Антитромботические негеморрагические композиции на основе гепарина, способ их получения и терапевтические применения

 

Изобретение относится к области медицины. Изобретение касается гепариновых составов, проявляющих антитромботическую активность и практически лишенных геморрагической активности. Составы согласно изобретению (S1, S2, S3) составлены из гепариновых фракций, таких, которые получают нейтрализацией гепарина протамином в пробирке. Изобретение касается также способа получения этих составов. Эти составы используют для получения лекарств с приемлемым носителем. При применении заявленных составов не возникают кровотечения при полном сохранении основных свойств. 3 с. и 18 з.п. ф-лы, 2 ил., 13 табл.

Изобретение относится к композициям на основе гепарина, а также способу их получения и их терапевтическим применениям.

В особенности оно касается составов на основе гепаринов, нейтрализованных протамином, проявляющих антитромботическую активность, но заметно лишенных геморрагической активности.

Гепарины известны и используются в течение многих десятилетий для получения медикаментов с антитромботической и/или противосвертывающей активностью, предназначенных в особенности для профилактики и лечения венозных и артериальных тромбозов, а также для предотвращения свертывания при экстракорпоральном кровообращении.

Вот уже несколько лет, как могут получать низкомолекулярные гепарины, которые всегда проявляют антитромботическую активность, но противосвертывающие свойства которых ослаблены.

Тем не менее, что касается нефракционированных гепаринов или низкомолекулярного гепарина, опасность кровотечения остается основным осложнением при лечении лекарствами на основе гепарина. В силу этого существуют значительные ограничения при использовании гепарина, который в особенности противопоказан больным, предрасположенным к кровотечениям, больным, страдающим дуоденальными или желудочными язвами, а также больным, недавно подвергавшимся хирургическому вмешательству, у которых антитромботическое лечение гепарином может повлечь за собой кровотечения.

Вследствие этого полезные свойства гепаринов, а именно их антитромботическая или противосвертывающая активность, не могут быть правильно использованы вследствие значительных побочных эффектов, связанных с постоянной опасностью возникновения кровотечения.

Когда в ходе лечения гепарином внезапно возникают кровотечения, прибегают к протаминсульфату, который производит нейтрализацию гепарина in vivo.

Хотя такое использование протамина известно уже в течение нескольких лет, механизм нейтрализации гепарина изучен недостаточно хорошо. Относительно недавнее исследование показало, что низкомолекулярные гепарины нейтрализуются в меньшей степени по сравнению с нефракционированными гепаринами ("Профили нейтрализации гепаринов, различающихся по происхождению и молекулярной массе, протамином в пробирке", SEMINARS IN TROMBOSIS AND IN HEMOSTASIS, vol. 15, N4, 1989).

Таким образом, проблемой, которую имеет целью решить настоящее изобретение, является значительное уменьшение опасности возникновения кровотечений, изложенной выше, ограничивающей терапевтическое применение гепаринов.

Более точно, целью изобретения является возможно большая ликвидация опасности возникновения кровотечений при лечении гепаринами при сохранении их основных свойств, в особенности антитромботической активности.

Также целью настоящего изобретения является создание гепариновых композиций, обладающих очень интересными фармакологическими свойствами, в особенности антитромботическими, в значительной степени эквивалентных гепариновым составам, использовавшимся до настоящего времени, но которые лишены основного недостатка, заключающегося в значительной опасности возникновения кровотечений.

Другой целью настоящего изобретения является также создание способа получения таких составов, который должен быть дешев и прост в применении, позволяющего, кроме того, расширить их терапевтические применения.

Равным образом изобретение имеет целью терапевтические применения этих составов.

Эти цели достигнуты при помощи гепариновых композиций согласно изобретению, которые обладают антитромботической активностью и практически лишены геморрагической активности. Эти композиции отличаются тем, что они составлены, по существу, из фракций гепарина, полученных нейтрализацией гепарина протамином in vitro.

Под фракцией гепарина, нейтрализованного протамином, подразумевают любую фракцию, полученную из природного или уже фракционированного гепарина, или синтетического гепарина, геморрагическая способность которого была нейтрализована воздействием протамина, или любого его аналога или эквивалента, обладающего аналогичной способностью уменьшать геморрагическую способность.

Композиции согласно изобретению преимущественно составлены из фракций гепарина, полученных нейтрализацией нефракционированного или низкомолекулярного гепарина протамином in vitro.

Согласно одному из вариантов реализации изобретения, композиция состоит из фракций гепарина, из которых 25% имеют молекулярную массу меньше 2,5 кД и 40% имеют молекулярную массу больше 20 кД.

