугирование может проводиться при более низких скоростях, например 500 г в течение примерно 20 минут. Образовавшаяся на поверхности жидкость, содержащая плазму, может быть удалена по стандартной технологии.

Фильтрация может проводиться с помощью пропускания всей крови через подходящий фильтр, который отделяет кровяные клетки от плазмы. Желательно, чтобы фильтр представлял собой микропористую мембрану, обеспечивающую хорошую проницаемость для протеина.

Полученная плазма затем перерабатывается, чтобы преобразовать фибриноген в мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин. Это преобразование может быть проведено по любой из известных технологий или предназначенных для дальнейшего развития.

Предпочитаемым способом производства мономера фибрина является способ с помощью фермента в виде тромбина, включающего тромбин. Фермент в виде тромбина - это любой фермент, который может служить катализатором образования фибрина из фибриногена. Известным источником ферментов в виде тромбина являются змеиные яды. Желательно, чтобы фермент в виде тромбина был очищен от змеиного яда.

В зависимости от выбора фермента в виде тромбина, такой фермент может выделять фибринопептид A, который образует фибрин I, фибринопептид B, который образует ВВ фибрин, или же и фибринопептид A и B, которые образуют фибрин II. Следует отметить, что те ферменты в виде тромбина, которые выделяют фибринопептид A и B, делают это на различных скоростях.

Так, полученный состав может быть, например, смесью фибрина II и фибрина I или смесью фибрина II и ВВ фибрина.

В таблице 1 представлен неограниченный список источников змеиных ядов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, название фермента в виде тромбина и какой(-ие) фибринопептид(ы) выделяется (-ются) при обработке этим ферментом.

Для обзора ферментов в виде тромбина из змеиных ядов см.: H.Piekle и K. Stocker, Thrombosis and Haemostasis, 65(4): 444-450 (1991).

Предпочитаемыми ферментами в виде тромбина являются Батроксобин, особенно из: B. Moojeni, B.Maranhao и B.atrox и Анкрод, особенно из A.rhodostoma.

Мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин могут быть получены контактированием плазмы с ферментом в виде тромбина, позволяя тем самым фибриногену в плазме превращаться в мономер фибрина. Однако полученный мономер фибрина спонтанно полимеризуется для образования связанного водородом полимера в форме геля. Представляющий собой раствор полимер отделяется от остающейся сыворотки. Гель является формой состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Этот гель не образующего поперечных связей фибрина может быть собран, например, с помощью центрифугирования (3,000 г за 10 минут), прямым отделением вручную не образующего поперечных связей фибрина от сыворотки, фильтрацией, прямой или под давлением, после чего удаляется отделенная сыворотка. (Может быть использован фильтр с размерами отверстий от 1 до 100 микрон, например, керамический полипропиленовый микрофильтр с размером отверстий 20 микрон фирмы Porex, Inc., тефлоновый микрофильтр с размером отверстий 20-70 микрон фирмы Fluorotechniques, Inc. или же микрофильтр из нейлона 66 с размером отверстий 22-46 микрон фирмы Costar, Inc.).

Такая процедура отделяет не образующий поперечных связей фибрин, представляющий собой раствор, от сыворотки и тем самым концентрирует гель не образующего поперечных связей фибрина по отношению к плазме.

Следует отметить, что гель не образующего поперечных связей фибрина сохраняет по крайней мере некоторое количество протромбина, фактора XIII и других необходимых веществ из плазмы, так что не образующий поперечных связей фибрин I может быть превращен в образующий поперечные связи фибрин II без добавления экзогенного тромбина или фактора XIII. Этот эндогенный протромбин и фактор XIII могут быть использованы в фибриновом герметике, согласно предмету настоящего изобретения, в качестве компонентов состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин.

Сила центрифугирования и величина давления при фильтрации в ходе отделения будут определять количество сыворотки, удаленной из геля не образующего поперечных связей фибрина, при этом чем больше будут сила и давление, тем выше будет концентрация геля, не образующего поперечных связей фибрина.

Однако желательно, чтобы сила и давление не были слишком высокими для удаления протромбина и фактора XIII из геля, не образующего поперечных связей фибрина.

Теперь гель, не образующий поперечных связей фибрина, готов для применения в качестве компонента фибринового герметика как форма состава, содержащая не образующий поперечных связей фибрин. Замечено, что когда такой состав приготавливается из всей крови, примерно от 60% до 90% первоначального фибриногена присутствует в составе, но, естественно, в форме не образующего поперечных связей фибрина.

Состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин, может быть использован сразу же после того, как он получен. Наиболее желательно использовать такой состав сразу же после его получения, когда состав является собственным. Если состав не используется сразу же после получения, его можно хранить.

Хранение состава требует, например, его замораживания или лиофилизации, или содержания его при температуре 4^oC. Состав в замороженной или лиофильной форме будет стабильным несколько месяцев. Если состав содержит при 4^oC, считается, что состав стабильный по крайней мере в течение нескольких дней.

Если состав заморожен, он должен быть разморожен перед применением. Этот способ, в результате которого происходит образование геля не образующего поперечных связей фибрина, превращает фибриноген в гель не образующего поперечных связей фибрина и концентрирует этот гель обязательно за один этап.

Альтернативно, но менее желательно, можно добиться концентрации фибриногена традиционными способами, например, с помощью криогенного осаждения и осаждения с применением различных реагентов, например, полиэтиленового гликоля, эфира, этанола, сульфата аммония или глицина.

Концентрированный фибриноген затем может быть превращен в гель не образующего поперечных связей фибрина описанными выше способами или, предпочтительно, если фибриноген уже в концентрированной форме, он может быть превращен в состав, содержащий мономер фибрина, без необходимости образовать прежде гель не образующего поперечных связей фибрина. Это может быть выполнено путем контакта концентрированного фибриногена с хаотропным агентом для получения раствора фибриногена.

Хаотропный агент необходим для предупреждения самопроизвольной полимеризации мономера фибрина, образованного от контакта фибриногена с ферментом в виде тромбина. Хаотропный агент смешивается с таким фибриногенным составом и затем взбалтывается в течение около 1-2 минут для образования раствора фибриногена. Фибриноген может затем превратиться в мономер фибрина, например, с помощью фермента в виде тромбина, как описано выше, или же с помощью фермента в виде тромбина, зафиксированного на носителе, как описано ниже.

Пригодные хаотропные агенты включают мочевину, бромид натрия, гидрохлорид гуанидина, KCNS, иодид калия и бромид калия. Предпочитаемая концентрация хаотропного агента составляет примерно от 0,2 до 6,0 моляр, и наиболее предпочитаемая - примерно от 0,3 до 2,0 моляр. Желательно применять как можно малое количество хаотропного агента, способного предотвратить спонтанную полимеризацию мономера фибрина.

Следует отметить, что желательно не добавлять источник ионов кальция к хаотропному агенту, пока нужно преобразовать мономер фибрина в полимер фибрина, как описано ниже. Это гарантирует то, что мономер фибрина не будет образовывать поперечные связи, благодаря активности любых эндогенных факторов, влияющих на свертываемость крови.

В предпочтительном варианте изобретения фирмент в виде тромбина фиксируется и на носителе. Предпочтение отдается такому варианту, потому что можно легко отделить фиксированный фермент от плазмы, тем самым предохраняя состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин, от загрязнения ферментом.

Согласно настоящему изобретению, может быть использован любой носитель, к которому может прикрепляться фермент в виде тромбина. Неограниченными примерами пригодных носителей являются целлюлоза, полидекстраны, агароза, полистиролы, двуокись кремния, полиакриловые кислоты, полиакриламиды, поливиниловые спирты, стеклянные шарики, политетрафторэтилен, поликарбонат, коллаген, производные целлюлозы, тефлон и их композиты, при этом предпочтение отдается двуокиси кремния, полистиролу и агарозе, наибольшее предпочтение отдается агарозе.

В другом предпочтительном варианте фермент в виде тромбина закрепляется к носителю, представленному фильтром, или на одной стороне фильтра и закрепляется к другому носителю, например, шарику. Другими словами, фермент в виде тромбина пройдет через фильтр.

Следовательно, размер отверстий фильтра должен быть таким, чтобы фиксированный фермент в виде тромбина не смог пройти через фильтр, а не образующий поперечных связей фибрин - смог. Не образующий поперечных связей фибрин получается с помощью контактирования плазмы с ферментом в виде тромбина на одной стороне фильтра для образования мономера фибрина, который вместе с оставшейся плазмой проходит через фильтр.

Таким образом, полученный состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин, обязательно отделяется от фермента в виде тромбина. Мономер фибрина, сразу же после прохождения фильтра самопроизвольно полимеризуется для образования не образующего поперечных связей фибрина.

Чтобы зафиксировать фермент в виде тромбина к носителю, последний должен быть активирован. Это может быть выполнено любым подходящим способом. Например, различными активными химическими составами, пригодными для образования производных, являются: группы диазония, группы изоцианата, группы хлорангидрида кислоты, группы ангидрида кислоты, группы сульфонилхлорида, группы динитрофторфенила, группы изотиоцианата, гидроксильные группы, аминогруппы, группы n-гидроксисукцинимида, группы триазина, гидразиногруппы, группы карбодимида, группы силана и бромид циана.

См.: (а) Пентафарм Патент DT 2440 254 Al; (б) P. D. G. Dean, W.S.Johnson и F.A.Middle (Издатели) (1991) IRL Press Oxford - Хроматография сродства - Практический подход- - глава 2 - Способы активации, выдержки из которых приведены здесь в качестве ссылки.

