Новый ослабленный штамм pseudomonas aeruginosa

 

Изобретение относится к новым безопасным ослабленным штаммам Pseudomonas aeruginosa, полученным выделением Pseudomonas aeruginosa в чистом виде согласно иммунотипу Fisher-Devlin и затем неоднократной очисткой выделенного штамма, в особенности штаммов CFCAPA 10142 (КССМ 10029), CFCPA 20215 (КССМ 10030), CFCPA 30720 (KCCM 10031), CFCPA 40057 (КССМ 10032), CFCPA 50243 (КССМ 10033), CFCPA 60534 (КССМ 10034) и CFCPA 70018 (КССМ 10035). Кроме того, настоящее изобретение касается вакцин для иммунизации против инфекции Pseudomonas aeruginosa, которая включает протеины клеточной оболочки, имеющие молекулярный вес от 10.000 до 100.000, полученные из ослабленных штаммов, терапевтическое средство для лечения инфекции Pseudomonas aeruginosa, содержащее иммуноглобулин(ы), вырабатываемые протеинами клеточной оболочки лабораторных животных, и метода их получения. Протеиновая компонента клеточной оболочки ослабленного штамма не является патогенной и безопасна, она проявляет превосходную способность образования антител и полезна для получения вакцины и терапевтического средства. 10 с. и 17 з.п.ф-лы, 2 ил., 14 табл.

НОВЫЕ ОСЛАБЛЕННЫЕ ШТАММЫ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Область изобретения Настоящее изобретение касается новых ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, профилактической вакцины и терапевтического средства для инфекции Pseudomonas aeruginosa и метода их получения. Более точно, настоящее изобретение относится к новым ослабленным штаммам Pseudomonas aeruginosa, полученным выделением Pseudomonas aeruginosa в свободном состоянии согласно иммунотипу Fisher-Devlin, а затем неоднократной очисткой выделенного штамма последовательным пропусканием через мышей, к профилактической вакцине, приготовленной из нее, и терапевтическим иммуноглобулинам, вырабатываемым протеинами клеточной оболочки, выделенными из штамма Pseudomonas aeruginosa, и методу их получения.

Описание предыстории изобретения Pseudomonas aeruginosa представляет собой подвижный грамположительный стержень бактерий, имеющий размеры приблизительно 0.5 um х 1.5 - 3.0 um и единственный жгутик, широко распространенный в почве, воде, сточных водах и кишечнике человека (Mol. Microbiol. 4, 1069 - 1075, 1990). Pseudomonas aeruginosa представляет собой патогенный штамм, вызывающий трудноизлечимые заболевания, такие как сепсис, генерализованная инфекция, хронические инфекции дыхательных путей, фиброзно-кистозная дегенерация поджелудочной железы и т. д. Сепсис, вызванный Pseudomonas aeruginosa - это заболевание, являющееся следствием или инвазии самих микроорганизмов или же секретов их токсических составных частей в кровь пациентов, ослабленных хирургическим вмешательством, разрывом тканей, травмой и т.п. Присутствие токсинов вызывает шок с сильным жаром, повышенным кровяным давлением и другими симптомами, которые в конечном счете приводят к смерти. Более того, так как Pseudomonas aeruginosa был выявлен при инфекциях мочевых путей, интерес к этому штамму значительно вырос. Следовательно, крайне необходимо разработать медицинское средство (или средства), способное эффективно препятствовать или излечивать трудноизлечимые гноеродные заболевания, такие как сепсис и инфекции мочевых путей, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Однако штаммы Pseudomonas aeruginosa устойчивы к большинству антибиотиков и поэтому эффективных превентивных или лекарственных средств для инфекций Pseudomonas aeruginosa не разработано до сих пор. Таким образом, вирулентность инфекций Pseudomonas aeruginosa увеличивается с течением времени.

Штаммы Pseudomonas aeruginosa могут быть классифицированы различным образом. Одна система классифицирует эти штаммы по семи типам согласно иммунотипам Фишера. Другая система, основанная на O-антигенной группе, предложена Terada. Совершенно иную классификационную систему представляет собой Международная Антигенная Схема Типизации (IATS). Согласно классификаций штаммами Pseudomonas aeruginosa, наиболее часто встречающимися у инфицированных Pseudomonas aeruginosa пациентов, являются штаммы типов: 5/2a, 2c, 3,7/3a, 3c, 1/4a, 4b, 6/5a, 5b, 4/6, 2/7a, 7b, 7c, /10a, /13, /12, /11 и 3,7/3d, 3e согласно иммунотипу/O-серотипу Фишера а также иммунотипы 3, 7, 2 и 1 Фишера (соответствующие 3a, 3c, 3d, 3e, 7a, 7b, 7c, 4a, и 4b O-серотипам).

Один из методов лечения инфекций Pseudomonas aeruginosa нейтрализует токсины этого штамма антитоксинами. Однако антитоксин является терапевтическим средством, которое успешно применяется только в случае, если пациенты уже страдают от сепсиса, но он не обладают профилактическим действием. Далее, доступный в настоящее время антитоксин очень дорог и его применение ограничено. Помимо этого, наиболее важным недостатком, связанным с использованием антитоксина, является относительно низкая скорость его лечебного воздействия и серьезные побочные эффекты.

Чтобы избежать недостатков, связанных с применением антитоксина, изучается метод, который использует общий антиген для того, чтобы предотвратить инфекцию Pseudomonas aeruginosa и проводить ее лечение. Методы, которые исследуют получение общего антигена, могут быть в основном разделены на две группы. Первая относится к использованию общего антигена, выделенного и очищенного из штаммов Pseudomonas aeruginosa, имеющих различные иммунотипы, в качестве профилактической антигенной вакцины против инфекций Pseudomonas aeruginosa (Japan, J. Exp. Med. 45, 355 - 359, 1975). Вторая группа относится к использованию массы общего антигена, полученной с применением техники генной инженерии, при которой выделенный генный код целевого антигена внедряют в подходящий вектор, чтобы получить рекомбинантный вектор, а затем на подходящий организм "хозяина" воздействуют этим рекомбинантным вектором и осуществляют инкубирование для выделения целевого антигена.

Хотя с точки зрения теории, разработка профилактической вакцины с использованием общего антигена эффективна, в настоящее время дальнейшие изучения этого метода показывают, что этот метод имеет множество проблем, которые остаются нерешенными. Основной недостаток состоит в том, что общий антиген не может препятствовать распространению всех видов Pseudomonas aeruginosa, имеющих различные иммунотипы, в связи с чем эффективность антигена очень низка. Такая низкая эффективность предполагает наличие другого неизвестного главного антигена, помимо общего антигена, который способен оказать результативный профилактический эффект.

Другой метод лечения инфекции Pseudomonas aeruginosa состоит во введении антибиотических или хемотерапевтических средств, имеющих широкий спектр избирательности относительно штамма Pseudomonas aeruginosa. Однако, так как существует множество штаммов Pseudomnas aeruginosa и они обычно имеют высокую степень стойкости относительно лекарственных средств, то многие пациенты стали жертвами штаммов Pseudomonas aeruginosa, которые не могут быть результативно обработаны антибиотиками.

Кроме того, метод использования терапевтического иммуноглобулина уже разработан. Однако такой иммуноглобулин не имеет совсем или имеет незначительное терапевтическое воздействие на все инфекции Pseudomonas aeruginosa и поэтому он может быть использован только для очень ограниченного типа инфекций Pseudomonas aeruginosa. В основном это происходит за счет того, что иммуноглобулин приготовлен методом получения поликлонального антитела для определенного типа микроорганизма и поэтому он не может воздействовать обычным образом на многочисленные штаммы Pseudomonas aeruginosa.

Предпринимались попытки разработки недорогого терапевтического средства против Pseudomonas aeruginosa, при этом использовали моноклональные антитела мыши (J. Inf. Dis. 152, 1290 - 1299, 1985) или моноклональные антитела человека (FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263 - 268, 1990). В этом случае для получения наиболее эффективных нейтрализующих антител при применении методики клеточного синтеза клеточная линия, отобранная из клеточного банка, затем может быть использована в качестве исходного материала для получения целевого антитела в промышленном масштабе. Однако целью этого метода является получение антитела, а не профилактических вакцин при лечении инфекции Pseudomonas aeruginosa. Кроме того, недостатком этого метода является и то, что поскольку все эти инфекции вызваны разными штаммами Pseudomonas aeruginosa с различными серологическими и иммунологическими типами, то все они не могут быть подвергнуты обработке с помощью одного вида моноклонального антитела. Таким образом, терапия с применением моноклональных антител не может быть использована эффективным образом для лечения всех пациентов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa.

Одновременное введение нескольких видов антител на основании установленной их перекрестной активности было разработано с целью расширения эффективности лечения этим методом. В этом случае кровь пациентов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa, собирают и анализируют для установления серологического и/или иммунологического типа штаммов Pseudomonas aeruginosa. Затем пациенту вводят моноклональные антитела, подходящие для установленного типа штамма. Однако этот метод требует много времени и поэтому непригоден для пациентов, состояние которых требует немедленного лечения.