Согласно другому варианту реализации изобретения композиция состоит только из фракций гепарина, имеющих молекулярную массу меньше 2,5 кД.

В других композициях фракции гепарина имеют спектр молекулярных масс, зависящий от используемых способов нейтрализации протамином.

Композиции согласно изобретению в значительной мере свободны от протамина.

Изобретение также относится к способу получения вышеупомянутых композиций, отличающемуся тем, что он содержит стадию нейтрализации гепарина протамином in vitro.

Заявители неожиданно обнаружили, что можно нейтрализовать геморрагическую активность гепарина, полностью сохранив его антитромботические свойства, in vitro особенно, при помощи протамина.

Точнее, способ согласно изобретению заключается в том, что гепарин в растворе вводят в реакцию с протамином, особенно в форме соли протамина, в соответствии с изменяющимися величинами отношений гепарин/протамин.

Согласно предпочтительному способу реализации изобретения раствор гепарина смешивают с раствором соли протамина, предпочтительно при комнатной температуре, центрифугируют полученную смесь и извлекают отстой.

Согласно изобретению под раствором гепарина подразумевают раствор натурального или уже фракционированного гепарина или синтетического гепарина.

Соль протамина предпочтительно состоит из протаминсульфата.

Согласно изобретению можно использовать любой аналог или эквивалент протамина, обладающий аналогичной способностью к нейтрализации гепарина и, следовательно, к уменьшению его геморрагической способности.

Отстой впоследствии может быть лиофилизован.

Обрабатываемый гепарин и протамин могут быть использованы в различных соотношениях, которые приводят, по существу, к устранению опасности возникновения кровотечений, связанной с гепаринами.

Способ содержит стадию нейтрализации гепарина протамином или его эквивалентом предпочтительно в соотношении гепарин/протамин от 2/1 до 1/2.

Согласно одному из вариантов реализации этого способа отношение гепарин/протамин есть величина порядка 1/1. В этом случае получают гепариновые композиции, содержащие фракции, по меньшей мере 25% которых имеют молекулярную массу меньше 2,5 кД и по меньшей мере 40% имеют молекулярную массу больше 20 кД.

Согласно другому варианту реализации изобретения отношение гепарин/протамин есть величина порядка 1/2. Тогда получают гепариновые композиции, содержащие, по существу, фракции с молекулярной массой меньше 2,5 кД.

Способом, соответствующим настоящему изобретению, получают гепариновые композиции, не содержащие протамин.

Фармакологическое исследование гепариновых композиций согласно изобретению неожиданно показало, что они практически лишены геморрагической активности и наряду с этим сохраняют их антитромботические свойства.

Это фармакологическое исследование также неожиданно показало, что гепариновые фракции, полученные нейтрализацией протамином согласно изобретению, проявляют антитромботическую активность, которая растет при введении возрастающих доз без параллельного увеличения их геморрагической или противосвертывающей активности. Экспериментальные данные показали, что композиции согласно изобретению способны ингибировать гидролитическую активность лейкоцитарной эластазы человека более эффективно, чем нефракционированный гепарин. Ликвидация опасности возникновения кровотечений позволяет рассматривать введение лекарства парентеральным путем или в виде аэрозоля бронхолегочным путем при лечении некоторых бронхолегочных заболеваний, которые могут быть связаны с избытком лейкоцитарной эластазы, таких как синдромы острых респираторных заболеваний, муковисцидоз, хронические закупоривающие бронхопневмопатии.

Стабильные и нетоксичные гепариновые композиции согласно изобретению могут быть использованы для получения медикаментов, предназначенных для различного терапевтического применения. Эти применения аналогичны применению гепарина и его классических производных, включая случаи, когда гепарин противопоказан по причине опасности возникновения кровотечения, которую представляет больной. Они могут служить особенно для получения лекарств для лечения и профилактики венозных или артериальных тромбозов или для предотвращения свертывания крови при экстракорпоральном кровообращении.

Таким образом, изобретение в равной мере относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество гепариновой композиции согласно изобретению, в комбинации с фармацевтически приемлемой основой для приготовления лекарства.

Речь может идти, например, об антитромботических фармацевтических композициях или о фармацевтических композициях для подавления гидролитической активности лейкоцитарной эластазы человека.

Гепариновые фракции этих композиций могут быть переведены в форму фармацевтически приемлемой соли в соответствии с классическими способами.

Фармацевтические композиции согласно изобретению предпочтительно представляют собой пригодные для инъекции препараты, предназначенные, в особенности, для введения парентеральным путем.

Для других применений, таких как подавление лейкоцитарной эластазы, предусмотрены препараты, приспособленные для введения бронхолегочным путем.