Предпочитаемый способ химической активации осуществляется с помощью группы гидразида. Применение носителя, активированного гидразидом, вытекает из максимальной процентной концентрации (по крайней мере, примерно от 30 до 50%, как измерено в анализе S2238 - См. Axelsson G. и др. Thromb. Haemost., 36: 517 (1976)) фермента в виде тромбина, задерживающего его активность, главным образом, без выщелачивания фермента. К тому же, низкие значения pH, например pH 4-6, могут быть использованы для связывания фермента в целях предупреждения его разрушения.

Обычно активация носителя осуществляется с помощью высокореактивного соединения, затем носитель вступает в реакцию с функциональной группой лиганда, например -OH, -NH₂, -SH, -COOH, -CHO для образования ковалентной связи.

Предпочитаемыми активирующими средствами, используемыми в настоящем изобретении, являются: (а) с помощью группы триазина и предпочтительно групп триазингалогенида; (б) с помощью трезилхлоридной группы;
(в) с помощью карбонилдиимидазольной группы;
(г) с помощью цианобромидной группы; и
(д) с помощью гидразидной или амминной группы.

В пунктах (а)-(г) протеин соединяется посредством реакции с группами -NH₂, -SH или -OH, тогда как в пункте (д) протеин связывается посредством окисленной углеводной части, т.е. -с -CHO.

Применение этих химических соединений обусловлено максимальной процентной концентрацией (по крайней мере, примерно от 30 до 50%, как измерено в анализе 2238) фермента в виде тромбина, сдерживающего его активность, главным образом, без выщелачивания фермента.

Для активации триазином использовали два различных способа. Первый способ заключается в связывании триазинового кольца непосредственно с поверхностными группами OH. Это похоже на применяемый способ активации CNBr, где поверхностные диодовые группы вступали в реакцию с CNBr. При активации триазином группы OH агарозы вступали в реакцию с триазином (цианурхлоридом).

Обычно носитель активируется высоко реактивным соединением, затем он вступает в реакцию с функциональной группой лиганда, т.е. -OH, -NH₂, -SH, -CHO для образования ковалентной связи. Оставшиеся активные группы, не имеющие присоединенного фермента в виде тромбина, могут быть, но не обязательно, блокированы нереактивными соединениями, такими, как этаноламин, уксусный ангидрид или глицин.

Предпочитаемыми способами активации, применяемыми в настоящем изобретении, являются следующие:
(а) активация цианобромидом, за которой следует прямое соединение фермента посредством -NH₂ групп на протеине;
(б) активация носителя монохлортриазином, за которой следует соединение фермента посредством групп -NH₂, -OH или -SH;
(в) активация носителя дихлортриазином, за которой следует соединение фермента посредством групп -NH₂, -OH или -SH;
(г) активация носителя трезилхлоридом, за которой следует соединение фермента посредством групп -NH₂, -OH или -SH;
(д) активация носителя гидразином адиминовой кислоты или гидразином, за которой следует соединение окислительного фермента посредством групп -CHO;
(е) активация носителя аминолигандом, за которой следует соединение окислительного фермента посредством групп -CHO.

Во всех перечисленных выше предпочитаемых способах в качестве носителя используется агароза, однако возможно применять двуокись кремния.

При использовании этого носителя предпочитаемыми способами активации являются следующие:
(а) активация гамма-глицидоксипропилтриметоксисиланом с прямым соединением фермента в виде тромбина посредством групп NH₂ на протеине;
(б) активация цианобромидом, за которой следует прямое соединение фермента посредством групп -NH₂ на протеине;
(в) активация гамма-глицидокситриметоксиланом, за которой следует разрыв эпоксидного кольца для образования диоловой группы, которая затем может быть активирована цианобромидом. Прямое соединение фермента может быть достигнуто посредством групп -NH₂ на протеине;
(г) активация гамма-глицидоксипропилтриметоксисиланом, за которой следует получение аминодвуокиси кремния путем обработки раствором аммиака.

Далее аминодвуокись кремния может быть активирована цианурхлоридом (триазином) и фермент соединен с помощью групп -NH₂, -OH или -SH.

Соединение фермента с активированным носителем может быть амортизировано на некотором значении pH с целью получения оптимального ферментного связующего вещества. Обычно со стандартными способами активации, такими, как гамма - глицидоксипропилтриметоксисилановое соединение фермента с активированным носителем и цианобромидом, соединение любого протеина с активными группами требует буферного действия при значениях pH на 1-2 единицы выше, чем pН (показатель кислотности) первичных и вторичных аминов ферментов.

Однако применение цианурхлорида в качестве активатора дает возможность использовать буферы с намного низким значением pH (оптимальное соединение pH составляет 4-6).

Другой способ соединения гликопротеинов, таких как батроксобин, с инертным носителем осуществляется посредством их углеводных частей. Это влечет за собой прежде всего окисление сахарной группы до групп -CHO, за которым следует прямое соединение при кислотном pH до аминогруппы, такой как гидразид. Можно применять большое количество соединяющих буферов.

Например, см. таблицу 2.

После активации носитель будет иметь больше активных зон, чем требуется для соединения фермента. Эти зоны, если они не дезактивированы, могут ковалентно связывать примеси протеина, которые способны повлиять на биологическую функцию фиксированного фермента.

Лишние группы могут быть дезактивированы ковалентным соединением небольших, неинтерферентных аминов, таких как этаноламин.

Если применяются носители, активированные гидразидом или амином, блокирование остаточных реактивных групп, следующих за соединением фермента, может быть достигнуто с помощью уксусного ангидрида.

В зависимости от способа фиксации и носителя дезактивация фермента осуществляется в течение процесса фиксации. При применении носителя двуокиси кремния с наиболее желательным веществом активации (например, цианобромидом) теряется до 80-90% активности фермента. Однако применение агарозы в качестве носителя при активации цианурхлоридом дает меньшую потерю активности фермента.

Чтобы охарактеризовать эффективность фиксированного фермента на носителе могут быть использованы два способа для определения количества активного фермента, зафиксированного на носителе: анализ на время образования сгустка - Clauss A., Acta Haematol., 17:237 (1957) и анализ S2238 - См. Axelsson G. и др., Thromb. Haemost., 36: 517 (1976).

Для определения выщелачивания фермента с носителя может быть использовано следующее испытание.

Выщелачивание может быть определено с помощью отметки радиоактивным изотопом фермента в виде тромбина, например, батроксобином 1¹²⁵. Однако, прежде чем выполнять испытание на выщелачивание, необходимо удалить любой несвязанный радиоизотоп.

Это может быть достигнуто путем последовательного промывания носителя следующими составами: 50 мл 50 мМ ацетата натрия pH 5,5, 100 мл 50 мМ глицина/1 М хлорида натрия pH 3,0, 100 мл 50 мМ карбоната натрия/1 М хлорида натрия pH 10,0, 100 мл 50 мМ фосфата натрия/1 М хлорида натрия pH 7,0, 100 мл воды и 100 мл 50 мМ фосфата натрия/1 М хлорида натрия pH 7,0.

После такой процедуры промывания в промывной воде нет больше выявляемых изотопов, кроме ≥ 50% начального меченого фермента, связанного с носителем.

(а) Количество требуемого фермента
Количество фермента, необходимого для обработки 30-70 мл плазмы (полученной из 60-150 мл всей крови) составляет 30-200 единиц после примерно 10-15 - минутного смешивания.

Если в качестве матрицы носителя используется агароза, получается 30-200 ед. батроксобина в течение примерно 7-20 минут. При этой системе используется активация гидразидом и 0,25-1,0 г сухой агарозы. В таком случае не требуется блокирования оставшихся активных групп.

(б) Реакция фиксированного фермента с фибриногеном плазмы
Обычно реакция фиксированного фермента с фибриногеном плазмы выполняется следующим образом: примерно 30-70 мл плазмы добавляются к известному количеству высушенного носителя, содержащего фиксированный фермент в виде тромбина. Суспензия медленно смешивается (спиральным миксером или вручную) в течение примерно 7-20 минут.

За это время фибриноген в плазме расщепляется фиксированным ферментом для освобождения фибринопептида A и/или фибринопептида B, в результате чего образуются связанный водородом полимер фибрина I, связанный водородом полимер ВВ фибрина или связанный водородом полимер фибрина II, где каждый полимер связан с фиксированным ферментом.

Как описано выше, связанный водородом полимер фибрина имеет форму геля и может быть собран, например, с помощью центрифугирования (3,000 г за 10 минут) или фильтрацией (через мембранный фильтр с отверстиями 1-50 микрон). При таком способе связанный водородом полимер фибрина отделяется от сыворотки и благодаря этому полимер концентрируется.

Следует отметить, что если фермент в виде тромбина применяется в плазме, полученной при активации фактора XIII, тогда предпочитается, чтобы плазменный состав был изменен в то время, когда применяется фермент в виде тромбина, с тем, чтобы не дать возможности не образующему поперечных связей фибрину, например не образующему поперечных связей фибрину I или II, образовать образующий поперечные связи фибрин, образующий поперечные связи фибрин I или II.

Разумеется, нет необходимости изменять состав плазмы, если он используется как фибриновый герметик сразу же после того, как фибриноген превращается в не образующий поперечных связей фибрин.