Ранее было предложено использование протеинов клеточной оболочки, выделенных из штаммов Pseudomonas aeruginosa, в качестве антигена для вакцины (Vaccine, vol. 7, "Experimental studies on the protective efficacy of a Pseudomonas aeruginosa vaccine", 1989). Однако метод, предложенный в указанной выше ссылке, использует только 4 типа штаммов Pseudomonas aeruginosa, а именно штаммы NN 170041, NN 170015, NN 868 и NN 170046, которые не являются ослабленными, и поэтому существует проблема, связанная с токсичностью самих штаммов Pseudomonas aeruginosa. Далее, поскольку при получении протеиновой компоненты вакцины из таких штаммов Pseudomonas aeruginosa клетки могут быть разрушены, то в среду выделяются чужеродные нуклеиновые кислоты и токсичные высокомолекулярные вещества, липополисахариды (ЛПС), присутствующие в цитоплазме. Такие вещества затем внедряются в получаемую вакцины как примеси, повышая при этом ту степень осторожности, с которой необходимо вводить эту вакцину, и ограничивая, возможно, ее использование.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Таким образом, современными изобретателями проведены интенсивные исследования с тем, чтобы найти средства, способные результативно индуцировать антитела против Pseudomonas aeruginosa и проявляющие высокую иммуногенетическую (а именно антигенную) активность в сочетании с очень незначительным риском, вызванным собственной токсичностью самих штаммов Pseudomonas aeruginosa. Современные изобретатели пришли в заключению, что когда штаммы Pseudomonas aeruginosa, выделенные из Pseudomonas aeruginosa инфицированных пациентов, были классифицированы по семи образцам на основе их иммунотипов и затем каждый чистый штамм ослабляли неоднократным пропусканием через нового подходящего животного-"хозяина", то при этом могут быть получены безопасные и ослабленные штаммы Pseudomonas aeruginosa. Протеины клеточной оболочки этих штаммов не только полезны при получении вакцины для профилактики против инфекций Pseudomonas aeruginosa, но они также могут быть использованы в качестве индукторов антител для получения в организме животного иммуноглобулинов для инфекции Pseudomonas aeruginosa. Согласно настоящему изобретению полученные иммуноглобулины показывают очень высокое терапевтическое воздействие на различные инфекции Pseudomonas aeruginosa, включая очень серьезные случаи.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является обеспечение новым и безопасно ослабленным штаммом Pseudomonas aeruginosa, содержащим протеины клеточной оболочки, которые показывают антигенную активность и не обладают токсичностью самого штамма Pseudomonas aeruginosa.

Другим предметом настоящего изобретения является обеспечение вакциной для индуцирования иммунной реакции пациента, принимающего эту вакцину, с тем, чтобы предотвратить его последующее заболевание, вызванное Pseudomonas aeruginosa.

Следующим предметом настоящего изобретения является обеспечение методом получения этой вакцины. Еще одним предметом настоящего изобретения является обеспечение терапевтического средства для лечения инфекции Pseudomonas aeruginosa, которое содержит по меньшей мере один иммуноглобулин для штамма Pseudomonas aeruginosa.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является обеспечение метода получения иммуноглобулина.

Выше были очерчены некоторые из наиболее важных предметов настоящего изобретения. Эти предметы могут быть истолкованы только иллюстративно по сравнению с другими, имеющими большее отношение к предмету настоящего изобретения характеристиками и применениями. При различных применениях сущности настоящего изобретения, или модифицируя настоящее изобретение в пределах предмета его сущности, можно получить и многие другие успешные результаты. Следовательно, другие цели, а также детальное понимание изобретения возможны на основании резюме данного изобретения и подробного описания его предпочтительных воплощений помимо тех рамок, которые установлены пунктами патентной формулы в сочетании с сопутствующими чертежами.

РЕЗЮМЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Одно воплощение настоящего изобретения относится к новым, безопасным и эффективно ослабленным штаммам Pseudomonas aeruginosa, имеющим протеины клеточной оболочки, которые проявляют антигенную активность и не обладают токсичностью самого штамма Pseudomonas aeruginosa. Главным образом, настоящее изобретение относится к безопасным ослабленным штаммам Pseudomonas aeruginosa, которые получены выделением штаммов Pseudomonas aeruginosa от пациентов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa, классифицированием выделенных штаммов микроорганизмов по семи типам образцов согласно иммунотипу Fisher-Devlin, выбором единственного репрезентативного штамма для каждого иммунотипа, очисткой отобранного штамма повторяющимися стадиями инъекция/выделение/повторная инъекция, проводимыми с использованием лабораторных животных, и выбором наиболее ослабленного штамма для каждого из семи типов штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Дальнейшее воплощение настоящего изобретения касается новой вакцины и процесса получения этой вакцины для профилактики инфекции Pseudomonas aeruginosa. Вакцину получают выделением протеинов клеточной оболочки в значительной степени чистом состоянии из каждого из семи типов безопасных ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, как это описано ниже, и дальнейшей очисткой выделенных протеинов клеточной оболочки, а затем путем предпочтительного соединения очищенных протеинов клеточной оболочки, являющихся производными по меньшей мере 3 типов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa. В настоящем изобретении для каждого из этих трех типов, используемых для получения вакцины, указаны предпочтительные эквивалентные количества протеинов клеточной оболочки.

Другим воплощением настоящего изобретения является терапевтическое средство для инфекции Pseudomonas aeruginosa, которое содержит по крайней мере один иммуноглобулин, полученный культивированием по меньшей мере одного безопасного штамма Pseudomonas aeruginosa, очисткой выделенного протеина клеточной оболочки и затем введением чистого протеина клеточной оболочки в качестве индуктора антитела лабораторному животному для индуцирования иммуноглобулина, и метод получения этого терапевтического средства.

Выше очерчены наиболее уместные и важные характеристики настоящего изобретения для того, чтобы последующее детальное описание изобретения было лучше понято и чтобы можно было полностью оценить настоящий вклад в описываемую область деятельности. Дополнительные характеристики изобретения, описанные ниже, представляют предмет пунктов патентной формулы настоящего изобретения. Люди, квалифицированные в этой области, могут оценить, что раскрытые здесь концепция и специфические воплощения могут быть легко использованы как основа для модификации или проектирования других структур, выполняющих те же самые цели, что и настоящее изобретение. Далее, квалифицированные в этой области люди могут понять, что такие эквивалентные конструкции не отступают от существа и границ настоящего изобретения, как это будет указано далее в пунктах патентной формулы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Для полного понимания природы и цели настоящего изобретения необходимо сделать ссылки на приведенное ниже детальное описание, находящееся в связи с сопутствующими чертежами, на которых: Фиг. 1 представляет собой SDS-PAGE очищенных протеинов клеточной оболочки, выделенных из ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению.

Фиг. 2 представляет собой изменение веса мужских особей мышей, которым были внутривенно введены протеины клеточной оболочки ослабленных согласно настоящему изобретению штаммов Pseudomonas aeruginosa.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ РЕАЛИЗАЦИИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ Fisher-Delvin иммунотипы Pseudomonas aeruginosa классифицированы по семи типам, от типа 1 до типа 7. В настоящем изобретении штаммы Pseudomonas aeruginosa, имеющие иммунотипы Фишера 1 - 7, были выбраны как штаммы для ослабления на основании того, что они выявляются в крови пациентов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa, в значительном количестве, а именно 90 - 95% или более. В особенности среди семи типов Pseudomonas aeruginosa тип 1 и тип 3 являются наиболее часто выявляемыми штаммами у пациентов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa. Однако опыт настоящего изобретения может быть использован против любого из штаммов Pseudomonas aeruginosa для обеспечения защиты или лечения.

Согласно настоящему изобретению ослабленные штаммы Pseudomonas aeruginosa могут быть получены при выделении каждого из семи типов штаммов Pseudomonas aeruginosa в чистом виде из крови тех пациентов, которые, как установлено, инфицированы Pseudomonas aeruginosa, и затем ослаблением этих выделенных штаммов при повторных процессах очистки. Безопасными ослабленными штаммами Pseudomonas aeruginosa, полученными этим способом, являются все семь типов, обозначенных как CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534, CFCPA 70018 и представляющих соответственно тип 1, тип 2, тип 3, тип 4, тип 5, тип 6 и тип 7 по классификации Фишера. CFCPA составлено из начальных букв "Cheil Food and Chemical Pseudomonas aeruginosa", которым обозначена фирма Cheil Food and Chemicals Inc., в которой авторы настоящего изобретения работают, и название штамма Pseudomonas aeruginosa.

