Микросферы, способ их получения

 

Изобретение относится к фармации и касается микросфер. Изобретение заключается в том, что оно содержит желатинированное полярное ядро, на которое нанесены концентрично и попеременно n липидных двойных слоев или n водных слоев в жидком состоянии и n желатинированных полярных слоев, причем n является целым числом, равным или больше 1, и получены путем делипидирования липосом, называемых липосомами с желатинированным полярным ядром, которые содержат, по меньшей мере, один внешний липидный двойной слой, и, по меньшей мере, одну водную внутреннюю полярную фазу, содержащую желатинированное вещество. Изобретение относится также к способу получения микросфер. Изобретение обеспечивает возможность получения микросфер с регулируемым диаметром, могут быть использованы в качестве носителя активных веществ или в качестве диагностического реактива, они стабильны. 2 с. и 10 з.п. ф-лы, 2 табл., 6 фиг.

Настоящее изобретение относится к желатиновым микросферам, способу их получения и их применению.

Микросферы, представляющие собой частицы сферической формы, размер которых изменяется обычно от 1 до 250 мкм, состоят из материала-носителя и инкапсулированного вещества, и представляют особый интерес, либо когда желательно ввести в организм лекарство в форме, которая позволяет контролировать выделение активного компонента в течение определенного времени, если необходимо обеспечить продолжительное фармакологическое действие, либо когда необходимо защитить названный активный компонент от преждевременного разрушения в желудочно-кишечном тракте.

В зависимости от структуры материала-носителя различают два типа микрокапсул: - микрокапсулы емкостного типа, когда носитель образует твердую оболочку разной толщины, содержащую инкапсулируемое вещество, - микрокапсулы матричного типа, называемые также микросферами, когда носитель представляет собой непрерывную сетку, в которой диспергировано инкапсулированное вещество.

С точки зрения настоящего изобретения термин микрокапсула или микросфера включает только микрокапсулы или микросферы матричного типа.

Инкапсулировано может быть очень много веществ: речь может идти о химических продуктах, таких как лекарственное вещество, или о макромолекулах, таких как энзимы, а также о живых клетках.

Микросферы используют в многочисленных областях, таких как фармацевтика, биоиндустрия, косметология, агропромышленность, связанная с производством продуктов питания, бумажная промышленность и т.д.

Существует много способов получения микрокапсул, которые описаны в литературе, в частности можно назвать: - метод разделения фаз, описанный в патенте США 4675189 и в Европейской заявке на патент ЕП 52510, описывающий получение микрокапсул методом разделения фаз с использованием агента коацервации, такого как минеральные масла или растительные.

Однако микрокапсулы, полученные этим способом или аналогичными способами, имеют недостаток, заключающийся в том, что образуются агглютинаты /склеенные между собой частицы при получении названных микрокапсул, - метод выпаривания растворителя, описанный, в частности, в патенте США 4479911, и в Европейских заявках ЕП 301969 и ЕР145240, этот метод включает раздельное образование: органической фазы путем растворения соответствующего полимера в несмешиваемом с водой и летучем растворителе, и водной фазы, содержащей активное начало, введение водной фазы в органическую фазу, смешивание обеих фаз путем перемешивания и/или в присутствии эмульгатора, затем выпаривание растворителя, обычно при перемешивании и при температуре окружающей среды, чтобы получить желаемые микрокапсулы.

Заявка ЕП 145240 описывает, в частности, микрокапсулы, полученные путем приготовления первичной эмульсии В/М, состоящей из одного внутреннего водного слоя, содержащего гидрофильное вещество и вещество, удерживающее лекарство /натуральный или синтетический растительный клей, или соединения с высоким молекулярным весом и, в частности, желатин/ и из одного масляного слоя, содержащего полимер, предпочтительно полимолочную кислоту, или сополимер молочной кислоты с гликолевой кислотой или их смесь, в растворителе, не смешивающемся с водой, таком как дихлорметан, затем загущают или отверждают внутренний водный слой до достижения вязкости, превышающей 5000 сП, с последующим приготовлением вторичной эмульсии В/М/В в присутствии подходящего поверхностно-активного вещества, и наконец из полученной эмульсии выпаривают растворитель. Способ, описанный в этой заявке, позволяет получить капсулы диаметром от 0,5-400 мкм. Во всех случаях микрокапсулы или микросферы известного уровня техники имеют большой недостаток, заключающийся в том, что их диаметр составляет около 1 мкм или выше /1-1250 мкм/; однако существует множество областей применения, где требуются частицы со значительно меньшим диаметром, например порядка 1 нм или больше, например 20-600 нм.

Следовательно, задача изобретения состоит в получении желатиновых микросфер, диаметр которых можно регулировать и может достигать в случае необходимости 20 нм.

Объектом настоящего изобретения являются микросферы, отличающиеся тем, что они содержат полярное желатинированное ядро (GPC = gelified polar core), вокруг которого нанесены концентрично и поочередно липидных двойных слоев или водных слоев в жидком состоянии и желатинированных полярных слоев, где является целым числом; причем эти слои получены делипидированием липосом, называемых липогелосомами® (товарный знак, зарегистрированный на имя фирмы ЛИПОГЕЛЬ и обозначающий липосомы с желатинированным полярным ядром), которые содержат по меньшей мере один внешний двойной липидный слой и по меньшей мере одну внутреннюю полярную водную фазу, содержащую желатинированное вещество.