Состав плазмы может быть изменен, чтобы предотвратить образование поперечных связей у не образующего их фибрина по известному способу или способу, который должен быть разработан. Это может быть осуществлено блокированием эндогенного тромбина, который может активизировать фактор XIII, например гирудин или ингибиторы тромбина, или блокированием действия активированного фактора XIII, например, посредством тяжелых металлов (Hg), тиомерозала или подавляющих антител.

Образование поперечных связей фибрина I или II требует присутствия ионов кальция. Следовательно, если кальций удаляется из состава плазмы, образование поперечных связей фибрина I или II может быть подавлено.

См. : Garr и др., J. Biochem., 239:513 (1986); Kaminski и др., J. Biol. Chem., 258:10530 (1983) и Kanaide и др. 13:229 (1982).

Хелатные соединения кальция могут быть добавлены в состав для предупреждения образования поперечных связей фибрина I или II. Такие хелатные соединения связываются с кальцием, предупреждая образование поперечных связей. Может быть использован любой хелат кальция.

Неограниченные примеры хелатных соединений кальция включают лимонную кислоту, сахарную кислоту, этилендиаминтетра уксусную кислоту (ЕDTA), нитрилотри уксусную кислоту (NTA), гидроксиэтилендиамин-триуксусную кислоту (HEEDTA), этилендиамин-ди[о-гидроксифенилуксусную кислоту] (EDDHA), этиленгликоль-бис (2-аминоэтилэфир) тетра-уксусную кислоту (ECTA), диэтилентриаминпента уксусную кислоту (DTPA), 1,2-диаминциклогексантетра-уксусную кислоту (DCTA), N, N-бис-гидроксиэтилглицин, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этан-сульфокислоту (HEPES) и N-гидроксиэтилимино-ди-уксусную кислоту (HIMDA) и их соли, при этом предпочтение отдается солям лимонной кислоты.

Любая клеточная культура, которая может выделять фибриноген, может быть использована в предмете изобретения. Фибриноген в клеточной культуре может быть превращен в мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин теми же способами, что описаны выше относительно плазмы.

Однако перед этим превращением желательно удалить клеточные обломки.

Процедура может быть выполнена следующим образом: клетки HEPG2 выращиваются и сохраняются, как описано в стандартных текстах по клеточной культуре млекопитающих. Также см. Liu и др. , Cytotechnology, 5: 129-139 (1991). Клетки высеваются в колбы при соотношении расщепления между 1:4 до 1:8 в Минимально Необходимой Среде, содержащей 10% сыворотки теленка, и добавляется буфер с 5% CO₂.

После роста в течение 24-36 часов при 37^oC среда удаляется и заменяется свободной от сыворотки средой, содержащей подходящий ингибитор протеазы и 2 ед. /мл гепарина. Культура выдерживается еще в течение периодов в 24 часа с тремя последующими заменами свободной от сыворотки среды.

Доведенная до кондиционного состояния среда центрифугируется при 3,000 г за 10 минут для удаления любых клеточных обломков, оставшаяся на поверхности осветленная жидкость, содержащая фибриноген, медленно смешивается с ферментом в виде тромбина в течение 4-5 часов.

Предпочтительно, фермент в виде тромбина фиксируется. Пригодным является соотношение от примерно 1,0 мл до 50 мл осажденного объема фермента в виде тромбина с агарозой на 500 мл среды. Как описано выше, кроме агарозы, могут быть использованы другие носители. Полученный в результате этого мономер фибрина самопроизвольно полимеризуется и сцепляется вокруг неподвижного носителя.

Оставшаяся на поверхности жидкость, которая теперь не содержит фибриноген, сливается с носителя/фибринового геля, который затем промывается подряд 4 раза раствором NaCl - 0,15 М при соотношении от примерно 10 мл до 100 мл на 1,0 мл первоначального осаждения объема носителя. Промытый гель затем наполовину обезвоживается с помощью стеклянной воронки в условиях вакуума.

Применение клеточных культур, которые могут выделять фибриноген, особенно желательно, когда используется содержащий мономер фибрина состав. Это - потому, что считается, что такой состав может быть использован для образования полимера фибрина, используемого в качестве фибринового герметика, не принимая во внимание тот факт, образует ли полимер фибрина в конечном итоге поперечные связи.

Следовательно, пока такая клеточная культура не содержит фактора XIII, необходимого для образования поперечных связей, нет необходимости добавлять экзогенный фактор XIII для обеспечения эффективности фибринового герметика.

Состав не образующего поперечных связей фибрина может быть также получен из рекомбинирующего фибриногена. Совсем недавно фибриноген был получен с помощью рекомбинирующей технологии DNA. См. S.Roy и др., J. Biol. Chem., 266: 4758-4763 (1991), ссылки на эту работу здесь приводятся. Roy и др. являются первой группой, которая выражает все три цепи фибриногена и заявляет, что клетки COS выражают, собирают и выделяют цепи в такой форме, которая способна образовать сгусток, индуцированный тромбином.

Полученный состав фибриногена затем может быть использован для приготовления состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин таким же способом, как здесь описано выше относительно клеточных культур, которые выделяют фибриноген. Однако предпочитается, чтобы до образования состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, клеточные обломки были удалены таким же способом, как описано выше относительно клеточных культур.

Клеточные обломки могут быть удалены с помощью центрифугирования или фильтрации.

Применение рекомбинирующего фибриногена особенно предпочитается, когда используется содержащий мономер фибрина состав. Это потому, что считается, что такой состав может быть использован для образования полимера фибрина, используемого в качестве фибринового герметика, не принимая во внимание, образует ли в конечном итоге полимер фибрина поперечные связи.

Так как клеточная культура рекомбинирующего фибриногена не содержит фактор XIII, необходимый для образования поперечных связей, нет необходимости добавлять экзогенный фактор XIII для получения эффективного фибринового герметика.

Превращение фибриногена в не образующий поперечных связей фибрин с помощью, например, фермента в виде тромбина приводит к образованию фибрина в форме связанного водородом полимера фибрина. Однако, как указывалось выше, предпочитается, чтобы состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин, что важно для состава, содержащего мономер фибрина, был в олигомерной или мономерной форме. Это может быть достигнуто путем повышения растворимости состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Повышение растворимости особенно предпочитается, когда не образующий поперечных связей фибрин получается с помощью фермента в виде тромбина, который фиксируется на носителе. Это связано с фактом, что использование фермента в виде тромбина, зафиксированного на носителе, приводит обычно к получению связанного водородом полимера фибрина, не образующего поперечных связей, соединенного с таким фиксированным ферментом.

Следовательно, так как предпочитается, чтобы в полученном составе не было носителя, повышение растворимости позволяет удалить носитель из состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин, вместе с зафиксированным ферментом.

Повышение растворимости может быть достигнуто лишь известным способом или способом, который должен быть разработан, приводящим к образованию мономера фибрина. Повышение растворимости может быть осуществлено путем добавления в состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин, подходящего буферного кислотного раствора, при этом желательно, чтобы значение pH кислотного буфера было меньше, чем 5, желательно, примерно от 1 до 5.

Неограниченные примеры пригодных буферных кислотных растворов включают: уксусную кислоту, янтарную кислоту, глюкуроновую кислоту, цистиновую кислоту, кротоновую кислоту, итаконовую кислоту, глутаминовую кислоту, муравьиную кислоту, аспарагиновую кислоту, адапиновую кислоту и их соли, при этом предпочтение отдается янтарной кислоте, аспарагиновой кислоте, адипиновой кислоте и солям уксусной кислоты, наиболее предпочтителен ацетат натрия. Замечено, что предпочитаемые кислотные буферы действуют более эффективно, чем другие кислотные буферы, которые были опробованы.

Предпочитаемая концентрация кислотного буфера составляет примерно от 0,02 М до 1 М, наиболее предпочитаемая - примерно от 0,1 М до 0,3 М. Такая предпочитаемая концентрация и делает ионную прочность состава биологически более совместимой.

Предпочитается использовать как можно меньший объем кислотного буфера, необходимого для повышения растворимости не образующего поперечных связей фибрина для образования водного раствора, содеражащего мономер фибрина. Это приводит к водному раствору, содержащему мономер фибрина, отличающегося высокой концентрацией в мономере фибрина. Обычно требуется примерно от 1 мл до 4 мл кислотного буфера на 1 мл состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Кислотный буфер смешивается с не образующим поперечных связей фибрином и затем сильно встряхивается в течение примерно 1-2 минут, чтобы гарантировать полную растворимость.

Солюбилизация может также осуществляться при нейтральном значении pH посредством хаотропного агента. Пригодные хаотропные агенты включают мочевину, бромид натрия, гидрохлорид гуанидина, KCNS, иодид калия и бромид калия. Предпочитаемая концентрация хаотропного агента составляет примерно от 0,2 до 6,0 моляр, наиболее предпочтительно - от 3,5 до 5,0 моляр.

Так же как и с кислотным буфером, предпочитается использовать как можно меньшее количество хаотропного агента, который повысить растворимость не образующего поперечных связей фибрина. Обычно требуется примерно от 1,0 мл до 1,5 мл хаотропного агента на 1 мл состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Хоатропный агент смешивается с таким составом и затем сильно встряхивается в течение примерно 1-2 минут, чтобы гарантировать полную растворимость.

В соответствии с этим, солюбилизация приводит к получению состава, содержащего мономер фибрина, и в частности, содержащий мономер фибрина водный раствор. Предпочтительно, чтобы концентрация мономера фибрина в водном растворе составляла не меньше, чем примерно 10 мг/мл, более предпочтительно - от 20 мг/мл до 100 мг/мл, наиболее предпочтительно - примерно от 25 мг/мл до 50 мг/мл.

