Смесь бактериоцинов, штамм streptococcus thermophilus - продуцент бактериоцинов и способ их получения

 

Изобретение относится к микробиологии. Получена смесь бактериоцинов из штамма-продуцента Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351 с аминокислотными последовательностями SEQ ID N 1 и SEQ ID N 2. Бактериоцины получены культивированием штамма-продуцента в среде и условиях, благоприятных для его роста, и до содержания микроорганизмов в среде 10⁷ - 10⁹ м.к./мл с последующим центрифугированием культуры, приготовлением экстракта супернатанта, содержащего целевой продукт. Бактериоцины используют для приготовления пищевых продуктов или косметической продукции. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 7 табл.

Описание Предметом данного изобретения являются два бактериоцина из Streptococcus (S. ) thermophilus, штамм S. thermophilus, который продуцирует эти бактериоцины, способ получения этих бактериоцинов из этого штамма, а также использование этих бактериоцинов и/или этого штамма для изготовления пищевых продуктов или косметической продукции.

Исходный уровень исследований Бактериоцин - это антибактериальное вещество или соединение, которое активно против бактерий, состоящее из белковой части, которая участвует в антибактериальном или антибиотическом действии. Бактериоцин обычно обладает узким спектром активности или подавления, часто ограниченным видами, близкими к видам бактерий, которые их продуцируют.

В настоящее время известно четыре бактериоцина S. thermophilus.

Первый, в частности, имеет молекулярный вес, равный от 10 до 20 кD, обнаруживает термолабильность при 90^oC и чувствительность к пепсину (Smaczny et al., Deutsche Molkerei - Zeitung, 105: 15, 460-465, 1984).

Второй, который описывается в основном по его спектру подавления бактерий в ЕР 443543, обладает способностью подавлять главным образом рост бактерий родов Staphylococcus и Pseudomonas и не способен подавлять рост бактерий родов Lactococcus и Enterococcus и видов Bacillus cercus.

Третий, который описан Pulusani et al. (J. of Food Science, 44: 2, 575-578, 1979), сильно подавляет Pseudomonas, не чувствителен к пепсину и содержит остатки сахаров.

И наконец, четвертый, описанный Gilano et al. (Microbiologie-Aliment-Nutrition, 8, 21-30, 1990), не чувствителен к пепсину, содержит остатки сахаров и не проходит через мембрану с пористостью, равной 100 кD.

В настоящее время S. thermophilus имеет большое значение для пищевого сектора, причем применяется в основном для приготовления молочных продуктов, таких как йогурты, например, и некоторые сыры. Кроме того, существует очень немного бактериоцинов, которые активны одновременно против Bacillus, Clostridium и Listeria. Поэтому может представлять значительную пользу, другими словами, существует потребность в расширении ряда бактериоцинов, продуцируемых представителями этого вида, чтобы, в частности, получить более широкий спектр антибактериальной активности, конкретно, в случае этого типа продукта.

Цель данного изобретения состоит в ответе на эту потребность.

Краткое изложение изобретения Одной из целей данного изобретения является определение аминокислотной последовательности двух новых бактериоцинов S. thermophilus, а также их сигнального пептида, который обеспечивает их секрецию.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти два бактериоцина, также являются еще одним объектом этого изобретения.

И также другой целью этого изобретения являются штаммы Streptococcus thermophilus, продуцирующие по крайней мере один из бактериоцинов по этому изобретению, особенно штамм CNCM 1-1351 S. thermophilus, описанный ниже, который способен продуцировать бактериоцины по этому изобретению.

Способ получения экстракта по крайней мере одного бактериоцина по этому изобретению также является еще одним объектом этого изобретения.

И наконец, последним объектом данного изобретения является использование бактериоцинов по данному изобретению и использование их нуклеотидной последовательности, а также их сигнальной последовательности.

Детальное описание изобретения Штамм CNCM 1-1351 S. thermophilus был выделен из ферментированного молочного продукта из Чехословакии, и наблюдалось, к удивлению, что он обладает замечательным свойством подавления роста широкого круга бактерий. Этот штамм был помещен на хранение 05.08.93 г., по Будапештскому договору, в Национальную коллекцию культур микроорганизмов Института Пастера, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724, PARIS CEDEX 15, Франция, где он был соответственно обозначен 1-1351.

Особенности этого штамма, относящиеся, в частности, к его морфологии, ферментации сахаров и тому подобному, даны ниже: Морфология: - Нежгутиковые образующие цепочку кокки. Не образуют споры.

- Грам-положительные микроорганизмы, каталазоотрицательные и факультативные анаэробы.

Ферментация сахаров: Образование молочной кислоты из D-глюкозы, лактозы, сахарозы, раффинозы. Отсутствие образования молочной кислоты из маннозы, фруктозы, галактозы.

Другие: Штамм, продуцирующий по крайней мере два бактериоцина, один белок, отвечающий за невосприимчивость к бактериоцинам, и экзополисахариды, обладающие структирующими свойствами.

Супернатант культуры штамма CNCM 1-1351 поэтому обладает относительно широким спектром антибактериальной активности. Среди бактерий, чувствительных к этому супернатанту, могут содержаться Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus Lactis biovar diacetylactis, Lactococcus cremoris, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Leuconostoc cremoris Leuconostoc mesenteroised, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Propionibacterium, Listeria innicua, Listeria momocytogenes, Micrococcus varians и споры и вегетативные клетки Clostridium botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium bifermentans, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus и Bacillus cereus, например (Bacteries lactiques, vol. I, 1994, Lorica edition).

Затем стало возможно выделить из этого штамма CNCM 1-1351 два белковых фактора, называемых бактериоцинами, которые ответственны за эту антибактериальную активность.

Что касается последнего результата, то первый бактериоцин по этому изобретению, который называется в этом описании "термофиллин I", имеет последовательность ПОСЛ ИД N : 1, описанную в перечислении последовательностей ниже.