Ослабленные штаммы Pseudomonas aeruginosa, полученные путем неоднократного процесса очистки, имеют фенотипы и микробиологические свойства, в значительной степени идентичные свойствам соответствующих "родительских" штаммов, но проявляющие новые свойства, полезные при получении вакцины антигена для профилактики против инфекции Pseudomonas aeruginosa в большей степени, чем для любых иных возбудителей заболеваний, которые присутствуют в "родительских" штаммах до их ослабления. Следовательно, ослабленные штаммы Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению следует рассматривать как новые штаммы микроорганизмов. Поэтому эти штаммы являются депозитами Korean Culture Center of Microorganism в Korean Federation of Culture Collection (Корейская Федеральная Коллекция Культур), называемой далее KCCM, в качестве полномочного международного депозитария согласно Будапештского договора от 12 мая 1993 года под номерами для каталога новых поступлений: KCCM 10029 для CFCPA 10142, KCCM 10030 для CFCPA 20215, KCCM 10031 для CFCPA 30720, KCCM 10032 для CFCPA 40057, KCCM 10033 для CFCPA 50243, KCCM для CFCPA 60534 и KCCM 10035 для CFCPA 70018.

Процедуры очисток для получения ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa повторяются до тех пор пока штаммы не достигнут требуемого уровня ЛД50. Хотя число этих процессов очистки или стадий варьируется в зависимости от уровня квалификации специалиста, токсичности "родительских" штаммов и им подобных факторов, предпочтительно проводить очистку от 3 до 7 раз, например до тех пор, пока ЛД50 Psoudomonas aeruginosa не будет оставлять по меньшей мере 2107 клеток. Согласно настоящему изобретению величина ЛД50 новых ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, полученных таким образом, для мышей составляет предпочтительно 2.0107 клеток или более.

Настоящее изобретение обеспечивает также вакциной для иммунизации против инфекции Pseudomonas aeruginosa, эту вакцину получают выделением протеинов клеточной оболочки в чистом виде из каждого из новых ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению с последующей очисткой протеинов клеточной оболочки и сочетанием полученных таким образом протеинов клеточной оболочки при определенном соотношении (предпочтительны эквивалентные количества протеинов клеточной оболочки) каждого из целевого штамма Pseudomonas aeruginosa, иммунизации которого добиваются. Количество, используемое для каждого штамма, таково, что оно является достаточным для индуцирования иммунизации, против которой бы штамм находился в форме "хозяина".

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает методом получения вакцины для иммунизации против Pseudomonas aeruginosa, характеризуемым тем, что ослабленные штаммы Pseudomonas aeruginosa инкубируют в ферментере, поддерживая оптимальные условия для роста с целью получения массы штамма Pseudomonas aeruginosa. Для получения целевых протеинов клеточной оболочки приготовленную массу микроорганизма обрабатывают, используя ряд процедур, включая экстракцию протеинов клеточной оболочки при их обработке органическим растворителем и фракционирование на основе молекулярных весов и ультрацентрифугирование. Полученные протеины клеточной оболочки, являющиеся производными семи типов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, сочетаются друг с другом при подходящем строении и требуемом соотношении, предпочтительно в эквивалентных количествах.

Метод получения вакцин согласно настоящему изобретению можно резюмировать следующим образом (см. таблицу 1).

В дальнейшем составы вакцины настоящего изобретения будут объяснены более подробно со ссылкой на метод их получения.

Для получения вакцин для профилактики против Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению на первой стадии процесса семь типов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, а именно CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 и CFCPA 70018 подвергают инкубированию в соответствующем ферментере подходящего размера. В качестве культуральной среды для этих целей используют соевый бульон трипсина или, предпочтительно, описанную ниже специальную среду, подходящую для инкубирования Pseudomonas aeruginosa.

Специальная среда содержит глюкозу (30 г/л), пептон (15 г/л), MgSO4 (0.5 г/л), CaCO3 (5 г/л), KH2PO4 (1 г/л), FeSO4 (5 мг/л), CuSO4 (5 мг/л) и ZnSO4 (5 мг/л). Эта специальная среда разработана авторами настоящего изобретения для культивирования штаммов Pseudomonas aeruginosa и является новой. Следовательно, эта специальная среда включается в объем притязаний настоящего изобретения. В случае, когда штаммы Pseudomonas aeruginosa выращивают на этой специальной среде, выход бактериальной массы по крайней мере на 30% больше, чем выход массы, выращенной на соевом бульоне трипсина исходя из веса сухой бактериальной массы. Таким образом, использование такой специальной среды является одним из предпочтительных воплощений.

Для такой бактериальной массы оптимальные условия стадии инкубирования следующие: температура 37oC, скорость аэрации 1 объем/объем в минуту, объем посевного материала составляет 5% объем/объем раствора культуральной среды, инкубирование проводится при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение первых 2 ч и затем со скоростью 600 об/мин в течение 10 - 20 ч, предпочтительно в течение 12-16 ч.

По завершении стадии инкубирования проводится вторая стадия, на которой осажденные бактериальные клетки отделяют от культурального раствора с помощью центрифугирования или аналогичным способом. На третьей стадии отделенные таким образом бактериальные клетки обрабатывают с помощью органического растворителя, для инактивирования микроорганизмов и для одновременного удаления клеточной оболочки липидных компонентов. На этой, третьей, стадии органический растворитель предпочтительно выбирать из группы, содержащей ацетон, хлороформ, этанол, бутанол и т.п., причем предпочтение отдается ацетону.

Четвертая стадия включает повторные экстракции протеинов клеточной оболочки, а именно 5 - 6 экстракций, пока сами клетки не разрушены настолько, что потеряно их содержимое. Для этой цели клетки микроорганизмов сохраняют в растворе типа раствора фосфатного буфера, трис-фосфатного буфера и т.п., причем фосфатный буфер является предпочтительным, и подвергают воздействию с помощью смесителя или гомогенизатора для экстракции протеинов клеточной оболочки. Предпочтительно проводить экстракцию при перемешивании со скоростью 100 - 2000 об/в мин и при 4oC. Кроме того, при осуществлении этой, четвертой, стадии следует соблюдать специальные предосторожности для предотвращения разрушения клеток, так чтобы целевые протеины клеточной оболочки могли храниться отдельно от токсичных протеинов, присутствующих в цитоплазме. Таким образом, при проведении процесса экстракции необходимо непрерывно определять, разрушены клетки или нет, определяя присутствие лактата дегидрогеназы или гексокиназы в качестве цитопластической метки энзима.

После этого протеины ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, полученные в виде супернатанта согласно процессу, описанному выше, фракционируют, подвергая их первой и второй ультрафильтрации для получения только тех протеинов, молекулярные веса которых составляют от 10.000 до 100.000. На этой стадии очень важно, чтобы молекулярный вес получаемых в результате протеинов клеточной оболочки находился в пределах 10.000 - 100.000. Причина этого состоит в том, что молекулярный вес протеинов клеточной оболочки составляющий менее 10.000 не обеспечивает необходимый профилактический эффект, как это было установлено в экспериментах на животных, в то время как молекулярный вес более 100.000 может вызвать токсические эффекты за счет присутствия в них высокомолекулярных липополисахаридов (ЛПС).

Каждый их выделенных протеинов клеточной оболочки каждого из семи типов ослабленного штамма Pseudomonas aeruginosa, имеющий молекулярный вес от 10.000 до 100.000, в дальнейшем подвергается очистке ультрацентрифугированием, для удаления любых, возможно незначительных, количеств липополисахарида, которые могут присутствовать. Затем осуществляется стадия по удалению любых бактериальных веществ, для получения в результате протеинов клеточной оболочки ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, которые не являются патогенными и которые обладают значительной чистотой для их использования в качестве вакцины для профилактики против инфекции Pseudomonas aeruginosa.

Протеины клеточной оболочки, полученные из семи типов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, затем соединяют в определенном соотношении для составления вакцины. При рассмотрении частоты случаев заболеваний, вызванных "родительскими" штаммами Pseudomonas aeruginosa до ослабления, соединения протеинов клеточной оболочки следует проводить, смешивая протеины, полученные по крайней мере из трех типов, наиболее предпочтительно из четырех типов и более, а наиболее предпочтительно из всех семи типов штаммов Pseudomonas aeruginosa. Хотя соотношение смешивания меняется от типов штаммов Pseudomonas aeruginosa, из которых получены протеины клеточной оболочки, для последующего соединения предпочтительным соотношением при смешивании протеинов является соотношение эквивалентных количеств.

Например, предпочтительны составы вакцин, согласно настоящему изобретению содержащие протеины клеточной оболочки, полученные из CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 и CFCPA 60534 при соотношении при смешивании 1:1:1.5:0.5; 1: 1:1:1 или 0.5:1.5:1.5:0.5, или вакцина, содержащая все протеины клеточной оболочки, полученные из CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534, CFCPA 70018 при смешивании в значительной степени эквивалентных количеств. По крайней мере, количество смеси каждого из штаммов Pseudomonas aeruginosa протеинов клеточной оболочки, присутствующее в вакцине, - это то минимальное количество, которое достаточно для индуцирования иммунизации подразумеваемого "хозяина"/пациента.