Преимущество таких микросфер состоит в том, что они имеют регулируемый диаметр, предпочтительно равный от 20 до 600 нм, - они стабильны, - в них могут капсулироваться активные водорастворимые вещества, - могут высвобождать сразу же активное начало или с замедленным его выделением в зависимости от температуры плавления желатинированного вещества,
- могут использоваться как основа для подвески лиганд, веществ, малораспознаваемых ретикулоэндотелиальной системой /скрытые микросферы/; электрически заряженных соединений /при электрическом воздействии на "мишени" в электротерапии/, и
- способны стать скрытыми /т.е. нераспознаваемыми ретикулоэндотелиальной системой/, если они имеют диаметр порядка 20-40 нм.

Согласно изобретению, желатинированное вещество выбирают из желатинируемых соединений как полимеризуемых, так и неполимеризуемых, таких как полисахариды, полипептиды или полиакриламиды.

Предпочтительно неполимеризуемое желатинируемое вещество выбирают из желатины, агарозы или каррагенанов, а полимеризуемое желатинируемое вещество выбирают из полиакриламидных гелей.

Такие липосомы с желатизированным полярным ядром или липогелосомы описаны в патенте ЕП 0393049, в котором указывается, что они состоят из двухслойной межфазной фазы, в случае однопластинчатых липогелосом, или из нескольких межфазных двухслойных фаз, наложенных концентрично, в случае многопластинчатых липогелосом, и из одной внутренней инкапсулированной желатинированной водной полярной фазы.

Этот патент описывает, в частности, способ получения таких однопластинчатых или многопластинчатых липогелосом: водная инкапсулированная желатинированная фаза, образуемая из первоначальной жидкой водной фазы, в которой названные липогелосомы получены трансформацией названной водной фазы в гель благодаря присутствию в этой водной фазе одного или нескольких желатинируемых соединений, полимеризуемых или нет; неинкапсулированная водная фаза может, кроме этого, стать нежелатинируемой в результате физического, химического или энзиматического воздействия.

Одна или несколько двухслойных межфазных фаз состоят, например, из липидов класса 4 /фосфолипиды/, в некоторых случаях в смеси с липидами класса 2 и класса 3 /свободный холестерин/ и/или из липидов класса 5. Эта классификация липидов, предложенная профессором Hauton и сотр., основанная на коэффициентах разделения K_D между водной полярной фазой и межфазной фазой, однослойной или двухслойной, и K_C между межфазной фазой и гидрофобной фазой или неполярной, будет использоваться в описании /Hauton и Lafont, Биохимия, 1987, 69, 177-204/, она описана также в патенте ЕП 393049, указанном выше.

Также липогелосомы /LGS/ обычно классифицируют по числу двойных слоев:
- маленькие и большие липогелосомы однопластинчатые;
SULGS = small unilamellar lipogelosomes;
LULGS = large unilamellar lipogelosomes.

- многопластинчатые липогелосомы: MLGS = multilamellar lipogelosomes.

Согласно изобретению, этап делипидирования названных липогелосом может быть осуществлен разными способами и привести к желатинированным микросферам регулируемого диаметра:
а/ поверхностное делипидирование однопластинчатых или многопластинчатых липогелосом осуществляют путем:
1/ экстракции поверхностного липидного двойного слоя из названных однопластинчатых или многопластинчатых липогелосом с помощью органического растворителя (или смесью органических растворителей), не смешивающегося с водой;
2/ бифазного разделения органической фазы и водной фазы;
3/ отделением водной фазы, содержащей желатинированные микросферы, поверхностно делипидированные /удаление наиболее поверхностного двойного слоя/.

В случае делипидирования однопластинчатых липогелосом (удаление единственного липидного двойного слоя) получают желатинированные микросферы согласно изобретению. Называемые гелосомы® /GS/ товарный знак, также зарегистрированный на имя фирмы ЛИПОГЕЛЬ (маленькие гомогенные гелосомы, обозначаемые SHGS = small homogenous gelosomes, и большие гомогенные гелосомы, обозначаемые LHGS = homogenous gelosomes), или гомогенные полимерисомы® (товарный знак, зарегистрированный на имя фирмы ЛИПОГЕЛЬ и обозначающий также желатинированные микросферы согласно изобретению/, т.е. не содержащие никакого липидного двойного слоя и состоящие таким образом из гомогенных желатинированных водных микросфер, соответствующих желатинированному полярному ядру /GPC/, указанному выше, полимеризованному или нет.

В случае поверхностного делипидирования многопластинчатых липогелосом /уделение наиболее поверхностного липидного двойного слоя/, получают гибридные структуры между липогелосомами /LGS/ и гелососомами /GS/, называемыми многослойными гибридными гелосомами /MGS/ гибрид MGS = hibrid multilayered gelesomes/ или многослойными гибридными полимерисомами, состоящими из желатинированного полярного ядра /GPC/, полимеризованного или нет, на которое нанесены концентрично двойные липидные слои, разделенные желатинированными водными слоями, полимеризованными или нет, причем наиболее внешний слой является желатинированным водным слоем, полимеризованным или нет. Такие микросферы согласно изобретению представляют собой;
- однопластинчатые липогелосомы (LGS), когда первоначальные неделипидированные липогелосомы, служащие для их получения, были двухпластинчатыми или
- многопластинчатые липогелосомы (LGS), когда первоначальные неделипидированные липоголосомы, служащие для их получения, были многопластинчатыми;
эти микросферы окружены поверхностным водным слоем, полимеризованным или нет /Таблица 1 и фигуры 2 и 3/.

Органическим растворителем, не смешивающимся с водой, является гептан, но не в ограничительном смысле.