Другие характеристики и преимущества композиций согласно изобретению проиллюстрированы примерами, приведенными ниже для сведения и не ограничивающими объем изобретения, со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых представлены: фиг. 1 - сравнительные кривые зависимости геморрагической активности нефракционированного гепарина, низкомолекулярного гепарина и негеморрагических гепариновых композиций согласно изобретению (S1, S2, S3); фиг. 2 - сравнительные кривые зависимости антитромботической активности нефракционированного гепарина, низкомолекулярного гепарина и гепариновых композиций согласно изобретению (S1, S2, S3).

ПРИМЕРЫ Используемые продукты: стандартный гепарин (Лео), протаминсульфат (Шоаи) и низкомолекулярный гепарин "Enoxaparine" под торговым названием "Lovenox" (Фармука).

Пример 1. Приготовление отстоя S1 Готовят 14,4 мл раствора стандартного гепарина с титром 72000 международных единиц (480 мг) и 48 мл раствора протаминсульфата с титром 48000 UAH. Эти растворы смешивают при комнатной температуре. В таком случае отношение гепарин/протамин равно 1/1, то есть 1 мг гепарина нейтрализуют 1 мг протаминсульфата. Полученную таким образом смесь центрифугируют в течение 10 минут и извлекают отстой, который подвергают лиофилизации.

Пример 2. Приготовление отстоя S2 Действуют, как описано в примере 1, начиная с 9 мл раствора стандартного гепарина (а именно 45000 международных единиц, 300 мг) и 60 мл протаминсульфата (а именно 60000 UAH). В таком случае отношение гепарин/протамин равно 1/2, то есть 1 мг гепарина нейтрализуют 2 мг протаминсульфата.

Пример 3. Приготовление отстоя S3 Действуют, как описано в примере 1, начиная с 4 мл раствора низкомолекулярного гепарина, "Enoxaparine" (Lovenox) (а именно 400 мг) и 40 мл протаминсульфата (а именно 40000 UAH). В таком случае отношение гепарин/протамин равно 1/1, то есть 1 мг низкомолекулярного гепарина нейтрализуют 1 мг протаминсульфата.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ Молекулярно-массовое распределение (см.табл.1, табл. 2).

Спектр поглощения в ультрафиолетовой области для отстоя 1 (пример 1) Раствор, разбавленный в соотношении 1/20, имеет два максимума поглощения при следующих длинах волн: 212 нм : ОП = 3,47 и 271,5 нм : ОП = 2,22.

Титрование отстоя S1 (пример 1) Перед лиофилизацией отстоя S1, полученного согласно примеру 1, каждая колба содержит 0,7 мл раствора отстоя. Чтобы проверить воспроизводимость проводят 12 идентичных количественных определений: результаты представлены в таблице 3.

Количественное определение протеинов Количественное определение протеинов в отстоях S1 и S2, соответственно полученных согласно примерам 1 и 2, осуществляют согласно методу Пьерса (Коффре реактиф Лаборатуар Пьерс).

Результаты представлены в таблице 4.

Электролитный состав (ммэкв/л) Электролитный состав отстоев S1 и S2 дан в таблице 5.

Определение pH (см. табл. 6).

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
А. Экспериментальные исследования на крысах в модели венозного тромбоза, индуцированного стазом, и модели провоцированного кровотечения
Исследования проводят согласно методу, описанному C.Doutremepuich и др. "Лечение экспериментальных венозных тромбозов у крыс гепарином и низкомолекулярной гепариновой фракцией", Haemostasis, 13, 109-112 (1983).

а. Лечебная модель (подкожные инъекции через два часа после индуцирования тромбоза).

Проводят два исследования в соответствии со следующим протоколом:
ТО: лигатура полой вены
ТО+2Н: подкожная инъекция растворов
ТО+5Н3О: индуцирование кровотечения
ТО+6Н: отбор проб (кровь и сгустки)
Данные, полученные в результате первого исследования собраны в таблицах 7 и 8.

Это первое исследование показывает, что гепарин, нейтрализованный in vitro протамином в отношении гепарин/протамин, равном 1/1, приводящем к отстою S1, при дозе 2 мг проявляет достаточно заметную антитромботическую активность, которая сравнима с антитромботической активностью не нейтрализованного гепарина и антитромботической активностью гепарина Lovenox (низкомолекулярный гепарин), тогда как противосвертывающая активность и геморрагическая активность только немного увеличены.

Отстой S1 не оказывает какого-либо воздействия на кровяные клетки.