Если это необходимо, то вакцина для профилактики против инфекции Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению может включать, в дополнение к протеину клеточной оболочки, полученному так, как это описано выше, фармацевтически приемлемые наполнители, например гидроксид кальция, фосфат кальция, иммуностимулирующий комплекс, SAF-1, SAFm и аналогичные наполнители, известные людям, квалифицированным в этой области.

При применении в качестве профилактической вакцины против инфекций Pseudomonas aeruginosa используемые дозировки варьируются в зависимости от пола, возраста, веса, состояния здоровья и т.п. объектов, подвергшихся воздействию Pseudomonas aeruginosa, но составляют обычно от 0.5 до 2.5 мг смеси протеина клеточной оболочки каждого из ослабленных штаммов. Это количество получают из бактериальной массы, имеющей сухой вес 0.1 - 0.5 г (что соответствует мокрому весу от 0.5 до 2.5 г). Предпочтительно введение путем внутримышечных инъекций.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения протеин клеточной оболочки, полученный в чистом виде из ослабленного штамма Pseudomonas aeruginosa настоящего изобретения, может быть также использован в качестве индуктора антитела для стимулирования выработки иммуноглобулина у лабораторных животных. Поэтому настоящим изобретением обеспечивается терапевтическое средство для лечения инфекции Pseudomonas aeruginosa, который содержит иммуноглобулин, полученный инъекцией протеина клеточной оболочки в чистом состоянии лабораторному животному для стимулирования выработки иммуноглобулина против Pseudomonas aeruginosa; указанный протеин получен и очищен методом, изложенным выше.

Конкретно, выделенный и очищенный протеин клеточной оболочки, полученный согласно процессу, проиллюстрированному выше, из ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa настоящего изобретения представляет собой антиген, используемый для того, чтобы сделать прививку лабораторным животным, таким как овца, кролик и т. п., с целью стимуляции выработки соответствующего антитела. Кровь лабораторных животных собирают и сыворотку отделяют. Эту сыворотку обрабатывают известным способом для получения целевого иммуноглобулина в чистом состоянии. Для этой цели выделение и очистка иммуноглобулина из выделенной сыворотки могут быть осуществлены согласно методу, хорошо известному в этой области (см. Practical Immunology, 3rd Ed., 1989, 292 - 294), например, смешиванием выделенной сыворотки с дистиллированной водой, добавлением этой смеси к диэтиламиноэтил(ДЭАЭ)-целлюлозе с тем, чтобы иммуноглобулин мог абсорбироваться, удалением супернатанта и последующей промывкой иммуноглобулин-абсорбированная ДЭАЭ-целлюлоза несколько раз с помощью раствора фосфатного буфера для получения чистого иммуноглобулина.

Иммуноглобулин, используемый в терапевтическом средстве для лечения инфекции Pseudomonas aeruginosa, получен иммунизацией лабораторных животных смесью, содержащей протеины клеточной оболочки, выделенные из различных ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa в определенном соотношении. Для этой цели может быть использован смешанный иммуноглобулин, полученный иммунизацией лабораторных животных смесью, содержащей каждый из протеинов клеточной оболочки, полученных из каждого из семи типов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa в определенном соотношении, предпочтительно соотношение эквивалентных количеств. Однако из рассмотрения перекрестной реактивности каждого из иммуноглобулинов следует, что иммуноглобулины, полученные иммунизацией лабораторных животных смесью, которая содержит протеины клеточной оболочки, выделенные из каждого из четырех типов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, приведенных ниже: CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 и CFCPA 60534 при их соотношении 1:1:1:1, обеспечивают значительное терапевтическое влияние на инфекции, вызванные всеми штаммами Pseudomonas aeruginosa, имеющими тип Фишера 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7. Это комбинированное терапевтическое средство предпочтительно для лечения заболевания, вызванного Pseudomonas aeruginosa.

Иммуноглобулин для Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению может быть введен в фармацевтический состав в лиофилизованной или в жидкой форме и может, если это необходимо, дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители, например стабилизаторы, консерванты, изотонические агенты и т. п. Предпочтительно, чтобы фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть использованы, включали, например, маннитол, лактозу, сахарозу, человеческий альбумин и т.д. в случае лиофилизованных составов и физиологический раствор, воду для инъекций, раствор фосфатного буфера, гидроксид алюминия и т. д. в случае жидкого препарата.

Дозировка иммуноглобулина варьируется в зависимости от возраста, веса тела, пола и общего состояния здоровья, при этом вводятся серьезная инфекция Pseudomonas aeruginosa и компоненты смешанного иммуноглобулина. Иммуноглобулин обычно вводится внутривенно взрослым особям в количестве от 0.1 до 1000 мг в день на 1 кг веса тела.

Настоящее изобретение будет более существенно проиллюстрировано следующими примерами, но оно никоим образом не ограничивается ими.

Пример 1. Выделение штамма Pseudomonas aeruginosa из инфицированных Pseudomonas aeruginosa пациентов и их идентификация.

Были асептически собраны аликвоты от 1 до 5 мл каждого из 260 разных образцов крови, взятых у пациентов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa, эти аликвоты выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре. После того как кровь оставляли в холодильнике при 4oC на ночь, ее центрифугировали при 1500 х g (g - ускорение силы тяжести) в течение 10 мин при 4oC для удаления твердых веществ и для получения супернатантной сыворотки. Полученную сыворотку разбавили раствором фосфатного буфера (NaH2PO4 1.15 г, KCl 0.2 г, KH2PO4 0.2 г, NaCl 8.766 г на 1 л) в соотношении 1:10, а затем распыляли на слой питательной среды из трипсинового соевого культурального бульона, добавив предварительно приготовленного агара до 1.5%. Питательную среду инкубировали в течение 12 ч или более в инкубаторе, поддерживая постоянную температуру 37oC в аэробных условиях. Полученные таким образом культуры были затем перенесены на свежие питательные среды, а затем были выделены целевые микроорганизмы в чистом виде, пользуясь известным методом выделения чистых микроорганизмов (см. Thomas D. Brock and Michael Т. Madigan, Biology of Microorganisms 1988, 5th Ed., p. 32 - 33, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey).

Серологические и иммунологические характеристики выделенных штаммов Pseudomonas aeruginosa уже описаны (см. справочник Bergey), а их идентификация может быть определена использованием промышленного набора для анализа согласно аналитическому методу, описанному в J. Gen. Microbiol., 130, 631 - 644, 1984. Каждый штамм Pseudonionas aeruginosa был инокулирован в испытательную трубку, содержащую 5 мл трипсинового соевого бульона, а затем проводили инкубирование при 37oC в аэробных условиях с тем, чтобы концентрация бактериальной массы была доведена до такой величины, чтобы поддерживать поглощение приблизительно 2.0 или более при видимом свете, имеющем длину волны 650 нм.

Аликвота 1 мл была асептически отобрана из этого культурального раствора, и ее центрифугировали при 600xg при 4oC в течение 10 мин. Культуральный супернатантной раствор удалили, а осажденные микроорганизмы суспендировали добавлением такого же количества стерильного физиологического раствора. 15 ul каждой из испытуемой сывороток было добавлено в каждую ячейку из 96-ячеечной микрочашки Петри и перемешано с 15 ul суспензии микроорганизмов, полученных выше для определения произошла ли агглютинация в течение 10 - 30 мин. В этом исследовании идентификация выделенных микроорганизмов может быть легко осуществлена, так как штамм микроорганизма с положительной агглютинацией имеет серотип, идентичный серотипу добавленной к нему сыворотки.

Пример 2. Выбор ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa из каждого из выделенных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Чтобы ослабить штаммы Pseudomonas aeruginosa с целью получения безопасных микроорганизмов для использования в препарате вакцины, был выбран один штамм для каждого из штаммов Pssudomonas aeruginosa, имеющих разные иммунотипы, а затем этот штамм был ослаблен путем повторных очисток.

В этом процессе был выбран контроль токсичного штамма Pseudomonas aeruginosa GN 11189 (Episome Institute, Japan), который показывает 100%-ную летальность в течение 3 дней после внутривенного (или интраперитонеального) введения 2.0106 клеток штамма GN 11189 мужской особи мыши, имеющей вес от 20 до 25 г.

Каждый штамм из выбранных штаммов Pseudomonas aeruginosa, имеющих разные иммунотипы, был культивирован в жидком трипсиновом соевом бульоне при тех же условиях, что и в примере 1, а затем проводили центрифугирование при 600xg в течение 10 мин при 4oC. Полученный таким образом осадок клеток суспендировали в 10 мл физиологического раствора, снова центрифугировали при описанных выше условиях, а затем разбавляли свежим физиологическим раствором для того, чтобы довести содержание клеток до величин 5105, 5106, 5107, 5108 клеток в 1 мл. Каждое из этих разведений вводили внутривенно (или интраперитонеально) одной группе, содержащей 10 мышей. Контрольной группе вводили штамм GN 11189 в количестве 2.0106 клеток на каждое контрольное животное. С того момента, когда летальность в контрольной группе достигла в течение 3 дней 100%, штаммы Pseudomonas aeruginosa были выделены асептически из мыши/мышей, выживших при самих высоких концентрациях клеток. Выделенные штаммы вновь распыляли на питательную среду, содержащую соевый агар трипсина. Каждый штамм микроорганизма был выделен в чистом виде с использованием указанного выше метода выделения чистых микроорганизмов.