Кроме того, можно представить себе, что этот бактериоцин может обладать антибактериальной активностью, имеющей более широкий или более специфичный спектр для одного рода или одного вида бактерий, чем тот, который проявляет термофиллин I, когда последний имеет последовательность, отличающуюся от ПОСЛ ИД N : 1 заменой, делецией и/или вставкой по крайней мере одной аминокислоты, например. Конечно, уже известно из ЕР 521240, что низин Z обладает более благоприятным спектром активности, чем низин A, тогда как он отличается от низина A только заменой одной аминокислоты.

Вот почему все бактериоцины, имеющие замену, делецию и/или вставку по крайней мере одной аминокислоты в их первоначальной последовательности ПОСЛ ИД N : 1, могут считаться бактериоцинами по данному изобретению.

Второй бактериоцин по этому изобретению, названный в этом описании "термофиллином 2", имеет последовательность ПОСЛ ИД N: 2, описанную в перечислении последовательностей ниже. Также возможно представить себе, что этот бактериоцин может обладать антибактериальной активностью, если он имеет последовательность, которая отличается от последовательности ПОСЛ ИД N: 2 заменой, делецией и/или вставкой по крайней мере одной аминокислоты, например. Что касается последнего, то все бактериоцины, имеющие по крайней мере одну из модификаций, описанных выше, в их первоначальной последовательности ПОСЛ ИД N: 2, могут считаться бактериоцинами по данному изобретению.

Кроме того, еще одним объектом данного изобретения являются нуклеотидные последовательности, кодирующие термофиллин 1 и термофиллин 2, так как каждая из них может использоваться для придания, путем трансформации, бактериям, дрожжам или растениям, например, способности подавлять некоторые бактерии. Эти нуклеотидные последовательности могут, таким образом, быть относительно вариабельными по вырожденности генетического кода и могут, в частности, включаться в оперон CNCM 1-1351 штамма, имеющий нуклеотидную последовательность ПОСЛ ИД N: 3, описанную в перечислении последовательностей ниже.

В частности, возможно использовать нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотиды с 221 по 475 из последовательности ПОСЛ ИД N: 3, которая кодирует термофиллин 1 с его сигнальным пептидом. Однако большие преимущества дает использование только последовательности, кодирующей сигнальный пептид, от нуклеотида 221 по 288 из последовательности ПОСЛ ИД N: 3, с тем, чтобы связать ее с интересующим геном так, чтобы обеспечить секрецию белка, кодируемого этим интересующим геном, штаммом Streptociccus thermophilus.

Подобным же образом большие преимущества дает использование только последовательности, кодирующей секретируемый термофиллин 1, с нуклеотида 289 по 475 последовательности ПОСЛ ИД N: 3, чтобы стало возможным ее слияние с сигнальной последовательностью в плазмиде экспрессии, например, с тем, чтобы экспрессировать ее в другом микроорганизме, а не в S. thermophilus.

Подобным же образом может использоваться нуклеиновая последовательность, содержащая нуклеотиды с 495 по 686 последовательности ПОСЛ ИД N: 3, которая кодирует термофиллин 2, с ее сигнальным пептидом. Однако большие преимущества дает использование только одной последовательности, кодирующей сигнальный пептид, от нуклеотида 495 по 557 последовательности ПОСЛ ИД N: 3, так, чтобы обеспечить секрецию штаммом Streptococcus thermophilus какого-либо белка, слитого с этим пептидом.

Также большие преимущества дает использование только последовательности, кодирующей секретируемый термофиллин 2, с нуклеотида 558 по 686 последовательности ПОСЛ ИД N: 3, так, чтобы было возможно слить ее с сигнальной последовательностью в плазмиде экспрессии, например, чтобы экспрессировать ее в другом микроорганизме, а не в S. thermophilus.

И наконец, так как наблюдалось, что некоторые другие штаммы S. thermophilus, помимо CNCM 1-1351, демонстрируют спектр подавления, сходный со спектром, проявляемым штаммом CNCM 1-1351, и устойчивость к последнему (особенно штаммы Sfi 12 и 25, описанные ниже), очень вероятно, что эти штаммы могут продуцировать по крайней мере один из бактериоцинов данного изобретения и в то же самое время белок невосприимчивости, придающий эту устойчивость. В соответствии с последним все штаммы, способные продуцировать по крайней мере один из бактериоцинов, описанных выше, включаются в данное изобретение.

В способе получения экстракта, содержащего по крайней мере один бактериоцин по данному изобретению, штамм S. thermophilus, который продуцирует по крайней мере один из указанных бактериоцинов, культивируется в среде и при условиях, благоприятных для роста S. thermophilus до тех пор, пока среда не будет содержать 10⁷-10⁹ микроорганизмов штамма на мл, полученную культуру центрифугируют и затем получают экстракт супернатанта, содержащего по крайней мере один из указанных бактериоцинов.

Для получения этого экстракта штамм S. thermophilus, продуцирующий по крайней мере один из указанных бактериоцинов по данному изобретению, особенно штамм CNCM 1-1351 S. thermophilus, может поэтому культивироваться в среде и при условиях, благоприятных для роста S. thermophilus.

Он может культивироваться особенно в среде MSK (снятое коровье молоко с добавлением дрожжевого экстракта) или в среде HJ (ультрафильтрат коровьевого молока, дополненный дрожжевым экстрактом и соитоном), например. Он, предпочтительно, культивируется в среде, которая является селективной для Streptococcus, такой как среда М 17, описанная Р.Е. Terzaghi et aL, J. Appl. Microbiol., 29, 807-813 (1975), дополненная 0,5-2% сахара, который может ферментироваться S. thermophilus, особенно сахарозой, лактозой или глюкозой, например.

Такая среда может быть приготовлена путем смешивания 95 мл основной среды и 5 мл раствора, содержащего 10 г ферментируемого сахара на 100 мл воды, причем раствор ферментируемого сахара и основная среда стерилизовались отдельно при 121^oC в течение 15 мин, а основную среду готовили путем растворения следующих компонентов в 950 мл кипящей воды: трипсиновый гидролизат казеина - 2,5 г
пепсиновый гидролизат мяса - 2,5 г
папаиновый гидролизат соевых бобов - 5,0 г
дрожжевой экстракт - 2,5 г
мясной экстракт - 5,0 г
бета-глицерофосфат - 19 г
сульфат Mg - 0,25 г
аскорбиновая кислота - 0,5 г
Указанный штамм может культивироваться в указанной благоприятной для роста S. thermophilus среде при 37-48^oC в течение, например, 2-8 часов, до тех пор пока среда не будет содержать примерно 10⁷-10⁹ микроорганизмов штамма на мл, причем значение около 10⁸ микроорганизмов/мл соответствует, с одной стороны, оптической плотности среды, измеренной при 600 нм (OD₆₀₀), равной примерно 3,6, и с другой стороны, концентрации, достигаемой в коровьем молоке в точке, в которой оно коагулирует под воздействием подкисления, продуцируемого культивируемым штаммом.

