Способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике нарушений тромбоцитарного звена гемостаза. Способ заключается в том, что при отборе крови у больного путем пункции локтевой вены в смеси с раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 получают обогащенную тромбоцитами плазму путем центрифугирования, подготавливают бестромбоцитарную плазму для настройки агрегометра, получают основную концентрацию аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида натрия и снимают агрегационную кривую, основную навеску аденозиндифосфата уменьшают в 10 и 100 раз, а агрегационную активность тромбоцитов исследуют в течение 45-60 мин после забора крови, регистрируют двухволновую агрегатограмму, по которой оценивают нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни. Способ обеспечивает диагностику нарушений в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни. 2 ил., 5 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности к оценке функционального состояния кровяных пластинок в зависимости от степени агрегации тромбоцитов.

Известен способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии, при котором отбирают кровь у больного путем пункции локтевой вены (самотеком) в смеси с раствором цитрата натрия, затем получают основную концентрацию аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида и снимают прямую зависимость степени агрегации тромбоцитов от концентрации аденозиндифосфата у здоровых лиц и у больного. (Kenneth K.Wu. Platelet activation mechanisms and markers in arterial thrombosis. J.of Internal Medicine, 1996. V 239, N 1-P6 17-34).

Недостатком аналога является невозможность выявить порог чувствительности тромбоцитов при различных патологических состояниях и фазах заболевания.

Известен способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза, при котором отбирают кровь у больного путем пункции локтевой вены смеси с раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, в получении обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрофугирования, подготовке бестромбоцитарной плазмы для настройки агрегометра, в получении основной концентрации аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида и снятии агрегационной кривой натрия (Лычев В.Г. Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. М. Медицина, 193,53-56).

В формировании внутрисосудистого тромбообразования тромбоциты играют существенную патогенетическую роль. По существу в него вовлечено такое разнообразие биологически активных веществ, которое делает проблему управляемости тромбоцитарного гемостаза одной из сложнейших клинико- фармакологических задач. Однако в этой работе, посвященной нарушениям гемостаза при различных патологических процессах, не проводится изучение морфофункциональной активности кровяных пластинок. Невозможно выявить порог чувствительности при различных патологических состояниях и фазах заболевания.

Данное изобретение устраняет недостатки и аналога, и прототипа.

Техническим и медицинским результатом данного изобретения являются: - получение двухволновой агрегатограммы при различных подпороговых значениях концентрациях аденозиндифосфата, что позволяет выявить интенсивность агрегационной активности клеток; - диагностика нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни; - выявление характера и степени нарушений в клеточном звене гемостаза в зависимости от формы, тяжести течения и лечения болезни; - определение интервала, при котором регистрируется двухволновая агрегатограмма, характеризующая состояние гранулярного аппарата кровяных пластинок; - обоснование применения лекарственных средств, корректирующих функциональную активность кровяных пластинок.

Технический и медицинский результаты достигаются тем, что в способе диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии, заключающемся в том, что в отборе крови у больного путем пункции локтевой вены в смеси с раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, в получении обогащенной тромбоцитами плазмы путем цетрифугирования, подготовке бестромбоцитарной плазмы для настройки агрегометра, в получении основной концентрации аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида натрия и снятии агрегационной кривой, основную навеску аденозиндифосфата уменьшают в 10 и 100 раз, а агрегационную активность тромбоцитов исследуют в течение 45-60 минут после забора крови, регистрируют двухволновую агрегатограмму, по которым оценивают нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни.

Сущность изобретения поясняется на различных примерах, приведенных в таблицах 1-5 и на фиг.1 и фиг.2. Во всех таблицах приняты единые обозначения, где: n - число наблюдений, p- интервал достоверности, ^* - p < 0,05 (95%) ^** - p < 0,01 (99%)
^*** - p < 0,001 (99,9 %)
А - группа A,
Б - группа Б
B - группа больных,
N - число наблюдений,
M±m-M - средняя величина: m - средняя ошибка.

На фиг. 1 приведены формы агрегационных кривых в контроле (у здоровых лиц) в зависимости от концентрации используемого индуктора (аденозиндифосфата).

На фиг.2 показана агрегация тромбоцитов у больных генерализованной формой иерсиниозов, индуцированная разными дозами аденозиндифосфата (АДФ) в различные периоды болезни.

По оси ординат отложена частота регистрации двухфазной кривой (в процентах).