Если применяется фермент в виде тромбина, зафиксированный на носителе, что приводит к присутствию такого фермента в составе, содержащем не образующий поперечных связей фибрин, после солюбилизации фиксированный фермент может быть удален из состава, содержащего мономер фибрина. Это может быть выполнено, например, с помощью фильтрации через любой пригодный фильтр, который может отделить фермент. Подходящие фильтры включают керамический полипропиленовый фильтр с размером отверстий 20 микрон, принадлежащий фирме Porex, Inc. , тефлоновый фильтр с размером отверстий 20-70 микрон фирмы Fluorotechnoques, Inc. или нейлоновый фильтр 66 с размером отверстий 22-46 микрон фирмы Costar, Inc.

Альтернативным способом для гарантии того, что в составе, содержащем мономер фибрина, нет фермента в виде тромбина, например батроксобина, является использование в системе растворимого фермента в виде тромбина и удаление фермента после солюбилизации связанного водородом полимера фибрина. Удаление фермента может быть достигнуто с помощью матрицы средства, например лиганда, связанного с инертным носителем, имеющим специфичное средство для фермента в виде тромбина, или ионного обмена, или гидрофобного носителя, или наиболее эффективно используя систему авидина-биотина.

Взаимодействие биотина-авидина выявляют одну из самых прочных нековалентных связующих констант (K_DIS = 10^-15 М), известных в природе.

См. E.A.Bayer и M.Wilchek, Methods of Biochem. Analysis, 26: 1 (1980).

В данном способе биотин связан ковалентно с батроксобином, например, и парное соединение биотина-батроксобина (которое растворимо) непосредственно взаимодействует с плазмой, например, 10 В.ед. плюс 50 мл плазмы взаимодействуют в течение 10 минут при 37^oC. Полученный полимер фибрина I собирается центрифугированием или фильтрацией и вновь растворяется примерно в 4 мл 0,2 М ацетата натрия с pH 4,0, содержащем 30 мМ хлорида кальция.

К раствору фибрина 1 добавляется молярный избыток авидина, соединенного с инертным носителем, таким, как агароза. Комплекс агароза: авилен: биотин-батроксобин затем отделяется от фибрина I посредством центрифугирования или фильтрации, в результате чего образуется состав, содержащий мономер фибрина, который совершенно свободен от батроксобина и который может вновь полимеризоваться, как описано ниже, для образования фибринового герметика.

Соответственно, одним из вариантов настоящего изобретения является состав, содержащий мономер фибрина, который фактически свободен от фермента в виде тромбина. Под фактически свободным подразумевается либо то, что весь фермент в виде тромбина удален, либо остающийся в составе фермент в виде тромбина находится на уровнях, недостаточных для оказания какого-либо нежелательного фармацевтического эффекта. Таким образом, составы по этому изобретению, которые должны быть "фактически свободными", могут содержать фермент в виде тромбина в количестве примерно между нулем и 10% первоначального фермента, и, желательно, примерно между нулем и 2% фермента в виде тромбина, используемого для получения состава мономера фибрина.

Несмотря на то, что эти варианты описывают составы, из которых в результате необходимого превращения в растворимый фибрин удален фермент в виде тромбина, считается, что составы, удерживающие большую часть или весь фермент в виде тромбина, имеют также практическое применение, и в таком случае они являются частью настоящего изобретения.

Состав, содержащий мономер фибрина, теперь готов к применению в качестве компонента фибринового герметика. Замечено, что когда такой состав приготавливается из всей крови, в нем присутствует примерно от 60% до 90% первоначального фибриногена, но, разумеется в форме мономера фибрина.

Содержащий мономер фибрина состав может быть использован сразу же после приготовления. Действительно, особенно предпочитается использовать такой состав сразу же после приготовления, когда он приготовлен из собственной крови. Если же состав не используется сразу же после приготовления, он может храниться. Условия хранения требуют, чтобы состав сохранялся, например, с помощью замораживания или лиофилизации или выдерживания его при 4^oC.

Считается, что состав в замороженной или лиофильной форме будет стабильным в течение нескольких месяцев. Когда состав хранится при 4^oC, считается, что он стабилен в течение нескольких дней.

Если состав заморожен, он должен быть оттаян в момент применения. Если состав сохраняется в лиофильной форме, в момент применения предпочитается, чтобы он был восстановлен добавлением того же кислотного буфера, какой применялся на этапе солюбилизации, если эта кислота была летучей, например уксусная кислота, или же, если применялся хаотропный агент, добавлением дистиллированной воды.

Как и на этапе солюбилизации, при восстановлении должны быть использованы как можно меньшее количество кислотного буферного раствора или дистиллированной воды, чтобы мономер фибрина был растворимым. Действительно, восстановление лиофилизированного состава, содержащего мономер фибрина, может привести к получению водного раствора, содержащего мономер фибрина, где концентрация такого фибрина составляет до 200 мг/мл.

Перед лиофилизацией в состав может добавляться наполнитель, например маннит или лактоза. Альтернативно, лиофилированный состав может применяться в лиофилированной форме. Такая форма особенно предпочитается, когда желательно добавить активирующий препарат, например антибиотики, в состав.

Состав, содержащий мономер фибрина, фактически может быть в любой форме, например, в виде раствора, суспензии, эмульсии или твердом виде, при этом предпочтение отдается раствору. Следовательно, такой состав может быть жидкостью, гелем, пастой или мазью. А также, разумеется, состав может быть в форме "гранулы", например лиофилизированного мономера фибрина, который может быть, но не должен, подвергнут обработке для получения раствора, эмульсии или суспензии непосредственно перед употреблением.

Может быть использован любой растворитель для получения раствора, но, разумеется, предпочтительно, чтобы этот растворитель был нетоксичным. Неограниченные примеры растворителей включают воду, этиловый спирт, глицероль и пропиленгликоль, предпочтение отдается воде.

Пример суспензии заключается в том, что состав, содержащий мономер фибрина, может быть смешан с органическими растворителями, например этанолом, до конечной концентрации этанола более 3,0 М и встряхивается. Мономер фибрина будет выпадать в осадок и может быть собран с помощью центрифугирования.

Осадок промывается органической фазой для удаления водного раствора, применяемого на этапе солюбилизации. Этаноловая суспензия мономерного фибрина может затем накладываться непосредственно на бинт или другой носитель (нить для зашивания ран, протез, перевязочное средство) или даже прямо на рану. Органическая фаза испаряется. В случае с бинтом или другим держателем суспензия может быть регидрирована контактированием с местом приложения или каким-либо другим способом, и фибрин может полимеризоваться.

Альтернативно, органическая суспензия мономера фибрина приготовленная в виде высоко летучей фазы, например, диэтилового эфира, может быть распылена и применяться в виде дисперсной суспензии на нужное место. Желательно, чтобы летучая фаза не воспламенялась. Органическая суспензия мономера фибрина может применяться в ухо, нос, горло или легкие путем распыления или вдыхания или с помощью инъекции при желудочном повреждении или кровотечении в пищеводе.

Фибриновый герметик, согласно предмету изобретения, применяется путем контактирования нужного участка с составом, содержащим мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, и превращения мономера фибрина в полимер фибрина или не образующего поперечных связей фибрина в фибрин, образующий поперечные связи, одновременно с этапом контактирования, тем самым образуя фибриновый сгусток.

Согласно предмету изобретения, "нужный участок" - это то место, где желательно образование фибринового сгустка. Что из себя представляет и где находится нужный участок, зависит от применения фибринового герметика - предмета изобретения.

Следует отметить, что фибриновый герметик может применяться не только у человека, но и у других млекопитающих. А также, если источником фибринового герметика является кровь, предпочтительно, но не обязательно, чтобы кровь была от одного и того же вида, в котором этот фибриновый герметик применяется.

Фибриновый герметик настоящего изобретения может быть использован в любом известном способе или способе, который должен быть разработан для фибринового герметика. Способы, наборы или фибриновый герметик настоящего изобретения могут применяться при соединении тканей и органов, остановке кровотечения, заживлении ран, изоляции хирургической раны, в сосудистой хирургии, где нужно обеспечить гемостаз для сшивания кровоточащих отверстий анастомоза периферической коронарной артерии; сшивания сосудов левого желудочка; аортотомии и канюляционных участков; при диффузном эпимиокардиальном кровотечении при повторных операциях и медленных венозных кровотечениях, например, в области предсердия, сосудов правого желудочка или полостных уровнях.

Предмет изобретения служит также для изоляции дакроновых артериальных трансплантатов перед пересадкой, изоляции тканей вне тела, получения фибриновых тканей для роста клеток, остановки кровотечения из поврежденной селезенки (тем самым спасая орган), печени и других паренхиматозных органов, герметизации трахеального и бронхиального анастомоза и утечки воздуха или разрыве легкого, герметизации бронхиальных пробок, бронхиальных свищей и свищей, возникающих при воспалении пищевода, для бесшовного и безрубцового лечения (способ "Молния"), а также для закупорки кровеносного сосуда в сосудистой радиологии внутрицеребрального AVM, AVM печени, при ангиологических нарушениях толстой кишки, воспалительной сыпи пищевода, "откачивании" крови после пищеварительной язвы и т.д.