Для получения неочищенного экстракта указанного супернатанта можно использовать любой подходящий метод преципитации, такой как преципитация с помощью трихлоруксусной кислоты, "высаливание" или осаждение растворителем, например.

Предпочтительно, чтобы для получения этого неочищенного экстракта pH супернатанта доводилась до 1,0-2,0 с помощью H₃PO₄, преципитат отделялся, и проводили одно или более последовательных осаждений с помощью трихлоруксусной кислоты, причем после каждого следовало ресуспендирование в водной суспензии с трихлоруксусной кислотой.

Использование бактериоцинов и/или штамма Streptococcus thermophilus, который продуцирует эти бактериоцины, по данному изобретению предусматривается при приготовлении пищевых продуктов или косметической продукции.

Культура указанного штамма может, в частности, использоваться в качестве стартера при приготовлении сыров, особенно сыров типа моззарелла (чтобы избежать образования полостей, образуемых Bacillus polymixa, споры которой переживают ферментацию), типа швейцарского (такого, как груйер или эмментальский, для борьбы с загрязнением Clostridium tyrobutiricum), типа вачерен (для борьбы с загрязнением Listeris monocytogenes) и типа "сэрэ" (фразцузское название мягкого или сливочного сыра), или при приготовлении кисломолочных продуктов, особенно йогурта или порошкового молока для рецептур для младенцев, например.

В частности, указанный штамм Streptococcus thermophilus может культивироваться в молоке в комбинации со штаммом Lactobacillus bulgaricus, который умеренно чувствителен к термофиллину (например, штамм YL 5, описанный ниже), чтобы исключить после подкисление йогурта, вызываемое L. bulgaricus.

Указанные бактериоцины, особенно в форме неочищенного или очищенного экстракта, или указанный штамм могут также использоваться в качестве консервирующего или активного средства против патогенных бактерий, особенно при приготовлении мясных продуктов, таких как муссы, в качестве активного вещества против роста спор клостридий, особенно Clostridium botulinum или при приготовлении кремов или лосьонов в качестве активного вещества против патогенных бактерий кожи, или же при приготовлении гигиенических продуктов и лечебных средств для ротовой полости в качестве активного вещества против патогенных бактерий ротовой полости, особенно против Streptococcus sobrinus, например.

Бактериоцины по данному изобретению охарактеризованы более детально ниже с помощью различных микробиологических, биохимических и генетических данных, иллюстрирующих их свойства. Проценты даны по весу.

Единица антибактериальной активности - "Agar Well-Test".

В рамках данного описания антибактериальная активность определяется на основе условных единиц.

Одна условная единица (уе) определяется как величина, обратная степени наивысшего разделения, при котором образец еще проявляет антибактериальную активность в испытании, известном лицам - специалистам в данной области под названием "agar well test", английское выражение, которое буквально означает испытание с использованием лунок, вырезанных в агаре.

Стандартный образец супернатанта культуры S. thermophilus по данному изобретению, полученный в стандартных условиях, показанных в примере 1, обычно проявляет активность, равную 32 ye в объеме 60 мкл. Это, таким образом, означает активность, равную 460 уе/мл.

Стандартный неочищенный экстракт бактериоцина, полученного из супернатанта культуры, показанной в примере 1, путем просветления с последующими двумя последовательными осаждениями с помощью трихлоруксусной кислоты и с ресуспендированием после каждого в водной суспензии с трифторуксусной кислотой, обычно имеет активность, равную примерно 1,4 х 10⁵ уе/мл.

С помощью указанного определения на агаре с вырезанными ячейками устанавливается, обладает ли все еще образец антибактериальной активностью при данной степени разведения.

Чтобы сделать это, в чашку Петри наливали 35 мл среды М 17 и к ней добавляли 1% сахарозы и 1,5% агара.

5 мл среды М 17, к которой добавлены 1% сахарозы и 0,75% агара, засеваются 5 мкл культуры, полученной в течение предыдущей ночи, штамма S. thermophilus, который по типу чувствителен к данному бактериоцину (типичный индикатор), в данном случае, например, штамм Sfi 3.

5 мл выливали поверх 35 мл и оставляли высыхать в течение 15 мин в ламинарном потоке. В среде с культурой вырезаются лунки диаметром 5 мм.

Испытуемые образцы наливают в лунки в количестве 70 мкл на лунку. Инкубация проводится в течение 6 час в анаэробных условиях при 42^oC. Во время этой инкубации типичный индикаторный штамм подращивался, и становились видны зоны подавления роста. Степень разделения, при которой образец больше не проявляет антибактериальной активности - это степень разведения, при которой зона подавления больше не различается.

Инактивация ферментами
С помощью указанного определения на агаре с вырезанными лунками на агаре, засеянном указанным индикаторным типичным штаммом, как описано выше, определено, инактивируются ли данные бактериоцины или нет различными ферментами.

При всех использованных ферментах, за исключением липазы, от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл фермента добавляется к указанному стандартному неочищенному экстракту, разведенному в 33х буфером, рекомендованным поставщиком фермента, так чтобы получить образцы с 300 ye в 70 мкл. Затем ферменту позволяют действовать в течение 30 мин при температуре, рекомендованной поставщиком перед помещением всего объема в лунку в агаре для испытания.