При осуществлении способа кровь исследуемого забирается путем пункции локтевой вены (самотеком) в пластиковую пробирку в смеси с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугируется на малых оборотах (100g) в течение 15 минут. Производится отбор богатой тромбоцитами плазмы в селиконовую пробирку. Оставшаяся кровь центрифугируется в течение 15 минут при 2000g для получения бестромбоцитарной плазмы, которая используется для настройки агрегометра и для получения необходимой концентрации кровяных пластинок в плазме, используемой в исследовании. Для исследования агрегационной способности тромбоцитов необходима плазма с содержанием тромбоцитов 250-300·10⁹/л.

Для получения основной концентрации (10 мкг/мл=2·10^-5М) сухую навеску АДФ (аденозиндифосфат) разводили физиологическим раствором хлорида натрия (0,9%). Эта концентрация АДФ использовалась как базисная для изучения агрегационной способности клеток у больных и здоровых лиц. Однако эта концентрация не дает полного представления об агрегационной активности тромбоцитов, т.к.:
- при использовании этой концентрации обычно не удается получить двухволновую агрегатограмму;
- при ряде патологических состояний использование этой концентрации АДФ не позволяет выявить истинную интенсивность агрегационной активности кровяных пластинок;
- одна высокая концентрация АДФ (2·10^-5М) не позволяет выявить порог чувствительности тромбоцитов при различных патологических состояниях и фазах заболевания.

В связи с этим для более полной оценки функциональной способности тромбоцитов применяли следующие концентрации АДФ: 2·10^-6 (1 мкг/мл) и 2·10^-7М (1 мкг/мл), разводя базисный раствор АДФ (2·10^-5М) соответственно в 10 и 100 раз. При необходимости производили промежуточные разведения индуктора: 1·10^-5М (5 мкг/мл), 0,5·10^-5М (2,5 мкг/мл), 1-10^-6М (0,5 мкг/мл), 2·10^-8М (0,01 мкг/мл). Исследования агрегационной активности тромбоцитов необходимо проводить в течение 45-60 мин после забора крови.

При ряде инфекционных заболеваний (менингоковая инфекция, дифтерия, вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция, кишечные инфекции и др.) отмечаются манифестные клинические проявления гемокоагуляционных нарушений: выраженная геморрагическая сыпь на коже, кровоизлияния под слизистые оболочки, внутренние органы. Молниеносное развитие и глубина нарушений в системе гемокоагуляции, приводящие к клинически выраженным нарушениям микроциркуляции, в том числе к кровоизлияниям в склеру и слизистые оболочки, носовым и желудочным кровотечениям, множественным геморрагиям на коже, выявляются при тяжелом течении инфекционных заболеваний, особенно в случае развития токсикоинфекционного шока (ТИШ) и острой печеночной недостаточности.

Изучение связи между тяжестью болезни, клиническими проявлениями гемокоагуляционных нарушений и степенью изменения тестов гемостаза позволило выявить зависимость между выраженностью геморрагических проявлений у больных менингококковой инфекцией в момент поступлений больных в стационар и агрегационной способностью тромбоцитов.

Вместе с тем, даже у больных ВИЧ-инфекцией, когда заболевание развивается в течение нескольких лет, нарушения системы гемостаза с клинической манифестацией геморрагического синдрома имеют место, начиная со стадии первичных проявлений 2Б, при отсутствии клинической симптоматики иммунодефицита (табл.1).

Общеизвестно, что ведущую роль в возникновении и развитии тромбогеморрагических нарушений при ряде патологических состояний играет изменение морфофункциональных свойств тромбоцитов. В то же время, нарушения функциональной активности кровяных пластинок с использованием стандартной концентрации АДФ (2·10^-5М), даже при наличии клинических проявлений в системе гемостаза, мы обнаружили только при тяжелом течении болезни. Так, агрегационная активность тромбоцитов (концентрация АДФ - 2·10^-5М) была снижена только у больных ВИЧ-инфекцией на стадиях вторичных заболеваний (3А-3Б), причем максимально низкая величина агрегации зарегистрирована у лиц на стадии 3В (63.4%) от значений здоровых лиц.

Особенно четко вывялено истинное изменение активности тромбоцитов при использовании теста регистрации агрегационной способности тромбоцитов под действием разных доз АДФ (2·10^-8М).

Использование подпороговой концентрации АДФ (2·10^-6М) позволило выявить снижение агрегационной активности у 80-90 % больных ВИЧ-инфекцией на всех стадиях заболевания. При этом, у всех больных средняя величина агрегации была также значительно снижена от 60,8% (стадии 2Б-2В) до 48,5-50,7% (стадии 3Б-3В).