Предмет изобретения более того служит для обеспечения гемостаза в роговичных трансплантатах, при носовых кровотечениях, после тонзиллектомии, удалении зубов и в других областях применения. См. G.F.Gestring и R.Leriner, Vascular Surgery, 294-304, Sept. 10 ct. 1983. А также фибриновый герметик настоящего предмета изобретения особенно подходит для пациента с дефектами свертываемости крови.

Дозировка состава, включающего мономер фибрина или состава, включающего не образующий поперечных связей фибрин, зависит от особого применения фибринового герметика, но состава должно быть достаточное количество для обеспечения его предназначения. Обычно для состава, включающего водный раствор мономера фибрина, считается достаточным для эффективного фибринового герметика количество примерно от 3 мл до 5 мл.

Однако в зависимости от применения состава его количество может составлять примерно от 0,05 мл до 40 мл. А также, если состав, включающий не образующий поперечные связи фибрин, применяется в полимерной форме или твердой, он должен содержать это количество фибрина, которое находится в таком водном растворе.

В настоящем изобретении превращение мономера фибрина в полимер фибрина или же не образующего поперечных связей фибрина в фибрин, образующий поперечные связи "одновременно" с этапом контактирования обозначает, что данный этап превращения и этап контактирования имеют место в течение временного периода каждого этапа с тем, чтобы образовать фибриновый сгусток в нужной зоне.

Следовательно, одновременность может обозначать, что после этапа контактирования мономер фибрина превращен в полимер фибрина или же не образующий поперечных связей фибрин превращен в фибрин, образующий поперечные связи. Это осуществляется путем контакта состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, после чего такой состав применяется в нужном месте, с составом, который может преобразовать мономер фибрина в полимер фибрина или же не образующий поперечных связей фибрин в фибрин, образующий поперечные связи.

Этап превращения обычно должен осуществляться в течение 0,5 минут после контакта. В противном случае, состав, содержащий мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, особенно если не образующий поперечных связей фибрин является мономером фибрина, может вытечь из нужного участка.

Одновременно может также обозначать, что этап контактирования и этап превращения происходят в одно и то же время. Это осуществляется путем контакта нужного участка с составом, включающим мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, в одно и то же время, в течение которого такой состав контактирует с составом, в течение которого такой состав контактирует с составом, который может преобразовать мономер фибрина в полимер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин в фибрин, образующий поперечные связи.

В конечном итоге, что предпочтительно, одновременно может также означать, что этап превращения может начинаться перед этапом контактирования, но не слишком, так, чтобы весь мономер фибрина превратился в полимер фибрина или же весь не образующий поперечных связей фибрин превратился в фибрин, образующий поперечные связи.

В противном случае, весь мономер фибрина будет превращен в полимер фибрина или же весь не образующий поперечных связей фибрин будет превращен в фибрин, образующий поперечные связи, перед этапом контактирования, что приведет к образованию очень слабого фибринового герметика.

Этот вариант исполнения изобретения осуществляется смешиванием состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, с составом, который может превратить мономер фибрина в полимер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин в фибрин, образующий поперечные связи, непосредственно перед этапом контактирования.

Так как для завершения этапа превращения требуется около 30 секунд, этап превращения должен начинаться не раньше примерно 30 секунд и предпочтительно, не раньше примерно 3 секунд перед этапом контактирования. Этот вариант предпочитается потому, что максимальное количество состава, включающего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, останется в нужном месте, образуя надежный фибриновый сгусток.

Превращение мономера фибрина в полимер фибрина или не образующего поперечных связей фибрина в фибрин, образующий поперечные связи, может быть выполнено любым известным способом или способом, который должен быть разработан.

Однако, как будет проходить этап превращения, зависит от источника состава, включающего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, например всей крови или рекомбинирующего фибриногена, формы мономера фибрина или не образующего поперечных связей фибрина, например фибрина I или ВВ фибрина или же, в меньшей степени, от того, содержит ли нужный участок кровь пациента или другую жидкость тела во время применения фибринового герметика.

А также, если применяется отдельный состав, такой как щелочной буфер, на этапе превращения (обсуждается ниже), тогда способ по изобретению может быть выполнен, например, с помощью двухсекционного шприца. Двухсекционный шприц может быть в форме Y, что позволяет смешивать состав, содержащий мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, а также смешивать состав, предназначенный к применению, на этапе превращения непосредственно перед этапом контактирование.

Также, кроме двухсекционного шприца в форме Y, может быть использован двухсекционный шприц с двумя отверстиями. Это позволяет одновременное контактирование нужного участка и превращение в полимер фибрина или образующий поперечные связи фибрин. Составы из двухсекционного шприца могут быть также распылены на нужное место.

См. H.B.Kram и др., The American Surgeon, 57: 381 (1991).

Если источником состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, является кровь, тогда, как обсуждено выше, считается, что состав будет содержать достаточное количество протромбина, фактора XIII и других необходимых веществ для превращения такого мономера фибрина или не образующего поперечных связей фибрина в фибрин, образующий поперечные связи, например, активаторов протромбина.

Если не образующий поперечных связей фибрин является полимером фибрина, т. е. не образующий поперечных связей фибрин не может быть подвергнут солюбилизации, то он может быть превращен в образующий поперечные связи фибрин активацией протромбина и фактора XIII такого состав для образования образующего поперечные связи фибрина.

Такая активация может быть выполнена контактированием состава с источником ионов кальция. Неограниченные источники ионов кальция включают хлорид кальция желательно концентрации 30 мМ. Альтернативно, но менее желательно, ионы кальция могут быть доставлены кровью в нужное место.

Если не образующий поперечных связей фибрин подвергается солюбилизации, т. е. является мономером фибрина, то, как мономер фибрина превращается в образующий поперечные связи фибрин, зависит от того, как проходил этап солюбилизации.

Если растворимость не образующего поперечных связей фибрина повышалась посредством кислотного буфера, то образующий поперечные связи фибрин может быть получен повышением значений pH состава, содержащего мономер фибрина, таким образом, что мономер фибрина может полимеризоваться. Это может быть осуществлено контактированием такого состава с любым пригодным щелочным буфером.

Неограниченные примеры подходящих щелочных буферов включают HEPE, гидроокись натрия, гидроокись калия, гидроокись кальция, бикарбонаты, такие как бикарбонат натрия и бикарбонат калия, соли трех металлов лимонной кислоты, соли уксусной кислоты и соли серной кислоты.

Предпочитаемые щелочные буферы включают: 0,6 0,5-0,75 М карбоната натрия / бикарбонат pH 10-10,5, 0,5-0,75 М бикарбоната натрия / NaOH pH 10,0, 1,5 М глицина / NaOH pH 10,0, 0,5-1,1 М бис-гидроксиэтиламиноэтановую сульфокислоту (BES) pH 7,5, 1 М гидроксиэтилпиперазинпропановую сульфокислоту (EPPS) pH 8,5, 0,5 М трицина pH 8,5, 1 М морфолинопропановую сульфокислоту (TES) pH 8.0 и 0.5 М циклогексиламинэтановую сульфокислоту (CHES) pH 10,0; наибольшее предпочтение отдается 0,5-0,75 М карбонату натрия/бикарбонат pH 10-10,5, 0,5-1,0 М бис-гидроксиэтиламиноэтановой сульфокислоте (BES) pH 7,5, 1 М гидроксиэтилпиперазинпропановой сульфокислоте (EPPS) pH 8,5 и 1 М тригидроксиметил-аминоэтановой сульфокислоте (TES) pH 8,0.

Количество применяемого щелочного буфера должно быть достаточным для полимеризации не образующего поперечных связей фибрина.

Предпочитается, чтобы примерно 10 частей - 1 часть состава, содержащего мономер фибрина, смешивались примерно с 1 частью щелочного буфера. Более того, предпочитается, чтобы это соотношение равнялось 9:1. Следует отметить, что предпочитаемое соотношение зависит от выбора буфера и желаемой "прочности" полимера фибрина. Разумеется, желаемая прочность полимера фибрина зависит от конечного применения фибринового герметика.

Если солюбилизация осуществлялась с хаотропным агентом, тогда мономер фибрина может быть превращен в образующий поперечные связи фибрин путем разбавления состава, содержащего мономер фибрина, например, дистиллированной водой. Разбавление должно быть выполнено таким образом, чтобы использовалось минимальное количество растворителя. Обычно полученная концентрация хаотропного агента после разбавления должна быть примерно от 0,5 до 0,1 моляр.

Кроме повышения значения pH или разбавления хаотропного агента состава, содержащего мономер фибрина, предпочитается, чтобы протромбин и фактор XIII такого состава были активированы для образования фибрина, образующего поперечные связи.

Такая активация должна осуществляться путем контакта состава с источником ионов кальция. Источник ионов кальция может быть частью щелочного буфера или частью кислотного буфера, который применяется на этапе солюбилизации. Неограниченные источники ионов кальция включают хлорид кальция, предпочтительно с концентрацией 30 мМ. Альтернативно, менее желательно, источник ионов кальция может быть принесен кровью в нужное место.

Следует отметить, что если щелочным буфером является буфер карбонат/бикарбонат, в этом случае источник ионов кальция должен добавляться к кислотному буферу во время солюбилизации. Это связано с тем, что хлорид кальция не растворяется в буфере карбонат/бикарбонат. Предпочтительно, чтобы концентрация ионов кальция в кислотном буфере составляла примерно от 5 миллимоляр до 150 миллимоляр, более предпочтительно - примерно от 5 мМ до 50 мМ.