С другой стороны, для коммерческой липазы сначала к 100 мкл раствора, содержащего 200 мкг/мл липазы, добавляется 1 мкл смеси ингибиторов (1,25 М ЭДТУ; 0,25% пепстатина A (p4265 Sigma); 0,25% Е-64 (E3132 Sigma); 0,25% апротинина (A1153 Sigma), и ингибиторам позволяют действовать в течение 45 мин при комнатной температуре, затем добавляют 5 мкл (450 ye) разведенного стандартного неочищенного экстракта и позволяют реагировать в течение 30 мин при 37^oC, затем 70 мкл смеси помещали в лунку в агаре для испытания. Использованные для разведений буферы были следующими.

- pH 2,0: 100 мМ малеиновая кислота, доведенная NaOH,
- pH 7,0: 100 мМ фосфатный буфер (К₂HPO₄/KH₂PO₄),
- pH 7,5: 100 мМ фосфатный буфер (К₂HPO₄/KH₂PO₄),
- pH 7,75: 100 мМ Трис-HCl.

Диаметр зоны подавления сравнивается с контрольным диаметром зоны, полученной без добавления фермента, который для каждого буфера и для каждой температуры инкубации составляет примерно 14 мм.

В таблице I представлены результаты, полученные с испытуемыми ферментами. В этой таблице фермент обозначен по его типу, названию поставщика и к тому же номером поставщика. Инактивация бактериоцина показана как функция концентрации добавленного фермента. Цифра 0 обозначает, что больше не существует какой-либо зоны, или другими словами, что антибактериальная активность данного бактериоцина нарушена инкубацией с ферментом. Цифра 14 показывает, что все еще существует зона, равная 14 мм, соответствующая полной антибактериальной активности данного бактериоцина.

Все протеазы угнетают антибактериальную активность супернатанта, что указывает на то, что в этой активности задействована белковая часть.

Тот факт, что не наблюдается никакого влияния каталазы на антибактериальную активность бактериоцинов, также показывает, что угнетение роста типичного индикаторного штамма не связано с антибактериальной активностью H₂O₂, которая, как известно, обладает подобной активностью, как и бактериоцины, так как H₂O₂ разрушалась бы каталазой.

Подобно этому, тот факт, что не наблюдается устранения антибактериальной активности альфа-амилазой, демонстрирует отсутствие гидролизуемых альфа-амилазой сахаров, участвующих в этой антибактериальной активности.

Кроме того, тот факт, что липаза не обладает влиянием на интибактериальную активность, также показывает отсутствие липидной фракции, участвующей в этой активности.

Спектр подавления
С помощью определения на агаре с лунками, с агаром, засеянным разными штаммами спор или бактерий, определяют, обладает ли ингибирующей активностью на рост этих различных бактерий супернатант культуры CNCM 1-1351 штамма, продуцирующего два бактериоцина по этому изобретению, другими словами, определяется спектр подавления для этого супернатанта.

Чтобы сделать это, подавляющее действие на рост испытуемого штамма, производимое образцом супернатанта, проявляющего активность, равную 300 ye при pH 7,0, наблюдают по отношению к этому действию, которое в норме равно нулю, того же самого образца, предварительно дезактивированного инкубацией при 37^oC в течение 30 минут в присутствии 5 мкг/мл протеиназы К.

Для проведения этих исследований использовали чашки для тканевых культур FALCON 3046 Multiwell. 6 мл среды М 17, содержащей дополнительно 1% лактозы и 1,5% агара (среда M17L), покрывается 700 мкл среды M17, содержащей дополнительно 1% лактозы и 0,6% агара, засеянного 1% культуры тест-штамма, подрощенного в течение предыдущей ночи и разведенного до OD₆₀₀, равной 0,1.

Когда тест-штамм должен выращиваться из спор, засев осуществляется 10⁵- 10⁶ спор на мл покрывающей среды.

Если испытуемый штамм не Lactococcuc, Streptococcus или Enterococcus, среда M17L заменяется стандартной средой, предпочтительной для роста рассматриваемых бактерий, особенно на среду MRS, включающую дополнительно 2% глюкозы для Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostos и Beifidobacterium (Sanofi Diagnostics Pasteur, Франция), среду RCM для спор или вегетативных клеток Clostridium (Oxoid, Англия) и среду BHI (Difco, США) для других испытуемых бактерий.

Две лунки диаметром 5 мм и глубиной 5 мм вырезаются в каждой чашке. Образец объемом 70 мкл с 300 ye данного бактериоцина помещается в одну из лунок, а в другую тот же самый образец, предварительно дезактивированный. Инкубиацию проводят при температуре, благоприятной для роста испытуемого штамма в течение периода, необходимого для того, чтобы чашка покрылась видимым бактериальным газоном.

Эффект или степень подавления характеризуется диаметром наблюдаемой зоны подавления роста. Считается, что подавление очень высокое (+ + + +), если зона имеет диаметр, равный 16-18 мм, высокое (+ + +) при диаметре, равном 11,5- 15,5 мм, среднее (+ +) при диаметре, равном 7,5-11 мм, слабое при диаметре, равном 5-7,5 мм и нулевое (-), если зона не наблюдается.

Таким образом было испытано более 74 штаммов молочнокислых бактерий различных видов и подвидов, и наблюдалось, что только примерно 7% из них устойчивы к супернатанту. Детали результатов этих испытаний представлены в таблице II. В этой таблице II, как и в последующих таблицах, название штамма или указанный N - это N , который присвоен ему в коллекции Nestle (адрес: NESTEC S. A. , Reseearch Centre, Vers-chez-les-Blanc, CH-1000 Lausanne 26, Швейцария). Указанная температура является температурой инкубации во время испытания.

В этой таблице II видно, что спектр подавления супернатанта является узким в том смысле, что для некоторых видов Lactobacillus, таких как Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus, например, степень подавления гетерогенна. Однако для других видов, таких как L. fermentum, L. helveticus и Lactococcus, например, степень подавления гомогенна.

Это целесообразно в свете того факта, что очень трудно отличить один штамм от другого внутри одного и того же вида. Поэтому возможно предвидеть преимущественное использование супернатанта или очищенных бактериоацинов для различения промышленных штаммов.

Также возможно предвидеть использование штамма, продуцирующего по крайней мере один из бактериоцинов по данному изобретению, в культуре с другим штаммом молочнокислых бактерий, который природно устойчив или слабочувствителен к бактериоцинам, продуцируемым в среде. Йогурты, особенно йогурты, демонстрирующие сниженное послеподкисление, например, могут получаться таким образом.