б/ Полное делипидирование однопластинчатых и многопластинчатых липогелосом путем:
1/ липидной экстракцией однопластинчатых или многопластинчатых липогелосом с помощью органического растворителя или смесью органических растворителей, которые полностью смешиваются с водой или частично;
2/ бифазное разделение органической фазы и водной фазы;
3/ отделение органического /их/ растворителя /лей/ от водной фазы; и
4/ отделение желатинированных и полностью делипидированных микросфер.

Согласно изобретению, когда первый этап /1/ выполнен с помощью органической фазы, смешивающейся с водой, добавляют неполярный органический растворитель перед этапом /2/, что позволяет осуществить таким образом бифазное разделение.

В случае полного делипидирования однопластинчатых липогелосом /удаление единственного двойного липидного слоя получают гомогенные гелосомы /GS/ или гомогенные полимерисомы, такие как указаны выше.

В случае полного делипидирования двухпластинчатых липогелосом получают полярное желатинированное ядро /GPS/, полимеризованное или неполимеризованное, окруженное одним водным слоем в жидком состоянии, и одним поверхностным водным слоем в желатинированном состоянии, полимеризованном или неполимеризованном.

В случае полного делипидирования многопластинчатых липогелосом получают гелосомы /GS/ многослойные (MGS = или multilayered gelosomes) многослойные полимеросомы, состоящие из желатинированного полярного ядра /GPC/, возможно полимеризованного, на которое нанесены концентрично водные желатинированные слои, полимеризованные или неполимеризованные, разделенные между собой водными слоями в жидком состоянии.

Органическим растворителем в данном случае является преимущественно, но не ограничительно н-бутанол.

Объектом настоящего изобретения является также способ получения микросфер, содержащих желатинированное полярное ядро, вокруг которого нанесены при необходимости концентрично и попеременное липидных двойных слоев или водных слоев в жидком состоянии и желатинированных полярных слоев, причем является целым числом, отличающийся тем, что он включает:
а/ получение липосом, называемых липогелосомами, содержащих n+1 двойных липидных слоев, из которых один внешний липидный двойной слой и, по меньшей мере, одна дисперсная внутренняя водная полярная фаза содержат желатинированное вещество, и
б/ делипидирование названных липогелосом.

Этап а/ описан в патенте ЕП 0393049.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа, перед этапом делипидирования липогелосомы сортируют в зависимости от их диаметра с помощью ультразвука.

Согласно другому также предпочтительному варианту осуществления способа, перед этапом делипидирования удаляют с помощью тангенциальной ультрафильтрации неинкапсулированные вещества.

Тогда получают концентрат липогелосом, удержанный на фильтре после ультрафильтрации;
этап делипидирования осуществляют в этом случае из названной удержанной части после ультрафильтрации.

Согласно другому варианту осуществления способа, этап б/ делипидирования при поверхностном делипидировании включает:
1/ экстракцию поверхностного липидного двойного слоя из названных однопластинчатых или многопластинчатых липогелосом с помощью органического растворителя или смеси органических растворителей, не смешивающихся с водой;
2/ двухфазное разделение органической фазы и водной фазы; и
3/ отделение водной фазы, содержащей желатинированные микросферы, после поверхностного делипидирования, описанные выше.

Согласно еще одному варианту названного способа, этап /б/ делипидирования включает в себя при полном делипидировании:
1/ экстракцию из однопластинчатых или многопластинчатых липогелосом с помощью органического растворителя или смеси органических растворителей, смешивающихся с водой, или частично смешивающихся с водой;
2/ двухфазное разделение органической фазы и водной фазы;
3/ удаление органического растворителя из водной фазы, и
4/ отделение желатинированных и полностью делипидированных микросфер, описанных выше.

Кроме вариантов, указанных выше, изобретение включает в себя и другие варианты, которые выявятся из нижеследующего описания со ссылкой на примеры осуществления способа, являющегося объектом данного изобретения, а также на чертежи, в которых
- фиг. 1 иллюстрирует желатинированную микросферу, полученную делипидированием однопластинчатой липогелосомы;
- фиг. 2 иллюстрирует желатинированную микросферу, полученную поверхностным или полным делипидированием двухпластинчатой липогелосомы;
- фиг. 3 иллюстрирует желатинированную микросферу, полученную поверхностным и полным делипидированием многопластинчатой липогелосомы;
- фиг. 4 иллюстрирует изменение молярных объемов однопластинчатых липогелосом, в зависимости от радиуса R /координаты лог/лог/;
- фиг. 5 иллюстрирует изменения молярных объемов гомогенных гелосом (маленьких и больших) в зависимости от радиуса R - h /координаты лог/лог/;
- фиг. 6 иллюстрирует изменения молярных объемов многопластинчатых липогелосом в зависимости от радиуса R /координаты лог/лог/.

Эти примеры даны только в качестве иллюстрации объекта изобретения и никоим образом не ограничивают изобретение.

Различные типы желатинированных микросфер по изобретению показаны в таблице 1, а также на фиг. 1-3.

Фиг. 1 иллюстрирует желатинированные микросферы как полимеризованные, так и неполимеризованные, полученные путем поверхностного или полного делипидирования однопластинчатой липогелосомы.