Считается, что полученный фибриновый сгусток будет образующим поперечные связи фибрином II независимо от того, какая форма не образующего поперечных связей фибрина, т. е. мономера фибрина или полимера фибрина, присутствует. Однако, если формой не образующего поперечных связей фибрина является ВВ фибрин, тогда считается, что может понадобиться источник дополнительного тромбина для превращения ВВ фибрина в фибрин, образующий поперечные связи.

Таким источником тромбина может быть, например, плазма от пациента, когда такая плазма добавляется к составу, содержащему не образующий поперечных связей фибрин.

Если желаемый участок содержит кровь и применяется содержащий мономер фибрина состав, т.е. не образующий поперечных связей фибрин подвергнут солюбилизации, в таком случае эта кровь может применяться в качестве разбавителя хаотропного агента или для повышения значения pH содержащего мономер фибрина состава. Таким образом, не требуется никакого разбавителя или щелочного буфера.

В настоящем варианте изобретения предпочитается, что источник ионов кальция содержится в кислотном буфере или хаотропном агенте, применяемом на этапе солюбилизации. Также, в этом варианте исполнения содержащий мономер фибрина состав может быть нанесен на твердый держатель, например бинт, нить для сшивания ран, протезы или перевязочные материалы, которые будут соприкасаться с нужным участком. Затем такой держатель накладывается на нужный участок до тех пор, пока не образуется фибриновый сгусток.

Однако следует отметить, что если содержащий мономер фибрина состав не имеет достаточного количества протромбина и фактора XIII для образования фибрина, образующего поперечные связи, такой состав все-таки применяется в качестве фибринового герметика, потому что полимеризация мономера фибрина самого по себе служит для образования фибринового сгустка.

Такой состав может быть также использован для образования фиброина, образующего поперечные связи, путем добавления источника ионов кальция и активированного фактор XIII (или исходных веществ к активированному фактору XIII) и тромбина, что необязательно.

Такой источник ионов кальция, активированный фактор XIII и тромбин могут быть добавлены к составу, содержащему мономер фибрина. Активированный фактор XIII может быть добавлен к содержащему мономер фибрина составу с конечной концентрацией примерно от 1,0 о 20 единиц фактора XIII на 1 мл состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Альтернативно, фактор XIII может быть доставлен кровью или жидкостями тела в нужное место или путем добавления собственной плазмы к составу, содержащему мономер фибрина. Неограниченные источники ионов кальция включают хлорид кальция желательно с концентрацией 30 мМ.

Альтернативно и менее предпочтительно ионы кальция могут быть доставлены кровью или жидкостью тела в нужное место. Может быть добавлено примерно от 4 единиц до 500 единиц тромбина на 1 мл состава, содержащего мономер фибрина, или же тромбин может быть выработан нужным участком.

Если источником состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин, являются клеточные культуры, которые выделяют фибриноген или рекомбинирующий фибриноген, а не образующий поперечных связей фибрин является полимером фибрина, т.е. не образующий поперечных связей фибрин не подвергался солюбилизации, в таком случае для образования фибрина, образующего поперечные связи должны быть использованы источник ионов кальция и активированный фактор XIII (или продукты предшествующей стадии к активированному фактору XIII).

Фактор XIII должен быть использован, так как эти источники не образующего поперечных связей фибрина не содержат фактора XIII. Активированный фактор XIII может быть добавлен в состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин с конечной концентрацией примерно от 1,0 до 20 единиц фактора XIII на 1 мл состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Альтернативно фактор XIII может быть доставлен кровью или жидкостями тела в нужное место или путем добавления собственной плазмы к составу, содержащему не образующий поперечных связей фибрин. Неограниченные источники ионов кальция включают хлорид кальция, желательно с концентрацией 30 мМ.

Альтернативно, менее желательно, ионы кальция могут быть доставлены кровью или жидкостями тела в нужное место. А также в качестве замены к такому составу может быть добавлен тромбин, чтобы убедиться в образовании образующего поперечные связи фибрина II. Может быть добавлено примерно от 4 единиц до 500 единиц тромбина на 1 мл состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин, или же тромбин может быть предоставлен нужным участком.

Если не образующий поперечных связей фибрин был подвергнут солюбилизации, т.е. является мономером фибрина, то, как мономер фибрина превращается в полимер фибрина, зависит от того, как прошла солюбилизация, например, с кислотным буфером или хаотропным агентом.

Образование полимера фибрина может осуществляться теми же способами, как описано выше. При желании этот полимер фибрина может быть затем превращен в образующий поперечные связи фибрин добавлением источника ионов кальция и активированного фактора XIII (или продуктов предшествующей стадии реакции к активированному фактору XIII) и, что необязательно, тромбина к составу, содержащему мономер фибрина, как описано выше. Активированный фактор XIII может быть добавлен к составу, содержащему не образующий поперечных связей фибрин, с конечной концентрацией примерно от 1,0 до 20 единиц фактора XIII на 1 мл состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Альтернативно фактор XIII может доставляться кровью или жидкостями тела в нужное место или же добавлением собственной плазмы к составу, содержащему не образующий поперечных связей фибрин. Неограниченные источники ионов кальция включают хлорид кальция, желательно с концентрацией 30 мМ.

Альтернативно, что менее предпочтительно, ионы кальция могут быть доставлены кровью или жидкостями тела в нужное место. Может быть добавлено примерно от 4 единиц до 500 единиц тромбина на 1 мл состава, содержащего мономер фибрина, или же тромбин может быть представлен нужным участком.

Фибриновый герметик согласно изобретению может также содержать вспомогательные вещества, например антибиотики: гентамицин, цефотаксим, небацитин и сисомицин, антагонисты H₂ гистаминина, т.е. ранитидин, и противораковые лекарства, например OK-432. Это может быть достигнуто путем добавления желаемого антибиотика к составу, содержащему мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин. См. м.с.н. Gersdorff и T.A.J.Robillard, Laryngoscope, 95: 1278-80 (1985); A.Ederle и др., Ital. J.Gastroenterol., 23: 354-56 (1991); V. Ronfard и др., Burns, 17: 181-84 (1991), T.Sakurai и др., J. Control Release, 18: 39-43 (1992); T.Morden и др., Cancer 69: 636-42 (1992); F. Greco, J. of Biomedical Materials Res., 25: 39-51 (1991) и H.B. Kram и др. , T. of Surgical Research, 50: 175-178 (1991), на которые здесь приведены ссылки.

Могут быть добавлены другие вспомогательные вещества, например фибронектин, фибринолитические ингибиторы, такие как апротитин, антиплазмин альфа-2, PAI-1, PAI-2, 6-аминогексановая кислота, 4-аминометилциклогексановая кислота, коллаген или кератиноциты. Считается, что дозировка такого вспомогательного вещества такая же, как и дозировка, применяемая в традиционных фибриновых герметиках.

Предмет изобретения также предлагает наборы фибриновых герметиков. Набор может содержать в качестве первого компонента состав, содержащий мономер фибрина, и в качестве второго компонента щелочной буфер, способствующий полимеризации мономер фибрина, или дистиллированную воду в зависимости от того, как прошел этап солюбилизации.

Второй компонент может по желанию содержать источник ионов кальция. Альтернативно первый компонент может быть составом, содержащим не образующий поперечных связей фибрин, а второй компонент может быть источником ионов кальция. Если источник фибриногена, используемого для получения состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин, происходит из клеточных культур, которые выделяют фибриноген или рекомбинирующий фибриноген, первый компонент может быть составом, содержащим не образующий поперечных связей фибрин, второй компонент может быть источником ионов кальция, а третий компонент - активированным фактором XIII.

Примеры
1. Получение плазмы из всей крови.

Вся кровь (100 мл) собирается в стандартный, коммерчески доступный пакет для крови, содержащий противосвертывающее средство, такое как цитрат/фосфат/декстрозу. Затем кровь поступает в контейнер, пригодный для центрифугирования, и подвергается центрифугированию при комнатной температуре в течение 100 минут при 3,000 г. Светлая плазма на поверхности (приблизительно 50 мл) сливается, а клеточные компоненты отбрасываются.

Альтернативным способом получения плазмы из всей крови является фильтрация. Также 100 мл всей крови собирается в пакет, содержащий подходящий антикоагулянт, такой как цитрат/фосфат/декстрозу. Затем кровь перегоняется через фильтр с хорошей пропускной способностью протеина с помощью перистальтического насоса. Перепад давления через мембрану приводит к тому, что плазма проходит через фильтр, тогда как клеточные компоненты остаются в циркулирующей крови. Плазма (50 мл) собирается для дальнейшей обработки.

Фиксация батроксобина на агарозу в форме бусинок.

При исследовании фиксации применялась агароза (Pharmacia), имеющая форму бусинок, 4% используемой агарозы образовывало поперечные связи, 45-165 μ м (90% частиц). При гидрировании этом материал увеличивается в 5 раз по отношению к своему объему.

Прежде всего бактроскобин окисляется 0,1 М периодата натрия в течение 1 часа при комнатной температуре в закрытом блестящем флаконе. Бактроксобин очищается посредством прохождения через колонку просачивания геля сефадекс PД-10. Окисленный батроксобин затем соединяется с активированным гидразидом гелем агарозы в течение ночи при комнатной температуре в 50 мМ ацетата натрия pH 5,5 плюс 10 мМ борогидрида натрия (30-200 ед. на 1,75 г увлажненного геля).