Также видно, что супернатант подавляет рост шести штаммов, продуцирующих низин, L. Lactis. Это доказывает, что данный бактериоцин не является низином. Это подтверждается тем фактом, что данный бактериоцин инактивируется трипсином при концентрации 10 мкг/мл (сравните таблицу 1), что не является характерным для низина.

Однако спектр подавления супернатанта культуры, продуцирующей два бактериоцина этого изобретения, является также и широким в том смысле, что он не ограничивается видами молочнокислых бактерий, но что он распространяется на другие виды грам-положительных бактерий, особенно на пищевые бактерии Bifidobacterium, на нежелательные патогенные бактерии Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Propionibacterium и Micrococcus varians и на споры и клетки многих патогенных бактерий рода Clostridium и Bacillus, например, что демонстрируется результатами, представленными в таблице III.

Результаты, показанные в этой таблице III, между прочим, делают возможным предположить преимущественное использование супернатанта или очищенных бактериоцинов в качестве консерванта при приготовлении пищевых продуктов, как активного вещества против патогенных возбудителей, особенно в мясных продуктах против Clostridium, в сырах против Listeria monocytogenes и C. tyrobutyricum или в свежих пастах и соусах против Bacillus, из которых действительно выделены вышеуказанные штаммы, например.

И наконец, данные бактериоцины не оказывают подавляющего действия на рост грам-отрицательных бактерий, что можно видеть в свете результатов, показанных в таблице IV.

Устойчивость к нагреванию, стабильность
Бактериоцины, присутствующие в экстракте, полученном при условиях, показанных в примере 1, не проявляют хорошей стабильности при хранении при 4^oC, если экстракт предварительно не прогрет. С другой стороны, они демонстрируют хорошую стабильность при хранении, если экстракт резко нагревают в течение по крайней мере 15 минут при 90-121^oC, например.

При проверке оказалось, в частности, что более 50% активности такого экстракта сохраняется после 5 месяцев хранения при 4^oC, если указанный экстракт прогревали заранее в течение 20 мин при 94^oC на водяной бане, например. При проверке также определено, что 100% активности сохраняется после прогревания указанного экстракта в течение 60 мин при 100^oC (испытание проводили на термостатированной масляной бане с 1 мл супернатанта, концентрированного или же культуры штамма S. thermophilus по данному способу).

С другой стороны, данные бактериоцины сохраняют только около трети их активности после стерилизующей обработки в течение 30 минут при 121^oC (испытание проводили на 40 мл неконцентрированного супернатанта культуры штамма S. thermophilus по данному процессу), например.

И наконец, с помощью исследования с ультрафильтрацией на фильтрах Amicon последующим электрофорезом в геле (SOS-PAGE) наблюдалось, что бактериоцины данного изобретения в супернатанте культуры S. thermophilus, особенно в супернатанте стандартной культуры, полученном в примере 1, существуют в виде агрегатов с молекулярным весом (МБ) более 10 kDa, из которых 67% представлены MB менее 100 KDa, а 33% представлены MB более 100 kDa.

Очистка бактериоцинов
В описании, которое следует далее, процентное содержание трифторуксусной кислоты и ацетонитрила дано по объему.

1 литр культуры штамма CNCM 1-1351 получают в среде М17, дополненной 1% сахарозы, в течение 6 час при 42^oC и в анаэробных условиях.

Затем добавляется 20 г смолы XAD-7 (Sigma) непосредственно в культуру, и все это осторожно перемешивается в течение 1 часа при 4^oC. Затем смесь фильтруется через фильтр Schleicher & Schvell (Германия) 604, затем смолу, оставшуюся на фильтре, промывают 1 литром 50 мМ раствора уксусной кислоты с pH 5,2 для удаления бактерий. Затем смолу помещают в колонку и элюируют бактериоцины 45 мл раствора, содержащего 70% ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ). Таким образом получается элюат, содержащий оба бактериоцина.

Объем элюата сначала снижается по 24 мл путем центрифугирования/ лиофилизации (Speedvac, Savant Instrument), полученный объем затем доводится до концентрации 2М NaCI и 250 мМ Трис·Cl, pH 8 до объема 50 мл, затем этот объем вводится в колонку Phenyl Superose HR 16/10 с гидрофобным взаимодействием (Pharmacia), предварительно уравновешенную буфером, содержащим 50 мМ Трис·Cl, pH 8 и 2М NaCl.

Затем последовательно пропускают со скоростью 4 мл/мин 200 мл предшествующего буфера, 100 мл линейного градиента, начиная с предшествующего буфера и заканчивая 50 мМ раствором Трис·Cl, pH 8, 100 мл предшествующего буфера, 60 мл чистой воды, 60 мл 50 мМ раствора Трис·Cl, pH 8 и в конце 60 мл чистой воды.

50 мкл каждой фракции, собранной на выходе из колонки, затем разводят в 50 мкл 0,1% ТФУ, и затем определяется антибактериальная активность каждой смеси с помощью испытания на агаре с вырезанными лунками, описанном выше.

Таким образом обнаружено, что франкция 470 и 490 мл проявляют антибактериальную активность. Эти фракции затем перемешивают, объем этой смеси снижают путем центрифугирования/лиофилизации до 1 мл, затем этот сниженный объем вводят в колонку Pep RPC HR 5/5 (Pharmacia), предварительно уравновешенную 0,1% раствором ТФУ, называемым в этом описании "раствором А".

Также готовят раствор элюирования "В", содержащий 70% ацетонитрила и 0,097% ТФУ, Затем через колонку последовательно пропускали со скоростью 1 мл/мин 1 мл раствора А, 9 мл линейного градиента, начиная с раствора А и заканчивая смесью 50/50 растворов А и В, 2 мл этой последней смеси, 7 мл линейного градиента, начиная с этой последней смеси и заканчивая второй смесью 20/80 растворов А и В, 2 мл линейного градиента, начиная с этой второй смеси и заканчивая раствором В, затем 2 мл этого последнего раствора.

