Применение 2,4-диаминопиримидин-3-оксида или одной из его солей при лечении нарушений формирования и структурирования коллагена

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к офтальмологии и дерматологии. Предложена новая терапевтическая композиция, предназначенная для лечения нарушений формирования и структурирования коллагена в тканях кожи или для лечения конъюнктивы глаза. Средство представляет собой 2,4-диаминопиримидин-3-оксида или одной из его солей в качестве активного вещества в сочетании с физиологически приемлемым эксципиентом. Оно обладает специфической активностью - ингибирует лизилкарбоксилазу и вызывает пространственную реорганизацию в микросетке коллагеновых волокон. 11 з.п.ф-лы, 3 ил.

Предметом настоящего изобретения является применение 2,4-диаминопиримидин-3-оксида или одной из его солей в качестве активного вещества для получения терапевтической композиции для фармацевтического или ветеринарного использования, предназначенной для лечения нарушений формирования и структурирования коллагена.

Для образования пучков природного проколлагена требуется гидроксилирование некоторого числа пролиновых и лизиновых остатков предпроколлагена в шероховатой эндоплазматической сети, затем гликозилирование гидроксилизиновых остатков в аппарате Гольджи. Это формирование коллагена было объектом многочисленных исследований.

Так, Миноксидил, т.е. 2,4-диамино-6-пиперидино-пиримидин-3-оксид, описанный и используемый при лечении некоторых видов гипертоний и при лечении андрогенной алопеции, исследовался в качестве специфического ингибитора лизилгидроксилазы, фермента, принимающего участие в формировании коллагена.

Этой же теме посвящены исследования Murad и др., опубликованные в Arch. of Biochem. Biophys. , том 292, N 1, с. 234-238 (1992) и том 308, N 1, с. 42-47 (1994), которые позволили показать, что способность ингибировать лизилгидроксилазу зависит от наличия третичной аминогруппы, находящейся в параположении к N-оксидной функции 2,4-диаминопиримидинового кольца, и предпочтительно эта группа должна быть пиперидиновой группой, как это имеет место в Миноксидиле.

Однако, в настоящее время совершенно неожиданно было обнаружено, что 2,4-диаминопиримидин-3-оксид, сокращенно называемый далее 2,4-ДПО, хотя и не содержит третичную аминогруппу в пара-положении к N-оксидной функции 2,4-диаминопиримидинового кольца, позволяет специфическим образом ингибировать лизилгидроксилазу.

Это соединение было описано в международной заявке на патент 92/01437 в качестве активного агента в косметическом средстве, предназначенном для борьбы с выпадением волос путем топического нанесения. Однако, в отличие от Миноксидила, 2,4-ДПО не обладает каким-либо антигипертензивным действием и, следовательно, является достаточно безвредным, при этом ингибирующая активность в отношении лизилгидроксилазы равна или превышает эту активность Миноксидила.

Предметом настоящего изобретения, следовательно, является применение 2,4-ДПО или одной из его солей в качестве активного вещества для получения фармацевтической или ветеринарной композиции, предназначенной для лечения нарушений формирования коллагена у человека или у животного.

В настоящем описании выражение "2,4-ДПО" означает не только собственно 2,4-ДПО, но и также одну из его солей, указанных ниже.

Под нарушением формирования коллагена согласно изобретению понимают любую нежелательную аккумуляцию коллагена и, в частности, любое нарушение структуры коллагеновой матрицы кожной ткани или конъюнктивы глаза; эти нарушения могут быть спонтанного травматического или послеоперационного происхождения. Из этих нарушений можно назвать, в частности, витреоретинопатию, системный склеродермит, уплотнения кожи, вызванные ультрафиолетовыми лучами, и рубцовые келоиды.

Использование 2,4-ДПО согласно изобретению, следовательно, позволяет достигать улучшения эстетического внешнего вида излечиваемого пациента.

Так, согласно изобретению, обработка может быть лечебной, однако, предпочтительно ее осуществляют с профилактической целью, то есть в течение периода, на протяжении которого происходит структурирование и, следовательно, аккумуляция коллагена, что имеет место особенно во время периода рубцевания.