Несвязанные реакции удаляются из геля путем промывания его растворами: 50 мл ацетата натрия pH 5,5, 100 мл 50 мМ глицина (1 М натрия pH 3,0, 100 мл 50 мМ карбоната натрия) 1 М натрия pH 10,0, 100 мл 50 мМ фосфата натрия / 1 М хлорида натрия pH 7,0, 100 мл 50 мМ фосфата натрия / 1 М хлорида натрия pH 7,0, 100 мл воды, 100 мл 50 мМ фосфата натрия / 1 М хлорида натрия pH 7,0, 100 мл 50 мМ фосфата натрия pH 7,0.

Реакция фиксированного фермента с фибриногеном плазмы для получения состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Фиксированный фермент (350 мг) добавляется примерно к 50 мл центрифугированной или отфильтрованной плазмы и медленно смешивается в течение 7-20 минут до образования не образующего поперечных связей фибрина I.

Полимер фибрина I вместе с добавленным фиксированным ферментом затем собирается с помощью или
а) центрифугирования при 3,000 за 10 минут, а затем удаления образовавшейся на поверхности сыворотки сливанием, или
б) фильтрации через подходящий фильтр с низким связыванием протеина, а затем отбрасывания отфильтрованной сыворотки и удержания полимера фибрина I вместе с фиксированным ферментом для дальнейшей обработки.

Этот полимер фибрина I является примером состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Солюбилизация полимера фибрина I для получения состава, содержащего мономер фибрина.

Солюбилизация полимера фибрина I достигается путем добавления примерно 1-4 мл 0,2 М ацетата натрия pH 4,0, содержащего буферного раствора 30 мМ хлорида кальция, к собранному полимеру фибрина I с фиксированным ферментом. Образец затем резко встряхивается в течение 2 минут в вихревом миксере, например. Удаление фиксированного фермента может затем быть достигнуто с помощью фильтрации раствора фибрина I через фильтр с низким связыванием протеина и с отверстиями 1-20 м. Фермент агарозы будет удержан фильтром, т.е. удален из системы. Оставшийся раствор, состав, содержащий мономер фибрина I, состоит из концентрированного кислотного раствора мономера фибрина I вместе с другими протеинами плазмы. Обычно из 100 мл всей крови получается примерно 4 мл или 5 мл состава, содержащего мономер фибрина, где концентрация мономера фибрина составляет от 25 мг/мл до 35 мг/мл. Теперь он готов к применению на пациенте, один или экструдированный с полимеризующимся буфером для образования фибринового герметика.

Реполимеризация состава, содержащего мономер фибрина I.

Реполимеризация достигается одновременным смешиванием 9 частей раствора, содержащего мономер фибрина I, с 1 частью пригодного реполимеризующего буфера, например 0,75 М карбоната натрия/бикарбоната натрия pH 10,0; однако при соотношении 9: 1 поддерживается высокая концентрация фибрина в конечном продукте. При коэкструзии фибрин I самопроизвольно реполимеризуется и превращается в фибрин II, затем следует образование поперечных связей фибрина в течение 30 минут.

Настоящее изобретение не ограничивается областью описанных специфичных вариантов, приведенных в качестве единичных иллюстраций отдельных аспектов изобретения. Действительно, различные модификации предмета изобретения, кроме тех, что показаны и описаны здесь, будут поняты специалистам данной области из нижеследующих описаний. Подобные модификации не выходят за рамки предлагаемой формулы изобретения.

Активация агарозы гидразидом, и соединение посредством карбогидратной части фермента.

Чтобы добиться реакций карбогидратной части батроксобина с активированным гидразидом носителем, сахар должен быть прежде окислен для получения свободных групп - CHO. Это выполняется следующим образом.

1-7 мг батроксобин растворяется в 2 мл воды и 0,2 мл 0,1 М периодата натрия. Смесь выдерживается при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего он обессоливается на колонке Сефадекс C25 для фильтрации геля. Окисленный активный батроксобин извлекается из колонки с 0,9% вес/объем хлорида натрия.

Для прямого связывания групп (-CHO) свободного альдегида может быть использована стандартная коммерческая доступная активированная гидрозидом агароза (Bio-rad Laboratories Ltd UK) или любая группа с конечной свободной аминогруппой. Если используется гидразид-агароза, процедура соединения заключается в следующем.

1-5 г геля гидрозида-агарозы суспендируется в 4 мл 50 мМ ацетата натрия pH 5,5. К суспензии добавляется 1 мл 10 мМ борогидрида натрия вместе с желаемым количеством окисленного батроксобина (обычно 100-200 В ед. на 1 г увлажненного геля).

Образец смешивается в течение ночи при комнатной температуре, а затем промывается через стеклянную воронку с 50 мл 50 мМ ацетата натрия pH 5,5, 100 мл 50 мМ глицина/ 1 М хлорида натрия pH 3,0, 100 мл 50 мМ карбоната натрия/ 1 М хлорида натрия pH 10,0, 100 мл 50 мМ фосфата натрия/ 1 М хлорида натрия pH 7,0, 100 мл воды и 100 мМ фосфата натрия/ 1 М хлорида натрия pH 7,0, и в конечном итоге 100 мл 50 мМ фосфата натрия pH 7,0.

Способ проведения реакции фиксированного батроксобина с плазмой заключается в следующем.

Значение pH плазмы (50 мл) уменьшается до 5,5 путем добавления уксусной кислоты. К плазме добавляется эквивалент 100-200 В ед. батроксобина, зафиксированного к примерно 1,75 г (вес увлажненного геля) агарозы. Плазма выдерживается при 37^oC в течение 10-15 минут, после этого времени значение pH увеличивается до 7,4 путем добавления гидроксида натрия.

Полимеризация фибрина I происходит почти мгновенно. Полимер фибрина I собирается центрифугированием при 3,500 об/мин, в течение 10 минут и вновь растворяется в 3-4 мл 0,2 М ацетата натрия pH 4,0 содержащего 30 мМ хлорида кальция. Фермент агарозы может быть затем отделен от фибрина I центрифугированием или фильтрацией. Затем фибрин I вновь полимеризуется для образования фибринового герметика путем добавления 9 частей раствора фибрина I к 1 части 0,75 м карбоната натрия/бикарбоната pH 10,0.

Система захвата фермента с помощью биотина-авидина.

Захват фермента осуществляется прежде всего добавлением биотина к батроксобину и улавливанием фермента биотина с помощью фиксированного авидина (авидин соединен с 6%-ной агарозой, образующей поперечные связи).

Добавление биотина к протеинам может быть достигнуто с помощью некоторого количества реагентов. С этой целью применяется N-гидроксисукцинимид-биотин (нерастворимый в воде), коммерчески доступной фирмы Amersham), MS-биотин (50 μл) добавлялся к 1 мг батроксобина при pH 8,6, затем раствор выдерживается при комнатной температуре в течение 1 часа. Избыток биотинового реагента удаляется с помощью гелевой фильтрационной колонки Сефадекс G-25 в присутствии фосфата калия pH 7,5 в качестве растворителя.

Эквивалент 10 В ед. (биотин-батроксобин) добавляется к 50 мл плазмы и выдерживается при 37^oC в течение 10 минут. Полимер фибрина 1 собирается центрифугированием (3,500 об/мин в течение 10 минут) и вновь растворяется в 3-4 мл 0,2 М ацетата натрия pH 4,0, содержащего 30 мМ хлорид кальция. К фибрину I добавляется авидин-агароза (коммерчески доступная фирма Sigma Chemical Co.) при 0,2 г (увлажненного геля) на 1 мл фибрина I.

Образец выдерживается при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугируется при 2,000 об/мин в течение 10 минут. Полученный фибрин I является совершенно свободным от батроксобина. Повторная полимеризация фибрина для образования фибринового герметика достигается так, как описано в примере 5.6.

Формула изобретения

1. Способ использования фибринового герметика, включающий контактирование нужного участка с составом, свободным от фермента в виде тромбина и содержащим мономер фибрина, причем одновременно с этапом контактирования осуществляют превращение этого мономера фибрина в полимер фибрина, образуя тем самым фибриновый герметик.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мономер фибрина выбран из группы, состоящей из не образующего поперечных связей фибрина I, ВВ фибрина и не образующего поперечных связей фибрина II.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что мономер фибрина является фибрином I.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полимер фибрина является полимером фибрина II.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полимер фибрина образует поперечные связи.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что состав образуется из источника, выбранного из группы, состоящей из крови, клеточных культур, которые выделяют фибриноген и рекомбинантный фибриноген.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что этим источником является кровь.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что состав дополнительно включает протромбин, активаторы протромбина и фактор XIII.

9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что кровь является аутологичной кровью.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап превращения осуществляют с помощью щелочного буфера или дистиллированной воды.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что щелочный буфер или дистиллированная вода дополнительно включает источник ионов кальция.

12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что щелочный буфер выбирают из группы, состоящей из гидроксида натрия, гидроксида калия, гидроксида кальция, бикарбонатных буферов солей металлов лимонной кислоты, солей уксусной кислоты и солей серной кислоты.