Затем определена антибактериальная активность фракций на выходе из колонки с помощью испытания на агаре с вырезанными лунками, которое описано выше. Все фракции с 14 по 22 проявляют антибактериальную активность. С другой стороны, два главных протеиновых пика, наблюдаемых при оптической плотности, равной 215 нм, определяются во фракциях 15 и 21 (по миллилитру).

Секвенирование бактериоцинов
N-концевая часть белков, содержащихся во фракциях 15, 18, 20, 21 и 22, секвенирована с использованием автоматического секвенатора Applied Biosystems 4774.

Наличие пептида, имеющего последовательность из 48 аминокислот, которая идентична последовательности для N-концевой части последовательности ПОСЛ ИД N: 1, обнаружена таким образом во фракции 15. Другой пептид, преимущественно присутствующий во фракции 21, также имеет последовательность из 23 аминокислот, которая идентична последовательности для N-концевой части последовательности ПОСЛ ИД N: 2.

Поэтому эти результаты показывают, что штамм CNCM 1-1351 продуцирует два пептида, обладающие антибактериальной активностью. Однако различное проявление зон подавления, полученных с фракциями 15 и 21, делает возможным предположение о различной антибактериальной активности термофиллина 1 и термофиллина 2 данного изобретения.

С другой стороны, аминокислотный состав фракций 15 и 21, предварительно гидролизованных 6N HCl при 100^oC в течение 24 часов, проанализирован известным методом "дабсилхлоридной дериватизации" ("dabsyl chloride derivatization"). Результаты показывают, что аминокислотный состав каждой фракции уже, по-видимому, соответствует присущей им пептидной последовательности.

И наконец, фракции 15 и 21 подвергли масс-спектрофотометрии, и определен молекулярный вес термофиллина 1, составляющий порядка 5800 Дальтон, и для термофиллина 2 определен молекулярный вес порядка 3900 Дальтон.

Секвенирование генов бактериоцинов
Вырожденные нуклеиновые последовательности ПОСЛ ИД N: 6 и ПОСЛ ИД N: 7, описанные в перечне последовательностей, ниже, которые соответствуют N-концевой части и C-концевой части соответственно, ранее секвенированного пептида термофиллина 1, получены обычным способом.

Часть смеси последовательностей ПОСЛ ИД N: 6 затем превращали в радиоактивные путем воздействия Т4 полинуклеотидкиназы, как описано в руководстве для лабораторий "Molecular cloning, a Laboratory manual" (second edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989), называемом в данном описании "Maniatis".

Затем проведена PCR ("полимеразная цепная реакция") с помощью двух нерадиоактивных смесей вырожденных последовательностей ПОСЛ ИД N: 6 и ПОСЛ ИД N: 7, на препарате хромосомной ДНК из штамма CNCM 1-1351, как описано в руководстве "PCR technology": (Н.А. Erdlich editor, М stockton press, London).

Затем при электрофорезе в геле обнаружена полоса в области 128 пар оснований (bp), которая затем элюирована по Maniatis. Часть материала затем клонировали непосредственно в плазмиду pGEM-Т (Promega) в соответствии с рекомендациями поставщика и затем секвенировали с помощью "дидезоксинуклеотидного" метода, по Maniatis, используя универсальные пробы pUC19.

Таким образом получена проба, имеющая последовательности ПОСЛ ИД N : 8, описанная в перечне последовательностей, ниже, соответствующая последовательности, кодирующей аминокислоты с 9 по 47 термофиллина 1. И наконец, другая часть элюированной полосы из 128 bp превращена в радиоактивную методом, называемым "случайным примированием" по Maniatis.

С другой стороны, проведено расщепление препарата хромосомной ДНК из штамма CNCM 1-1351 с помощью EcoRI и HindIII по рекомендациям поставщика фермента, затем 10 мкг продукта расщепления разгоняли с помощью аналитического электрофореза в геле, ДНК переносили в щелочной среде из геля на мембрану "Zeta probe" (Biorad), мембрану предварительно гибридизировали при 54^oC в течение ночи в среде, содержащей 6X SSC, 1% додецилсульфата натрия и 1% снятого молока, затем эту мембрану гибридизовали с радиоактивной вырожденной пробой ПОСЛ ИД N: 6 в предыдущей среде для гибридизации сначала в течение 18 часов при 54^oC со снижением температуры на 2^oC каждые 3 часа, затем в течение 24 часов при 42^oC.

Мембрану затем отмывали в течение 2 мин последовательно 3 раза в 6X SSC при комнатной температуре и в течение 1 мин в 6X SSC при 47^oC. В конце мембрану подвергали экспозиции на пленке для ауторадиографии. Все эти этапы осуществляли по руководству Maniatis.

Затем обнаружена полоса в области 3,6 kb, которая дает нам возможность определить место при препаративном электрофорезе и геле хромосомной ДНК (300 мкг) штамма CNCM 1-1351, выполненном при тех же условиях, что и описанный выше, так как эта часть геля содержит участок интересующей ДНК. Эту часть геля затем вырезали и элюировали обычным способом и элюированную ДНК лигировали в вектор pUC19 (Messing et al. Methods EnzymoL, 101; 20, 1983), предварительно расщепленный с помощью EcoRI и HindIII. Эти этапы проводили в соответствии с руководством Maniatis.

Штамм BZ234 Escherichia coli (Biocentre collection, University of Bale, Швейцария), предварительно превращенный в компетентный, затем трансформирован обычным путем с использованием среды лигирования. Трансформированные клетки затем отбирали с помощью альфа-комплементации. Затем по методу, называемому "перенос колонии" по Maniatis, 300 трансформированных колоний переносят на фильтр, их лизируют, гибридизуют с радиоактивной последовательностью ПОСЛ ИД N: 8, затем фильтр подвергают экспозиции на пленке для ауторадиографии.

Затем на пленке обнаружено 13 колоний, имеющих плазмиды, способные к гибридизации с последовательностью ПОСЛ ИД N : 8. Потом отобраны две из этих колоний, из них обычным способом экстрагирована плазмидная ДНК, и фрагмент ДНК, клонированный в две выбранные плазмиды pUC19, секвенирован "дидезоксинуклеотидным" методом с помощью универсальных проб pUC19, затем пробы создавали на основе последовательностей, полученных таким образом.