Однопластинчатые липогелосомы (SULGS и LULGS) содержат желатинированное полярное ядро /GPC/, либо полимеризованное, либо неполимеризованное /представлено белым цветом/ с радиусом R_GPC и двойной слой из фосфолипидов /представлено черным цветом/, с толщиной "h", равной 10^-8 см, в целом, радиус названных однопластинчатых липогелосом равен R=R_GPC + h,
Путем делипидирования однопластинчатой липогелосомы получают гомогенную гелосому /SHGS и LHGS/, в которой желатинированное полярное ядро неполимеризовано, или гомогенную полимерисому, в которой желатинированное полярное ядро полимеризовано.

Радиус желатинированной микросферы согласно изобретению как полимеризованной, так и неполимеризованной обозначается R_GPC.

Жидкая водная фаза, окружающая липогелосомы и микросферы, представлена прерывистыми линиями /штрихом/.

Фиг. 2 изображает желатинированные микросферы, полимеризованные или неполимеризованные, полученные путем поверхностного или полного делипидирования двухпластинчатой липогелосомы.

Фиг. 2,А изображает двухпластинчатую липогелосому, содержащую желатинированное полярное ядро /GPC/, полимеризованное или нет /представлено белым цветом/, с радиусом R_GPC и два липидных двойных слоя /представленных черным цветом/, имеющих толщину "h" равную 10^-8 см, и разделенных желатинированным водным слоем, с толщиной H; в целом радиус названных двухпластинчатых липогелосом /LGS/ равен:
R_LGS = R_GPC + 2h + H (1)
Фиг. 2, B изображает многослойные гибридные гелосомы или полимерисомы, полученные поверхностным делипидированием названных двухпластинчатых липогелосом /LGS/: извлечен только один поверхностный липидный двойной слой с получением микросфер, которые содержат желатинированное полярное ядро, полимеризованное или нет, окруженное одним двойным липидным слоем, и одним поверхностным желатинированным водным слоем с толщиной H, полимеризованным или нет.

Радиус этих микросфер составляет
R = R^GPC + h + H (2)
Фиг. 2, C изображает многослойные гелосомы или полимерисомы, полученные путем полного делипидирования названных двухпластинчатых липогелосом: извлечены оба липидных двойных слоя с получением негомогенной гелосомы или полимерисомы, состоящей из желатинированного полярного ядра /GPC/, полимеризованного или нет, одного водного слоя в жидком состоянии с толщиной h, и одного поверхностного желатинированного водного слоя, полимеризованного или нет, с толщиной H; радиус этих микросфер составляет
R = R_GPC + h + H
Фиг. 3 изображает многослойные гелосомы или полимерисомы, полученные путем поверхностного или полного делипидирования многопластинчатых липогелосом /MLGS/.

Эти многопластинчатые липогелосомы содержат желатинированное полярное ядро /GPC/, полимеризованное или неполимеризованное /представленное белым цветом/, с радиусом R_GPC и n липидных двойных слоев /представлены черным цветом/, где n = 3, причем толщина каждого двойного слоя h = 10^-8 см; радиус названных многопластинчатых липогелосом составляет
R_LGS = R_GPC + nh + (n-1)H (3)
в частности, когда n = 3, этот радиус равен:
R_GPC + 3h + 2H (4)
Путем поверхностного делипидирования названных трехпластинчатых липогелосом получают гибридные многослойные гелосомы или полимерисомы, содержащие желатинированное полярное ядро /GPC/, полимеризованное или нет, один липидный двойной слой, затем первый желатинированный водный слой, второй липидный слой, затем поверхностный второй желатинированный водный слой, полимеризованный или нет.

Радиус таких микросфер равен:
R = R_GPC + 2h + 2H (5)
Путем полного делипидирования названных трехпластинчатых липогелосом получают многослойные гелосомы или полимерисомы, содержащие желатинированное полярное ядро /GPC/, полимеризованное или нет, первый водный слой в жидком состоянии /представлен штрихом/, первый желатинированный водный слой, второй водный слой в жидком состоянии, затем поверхностный второй желатинированный водный слой, полимеризованный или нет.

Радиус таких микросфер по изобретению равен:
R = R_GPC + 2h + 2Н
Пример 1: Определение физических параметров липогелосом /LGS/ и микросфер согласно изобретению (при поверхностном или полном делипидировании): измерение диаметров микросфер.

Для того чтобы следовать стандартному методу расчета физических параметров определенного типа сферических частиц, необходимо строгое соблюдение системы единиц LMT.

Среди различных единичных систем старая система единиц C.G.S (сантиметр - грамм - секунда) лучше всего освоена биологами на практике. Однако очень легко перейти от одной системы единиц к другой путем использования соответствующих переходных коэффициентов.

В соответствии с системой C.G.S всегда выражают длину в см, поверхность в см², объем в см³, плотность в г/см³, концентрацию в г/см³ или в мол/см³, а время в с, эти условия необходимы для того, чтобы получить стандартные модели, отсутствие которых создает неувязку между биологическими науками, если не использовать связующую систему единиц (Hauton J.C. и сотр. Biochimie 1987, 69, 177-204, Биодинамика липидов: новые перспективы).

1/ Физические параметры частиц сферической формы:
сферическая частица X, такая как липогелосома /LGS/, гелосома /GS/ или гибридная структура между липогелосомой /LGS/ и гелосомой /GS/, с радиусом R в см, означает многомолекулярную единицу с объемом V_X, выраженным в см³, с плотностью d_x в г/см³, с массой m_x в г и с поверхностью S_X в см² /физические параметры частицы изображают маленькими буквами/.