13. Способ по п. 10, отличающийся тем, что щелочный буфер выбирают из группы, состоящей из 0,5-0,75 М карбоната натрия/бикарбоната pH 10-10,5, 0,5-0,75 М бикарбоната натрия/ NaOH pH 10,0, 1,5 М глицина/ NaOH pH 10,0, 0,5-1,0 М бис-гидроксиэтиламиноэтансульфокислоты (BES) pH 7,5, 1 М гидроксиэтилпиперазинпропановой сульфокислоты (EPPS) pH 8,5, 0,5 М триоина pH 8,5, 1 М морфолинапропановой сульфокислоты (MOP S) pH 8,0, 1 М тригидроксиметиламиноэтановой сульфокислоты (TES) pH 8,0 и 0,5 М циклогексиламиноэтановой сульфокислоты (CHE S) pH 10,0.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что щелочной буфер выбирается из группы, состоящей из 0,5-0,75 М карбоната натрия/бикарбоната pH 10-10,5, 0,5-1,0 М бис-гидроксиэтиламиноэтановой сульфокислоты (BES) pH 7,5, 1 М гидроксиэтилпиперазинпропановой сульфокислоты (EPPS) pH 8,5 и 1 М тригидроксиметиламиноэтановой сульфокислоты (TES) pH 8,0.

15. Способ по п.10, отличающийся тем, что контакт осуществляют с помощью двухсекционного шприца, в котором одна секция содержит указанный состав, а другая - указанный щелочный буфер или дистиллированную воду.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный состав является водным составом и имеет pH примерно от 1 до 5 или включает хаотропный агент.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что состав дополнительно включает кислотный буфер, выбранный из группы, состоящей из уксусной кислоты, янтарной кислоты, глюкуроновой кислоты, цистиновой кислоты, кротоновой кислоты, итаконовой кислоты, глутаминовой кислоты, муравьиной кислоты, аспартиновой кислоты, адипиновой кислоты и их солей.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что кислотный буфер выбирают из группы, состоящей из янтарной кислоты, аспартиновой кислоты, адипиновой кислоты и солей уксусной кислоты.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что кислотный буфер является ацетатом натрия.

20. Способ по п.17, отличающийся тем, что концентрация кислотного буфера составляет примерно от 0,02 до 1 М.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что концентрация буфера составляет примерно от 0,1 до 0,3 М.

22. Способ по п.16, отличающийся тем, что хаотропный агент выбирают из группы, состоящей из мочевины, бромида натрия, гидрохлорида гуанидина, KC NS, иодида калия и бромида калия.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что концентрация хаотропного агента составляет примерно от 0,2 до 6,0 М.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что концентрация хаотропного агента составляет примерно от 3,5 до 5,0 М.

25. Способ по п.16, отличающийся тем, что концентрация мономера фибрина в водном растворе составляет примерно от 10 до 200 мг/мл.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что концентрация мономера составляет примерно от 20 до 100 мг/мл.

27. Способ по п.16, отличающийся тем, что водный раствор дополнительно включает источник ионов кальция.

28. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нужный участок находится на теле млекопитающего.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что млекопитающее является человеком.

30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что нужный участок выбирают из группы, включающей кожу, сердечно-сосудистую систему, лимфатическую систему, легкие, ухо, нос, горло, глаз, печень, селезенку, черепную систему, спинную систему, лицевую систему, кость, сухожилие, поджелудочную железу, мочеполовую систему и систему пищеварения.

31. Способ получения из фибриногена состава, свободного от фермента в виде тромбина и содержащего мономер фибрина, включающий контактирование состава, содержащего фибриноген с ферментом в виде тромбина для превращения фибриногена в не образующий поперечных связей полимер фибрина, отделение не образующего поперечных связей полимера фибрина от состава, содержащего фибриноген, и солюбилизацию не образующего поперечных связей полимера фибрина для образования состава, свободного от фермента, в виде тромбина, содержащего мономер фибрина.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что фермент в виде тромбина фиксируется на носителе, причем контактирование приводит к тому, что фермент в виде тромбина связывается с не образующим поперечных связей полимером фибрина, в результате чего происходит отделение фермента в виде тромбина от состава, содержащего мономер фибрина.

33. Способ по п.32, отличающийся тем, что носитель выбирается из группы, состоящей из целлюлозы, полидекстранов, агарозы, полистиролов, двуокиси кремния, полиакриловых кислот, полиакриламидов, поливинилспиртов, стеклянных шариков, поликарбоната, коллагена, производных целлюлозы, политетрафторэтилена и их композитов.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что носитель выбирается из группы, состоящей из агарозы и двуокиси кремния.

35. Способ по п.31, отличающийся тем, что фермент в виде тромбина фиксируется на фильтре или носителе и находится на одной стороне фильтра, после этапа контактирования полученный мономер фибрина проходит через этот фильтр.

36. Способ по п.31, отличающийся тем, что этап солюбилизации осуществляют с помощью раствора кислотного бефера с pH менее чем примерно 5 или хаотропного агента.

37. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанный раствор кислотного буфера выбирают из группы, состоящей из уксусной кислоты, янтарной кислоты, глюкуроновой кислоты, цистиновой кислоты, кротоновой кислоты, итаконовой кислоты, глутаминовой кислоты, муравьиной кислоты, аспартиновой кислоты, адипиновой кислоты и их солей.

38. Способ по п.36, отличающийся тем, что раствор кислотного буфера или хаотропный агент, кроме того, включает источник ионов кальция.

39. Способ по п.31, отличающийся тем, что этап отделения осуществляют с помощью фильтрации.

40. Способ по п.31, отличающийся тем, что фермент в виде тромбина может превратить фибриноген в фибрин I.

41. Способ по п.31, отличающийся тем, что фермент в виде тромбина выбирается из группы, состоящей из анкрода и батроксобина.

42. Способ по п.31, отличающийся тем, что дополнительно включает удаление фермента в виде тромбина из состава, содержащего мономер фибрина, путем добавления биотина в фермент в виде тромбина и контактирование состава, содержащего мономер фибрина, с фиксированным авидином, в результате чего из состава, содержащего мономер фибрина, удаляется фермент в виде тромбина.

43. Способ использования фибринового герметика, включающий контактирование нужного участка с составом, свободным от фермента в виде тромбина и содержащим не образующий поперечных связей фибрин, причем одновременно с этапом контактирования осуществляют превращение не образующего поперечных связей фибрина в фибрин, образующий поперечные связи.

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что не образующий поперечных связей фибрин выбирают из группы, состоящей из не образующего поперечных связей фибрина I, ВВ фибрина и не образующего поперечных связей фибрина II.

45. Способ по п.44, отличающийся тем, что не образующий поперечных связей фибрин является фибрином I.

46. Способ по п.43, отличающийся тем, что состав получают из крови, клеточных культур, выделяют фибриноген или рекомбинантный фибриноген.

47. Способ по п.46, отличающийся тем, что кровь является аутологичной кровью.

48. Способ по п.43, отличающийся тем, что этап превращения осуществляют путем контактирования указанного состава с источником ионов кальция.

49. Водный состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий не образующий поперечные связи мономер фибрина, где концентрация мономера фибрина составляет примерно от 10 до 200 мг/мл, при этом названный состав имеет pH примерно от 1 до 5.

50. Водный состав по п.49, отличающийся тем, что концентрация мономера фибрина составляет примерно от 20 до 100 мг/мл.

51. Водный состав по п.49, отличающийся тем, что указанный мономер фибрина выбирают из группы, состоящей из фибрина I, ВВ фибрина и не образующего поперечных связей фибрина II.

52. Водный состав по п.51, отличающийся тем, что указанный мономер фибрина является фибрином I.

53. Водный состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий мономер фибрина, где концентрация указанного мономера фибрина составляет примерно от 20 до 200 мг/мл.

54. Водный состав по п.53, отличающийся тем, что указанная концентрация составляет от примерно 20 до 100 мг/мл.

55. Водный состав по п.53, отличающийся тем, что указанный мономер фибрина выбирают из группы, состоящей из фибрина I, ВВ фибрина и не образующего поперечных связей фибрина II.

56. Водный состав по п.55, отличающийся тем, что указанный мономер фибрина является фибрином I.

57. Водный состав по п.53, отличающийся тем, что дополнительно содержит источник ионов кальция, причем концентрация указанных ионов кальция составляет примерно от 5 до 200 мМ.

58. Состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий мономер фибрина, причем указанный состав является твердой формой.

59. Состав по п.58, отличающийся тем, что образуется путем лиофилизации водного раствора, содержащего мономер фибрина.

60. Состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий мономер фибрина и соединение, выбранное из группы, состоящей из антибиотика, гистамин-антогониста Н2, противоракового лекарства, фибронектина и фибринолитического ингибитора.

61. Набор, включающий состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий мономер фибрина и состав, выбранный из группы, состоящей из щелочного буфера и дистиллированной воды.

62. Набор по п.61, отличающийся тем, что указанный щелочной буфер или дистиллированная вода дополнительно содержит источник ионов кальция.

63. Набор, содержащий состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий не образующий поперечных связей фибрин и состав, содержащий источник ионов кальция.

64. Набор по п.63, отличающийся тем, что дополнительно содержит активированный фактор XIII.

65. Твердый носитель, имеющий на своей поверхности состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий мономер фибрина.

66. Твердый носитель по п.65, отличающийся тем, что носитель выбирается из группы, состоящей из бинта, нити для зашивания ран, протеза или перевязочного средства.

67. Твердый носитель по п.65, отличающийся тем, что указанный мономер фибрина выбирают из группы, состоящей из фибрина I, ВВ фибрина и не образующего поперечных связей фибрина II.

68. Твердый носитель по п.67, отличающийся тем, что указанный мономер фибрина является фибрином I.

69. Твердый носитель по п.65, отличающийся тем, что указанный состав представлен в твердой форме.

70. Твердый носитель по п.69, отличающийся тем, что указанная композиция получена путем лиофилизации водного раствора состава свободного от фермента в виде тромбина и содержащего мономер фибрина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2