Все семь видов первых ослабленных микроорганизмов были пропущены через мышей неоднократно от 3 до 7 раз согласно методу, изложенному выше, и до тех пор, пока для каждого из штаммов микроорганизма не была достигнута целевая величина ЛД50, составляющая по меньшей мере 2.0107 клеток. Безопасные значения для каждого полученного в итоге ослабленного штамма Pseudomonas aeruginosa, выраженные через ЛД50, приведены в таблице 2.

Все семь видов микроорганизмов, как это отмечено выше, показывают величину ЛД50, по крайней мере равную 2.0107 клеток. Следовательно, можно считать установленным, что ослабленные микроорганизмы отобраны.

Пример 3. Идентификация ослабленного штамма Pssudomonas aeruginosa.

К жидкой питательной среде (pH 7.2 - 7.4), приготовленной стерилизацией паром в течение 15 мин в автоклаве при 121oC, добавили стерилизованный 10% вес/объем цетримид до итоговой концентрации 0.3% вес/объем. Асептически отобрали 10 мл аликвоты приготовленной таким образом среды и поместили ее в испытательную трубку, в которую инокулировали по 1 капле каждого из ослабленного штамма Pseudomonas aeruginosa, выделенного в чистом виде, как это описано выше согласно примеру 2, посев культуры производили в течение 12 - 16 ч при 30 - 37oC. Из испытательной трубки, в которой происходил рост микроорганизмов, отобрали 0.5 мл культурального раствора и распыляли на питательную среду из цетримидного агара, а затем проводили инкубирование. Колонию, идентифицированную первой как Pseudomonas acruginosa с помощью образования пигмента, перенесли и затем ее инкубировали на среде Pseudomonas aeruginosa - агар для определения флуоресцина; эта среда содержит: протеазу пептона 2%, глицерол 1%, K2HPO4 безводный 0.15%, MgSO4 7H2O 0.15%, агар 1.5% (вес/объем), pH 7.2. Затем для определения пиоцианина использовали среду Pseudomonas aeruginosa - агар, содержащую: пептон 2%, глицерол 1%, K2SO4 безводный 1%, MgCl2 0.14%, агар 1.5% (вес/объем), pH 7.2. Затем вновь проводили морфологические испытания, тест на питательность и тест на оксидазу для того, чтобы определить присутствие штамма Pseudomonas aeruginosa. Типы выбранных штаммов Pseudomonas aeruginosa определяли согласно международной системе классификации, используя набор антигенов Pseudomonas aeruginosa (производство Difco laboratories, Detroit, Michigan, USA), а затем согласно классификации - по иммуносеротипам Фишера. Результаты этих анализов приведены в таблице 3.

Пример 4. Физиологические характеристики ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

(1) Для каждого из семи видов штаммов Pseudomonas aeruginosa, ослабленных согласно примеру 2, определяли скорость роста, зависящую от величины pH. Каждый штамм микроорганизма инокулировали в 50 мл трипсинового соевого бульона, имеющего pH 7.2, а затем предварительно инкубировали при 37oC в течение 12-16 ч в аэробных условиях при скорости перемешивания 200 об/мин. Каждую предварительно инкубированную бактериальную массу штамма инокулировали в 500 мл свежих порций трипсинового соевого бульона с pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 и pH 9.0, имеющих конечную концентрацию 1% (вес/объем), а затем инкубировали в ферментере при 37oC в условиях, указанных выше. В течение этого времени с каждой из культуральных сред с интервалом в 2 ч был получен образец, концентрация бактериальной массы определялась спектрофотметрически измерением поглощения образца при 600 нм. Эти результаты приведены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, ослабленные штаммы Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению не растут в сильно кислых условиях, например при pH 3.0, но показывают в значительной степени идентичную или одинаковую скорость роста при pH среды в пределах pH 5.0 - 9.0. Таким образом, в настоящем изобретении все семь видов микроорганизмов растут очень хорошо в пределах широкого разброса pH.

(2) Согласно такому же методу, что и в пункте (1), описанном выше, скорости роста штаммов Pseudomonas aeruginosa определяли в зависимости от изменений температуры. Каждый из семи видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa инокулировали в 50 мл трипсинового соевого бульона при pH 7.0, затем предварительно инкубировали 12-16 ч при 37oC в аэробных условиях при скорости перемешивания 200 об/мин. Каждый из предварительно инкубированных штаммов инокулировали в 500 мл трипсинового соевого бульона при pH 7.0, а затем инкубировали в ферментере, где поддерживали различную температуру: 25, 30, 37 и 42oC, прочие условия были такими же, как описанные выше. В течение указанного времени определяли скорость роста в каждом ферментере, измеряя поглощение культурального раствора при 600 нм с помощью спектрофотометрии. Результаты описаны в таблице 5.

Как можно видеть из таблицы 5, все семь видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa показывают наилучший рост при 37oC и показывают также хороший рост при 30 и 25oC. При 42oC, однако, каждый из семи видов штаммов Pseudomonas aeruginosa демонстрирует сравнительно низкую скорость роста по сравнению со скоростью роста при других температурах.

(3) Приведенный ниже эксперимент был осуществлен для определения влияния источника углерода на рост ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa. Каждый из семи видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa инокулировали в 50 мл трипсинового соевого бульона при pH 7.0, а затем инкубировали в течение 12 -16 ч при 37oC в аэробных условиях при скорости перемешивания 200 об/мин. Культуральную среду затем центрифугировали при 6000 х g в течение 10 мин при 4oC в асептических условиях для сбора бактериальной массы, которую потом повторно суспендировали в 10 мл физиологического раствора. Каждые из 50 ul суспензий микроорганизмов, полученных выше, инокулировали в 5 мл среды М9 (Na2HPO4 7H2O 12.8 г, KH2PO4 3 г, NaCl 0.5 г, NH4Cl 1 г), содержащей различные источники углерода (как показано ниже), а затем инкубировали в течение 12 ч. Затем в каждом культуральном растворе определяли прирост микроорганизмов, измеряя абсорбцию при 600 нм (см. таблицу 6).

Характеристики роста ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa в зависимости от источника углерода представляют собой картину, в значительной степени аналогичную характеристикам роста основных штаммов Pseudomonas aeruginosa в зависимости от источника углерода (см. справочник Berley). Однако необходимо отметить, что хотя сообщалось, что Pseudomonas aeruginosa обычно не использует маннозу в качестве источника углерода, ослабленный штамм Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению показывает некоторый рост на среде, содержащей маннозу. Как видно из изложенного выше, ослабленные штаммы Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению можно инкубировать на подходящей среде, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические соединения, аминокислоты, витамины и другие питательные вещества, в аэробных условиях при выбранных значениях pH, температуры и прочих условиях для получения бактериальной массы. Протеины клеточной оболочки, полученные из этой бактериальной массы, используют для приготовления препарата вакцин Pseudomonas aeruginosa.

Для инкубирования ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa в качестве источника углерода могут быть использованы различные углеводы, такие как глюкоза, маннитол, фруктоза и т. д., различные органические кислоты, такие как уксусная, молочная кислота и им подобные. В качестве источника азота могут быть использованы разные органические и неорганические соли аммония, пептон, дрожжевые экстракты, гидролизаты казеина и другие азотсодержащие вещества. В качестве неорганических соединений могут быть использованы сульфат магния, карбонат кальция, сульфат железа, сульфат меди, сульфат цинка, кислый фосфат калия и им подобные. Предпочтительно проводить инкубирование в аэробных условиях при температуре 25 - 37oC, например путем посева в чашку Петри, или жидким культивированием, таким как культивирование при перемешивании или культивирование при аэрации и кручении. Значение pH среды предпочтительно поддерживать в пределах от pH 5 до pH 9 в течение всего периода инкубирования. Предпочтительно, чтобы бактериальная масса, полученная центрифугированием культурального раствора и инкубированная в течение 12 - 16 ч, использовалась для приготовления вакцин, как это описано ниже.

Примеру 5. Инкубирование ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

(1) В 5 л ферментере инкубировали бактериальную массу Pseudomonas aeruginosa, полученную согласно примеру 2 следующим образом. 2.5 л раствора среды, полученной растворением 30 г трипсинового соевого бульона в 1 л дистиллированной воды и доведением pH до 7.2, простерилизовали и затем ввели в 5 л ферментер. Условия инкубирования следующие: температура инкубирования 37oC, скорость аэрации 1 объем/объем в минуту, количество инокулята составляло 5% (объем/объем) от бактериальной массы ослабленного штамма Pseudomonas aeruginosa, полученной в примере 2 для культурального раствора; скорость перемешивания поддерживали равной 100 об/мин в первые 2 ч, а затем продолжали инкубирование в течение 12 - 16 ч при фиксированной скорости перемешивания, равной 600 об/мин. Хотя количество получаемой бактериальной массы иногда было различным в зависимости от штамма Pseudomonas aeruginosa, средний выход бактериальной массы составлял приблизительно 8 г (сухой вес) на литр культурального раствора.