Таким образом, один моль частиц X, т.е. N частиц X или 6.023·10²³ частиц /молярные физические параметры выражают заглавными буквами/ имеет молярный объем МV, в частности MV_x для V_xN см³, равный 4/3 π R³N см³ или 25,22·10²³R³см, молярную массу MM, в частности MM_x для m_xN_r или 25,22·³d_X г, а молярную поверхность MS, в частности MS_X для s_xN см², равную 4 π R²N см² или 75,68·10²³R² см² (4/3 π = 4,188; 4/3 π N = 25,23·10²³; 4 π = 12,5664 и 4 π N = 75,69·10²³).

Если концентрация частиц X выражена в мол.см^-3 на [X], то получают на см³ определенного эталонового объема /водная фаза, in vitro цельная кровь, плазма, промежуточная жидкость, желчь и т.д./ следующее соотношение, определяющее число n_X частиц на см³:
n_X = [X]N или n_X = [X]/N^-1
величина, обратная числу Авогадро N^-1, равная 0,166·10^-23, становится константой, выражающей в мол.см^-3 концентрацию одного атома, одной молекулы или одной частицы/. Физический или химический молярный параметр частицы, умноженный на N или разделенный на N^-1, дает значение этого параметра на частицу.

2/ Делипидирование однопластинчатых липогелосом /LGS/;
В случае однопластинчатых липогелосом /LGS/ с радиусом R в см получают желатинированную инкапсулированную водную фазу, полимеризованную или нет, называемую PP (полярная фаза), находящуюся в форме сферы с радиусом /R-h/ см, где h обозначает толщину в см поверхностного липидного двойного слоя, называемого BIP /Bilayer Interfacial Phase). Инкапсулированная желатинированная водная сфера обозначается символом GPC (Gelified Polar Core).

Результаты получают методом подсчета, изложенным выше, и показывают физические характеристики однопластинчатых липогелосом /LGS/ разных диаметров, а также микросфер согласно изобретению, т.е. желатинированных и полученных путем делипидирования.

Используются следующие символы:
R = данный радиус липогелосом /LGS/ в см,
h = толщина в см одного поверхностного липидного двойного слоя /BIP/, равного приблизительно 40х10^-8 см (т.е. 40 или 4 нм). Половина слоя BIP составляет приблизительно 20·10^-8 см.

MV_LGS = молярный объем в см³ липогелосом /LGS/ с данным радиусом R.

MV_GPC = молярный объем в см³ желатинированного полярного ядра /GPC/ однопластинчатых липогелосом /LGS/ с данным радиусом R, т.е. молярный объем микросфер, полученных путем делипидирования однопластинчатых липогелосом.

MV_BIP = молярный объем в см³ единственного поверхностного липидного двойного слоя /BIP/, окружающего однопластинчатые липогелосомы /LGS/ с данным радиусом R.

MV_BIP(e) = молярный объем внешнего фосфолипидного монослоя единственного поверхностного липидного двойного слоя (BIP), окружающего однопластинчатые липогелосомы /LGS/ с данным радиусом R.

MV_BIP(i) = молярный объем внутреннего фосфолипидного монослоя единственного поверхностного липидного двойного слоя /BIP/, окружающего однопластинчатые липогелосомы /LGS/ с данным радиусом R.

MS_LGS = молярная поверхность в см² липогелосом /LGS/ с данным радиусом R.

MS_GPC = молярная поверхность в см² желатинированного полярного ядра /GPC/ с радиусом /R - h/см, т.е. молярная поверхность желатинированных микросфер, полученных делипидированием.

Представлено четыре примера:
а/ однопластинчатые липогелосомы /LGS/ с радиусом R = 100·10^-8 см /т.е. диаметр, равный 20 нм/:
MV_LGS = 2,55 · 10⁶ см³
MV_GPC = 0,54 · 10⁶ см³ /т.е. 22 MMV_LGS/
MV_BIP = 1,98 · 10⁶ см³ /т.е. 78% MV_LGS/
MV_BIP(e) = 1,23 · 10⁶ см³ /т.е. 62,2% MV_BIP/
MV_BIP(i) = 0,75 · 10⁶ см³ /т.е. 37,8% MV_BIP/
MS_LGS = 7,57 · 10¹² см²
MS_GPC = 2,72 х 10¹² см².

б/ Однопластинчатые липогелосомы /LGS/ с радиусом R = 500 · 10^-8 /т.е. диаметр 100 нм/:
МV_LGS = 315 · 10⁶ см³
MV_GPC = 247 · 10⁶ см³ /т.е. 77,9% MV_LGS/
MV_BIP = 70 · 10⁶ см³ /т.е. 22,1% MV_LGS/
MV_BIP(e) = 36 · 10⁶ см³ /т.е. 52% MV_BIP/
MV_BIP(i) = 33 · 10⁶ см³ /т.е. 48% MV_BIP/
MS_LGS = 189 · 10¹² см²
MS_GPC = 160 · 10¹² см².