В то же время отстой S2, полученный нейтрализацией при соотношении гепарин/протамин, равном 1/2, не проявляет никакой геморрагической активности, но обладает уменьшенной антитромботической активностью.

Результаты второго исследования представлены в таблице 9.

Из полученных результатов следует, что антитромботическая активность фракций S1, S2 и S3 согласно изобретению возрастает с увеличением вводимых доз.

Если обратиться к зависимостям доза-эффект, установленным для доз в интервале от 2 мг/кг до 10 мг/кг, из фиг. 1 видно, что каков бы ни был тип гепарина, обработанного согласно изобретению, полученная гепариновая фракция обладает геморрагической активностью, подобной геморрагической активности контрольной группы, даже при самых больших дозах. Нефракционированный гепарин и низкомолекулярный гепарин (Lovenox), не нейтрализованные протамином согласно изобретению, проявляют высокую геморрагическую активность по сравнению с гепариновыми фракциями согласно изобретению.

Фиг. 2 показывает, что гепариновые фракции, полученные согласно изобретению, показывают интересную антитромботическую активность. В случае фракции S1 (отношение гепарин/протамин равно 1/1) эта активность сравнима с активностью гепаринов, не нейтрализованных в соответствии с изобретением.

б. Профилактическая модель (подкожное введение за один час до индуцирования тромбоза)
Исследование проводят с отстоем S1 (пример 1) в соответствии со следующим протоколом:
ТО: подкожная инъекция растворов
ТО + 1 час: индуцирование стаза
ТО + 24 часа: отбор проб (кровь и сгустки)
Полученные результаты представлены в таблице 10.

Полученные результаты показывают, что в качестве профилактического средства, через 24 часа после индуцирования тромбоза S1 проявляет антитромботическую активность, сравнимую с антитромботической активностью гепарина и Lovenox.

Б. Экспериментальное исследование на крысах в модели тромбоза, индуцированного генерацией свободных радикалов
(ссылка: Doutremepuich - в печати - Annales de Cardiologi et Angiologie)
Исследование проводят с S1 (пример 1) в соответствии со следующим протоколом:
(ТО подкожная инъекция растворов)
ТО + 25 мин: инъекция бенгальской розы при дозе 5 мг/кг
ТО + 30 мин: индуцирование свободных радикалов на уровне первой артериолы при помощи фотохимической реакции
ТО + 55 мин: инъекция бенгальской розы при той же дозе
ТО + 60 мин: индуцирование свободных радикалов на уровне второй артериолы
ТО + 85 мин: инъекция бенгальской розы при той же дозе
ТО + 90 мин: индуцирование свободных радикалов на уровне маленькой вены.

После последнего тромбоза производят отбор проб крови внутрисердечным путем.

Время возбуждения установлено 2 минуты, а время наблюдения - 10 минут.

Получены результаты, представленные в таблице 11.

В этой модели тромбоза, индуцированного свободными радикалами, отстой S1 (пример 1) проявляет антитромботическую активность, значительную по отношению к группе плацебо (индифферентных веществ), которая продолжается после 90 минут (ТО + 90 мин). Эта активность значительно больше, чем активность гепарина, введенного в той же дозе, спустя 30 и 60 минут (ТО + 30 и ТО + 60 мин).

В. Экспериментальное исследование на крысах в модели тромбоза, индуцированного лазерным нарушением эндотелия (ссылка: Vesvres, Haemostasis 1993, 23, 8-12)
а) Исследование 1
Исследование проводят согласно следующему протоколу:
ТО: подкожная инъекция тестируемого вещества при дозе 2 мг/кг
ТО + 35 мин: индуцирование артериального тромбоза под действием лазерного луча.

Время наблюдения установлено 10 минут. Полученные результаты представлены в таблице 12.

S1 проявляет антитромботическую активность, сравнимую с активностью не нейтрализованного гепарина, введенного в той же дозе, и уменьшает число эмболов, а также время эмболизации статистически значительным образом.

б) Исследование 2
Исследование проводят согласно следующему протоколу:
ТО подкожная инъекция тестируемых веществ при дозе 2 мг/кг.

ТО + 1 час: индуцирование первого артериального тромбоза
ТО + 3 час: индуцирование второго артериального тромбоза
ТО + 6 час: индуцирование третьего артериального тромбоза.

Время наблюдения установлено 10 минут.

Полученные результаты представлены в таблице 13.

S1 проявляет антитромботическую активность, сравнимую с активностью гепарина, не нейтрализованного протамином.

В заключение, исследования, описанные выше, показывают, что антитромботическая активность наблюдается в трех экспериментальных моделях тромбоза, а именно, модели венозного тромбоза, индуцированного стазом, модели артериального тромбоза, индуцированного свободными радикалами, и модели артериального тромбоза, индуцированного лазерным нарушением эндотелия.