(2) Каждый из семи типов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa инкубировали в тех же условиях, что описаны в пункте (1), за исключением того, что в качестве среды для культивирования Pseudomonas aeruginosa использовали среду, которая содержала глюкозу (30 г/л), пептон (15 г/л), MgSO4 (0.5 г/л), CaCO3 (5 г/л), KH2PO4 (1 г/л), FeSO4 (5 мг/л), CuSO4 (5 мг/л) и ZnSO4 (5 мг/л). С использованием этой специальной среды было получено приблизительно 10.4 - 10.5 г (сухой вес) бактериальной массы каждого из штаммов микроорганизмов. Таким образом, использование специальной среды обеспечивает выход бактериальной массы, которая по крайней мере на 30% (по сухому весу) выше, чем вес, полученный в случае трипсинового соевого бульона.

Пример 6. Частичная очистка протеинов клеточной оболочки от ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Для получения вакцин против Pseudomonas aeruginosa протеины клеточной оболочки, полученные из каждого из семи видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, были частично очищены. Ниже в качестве типичного примера используют штамм типа 3, а именно CFCPA 30720 (KCCM 10031). Однако другие ослабленные штаммы Pseudomonas aeruginosa могут быть также подвергнуты тому же самому методу очистки для получения частично очищенных протеинов клеточной оболочки.

2.5 л специальной среды, такой как использовалась выше в примере 4 (2), ввели в 5 л ферментер, а затем инкубировали в течение 12-16 ч, поддерживая при этом те же условия инкубирования, которые были описаны выше. По завершении инкубирования 2.5 л культурального раствора центрифугировали при 4oC и 6000 x g в течение 20 мин для удаления супернатанта. Осажденные клетки подвергали повторному суспендированию в растворе фосфатного буфера (Na2HPO4 1.15 г, KCl 0.2 г, KH2PO4 0.2 г, NaCl 8.766 г на 1 л, pH 7.2) при 4oC, вновь центрифугировали, а затем промывали тем же раствором фосфатного буфера. К 130 г клеток, полученных таким образом, добавили ацетон в количестве около 3 объемов (примерно 390 мл) от начального объема мокрых клеток и смесь выдерживали при 4oC в течение 12 ч или дольше. Ацетон удаляли из осажденных клеток, а 2 объема (около 260 мл) свежего ацетона от начального объема мокрых клеток вновь добавили к остатку. Полученную в результате смесь перемешивали в течение 5 - 10 мин, а затем центрифугировали при 4oC и 8000 x g в течение 20 мин. Всплывший ацетон удаляли, а к осадку добавили тот же объем ацетона. Смесь перемешивали и центрифугировали способом, описанным выше, для удаления супернатанта. Осажденные клетки сушили на пластине при комнатной температуре для удаления ацетона, высушенные микроорганизмы вновь суспендировали добавлением 250 мл такого же раствора фосфатного буфера, который описан выше для достижения конечной концентрации в 10% (объем/объем). Полученную в результате смесь обрабатывали в гомогенизаторе со скоростью 500 - 1500 оборотов/минуту в течение 10 минут, поддерживая при этом температуру 4oC для того, чтобы экстрагировать протеины клеточной оболочки. Полученную суспензию центрифугировали в течение 30 мин при 8000 - 10000 x g для получения супернатанта. Осажденные клетки отделяли, вновь проводили суспендирование, добавляя такой же объем раствора фосфатного буфера, а затем для получения супернатанта, проводя вторую экстракцию при таких же условиях, что и первую. При соблюдении тех же условий, в которых проводили первую экстракцию, протеины клеточной оболочки экстрагировали повторно 5-6 раз, соблюдая при этом осторожность чтобы не разрушить никакие клетки. Разрушение клеток можно определить, используя специфический протеин в качестве цитоплазмического маркера вещества, а именно лактата дегидрогеназы или гексогиназы. Экстрагированные супернатанты, каждый из которых анализировали, чтобы убедиться, что протеины клеточной оболочки были экстрагированы без включения в себя цитоплазмических протеинов, лактата дегидрогеназы и гексогиназы, были собраны вместе, перемешаны и в конечном итоге центрифугированы в течение 30 мин при 4oC и 1000 х g для получения чистого супернатанта. Полученный таким образом протеиновый раствор состоял только из чистых в значительной степени протеинов клеточной оболочки, концентрация протеинов с помощью количественного анализа протеинов была доведена до и затем поддерживалась в пределах от 1 мг/мл до 2 мг/мл. Далее чистоту протеинового раствора определяли с помощью электорофореза при градиенте концентрации 10-15%. В результате можно было установить присутствие целевых протеинов клеточной оболочки, имеющих молекулярный вес от 10.000 до 100.000 (см. фиг. 1).

Пример 7. Полная очистка сырых протеинов.

Нижеописанный процесс проводили так, чтобы после очистки неочищенного раствора протеинов клеточной оболочки, имеющего концентрацию 1 - 2 мг/мл, раствор содержал только важные компоненты.

Вначале 2-2.5 л неочищенного раствора протеина клеточной оболочки пропускали через мембранный фильтр, рассчитанный на молекулярный вес 100.000, для удаления молекул протеинов, имеющих молекулярный вес выше этой величины. В результате этого процесса протеины, имеющие молекулярный вес ниже 100.000, переходили в фильтрат, а протеины, имеющие молекулярный вес более 100.000, постоянно циркулировали, что позволяло их отделить от малых молекул с молекулярным весом ниже 100.000.

В результате этого раствор протеина был сконцентрирован на 10 - 20% от своего первоначального объема и был успешно промыт 20-25 л (10-кратное количество от первоначального объема протеинового раствора) стерилизованного раствора фосфатного буфера (Na2HPO4 1.15 г, KCl 0.2 г, KH2PO4 0.2 г, NaCl 8.766 г на 1 л) для удаления 90% или более протеинов, имеющих молекулярный вес ниже 100.000. Протеины с молекулярным весом ниже 100.000, выделенные в виде фильтрата, были пропущены через мембранный фильтр на молекулярный вес 10.000 такой же системы для удаления протеинов с молекулярным весом менее 10.000 и других примесей и, чтобы в то же самое время сгустить протеины, имеющие молекулярный вес 10.000 - 100.000 до концентрации 1 мг/мл.

На конечной стадии супернатант ультрацентрифугировали для удаления липополисахаридов (ЛПС) и фрагментов, относящихся к оболочке клетки, следы которых могут присутствовать в полученном супернатанте. Ультрацентрифугирование проводят в течение 3 ч при 180.000 x g - 200.000 x g и при 4oC. После удаления осадков полученный супернатант стерилизовали при фильтровании через 0.2 um фильтр, в результате было получено 250 - 260 мг протеинового состава для последующего использования в вакцинах при профилактике против инфекции Pseudomonas aeruginosa.

Пример 8. Очистка протеинов клеточной оболочки из ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, имеющих разные иммунотипы.

Оставшиеся шесть видов ослабленных согласно настоящему изобретению штаммов Pseudomonas aeruginosa, а именно штаммы CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 50243, CFCPA 60534 и CFCPA 70018, обрабатывали согласно тому же самому методу, который использовали для инкубирования микроорганизмов и для очистки с целью приготовления состава вакцины для штамма CFCPA 30720 Pseudomonas aeruginosa и который описан в примерах 5, 6 и 7. Полученные в итоге составы вакцины Pseudomonas aeruginosa имеют такие же спектральные характеристики, что и состав вакцины CFCPA 307206 при градиенте концентраций 10 - 15%. Помимо этого, в результате сравнения со стандартным маркером молекулярного веса установлено, что все протеины, содержащиеся в составах вакцин, имеют молекулярные веса в пределах от 10.000 до 100.000 (фиг. 1).

Пример 9. Испытания на способность к перекрестной защите смешанных антигенов.

Протеины клеточной оболочки, являющиеся производными от каждого ослабленного штамма Pseudomonas aeruginosa, после стадий выделения и очистки, проведенных согласно методам, описанным в примерах 7 и 8, вводились интраперитонеально в количестве 0.2 мг/кг шестинедельным мужским особям мышей, весящим 23-25 г, в целях иммунизации этих животных. В каждую группу входило 10-15 испытуемых животных. Спустя 1 неделю после иммунизации был произведен отбор крови от 2-3 особей каждой группы для проведения иммуносорбентного анализа с ферментной меткой (ИСАФМ). Оставшимся мышам были введены взятые наугад штаммы Pseudomonas aeruginosa, соответствующие их иммунотипу, при этом введенное количество составляло 10 - 50-кратное количество от начального значения ЛД50 для каждого из штаммов микроорганизма, которые приведены в таблице 2 примера 2. Перекрестная эффективность относительно каждого штамма Pseudomonas aeruginosa исследовалась непрерывно в течение 1 недели. В результате испытаний установлено, что все исследуемые группы продемонстрировали защитные свойства относительно соответствующих штаммов Pseudomonas aeruginosa и что ИСАФМ всех собранных образцов крови дал хорошие позитивные величины, что указывает на улучшение иммунологической реакции.