с/ Однопластинчатые липогелосомы /LGS/ с радиусом R = 2500 · 10^-8 см /т. е. диаметром 50 нм/:
MV_LGS = 39413 · 10⁶ см³
MV_GPC = 37545 · 10⁶ см³ /т.е. 95,3% MV_LGS/
MV_BIP = 1862 · 10⁶ см³ /т.е. 4,7% MV_LGS/
MV_BIP(e) = 939 · 10⁶ см³ /т.е. 50,4% MV_BIP/
MV_BIP(i) = 923 · 10⁶ см³ /т.е. 49,6% MV_BIP
MS_LGS = 4730 · 10¹² см²,
MS_GPC = 4580 · 10¹² см²
д/ однопластинчатые липогелосомы /LGS/ с радиусом R = 10000 · 10^-8 /т.е. диаметром 2000 нм или 2 мкм/:
MV_LGS = 2522432 · 10⁶ см³
MV_GPC = 2492284 · 10⁶ см³ /т.е. 98,8% MV_LGS/
MV_BIP = 30155 · 10⁶ см³ /т.е. 1,2% MV_LGS/
MV_BIP(e) = 15108 · 10⁶ см³ (т.е. 50,1% MV_BIP/
MV_BIP(i) = 15047 · 10⁶ см³ /т.е. 49,9% MV_BIP/
MS_LGS = 75690 · 10¹² см²
MS_GPC = 75076 · 10¹² см²
Путем делипидирования маленьких /SULGS/ или больших /LULGS/ однопластинчатых липогелосом экстрагируют единственный поверхностный липидный двойной слой: остаются только желатинированные полярные ядра /GPC/, образующие таким образом гомогенные гелосомы /GS/, полимеризованные или не полимеризованные, как указано выше.

Фиг. 4 и 5 показывают в координатах лог/лог, с одной стороны, изменения величины MV_LGS в см³, в зависимости от радиуса R в см и с другой стороны, изменения MV_GS в зависимости от радиуса /R-h/, выраженного в см.

Результаты, выраженные в МV /молярный объем/ в см³. моль^-1 могут выражаться в ММ /молярная масса/ в г·моль^-1 при умножении MV на плотность d в г·см^-3. Зная плотность d_PP желатинированной инкапсулированной водной фазы, полимеризованной или нет, и плотность поверхностного липидного двойного слоя d_BIP, можно подсчитать плотность d_LGS липогелосом /LGS/ или плотность d_GS/ гелосом /GS/.

3/ Делипидирование многопластинчатых липогелосом /LGS/:
Многопластинчатые липогелосомы /MLGS/ состоят из желатинированного полярного ядра (GPC), полимеризованные или нет, с радиусом R_GPC, выраженным в см, на которое концентрично наносят первый липидный двойной слой толщиной "h", равной приблизительно 40·10^-8 см, затем желатинированный водный слой, полимеризованный или нет, с толщиной H порядка 100 · 10^-8 см, затем второй липидный слой и т.д.

Символ n означает число липидных двойных слоев, а радиус R многопластинчатой липогелосомы /MLGS/ определяется по уравнению /3/, указанному выше.

Таблица II показывает в качестве примера изменения MV_LGS и соответствующее объемное содержание в % желатинированной инкапсулированной водной фазы, полимеризованной или нет (% MV_PP) и липидной фазы липогелосом (% MV_BIP), имеющих R_GPC = 210 · 10^-8 см и n липидных двойных слоев и, таким образом, /n-1/ желатинированных водных слоев, полимеризованных или нет, толщиной 100 · 10^-8 см.

Фиг. 6 показывает в координатах лог/лог/ те же самые параметры для многопластинчатых липогелосом. Практически нужно определять параметры R_GPC, n, h и H каждой многопластинчатой липогелосомы /MLGS/ для конкретизации их физических характеристик.

Согласно изобретению, при поверхностном делипидировании экстрагируют только один внешний или поверхностный липидный двойной слой многопластинчатых липогелосом /MLGS/ с толщиной h. Тогда получают гибридные структуры между липогелосомами /LGS/ и гелосомами /GS/, содержащие желатинированный водный слой толщиной H, полимеризованный или нет, и содержащий /n-1/ липидных двойных слоев, окружающих желатинированное полярное ядро /GPC/, полимеризованное или нет. Радиус этих гибридных структур равен R_LGS- h, где R_LGS - это радиус многопластинчатых липогелосом /MLGS/ перед делипидированием.

Согласно изобретению, при полном делипидировании экстрагируют все липидные двойные слои многопластинчатых липогелосом /MLGS/, оставляя пространство, которое будет заполняться водной полярной фазой в жидком состоянии в результате разделения фаз органическая/водная. Таким образом, получают негомогенные структуры, называемые многослойные гелосомы /MGS/, в которых первоначальная желатинированная инкапсулированная водная фаза, происходящая от многопластинчатых липогелосом /MLGS/, может быть полимеризованной или неполимеризованной. Радиус этих негомогенных гелосом /GS/ равен R_LGS-h, где R_LGS означает радиус многопластинчатых липогелосом перед делипидированием. После полного делипидирования молярный объем в процентах пространства, освобожденного таким образом от липидов и занимаемого жидкой водной фазой, получаемой после разделения растворитель/вода, будет выражаться в % MV_BIP от многопластинчатых неделипидированных липогелосом.

Пример 2: Получение микросфер согласно изобретению.

А. Продукты:
а/ фосфолипиды:
Липидная фаза состоит из фосфолипидов обезжиренной соли (STERN - Франция) в сухом виде и используемой в концентрации 7,5% вес/объем.

б/ неполимеризуемые желатинируемые агенты:
- желатин типа В150 Blooms фирмы Санофи-Биоиндюстри, Франция;
он имеет температуру плавления, равную 30-35^oC, и используется в концентрации 7,5% вес/объем.

- каррагенан фирмы Санофи-Биоиндустри, Франция. Смесь желатин/каррагенан 80/20 (в/в) имеет температуру плавления 50^oC. Эту смесь используют в концентрации 7,5 % вес/объем.

Желатин или смесь желатин/каррагенан при указанных выше соотношениях и концентрации образует неполимеризованную желатинированную водную фазу при температурах, ниже их температур плавления, соответственно ниже 30-35^oC и 50^oC.