Согласно изобретению гепариновая фракция, полученная на основе низкомолекулярного гепарина "Enoxaparine" (Lovenox), проявляет антитромботическую активность, значительно большую, чем антитромботическая активность того же низкомолекулярного гепарина, не обработанного in vitro протамином, а также значительно большую, чем антитромботическая активность фракций, полученных на основе нефракционированных и не обработанных in vitro протамином гепаринов, не представляя более никакой опасности возникновения кровотечения.

Способ согласно изобретению позволяет просто и дешево практически ликвидировать геморрагическую активность гепаринов, полностью сохраняя их антитромботическую активность.

Формула изобретения

1. Композиция гепарина, имеющая антитромботическую активность и практически лишенная геморрагической активности, отличающаяся тем, что включает фракции гепарина, содержащиеся в супернатанте, полученном центрифугированием смеси нейтрализации in vitro раствора гепарина раствором протамина.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она содержит фракции гепарина, содержащиеся в супернатанте, полученном центрифугированием смеси нейтрализации in vitro раствора нефракционного гепарина раствором протамина.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она содержит фракции гепарина, содержащиеся в супернатанте, полученном центрифугированием смеси нейтрализации in vitro раствора низкомолекулярного гепарина раствором протамина.

4. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что состоит из фракций, по меньшей мере, 25% которых имеют молекулярную массу меньше 2,5 кД.

5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что состоит из фракций, по меньшей мере, 40% которых имеют молекулярную массу больше 20 кД.

6. Композиция по любому из пп.1 - 4, отличающаяся тем, что состоит из фракций с молекулярной массой меньше 2,5 кД.

7. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что состоит из фракции, имеющей следующее молекулярно-массовое распределение, выраженное в %: фракции с молекулярной массой > 20 кД в УФ-области 43,3, в ИК-области 47,3; фракции с молекулярной массой 16 - 20 кД в УФ-области 2,7, в ИК-области 4,45; фракции с молекулярной массой 12 - 16 кД в УФ-области 4,5, в ИК-области 7,65; фракции с молекулярной массой 8 - 12 кД в УФ-области 9,7, в ИК-области 13,85; фракции с молекулярной массой 5 - 8 кД в УФ-области 8,13, в ИК-области 11,8; фракции с молекулярной массой 2,5 - 5 кД в УФ-области 6,36, в ИК-области 10,3; фракции с молекулярной массой < 2,5 кД в УФ-области 25,16, в ИК-области 4,65.

8. Композиция по любому из пп.1 - 7, отличающаяся тем, что она практически не содержит протамин.

9. Композиция по любому из пп.1 - 8, отличающаяся тем, что она проявляет ингибирующие свойства по отношению к гидролитической активности лейкоцитарной эластазы человека.

10. Способ получения композиции по любому из предшествующих пунктов, включающий смешивание раствора гепарина и раствора соли протамина для нейтрализации гепарина in vitro и последующего центрифугирования полученной смеси, отличающаяся тем, что после центрифугирования осуществляют извлечение супернатанта.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что соль протамина представляет собой протаминсульфат.

12. Способ по любому из пп.10 и 11, отличающийся тем, что гепарин и протамин используют в соотношении 1 : 1.

13. Способ по любому из пп.10 и 11, отличающийся тем, что гепарин и протамин используют в соотношении 1 : 2.

14. Способ по любому из пп.10 - 13, отличающийся тем, что используют нефракционированный гепарин.

15. Способ по любому из пп.10 - 13, отличающийся тем, что используют низкомолекулярный гепарин.

16. Композиция по любому из пп.1 - 9, отличающаяся тем, что ее используют для получения лекарства, проявляющего антитромботическую активность и практически лишенного геморрагической активности.

17. Антитромботическая фармацевтическая композиция, практически лишенная геморрагической активности, отличающаяся тем, что она содержит эффективное количество композиции по любому из пп.1 - 9 в комбинации с фармацевтически приемлемой основой для приготовления лекарств.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что она находится в форме раствора, пригодного для инъекций.

19. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что ее используют для ингибирования гидролитической активности лейкоцитарной эластазы человека.

20. Фармацевтическая композиция по п.19, отличающаяся тем, что она находится в форме, пригодной для введения бронхолегочным путем.

21. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что включает в качестве активного ингредиента фракции гепарина, содержащиеся в супернатанте, полученном центрифугированием смеси нейтрализации in vitro раствора гепарина раствором протамина при соотношении гепарина к протамину 1 : 1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15