В настоящем изобретении для получения вакцин, способных демонстрировать защитный эффект относительно инфекций, вызванных любым видом штаммов Pseudomonas aeruginosa, осуществляли обработку четырех видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa (3 типа штаммов Pseudomonas aeruginosa, которые наиболее часто выявляются при инфекциях человека, и 1 вид штамма Pseudomonas aeruginosa, который трудно выявить при заболевании, а именно штаммы CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 и CFCPA 60534) для получения протеинов клеточной оболочки, которые затем соединяли при соотношении эквивалентных количеств и проводили испытания на перекрестную защиту относительно каждого иммунотипа штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Протеины клеточной оболочки, выделенные из четырех видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, как было установлено выше, комбинировали при соотношении эквивалентных весовых количеств (1:1:1:1). Комбинированные протеины клеточной оболочки вводили интраперитонеально мужским особям мышей для их иммунизации. Контрольная группа получала 0.3 мл раствора фосфатного буфера (Na2HPO4 1.15 г, KCl 0.2 г, KH2PO4 0.2 г, NaCl 8.766 г в 1 л). Спустя неделю после иммунизации каждая из испытуемых групп, иммунизированных вакциной Pseudomonas aeruginosa, и контрольная группа, иммунизированная раствором фосфатного буфера, получали Pseudomonas aeruginosa интраперитонеально; использовали 5 различных концентраций, разбавленных серийно в 10 раз, разбавления составляли от 1108 до 1104 клеток. Спустя неделю было подсчитано число выживших животных, по которому определили индекс эффективности (ИЭ). Полученные результаты приведены в таблице 7, где индекс эффективности определяют как частное от деления величины ЛД50 испытуемой группы на величину ЛД50 контрольной группы. Как видно из таблицы 7, вакцина, содержащая протеины клеточной оболочки, полученные из четырех видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, а именно из штаммов CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 и CFCPA 60534, имеет величину ИЭ относительно каждого из иммунотипа штаммов Pseudomonas aeruginosa, равную 3.0 - 18 или более. Таким образом, если считается, что вакцины, имеющие величину ИЭ, равную хотя бы 2, обладают хорошим иммунологическим эффектом, то вакцина согласно настоящему изобретению показывает хороший защитный эффект относительно инфекций, вызванных любым из семи типов штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Согласно процессу, описанному выше, исследовалась способность к перекрестной защите двух вакцин относительно инфекции Pseudomonas aeruginosa. Исключение состояло в том, что использовали смесь протеинов клеточной оболочки, которые являются производными трех типов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa: CFCPA 10142, CFCPA 20215 и CFCPA 30720 (группа I), и смесь протеинов клеточной оболочки, полученных из всех семи видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa (группа II), в которых все протеины клеточной оболочки присутствовали в соотношении эквивалентных количеств; при этом указанные смеси использовали вместо смеси четырех видов протеинов. Результаты этого приведены а таблице 8.

Как видно из приведенных выше результатов, так как вакцина из смешанных протеиновых компонентов согласно настоящему изобретению содержит протеины клеточной оболочки по меньшей мере из трех различных видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, имеющих отличные друг от друга иммунотипы, то эта вакцина демонстрирует очень высокий защитный эффект относительно любого иммунотипа Pseudomonas aeruginosa по сравнению с эффектом, который дает только один известный антиген. Поэтому, хотя индекс эффективности вакцины согласно настоящему изобретению и меняется в зависимости от рода и количества выбранных микроорганизмов из ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, от величины отношения смешиваемых протеинов клеточной оболочки, являющихся их производными, от иммунологического плана и метода и т.п., можно сделать вывод, что вакцина настоящего изобретения эффективна относительно всех видов штаммов Pseudomonas aeruginosa, выявленных в настоящее время в больницах и у пациентов.

Пример 10. Токсикологические испытания протеинов клеточной оболочки.

При приготовлении компоненты вакцины для профилактики инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, следует убедиться в безопасности самих протеинов клеточной оболочки, которые используются как компоненты вакцин, а также в безопасности штаммов микроорганизмов, как это описано в примере 2. В описываемом примере протеины клеточной оболочки прошли частичную очистку, а затем их безопасность исследовалась на лабораторных животных, а именно на мышах. Каждый из ослабленных микроорганизмов инкубировали в 5-литровом ферментере, используя трипсиновый соевый бульон в качестве культуральной среды, а затем проводили обработку согласно процессам, приведенным в примерах 5, 6 и 7. Супернатанты протеинов клеточной оболочки, экстрагированных из ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, собрали вместе и вновь подвергли центрифугированию в течение 30 мин при 1000 x g и при 4oC, для удаления возможно находящихся в растворе мелких частиц. Полученные в результате протеины клеточной оболочки фильтровали через мембранный фильтр Amicon чтобы получить смесь протеинов клеточной оболочки, имеющих молекулярный вес от 10.000 до 100.000. Полученную смесь сгущали до концентрации протеинов 1 мг/мл, а затем стерилизовали с помощью 0.2 um фильтра, чтобы получить протеиновый материал для последующих токсикологических испытаний.

В токсикологических испытаниях в качестве лабораторных животных использовали мужские особи мышей весом 20 - 22 г. Испытуемой группе вводили внутривенно 20 - 100 мг/кг протеинового материала. Контрольная группа получала 25 мл/кг физиологического раствора. Как видно из таблицы 9 и связанной с ней фиг. 2, в испытуемой группе наблюдалась незначительная задержка прибавки в весе на первый день после введения препарата, но на второй и последующие после введения дни наблюдался нормальный рост и не было никаких специальных симптомов. Кроме того, даже на седьмой и в последующие дни не наблюдалось специфических изменений или симптомов во всех органах.

Пример 11. Определение антигенности протеинов клеточной оболочки.

Протеины клеточной оболочки, полученные частичной очисткой ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa таким же способом, который описан в примере 10, были использованы в качестве антигена; их вводили мышам внутривенно с целью иммунизации этих лабораторных животных в количестве 0.1 - 0.2 мг/кг. Спустя неделю после иммунизации было отобрано определенное количество крови от каждой особи из группы мышей, была выделена сыворотка из собранной крови и согласно методу ИСАФМ (J. Clin. Microbiol. 15, 1054 - 1058, 1982) определяли образование антител.

Вначале 100 ul антигена, полученного в примере 10, концентрация которого была доведена до величины 0.1 мг/мл в буфере (раствор 0.05М карбонатного буфера, содержащий Na2HCO3 2.85 г, Na2CO3 1.70 г, H2O 1 г, pH 9.6), добавили в каждую ячейку из 96-ячейковой микрочашки Петри. Затем или в течение 2 ч при комнатной температуре, или при 4oC в течение 12 - 14 ч происходило "приклеивание" протеинов к чашке.

После удаления водного раствора в каждую ячейку чашки добавили 200 ul 1%-й сыворотки бычьего альбумина, а затем при комнатной температуре в течение 1 ч происходила блокировка оставшихся ячеек, не связанных еще с протеинами.

В этом испытании в качестве антитела для контрольной группы использовали сыворотку неиммунизированных мышей. По завершении реакции чашку Петри промыли снова 5 - 6 раз раствором фосфатного буфера (pH 7.0 - 7.2) и добавили в каждую ячейку 100 ul второго антитела и оставили на 1 ч при нормальной температуре для дальнейшего взаимодействия.

После этого чашку Петри энергично промывали 7 или более раз с помощью того же самого промывочного раствора фосфатного буфера (pH 7.0 - 7.2). В каждую ячейку чашки добавили в качестве субстрата 50 ul дигидрохлорида ортофенилендиамина, доведенного до концентрации 0.3 - 0.4 мг/мл в растворе цитратно-фосфатного буфера (0.1 М цитратно-фосфатный буфер, pH 5.0) и оставили для взаимодействия в течение 20 мин при отсутствии света. Затем в каждую ячейку добавили по 50 ul 1N серной кислоты для прекращения взаимодействия. Поглощение каждого из растворов измеряли спектрофотометрически при длине волны 490 нм.

Как это видно из таблицы 10, введение антигена в количестве 0.1 - 0.2 мг/кг в испытуемой группе привело к увеличению иммунитета в 2-5 раз по сравнению с контрольной группой.

Пример 12. Получение иммуноглобулина для Pseudomonas aeruginosa.