с/ Полимеризуемый желатинируемый агент:
- Акриламид/бис-акриламид СИГМА.

Полимеризованную желатинированную водную фазу получают смешиванием продуктов: акриламид/окс-акриламид Сигма, Temed® фирмы Био-Рад и персульфат аммония фирмы Био-Рад при соответствующих концентрациях, в частности используют концентрацию 15% вес/объем акриламид/бис-акриламида.

Гель полиакриламида не является ограничительным примером, выбираемым из полимеризуемых соединений.

д/ Криозащитное вещество:
- сахароза СИГМА используется при 7,5 % вес/объем.

B. Методика работы.

Данные концентрации являются концентрациями, используемыми для начальной водной фазы, в которой диспергированы фосфолипиды.

Среди различных способов, используемых для получения липосом и липогелосом, годных для промышленного осуществления, предпочтительным является следующий способ, так как включает этап ультразвуковой обработки (применяемой в промышленности), который позволяет получить преобладающее количество липогелосом /LGS/, имеющих диаметр порядка 100 нм, т.е. радиус R = 500 · 10^-8 см. Путем квази-эластичной диффузии, измеренной с помощью лазерного гранулометра фирмы Sema - Tech /Ница/, 81% липогелосом LGS/ имеют диаметр около 92,7 нм /радиус R = 413 · 10^-8 см/ и 19% диаметр 312 нм /радиус R = 1560 · 10^-8 см/.

Этот способ включает:
1/ Медленное механическое перемешивание фосфолипидов обезжиренной сои (Stern - Франция) при концентрации 7,5% /в/об/ в течение 3 ч, диспергированных в водной фазе, содержащей желирующий агент /7,5 % желатина или смеси желатин/каррагенан или 15% акриламид/бис-акриламида без Temed® и персульфата аммония/, в жидком состоянии. В случае необходимости добавляют 7,5% /в/об/ сахарозы в качестве криозащитного агента.

а/ для неполимируемых желирующих веществ/желатин или смесь желатин/каррагеназа/ этот этап механического перемешивания осуществляется выше точки плавления этих желирующих веществ.

б/ для полиакриламида в качестве полимеризуемого желирующего вещества, это механическое перемешивание осуществляют без добавления Temed® и персульфата аммония, чтобы помешать процессу полимеризации.

На этом этапе механического перемешивания получают многопластинчатые липосомы /еще не перешедшие в липогелосомы/, имеющие диаметр, который варьируется от 297 нм до 2084 нм со средним диаметром 504 нм /т.е. радиусом R = 2520 · 10^-8 см/.

2/ Ультразвуковая обработка осуществляется с помощью ультразвукового прибора SONROREATOR (Undation Ultrasonics, Louvain-La-Neuve, Бельгия со звуководами из титана, пригодными для объема липосомной суспензии. Работают на частоте 20 кГц и с мощностью, соответствующей объему суспензии. Для объемов порядка 10 см³ время обработки равно 3-4 мин, а для объемов 700-750 см³ оно увеличивается до 10 мин.

а/ Для неполимеризуемых желирующих веществ, указанных выше, ультразвуковую обработку осуществляют при температуре выше точки плавления этих веществ.

б/ для полимеризуемого желирующего полиакриламида добавляют в начале ультразвуковой обработки Temed® и персульфат аммония для инициирования полимеризации. В конце ультразвуковой обработки фазу разбавляют водой, полученный продукт на 1/10 - 1/20-ю части, чтобы помешать полимеризации неинкапсулированной водной фазы в липосомах, в то время как инкапсулированная водная фаза в липосомах будет полимеризоваться.

3/ Удаляют неинкапсулированные соединения путем тангенциального ультрафильтрования, при этом липосомы и/или липогелосомы остаются в удержанной части. Размер используемого оборудования, производимого фирмой Filtron /Франция/, определяется в зависимости от объема, который необходимо обработать. Используемые мембраны имеют пороговую величину разрыва, равную 300 кДа- 1000 кДа /т.е. более точно 300000 - 1 млн. г·моль^-1/.

Если не осуществляют разбавление водой, то тангенциальную ультрафильтрацию липосом следует проводить при температуре, которая выше температуры плавления неполимеризуемых желирующих веществ /желатин или смесь желатин/каррагенан/. Если осуществляют разбавление водой после ультразвуковой обработки, то можно проводить тангенциальную ультрафильтрацию при температуре окружающей среды. Чтобы увеличить эффективность диализа неполимеризуемых инкапсулированных желатинированных соединений, используют папаин для фрагментирования неинкапсулированного желатина. Затем понижают температуру для превращения липосом в липогелосомы, которые затем концентрируются удержанной на фильтре части.

При использовании полиакриламида в качестве полимеризуемого желирующего вещества упомянутое разбавление и ультрафильтрация, которые следуют сразу после ультразвуковой обработки, позволяют удалить полимеризуемое неинкапсулированное вещество, а полимеризуемое инкапсулированное вещество превращает липосомы в липогелосомы.

4/ Поверхностное или полное делипидирование липогелосом /LGS/.