2,4-ДПО можно применять для получения терапевтической композиции, предназначенной для введения топическим, трансдермическим или интрадермическим путем.

Под физиологически приемлемыми солями согласно изобретению нужно понимать соли присоединения кислоты, такие, как соли серной кислоты, соляной кислоты, фосфорной кислоты, уксусной кислоты, бензойной кислоты, салициловой кислоты, гликолевой кислоты, ацетиламиноуксусной кислоты, янтарной кислоты, никотиновой кислоты, винной кислоты, малеиновой кислоты, метансульфокислоты, пикриновой кислоты и молочной кислоты.

Когда терапевтическая композиция находится в форме, вводимой топическим путем, то доля 2,4-ДПО обычно составляет 0,0001-5% масс. и предпочтительно 0,01-2% масс., в расчете на общую массу композиции.

Эксципиент может быть очень разнообразной природы, но предпочтительно он представляет собой физиологически приемлемую среду для введения топическим путем, само собой разумеется совместимую с активным веществом.

2,4-ДПО в этой среде может находиться либо в растворенном состоянии, либо в диспергированном состоянии, в частности, в тонкоизмельченной форме.

Физиологически приемлемая среда может представлять собой воду или смесь воды с растворителем или смесь растворителей. Из растворителей, которые могут быть использованы, можно указать в частности, низшие спирты с 1-4 атомами углерода, такие как этанол, изопропанол, трет-бутанол, алкиленгликоли, простые алкиловые эфиры алкиленгликоля и диалкиленгликоля, такие, как простой моноэтиловый эфир этиленгликоля, простой монометиловый эфир пропиленгликоля, простой моноэтиловый эфир диэтиленгликоля. Эти, предназначенные для топического применения композиции также могут содержать, по крайней мере, одну обычную добавку или действующее начало.

Из них можно назвать УФ-А- и УФ-Б- фильтры, такие как метоксициннаматы и производные бензофенона; антиоксиданты и/или улавливатели свободных радикалов, такие, как диметилсульфоксид, α-токоферол, 3-трет.-бутил-4-гидроксианизол, 3,5-ди-трет.-бутил-4-гидрокситолуол, дисмутазапероксид; гидратирующие агенты, такие, как мочевина, глицерин, молочная кислота; гидроксикислоты, тиаморфолинон и его производные и производные пирролидонкарбоновой кислоты, в частности, ее натриевая и калиевая соли; противовоспалительные агенты стероидного и нестероидного типа, такие, как гидрокортизон, β-метазон, дексаметазон, ацетилсалициловая кислота, индометацин, изопрофен, витамин D или нифлумовая кислота; и антибактериальные агенты, такие, как агенты, принадлежащие к группе макролидов, пиранозидов и тетрациклинов, такие, как эритромицин.

Эти композиции также могут содержать консерванты, стабилизаторы, регуляторы pH, модификаторы осмотического давления и эмульгаторы.

Эти, предназначенные для топического применения композиции на основе 2,4-ДПО могут находиться в различных формах, таких, как, например, лосьоны, гели, пены, везикулярные дисперсии, спреи или аэрозольные пены.

Эти композиции также могут находиться в форме желатинированных и загущенных композиций. Из желатинированных композиций можно назвать главным образом водные композиции, подвергнутые желатинированию с помощью гетеробиополисахаридов, таких, как гуммиксантан, склероглюканы или производные целлюлозы, и в частности простые эфиры целлюлозы; или водно-спиртовые композиции, подвергнутые желатинированию с помощью полигидроксиэтилакрилатов или -метакрилатов. Из водных желатинированных композиций можно назвать таковые, полученные с помощью полиакриловой кислоты, сшитой за счет полифункционального агента, такого, как имеющиеся в продаже агенты под названием "Карбопол ® " фирмы Groodrich. Однако, само собой разумеется, в качестве сгустителя можно использовать любой агент, обычно применяемый в фармации или дермофармации.

При топическом нанесении 2,4-ДПО обычно наносят на части обрабатываемого тела из расчета 0,0001 - 5 мг/кг/день и предпочтительно 0,001 - 1 мг/кг/день. Обработку обычно продолжают в течение всего периода, на протяжении которого происходит аккумуляция коллагена, и она может продолжаться в течение еще 90 дней после этого периода.