Аналогичные изменения выявлены у больных пищевыми токсикоинфекциями, иерсиниозом и дифтерией: истинное повышение или снижение агрегационной активности тромбоцитов обнаруживалось в большом проценте случаев при применении низких (подпороговых) доз АДФ (1·10^-6 - 2·10^-8 М) (таблица 3).

Так, у больного К., 16 лет (и/б N 15442), находившегося на лечении в КИБ N 2 г. Москвы с диагнозом: Иерсиниоз, генерализованная форма, смешанный вариант, тяжелое течение, наблюдали следующую динамику тромбоцитов: в периоде разгара болезни - использование стандартной дозы АДФ выявляло снижение агрегации клеток (64,7%; контроль - 100%), тогда как подпороговые концентрации (2·10^-7М) выявили высокий порог чувствительности к индуктору (188,2%; контроль - 100%); к моменту выписки из стационара - на стандартной концентрации АДФ (2·10^-5 М) величина агрегации клеток приближалась к значениям контроля (81%), тогда как применение подпороговой концентрации АДФ выявило сохраняющийся высокий порог чувствительности кровяных пластинок (164,7%).

Таким образом, использование подпороговых концентраций АДФ позволяет диагностировать истинные нарушения в клеточном звене гемостаза на ранних стадиях болезни. Так у больных с локализованной формой дифтерии нарушения в клеточном звене гемостаза на всем протяжении госпитального периода выявляются только при использовании низких доз АДФ (2·10^-6 - 2·10^-7 М) Данные приведены в таблице 4.

Но и у пациентов с токсической дифтерией II-III степени тяжести, поступивших в стационар в течении 48 часов от начала заболевания, удавалось зарегистрировать ТГ-синдром еще на стадии гиперкоагуляции, тогда как у пациентов, госпитализированных спустя 82 часа от начала болезни, имела самые ранние сроки болезни, имело место поражение кровяных пластинок: снижение количества тромбоцитов и способности их к агрегации (таб.5). Приведенные в таблицах примеры показывают, что использование подпороговых концентраций АДФ позволяет установить степень и фазу нарушений в тромбоцитарном звене гемостаза у больных с инфекционной патологией.

Использование изобретения дает возможность оценивать функциональную активность гранулярного аппарата кровяных пластинок по регистрации второй волны агрегации, обусловленной реакцией освобождения. Так, у больных иеросиниозами в периоде разгара заболевания двухфазные агрегационные кривые в 55-60% случаев регистрировались при концентрациях АДФ в пределах от 2·10^-7 до 2·10^-8М, в то время как у здоровых лиц вторая волна агрегации начинала выявляться лишь при концентрации АДФ 0,4·10^-6 М.

При применении различных концентраций АДФ от 2·10^-5 до 2·10^-7М было обнаружено, что у больных ВИЧ-инфекцией для получения второй волны агрегации (высвобождение АДФ из плотных гранул тромбоцитов) необходимы более высокие, по сравнению со здоровыми лицами, концентрации индуктора (2·10^-6М), что указывает на снижение порога чувствительных клеток к АДФ и истощение их гранулярного аппарата. Отсутствие этой волны - характерная черта ряда истинных тромбоцитопатий либо серьезного повреждения клеток в условиях эндотоксинемии (таблицы 2,4,5).

Таким образом, данное изобретение, основанное на использовании подпороговых концентраций АДФ, дает возможность диагностировать нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни. Использование набора пороговых и подпороговых концентраций АДФ выявляет характер и степень нарушений в клеточном звене гемостаза в зависимости от формы, тяжести течения и периода болезни, а также дает возможность определить интервал, при котором фиксируют двухволновую агрегатограмму, характеризующую состояние гранулярного аппарата кровяных пластинок.

Перечисленные факторы обосновывают применение лекарственных средств, коррегирующих функциональную активность кровяных пластинок.

Формула изобретения

Способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии, заключающийся в отборе крови у больного путем пункции локтевой вены, в смеси крови с раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, в получении обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрифугирования, в подготовке бестромбоцитарной плазмы для настройки агрегометра, в получении основной концентрации аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида и снятии агрегационной кривой, отличающийся тем, что исследуют агрегационную активность тромбоцитов под действием доз аденозиндифосфата в пределах от 10^-5 до 10^-8М, регистрируют двухволновую агретограмму, по которой оценивают нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на разных стадиях болезни.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7