Итак, получена нуклеотидная последовательность ПОСЛ ИД N: 3, описанная в перечне последовательностей, ниже, которая идентична для двух выбранных плазмид. Эта последовательность, таким образом, включает оперон, кодирующий два белка, имеющий аминокислотные последовательности ПОСЛ ИД N: 4, соответствующие до созревания термофиллину 1, и ПОСЛ ИД N: 5, соответствующей до созревания термофиллину 2 (смотрите перечень последовательностей ниже). Третья открытая рамка считывания также начинается с нуклеотида 679 этой последовательности и должна, конечно, соответствовать гену по невосприимчивости.

Путем сравнения N-концевых пептидных последовательностей очищенных бактериоцинов и аминокислотных последовательностей белков, кодируемых кодирующими рамками оперона ПОСЛ ИД N: 3, может быть определено, что белок из аминокислотной последовательности ПОСЛ ИД N: 4 (термофиллин 1) имеет лидерный пептид из 23 аминокислот, который имеет единицу глицин-глицин, характерную для класса бактериоцинов из молочнокислых бактерий.

И наконец, молекулярная масса термофиллина 1, рассчитанная по его нуклеотидной последовательности, соответствует массе, найденной с помощью спектрофотометрии, то есть составляет порядка 5800 Дальтон.

Аналогично, белок с аминокислотной последовательностью ПОСЛ ИД N: 5 (термофиллин 2) имеет лидерный пептид из 21 аминокислоты, который включает единицу глицин-глицин, характерную для класса бактериоцинов из молочнокислых бактерий. И наконец, молекулярная масса термофиллина 2, рассчитанная по его нуклеотидной последовательности, соответствует найденной с помощью спектрофотометрии, то есть составляет порядка 3900 Дальтон.

Роль различных бактериоцинов
Гомология с первым пептидом оперона "лактокоцеина М" ("lactococein М") (Klaenhammer et al., FEMS Micro. Rew., 12, 39-86, 1993) была обнаружена для последовательности термофиллина 1. Эта гомология связана с повторением единицы GA. Подобным же образом гомология с геном для оперона "лактацин F" (Klaenhammer er al., процитированный выше) была обнаружена для термофиллина 2 в банке данных GenEMBL с использованием программы TFASTA от GCG.

Два оперона, лактокоцеина М и лактацина F, фактически кодируют комплексы порации, включающие несколько пептидов. Поэтому возможно, что ранее описанный оперон может кодировать пептиды, действующие совместно в комплексе порации.

Тем не менее не исключается, что два бактериоцина действуют независимо, поскольку наблюдались несколько различные зоны подавления для двух термофиллинов при испытании на агаре с вырезанными лунками, описанном ранее.

Нижеследующие примеры представлены в качестве иллюстрации способа получения и применения бактериоцина по данному изобретению. Проценты в них даны по весу, если нет других указаний.

Пример 1
Культуральную среду М17, к которой добавлен 1% сахарозы, засевают 1% (объем/объем) культуры, содержащей 10⁸ микроорганизмов штамма CNCM 1-1351 S. thermophilus на мл. Инкубацию проводят в течение 6 часов при 42^oC в анаэробных условиях, после чего среда содержит примерно 10⁸ микроорганизмов штамма на мл и имеет OD₆₀₀, равную 3,6.

Стандартную культуру, полученную таким образом, центрифугируют. Супернатант (стандартный) собирается. Он подкисляется до pH 1,5 H₃PO₄, получается преципитат, который отделяется центрифугированием, и супернатант после осаждения кислотой собирается.

Бактериоцины, содержащиеся в последнем, осаждаются 10% трихлоруксусной кислотой. Осажденные бактериоцины собираются и затем ресуспендируются в водной суспензии с 0,2% трифторуксусной кислоты (объем/объем).

Бактериоцины снова осаждаются 10% трихлоруксусной кислотой. Осажденные бактериоцины собирают, их промывают 100% ацетоном и ресуспендируют в водной суспензии с 0,2% трифторуксусной кислоты (объем/объем).

Получается стандартный сырой экстракт данных бактериоцинов, имеющий активность 1,4·10⁵ уе/мл.

Таблица V представляет некоторые детали по характеристикам одного литра стандартного супернатанта и характеристикам для 18 мл стандартного неочищенного экстракта, другими словами, концентрата, который был из него получен, в частности, в отношении содержания белка и антибактериальной активности.

Пример 2
Йогурты сорта сквашенных готовятся с включением штамма этого изобретения S. thermophilus CNCM 1-1351 и штамма STII S. thermophilus (который устойчив к бактериоцинам по этому изобретению, но не проявляет антибактериальной активности) и YL5 L. bulgaricus, упомянутого выше.

Таким образом готовится молоко на основе цельного молока, содержащего 3,7% жира и 2,5% порошка снятого молока. 40 л этого молока пастеризуется при 92^oC в течение 6 мин, затем оно гомогенизируется при 75^oC и 150 бар (две стадии) и, наконец, охлаждается до температуры примерно 42^oC.

Лиофилизированные штаммы S. thermophilus CNCM 1-1351, S. thermophilus STII и L. bulgaricus YL5 затем реактивируются путем нескольких последовательных предварительных культивирований в стерильной среде MSK (10% восстановленное порошковое снятое молоко, содержащее 0,1% коммерческого дрожжевого экстракта).

Стерильное молоко затем засевается количеством, равным 1% (объем/объем) третьей предварительно полученной культуры каждого штамма S. thermophilus, взятой из стадии коагуляции среды и в количестве, равном 2% (объем/объем), третьей предварительно полученной культуры штамма L. Bulgaricus, взятой на стадии коагуляции среды. Затем молоко инкубируется при 42^oC до pH, равного примерно 4,65, и затем охлаждается до 4^oC.

Для сравнения, традиционный сквашенный йогурт готовится таким же образом, как описано выше, с помощью ранее описанных штаммов YS8 и SFi3 S. thermophilus и штамма YL18 L.bulgaricus, которые традиционно используются для производства йогурта.

В таблице VI представлены характеристики полученных продуктов, в частности, их pH во время хранения при 4^oC.