Согласно изобретению, 2,4-ДПО также можно использовать для получения терапевтических композиций, предназначенных для введения трансдермическим путем.

Тогда доля, 2,4-ДПО обычно составляет 0,001 - 5% и предпочтительно 0,01 - 2%, в расчете на общую массу композиции.

Используемый в этих композициях эксципиент обычно выбирают среди полимеров или виниловых сополимеров, к которым можно добавить промотор пенетрации.

Предназначенные для введения трансдермическим путем композиции можно наносить с помощью самоприклеивающихся систем, прилипающих к коже и обеспечивающих непрерывный переход, в течение по крайней мере 24-х часов, контролируемого количества активного вещества через кожу в систему кровообращения.

Из этих систем особенно можно назвать те, которые описаны в заявке на патент Франции 88.11685 (2.635.979), а также те, которые выпускаются в продажу фирмой Tilderm.

2,4-ДПО также можно применять для получения терапевтических композиций, предназначенных для введения интрадермическим путем.

Доля 2,4-ДПО тогда обычно составляет 0,0001 - 5% масс. и предпочтительно 0,01 - 1% масс., в расчете на общую массу композиции.

В этом случае 2,4-ДПО находится в форме, растворимой в физиологически приемлемом эксципиенте, таком, как физиологическая сыворотка.

Предназначенные для введения интрадермическим путем композиции могут включать, кроме того, различные терапевтические агенты, такие, как, например, антибактериальные агенты, антиоксиданты и противовоспалительные агенты стероидного или нестероидного типа.

2,4-ДПО обычно вводят интрадермическим путем в дозе ниже или равной 5 мг/кг/день и предпочтительно 0,0001 -1 мг/кг/день. Обработку обычно проводят в течение всего периода, на протяжении которого происходит аккумуляция коллагена, и ее можно продолжать еще в течение 30 дней после этого периода.

Хотя выше преимущественно ссылаются на композиции, предназначенные для фармацевтического использования, само собой разумеется, что они могут быть получены в виде препаративной формы, более соответствующей применению в ветеринарии, особенно для обработки лошадей, таких, как домашняя лошадь.

Композиции согласно изобретению, какой бы ни был способ применения или каково бы ни было использование, для которого они предназначены, получают известными способами.

Далее приводятся в качестве иллюстрации результаты исследований, демонстрирующих эффективность 2,4-ДПО, также, как различные примеры терапевтических композиций.

1 - Изучение ингибирования экспрессии иРНК, кодирующей лизилгидроксилазу (ЛГ) Из культуры фибробластов, происходящих от наружных соединительных оболочек человеческого волоса в пятом пересеве, 2·10⁵ фибробластов высевают в чашки Петри диаметром 60 мм, содержащие культуральную среду типа "Игла", модифицированную Дульбекко и дополненную с помощью 2 ммоль L-глутамина, 1 ммоль пирувата натрия, 100 единиц/мл пенициллина S, 100 мкг/мл стрептомицина S, 250 мг/мл амфотерина и 10% плодной телячьей сыворотки, выпускаемой в продажу фирмой Гибко BRL.

После культивирования в течение 24-х часов при 37^oC в камере, содержащей 95% воздуха и 5% диоксида углерода, среду заменяют аналогичной средой, но не содержащей плодной телячьей сыворотки. Клетки затем инкубируют при 37^oC в течение трех часов (фиг. 1A) или 18 часов (фиг. 1Б) в присутствии 5 ммоль Миноксидила, 5 ммоль 2,4-ДПО или 5 ммоль сульфата Миноксидила.

Согласно способу, описанному в "Short protocols in molecular biology, Harvard-medical school изд. John Wiley & sons, 1992", экстрагируют всю РНК из каждого из препаратов клеток, затем определяют ее количество путем УФ-спектрофотометрических измерений при 280 нм.

Для анализа экспрессии информационных РНК осуществляют их амплификацию с помощью реакции удлинения цепи полимеразой (PCR).