Липогелосомы /LGS/, находящиеся в большей или меньшей концентрации на фильтре, в зависимости от выбранных рабочих условий подвергают поверхностному делипидированию растворителем /или смесью растворителей/, не смешивающимся с водой. В качестве растворителя не смешивающегося с водой используют гептан. Полное делипидирование осуществляют при использовании растворителя, смешивающегося с водой, или преимущественно частично смешивающегося с водой, например, такого, как н-бутанол. После бифазного разделения на органическую фазу и водную фазу различные виды полученных микросфер рекуперируют в водной полярной фазе, в частности маленькие /SHCS/ или большие /LHGS/ гомогенные неполимеризованные гелосомы, маленькие /SHGS/ или большие /LHGS/ гомогенные полимеризованные гелосомы (гомогенные полимерисомы), многопластинчатые липогелосомы /MLGS/, окруженные неполимеризованным желатинированным водным слоем (гибридные структуры между липогелосомами и гелосомами), многопластинчатые липогелосомы /MLGS/, окруженные полимеризованным желатинированным водным слоем /гибридные структуры между липогелосомами и гелосомами) и полимеризованные или неполимеризованные многослойные гелосомы.

Осуществляемый с помощью лазерной гранулометрии и электронной микроскопии контроль за уменьшением диаметров, происходящим в результате поверхностного или полного делипидирования однопластинчатых липогелосом, позволяет определить, что используемый способ осуществляется правильно. Кроме того, количественный анализ липидов в органической фазе, полученной после разделения растворитель/вода, позволяет определить эффективность делипидирования.

Изобретение не ограничивается описанными выше методами выполнения, а включает все варианты, которые могут возникнуть на уровне знаний специалиста, не выходя за рамки изобретения.

Формула изобретения

1. Микросферы, отличающиеся тем, что они содержат желатинированное полярное ядро, на котором наложены концентрично и попеременно либо n липидных бислоев и n желатинированных полярных слоев, либо n водных слоев в жидком состоянии и n желатинированных полярных слоев, причем n обозначает целое число, равное или большее 1, при этом название микросферы могут быть получены путем делипидирования липосом, называемых липосомами с желатинированным полярным ядром, которые содержат по меньшей мере один внешний липидный бислой и по меньшей мере одну внутреннюю полярную водную фазу, содержащую желатинированное вещество.

2. Микросферы по п.1, отличающиеся тем, что желатинированное вещество выбирают из желатинируемых соединений, полимеризуемых или нет, таких, как полисахариды, полипептиды или полиакриламиды.

3. Микросферы по п.2, отличающиеся тем, что желатинированное вещество выбирают из желатина, агарозы или карагенанов, а желатинированное полимеризуемое вещество выбрано из полиакриламидных гелей.

4. Микросферы по одному из пп.1 - 3, отличающиеся тем, что они имеют диаметр, равный 20 - 600 нм.

5. Микросферы по одному из пп.1 - 3, отличающиеся тем, что делипидирование осуществляют путем поверхностного делипидирования полиламеллярных липосом с желатинированным полярным ядром путем экстракции поверхностного липидного бислоя названных полиламеллярных липосом с желатинированным полярным ядром с помощью органического растворителя или смеси органических растворителей, не смешивающихся с водой, бифазного разделения на органическую фазу и водную фазу, и отделения водной фазы, содержащей поверхностно делипидированные желатинированные микросферы.

6. Микросферы по одному из пп.1 - 4, отличающиеся тем, что делипидирование осуществляют путем полного делипидирования полиламеллярных липосом с желатинированным полярным ядром путем экстракции липидов из полиламеллярных липосом с желатинированным полярным ядром с помощью органического растворителя или смеси органических растворителей, смешивающихся с водой или частично смешивающихся с водой, бифазного разделения на органическую фазу и водную фазу, и отделения органического(их) растворителя(лей) от водной фазы, и отделения желатинированных микросфер, полностью делипидированных.

7. Микросферы по п.6, отличающиеся тем, что стадию экстракции липидов осуществляют с помощью органической фазы, смешивающейся с водой, а перед стадией бифазного разделения добавляют аполярный органический растворитель.

8. Способ получения микросфер по одному из пп.1 - 7, содержащих желатинированное полярное ядро, на которое нанесены концентрично и попеременно либо n липидных бислоев и n желатинированных полярных слоев, либо n водных слоев в жидком состоянии и n желатинированных полярных слоев, причем n является целым числом, отличающийся тем, что он включает получение липосом с желатинированным полярным ядром, содержащих n + 1 липидных бислоев, в том числе один внешний липидный бислой, и по меньшей мере одну внутреннюю водную полярную фазу, содержащую желатинированное вещество, и делипидирование названных липосом с желатинированным полярным ядром.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что перед стадией делипидирования проводят отбор липосом с желатинированным полярным ядром в зависимости от их диаметра, отбор проводят преимущественно с помощью ультразвука.

10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что перед стадией делипидирования удаляют неинкапсулированные вещества, предпочтительно путем тангенциальной ультрафильтрации.

11. Способ по одному из пп.8 - 10, отличающийся тем, что стадия делипидирования включает в целях поверхностного делипидирования экстракцию поверхностного липидного бислоя из полиламеллярных липосом с желатинированным полярным ядром с помощью органического растворителя или смеси органических растворителей, не смешивающихся с водой, бифазное разделение на органическую фазу и водную фазу, и отделение водной фазы, содержащей желатинированные микросферы, делипидированные поверхностно.

12. Способ по одному из пп.8 - 10, отличающийся тем, что стадия делипидирования включает в целях полного делипидирования экстракцию липидов бислоя из полиламеллярных липосом с желатинированным полярным ядром с помощью органического растворителя или смеси органических растворителей, смешивающихся с водой или частично смешивающихся с водой, бифазное разделение на органическую фазу и водную фазу, отделение органического(их) растворителя(лей) от водной фазы, и отделение желатинированных и полностью делипидированных микросфер.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10