Пример 3
Сыр меззарелла готовится традиционным способом с помощью культуры S. thermophilus CNCM 1-1351.

Пример 4
10 литров культуры штамма CNCM 1-1351 S. thermophilus получают в среде М17, дополненной 1% сахарозы, в течение 6 час при 42^oC и в анаэробных условиях. Затем непосредственно в среду добавляют 200 г смолы XAD-7 (Sigma), все осторожно перемешивают в течение 1 часа при 4^oC. Затем смесь фильтровали через фильтр Schleicher & Schvell (Германия) N 604, затем собранную смолу на фильтре промывают 10 литрами 50 мМ раствора уксусной кислоты, pH 5,2 для удаления бактерий.

Затем к смоле добавляют 450 мл раствора, содержащего 100% этанол и 20 мМ ацетата аммония, и все фильтруется для удаления смолы, затем фильтрат лиофилизируют до получения порошка, содержащего бактериоцины по этому изобретению, которые могут использоваться в пищевой промышленности.

И далее определена антибактериальная активность этого порошка, предварительно разведенного водой, путем испытания на агаре с вырезанными лунками, описанного выше. Этот порошок проявляет активность 10⁷ уе/г порошка.

И наконец, 0,5 г/кг вышеуказанного порошка добавляется к мясному муссу во время его приготовления традиционным способом. Таким образом получается мясной мусс, содержащий 5-10³ уе/г бактериоцинов, способных полностью подавить размножение патогенных бактерий, в частности Clostridium.

Пример 5
Этот пример относится к приготовлению увлажняющего крема для ухода за кожей, содержащего 0,05 г/кг порошка, описанного в примере 4, то есть, следовательно, 5·10² уе/г бактериоцинов, способных подавить рост нежелательных бактерий на коже.

Для изготовления этой эмульсии компоненты липидной фазы A смешиваются и нагреваются до 75^oC. Готовится водная фаза B и нагревается до 75^oC, затем она добавляется к липидной фазе A при медленном перемешивании, смесь охлаждается при медленном перемешивании до комнатной температуры, то есть до примерно 25^oC. При этой температуре медленно добавляются составляющие C по прописи. (табл. VII).

Пример 6
0,5 г/кг порошка бактериоцина, описанного в примере 4, добавляется к жидкому средству для чистки зубов. Это средство для чистки зубов, таким образом, способно подавлять рост патогенных бактерий ротовой полости, в частности, Streptococcus sobrinus.

Пример 7
Раствором, содержащим порошок бактериоцина из примера 4, разведенным водой до содержания 1%, опрыскивают пищевой продукт, подлежащий стерилизации, для предотвращения последующей контаминации во время упаковки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ИД N 1:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 62 аминокислоты
(B) ТИП: аминокислотная
() ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(VI) ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК:
(A) ОРГАНИЗМ: Streptococcus thermophilus
(B) ШТАММ: CNCM 1-1351
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 1(см. в конце описания)
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 2:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 43 аминокислоты
(B) ТИП: аминокислотная
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(VI) ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК:
(A) ОРГАНИЗМ: Streptococcus thermophilus
(B) ШТАММ: CNCM 1-1351
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 2 (см. в конце описания)
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛ ИД N 3:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 770 пар оснований
(B) ТИП: нуклеиновая кислота
(C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
(VI) ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК:
(A) ОРГАНИЗМ: Streptococcus thermophilus
(В) ШТАММ: CNCM 1-1351
(IX) ОСОБЕННОСТЬ:
(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: CDS
(В) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 221...475
(IX) ОСОБЕННОСТЬ:
(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: сиг_пептид
(B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 221...289
(IX) ОСОБЕННОСТЬ:
(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: мат_пептид
(B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 290...475
(D) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /функция = "кодирует термофиллин 1"
(IX) ОСОБЕННОСТЬ:
(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: CDS
(B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 495...686
(IX) ОСОБЕННОСТЬ:
(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: сиг_пептид
(B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 495...557
(IX) ОСОБЕННОСТЬ:
(A) НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: мат_пептид
(B) МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ: 558...686
(D) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /функция = "кодирует термофиллин 2"
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 3 (см. в конце описания)
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛ ИД N: 4:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 85 аминокислот
(B) ТИП: аминокислотная
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 4 (см. в конце описания)
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛ ИД N: 5:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 64 аминокислоты
(B) ТИП: аминокислотная
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 5 (см. в конце описания)
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛ ИД N: 6:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 17 пар оснований
(B) ТИП: нуклеиновая кислота
(C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
(III) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 6::
GAYATGGGNG GNTAYGC
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛ ИД N 7:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 17 пар оснований
(B) ТИП: нуклеиновая кислота
(C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
(III) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: ДА
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 7:
GCTATNGCNC CNACGTG
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛ ИД N: 8:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 128 пар оснований
(B) ТИП: нуклеиновая кислота
(C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одна
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
(VI) ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК:
(A) ОРГАНИЗМ: Streptococcus thermophilus
(B) ШТАММ: CNCM 1-1351
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛ ИД N 8 (см. в конце описания)

Формула изобретения

1. Смесь бактериоцинов, выделенная из штамма Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID N 1 и SEQ ID N 2 для приготовления пищевых продуктов или косметической продукции.

2. Смесь бактериоцинов по п.1 для приготовления сыров или кисломолочных продуктов или мясных продуктов, таких, как муссы.

3. Смесь бактериоцинов по п.1 для приготовления кремов, или лосьонов, или гигиенических лечебных продуктов.

4. Штамм Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351 - продуцент смеси бактериоцинов по п.1.

5. Способ получения бактериоцинов по п.1, предусматривающий культивирование штамма Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351, в среде и условиях, благоприятных для его роста, до содержания микроорганизмов в среде 10⁷ - 10⁹ м. к. /мл, центрифугирование культуры, приготовление экстракта супернатанта, содержащего целевой продукт.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что при приготовлении экстракта, pH супернатанта доводят до 1,0 - 2,0 добавлением H₃PO₄, осадок удаляют и проводят одно или более последовательных осаждений трихлоруксусной кислотой с ресуспендированием осадка после каждого осаждения в водной суспензии с трихлоруксусной кислотой.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18