Из 2 мкг полной РНК, полученных выше для каждого препарата клеток, синтезируют ин витро комплементарную ДНК с помощью набора для обратной транскрипции, выпускаемого в продажу под названием "First Strand C-DNA Synthesis Kit" фирмой PHARMACIA LKB Biotechnology AB. Аликвоту вышеполученной комплементарной ДНК затем амплифицируют по методу PCR в присутствии следующих специфических праймеров лизилгидроксилазы (ЛГ) и пролилгидроксилазы (ПГ): смысловой праймер ЛГ: 5' GAAATGGGCCATGTGAGAGCG 3'; антисмысловой праймер ЛГ: 5' TGTGGATGACAATAGTCGGCACG 3' смысловой праймер ПГ: 5' GTGGATGGAACAAGCCCTAAGGC 3'; антисмысловой праймер ПГ: 5' CCTCCCCACGGCACAGCATTTCG 3' для конечного объема 50 мкл.

20 мкл полученной после PCR смеси помещают на гель для электрофореза с 2% агарозы в присутствии 0,5 мкг/мл этидиумбромида и буфера для электрофореза Трис-ацетат ЭДТУ (ТАЕ) Iх.

После миграции в течение 1 часа под воздействием электрического поля в 100 вольт, интенсивность полос, соответствующих информационным РНК, кодирующим соответственно лизилгидроксилазу и пролилгидроксилазу, анализируют и количественно определяют с помощью анализатора изображений с программным обеспечением, выпускаемого в продажу фирмой Vilbert Jourmal под названием "Bioprofil ®".

Согласно такому же способу работы, который описан выше, определяют степень относительной экспрессии информационных РНК, кодирующих лизилгидроксилазу и пролилгидроксилазу, после культивирования в течение трех часов и 18 часов фибробластов в отсутствие всякой обработки.

Результаты представлены на фиг. 1A и 1Б.

Установлено таким образом, что инкубация фибробластов в течение трех часов в присутствии Миноксидила или Миноксидилсульфата снижает степень относительной экспрессии информационных РНК, кодирующих лизилгидроксилазу, которая составляет в этом случае 0,75.

После инкубации в течение трех часов в присутствии 2,4-ДПО, степень относительной экспрессии информационных РНК, кодирующих лизилгидроксилазу, составляет 0,55.

2,4-ДПО, следовательно, ингибирует в большей степени экспрессию информационных РНК, кодирующих лизилгидроксилазу, чем Миноксидил или его сульфатированный аналог.

Аналогичных результатов достигают после культивирования в течение 18 часов в присутствии различных испытуемых ингибиторов.

Кроме того, после культивирования в течение трех часов в присутствии Миноксидила или Миноксидилсульфата, степень относительной экспрессии информационных РНК, кодирующих пролилгидроксилазу, повышается, достигая соответственно 1,25 и 1,85.

После инкубации в течение трех часов в присутствии 2,4-ДПО степень относительной экспрессии информационных РНК, кодирующих пролилгидроксилазу, также более высокая и составляет величину порядка 1,3.

После культивирования в течение 18 часов в присутствии Миноксидила, Миноксидил-сульфата или 2,4-ДПО, степени относительной экспрессии информационных РНК, кодирующих пролилгидроксилазу, составляют соответственно 1,6, 1,3 и 1,15.

В отсутствие этих трех соединений, следовательно, не наблюдают ингибирования степени относительной экспрессии информационных РНК, кодирующих пролилгидроксилазу.

Испытуемые соединения, следовательно, обладают специфической ингибирующей активностью в отношении лизилгидроксилазы.

II - Изучение воздействия 2,4-ДПО на коллагеновую сетку, присутствующую во внеклеточной матрице культивируемых фибробластов К первичной культуре дермических человеческих фибробластов, происходящих после пластической операции молочной железы, в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 10% плодной телячьей сыворотки, добавляют 10 мкмоль 2,4-ДПО.

Спустя три дня, клетки лизируют путем гипоосмотического шока и осадок коллагена фиксируют 5%-ным раствором глутарового альдегида.

Затем наблюдают внеклеточную матрицу фибробластов с помощью растрового электронного микроскопа.

Также с помощью растрового электронного микроскопа наблюдают внеклеточную матрицу первичной культуры необработанных фибробластов.

Эти снимки представлены на фиг. 2 и 3.

Как можно констатировать по снимкам, представленным на фиг. 2 и 3, внеклеточная матрица необработанных фибробластов имеет большое скопление волокон, окружающих широкие области, лишенные коллагеновой сетки, тогда как внеклеточная матрица обработанных с помощью 2,4-ДПО фибробластов имеет намного более регулярную организацию, в которой не наблюдают большого скопления волокон и где величина областей, лишенных коллагеновой сетки, намного меньше.

Введение 2,4-ДПО в культуру фибробластов, следовательно, вызывает пространственную реорганизацию в микро-сетке коллагеновых волокон.

Примеры терапевтических композиций Пример 1: Крем для кожи Готовят крем для кожи путем смешения следующих ингредиентов:
2,4-ДПО - 0,5 г
Cetearch 30 - 7 г
Глицерилстеарат - 2 г
Цетиловый спирт - 1,5 г
Полидиметилсилоксан - 1,5 г
Парафиновое масло - 15 г
Фармакопейный чистый глицерин - 20 г
Консерванты - Достаточное количество
Деминерализованная вода - Достаточное количество до 100 г
Пример 2:
Распыляемый лосьон для кожи
Готовят распыляемый лосьон для кожи путем смещения следующих ингредиентов:
2,4-ДПО - 0,25 г
Этанол - 30 г
Деминерализованная вода - Достаточное количество до 100 г
Пример 3:
Раствор для инъекции
Готовят раствор для инъекции для введения интрадермическим путем за счет смешения следующих ингредиентов:
2,4-ДПО - 0,7 мг
Физиологическая сыворотка (раствор 9 г хлорида натрия в воде, взятой в количестве, достаточном для получения 100 мл раствора) - 1 млр

Формула изобретения

1. Применение 2,4-диаминопиримидин-3-оксида (2,4-ДПО) или одной из его физиологически приемлемых солей в качестве активного вещества для получения терапевтической композиции для фармацевтического или ветеринарного использования, предназначенной для лечения нарушений структуры коллагенового матрикса тканей кожи или конъюнктивы глаза.

2. Применение по п.1, в котором соли выбирают среди солей присоединения кислоты, выбираемой в группе, состоящей из серной кислоты, соляной кислоты, фосфорной кислоты, уксусной кислоты, бензойной кислоты, салициловой кислоты, гликолевой кислоты, ацетиламиноуксусной кислоты, янтарной кислоты, никотиновой кислоты, винной кислоты, малеиновой кислоты, метансульфокислоты, пикриновой кислоты и молочной кислоты.

3. Применение по любому из пп.1 и 2, в котором вышеуказанная композиция находится в форме для местного нанесения или введения чрезкожным или внутрикожным путем.

4. Применение по любому из пп.1 - 3, в котором вышеуказанная композиция находится в форме для введения топическим путем, причем доля 2,4-ДПО составляет 0,0001 - 5 мас.%, в расчете на общую массу композиции.

5. Применение по п.4, в котором доля 2,4-ДПО составляет 0,01 - 2 мас.% в расчете на общую массу композиции.

6. Применение по любому из пп.1 - 3, в котором вышеуказанная композиция находится в форме для введения чрезкожным путем, причем доля 2,4-ДПО составляет 0,001 - 5 мас.% в расчете на общую массу композиции.

7. Применение по п.6, в котором доля 2,4-ДПО составляет 0,01 - 2 мас.% в расчете на общую массу композиции.

8. Применение по любому из пп.1 - 3, в котором вышеуказанная композиция находится в форме для введения внутрикожным путем, причем доля 2,4-ДПО составляет 0,0001 - 5 мас.% в расчете на общую массу композиции.

9. Применение по п.8, в котором доля 2,4-ДПО составляет 0,01 - 1 мас.% в расчете на общую массу композиции.

10. Применение по любому из пп.1 - 9, в котором вышеуказанная композиция предназначена для лечения нарушения формирования коллагена у человека.

11. Применение по любому из пп.1 - 9, в котором вышеуказанная композиция предназначена для лечения нарушений формирования коллагена у животного.

12. Применение по п.11, в котором животным является лощадь.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3