Раствор протеина, полученный в примере 7, вводили кроликам для выработки соответствующего иммунитета. Хотя в качестве типичного примера использовали протеин клеточной оболочки, полученный из ослабленного штамма CFCPA 30720 Pseudomonas aeruginosa, такой же метод может быть применен к другим ослабленным штаммам Pseudomonas aeruginosa.

0.5 - 1 мл раствора протеина клеточной оболочки (содержащий 100 - 200 ug протеина клеточной оболочки), полученного из штамма CFCPA 30720 в примере 7, использовали для инокулирования кроликам-альбиносам трижды с интервалом в 7 дней. Затем через определенные интервалы отбирали кровь от каждого кролика и отделяли сыворотку. 100 мл выделенной сыворотки смешивали с 300 мл дистиллированной воды, смесь доводили ДЭ-АЕ-целлюлозой до веса 500 г при 4oC. Полученную смесь энергично встряхивали в течение 1 ч при 4oC, выдерживали, а затем супернатант отделяли и удаляли. Остаток промывали трижды, каждый раз используя 200 мл 0,01 м раствора фосфатного буфера (Na2HPO4 1.15 г, KH2PO4 0.2 г, KCl 0.2 г, NaCl 8.766 г на 1 л, pH 8.0), для того чтобы получить 600 мг иммуноглобулина с чистотой 96% и более.

Пример 13. Терапевтическое влияние иммуноглобулина на инфекцию Pseudomonas aeruginosa.

Терапевтическое влияние иммуноглобулинов штаммов Pseudomonas aeruginosa, полученных в примере 12, на инфекцию Pseudomonas aeruginosa изучалось способом, изложенным ниже. В каждой группе при этом было по 10 мышей. Каждой мыши вводили интраперитонеально 1.0 - 3.0106 клеток каждого из патогенных штаммов Pseudomonas aeruginosa, относящихся к 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 иммунотипам Фишера, для того чтобы вызвать у них инфекцию Pseudomonas aeruginosa. Спустя 2 - 6 ч после этого каждой мыши вводился внутривенно иммуноглобулин для каждого из штаммов с целью изучить их терапевтическое влияние; вводимое количество составляло 0.1-2 мг для каждой особи.

В контрольной группе вместо иммуноглобулина осуществляли внутривенную инъекцию 0.5 мл физиологического раствора. При этом испытании использовали иммуноглобулины CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 и CFCPA 60534 или смесь этих четырех иммуноглобулинов в соотношении эквивалентных количеств.

В результате, летальность в контрольной группе, которая получала только физиологический раствор, в течение 48 ч составила 50% и более и 100% после 72 ч. В испытуемой группе, которая получала соответствующие иммуноглобулины, установлена 80%-я и большая выживаемость спустя 72 ч после введения. Следовательно, можно показать, что иммуноглобулин является эффективным для лечения инфекции, вызванной патогенным штаммом Paeudomonas aeruginosa, имеющим соответствующий иммунотип Фишера. Однако нет иммуноглобулина, который бы оказывал большой эффект на инфекцию, вызванную патогенными штаммами Pseudomonas aeruginosa, имеющими иммунотип 4 и 5 по Фишеру.

С другой стороны, в группе мышей, которая получала комбинацию четырех типов иммуноглобулинов при их весовом соотношении 1:1:1:1, имелось очень высокое терапевтическое воздействие даже на типы Фишера 4 и 5 штаммов Pseudomonas aeruginosa за счет их перекрестной реактивности. Следовательно, смешанный состав иммуноглобулинов согласно настоящему изобретению может быть использован в качестве терапевтического средства, эффективного для инфекции, вызванной штаммами Pseudomonas aeruginosa, имеющими все иммунотипы Фишера. Результаты этого эксперимента приведены в таблицах 11 и 12.

Пример 14. Терапевтическое воздействие комбинированных иммуноглобулинов на инфекцию Pseudomonas aeruginosa.

Четыре вида ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, выбранных в примере 13, а именно штаммы CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 и CFCPA 60534, инкубировали и проводили их экстракцию согласно этим же процессам из примеров 5, 6 и 7 для получения комбинированного состава протеинов клеточной оболочки. Затем трижды с интервалом в 1 неделю проводили его инокуляцию в количестве 1.5 - 2 мг особям козла, осуществляя процедуру так, как это описано в примере 13, с целью получения значительного количества комбинированных иммуноглобулинов, которые затем подвергали очистке согласно известным методам (Practical Immunology, 3 rd Ed., 1989, pp. 292 - 294). Для того чтобы определить иммунологический защитный эффект и терапевтическое воздействие полученного выше очищенного комбинированного иммуноглобулина на патогенный штамм Pseudomonas aeruginosa с разными иммунотипами Фишера, поступали следующим образом. Патогенные штаммы Pseudomonas aeruginosa, имеющие разные иммунотипы, были инокулированы группам мышей (6 групп по 20 мышей в группе), которым предварительно трижды вводили комбинированный иммуноглобулиновый состав; другая группа мышей (6 групп по 10 мышей в группе не получали иммуноглобулинового состава) вводили иммуноглобулины в количестве 1.0 - 3.0106 клеток на каждую особь для того, чтобы наблюдать иммунологический защитный эффект комбинированного иммуноглобулина. Кроме того, еще одной группе мышей (6 групп по 10 мышей в группе) вначале инокулировали патогенный штамм Pseudomonas aeruginosa, а затем спустя 2 - 6 ч вводили внутривенно комбинированный иммуноглобулиновый состав, полученный выше; вводимое количество составило 0.1 - 5 мг на каждую особь весом 20 - 25 мг, для того чтобы наблюдать влияние иммуноглобулинового состава согласно настоящему изобретению.

Как следствие изложенного выше, можно показать, что комбинированный иммуноглобулиновый состав согласно настоящему изобретению обладает 80%-м или большим иммунологическим защитным эффектом и терапевтическим воздействием, составляющим 75% или более (определенным как выживаемость, % спустя 7 дней), в то время как все мыши из контрольной группы умерли в течение 3 дней.

Следовательно, можно определить, что комбинированная иммуноглобулиновая композиция по настоящему изобретению может быть использована как полезное медицинское средство, имеющее как превосходный терапевтический, так и защитный иммунологический эффект.

Пример 15. Технология приготовления лекарственного средства из иммуноглобулинов.

Комбинация протеинов клеточной оболочки, которые были получены при инкубировании и экстракции четырех видов ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, выбранных в примере 13, а именно штаммов CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 и CFCPA 60534, методом, описанным в примерах 5, 6 и 7, вводили мужским особям козлов тем способом, который описан в примере 14, для получения комбинированного иммуноглобулина Pseudomonas aeruginosa, который затем выделяли и очищали. Затем, используя различные фармацевтически приемлемые носители, проводили изготовление таких лекарственных средств, чтобы 1 - 100 мг антитела иммуноглобулина можно было вводить на каждый килограмм веса тела. Приготовленное лекарственное средство из иммуноглобулина вводили мышам, инфицированным Pseudomonas aeruginosa, для определения эффективности иммуноглобулинов в зависимости от вида используемых для иммуноглобулина носителей. Оказалось, что приготовленное жидкое лекарственное иммуноглобулиновое средство с физиологическим раствором для инъекций или с использованием раствора фосфатного буфера в качестве носителя, обладает высокой эффективностью. Использование в качестве носителей в лиофилизированном лекарственном средстве маннитола, сахарозы или лактозы обеспечивает высокую эффективность этих иммуноглобулиновых препаратов. С другой стороны, использование в лиофилизированном лекарственном средстве человеческого альбумина наряду с иммуноглобулином Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению снижает эффективность иммуноглобулина, а использование гидроксида алюминия в качестве носителя в случае жидких лекарственных форм демонстрирует низкую эффективность. Результаты испытаний суммированы в таблице 13.

Пример 16. Эффективность лекарственного иммуноглобулинового состава.

Лекарственные иммуноглобулиновое средство с раствором фосфатного буфера, которое, как установлено в примере 15, обладает высокой эффективностью, изучалось с целью определения его эффективности в качестве профилактического и терапевтического средства для вторичной кожной инфекции при разрывах тканей, ожогах, травмах и т. п. Мышью были получены ожоги в соответствии с методикой ожоговых испытаний (см. J. Infect. Dis. , 131, 688 - 691, 1975). Жидкий препарат, содержащий 0.5 - 1 мг комбинированного иммуноглобулина Pseudomonas aeruginosa в 1 л раствора фосфатного буфера, был изготовлен как спрей, которым обрабатывали место ожога мыши из испытуемой группы для определения его воздействия по сравнению с контрольной группой, которую не обрабатывали иммуноглобулиновым спреем. Результатом этого эксперимента был тот факт, что выживаемость мышей в группе, которая проходила обработку раствором иммуноглобулин-фосфатный буфер, была существенно выше, чем в группе, не подвергшейся обработке. Следовательно, можно показать, что препарат, содержащий иммуноглобулин Pseudomonas aeruginosa, согласно настоящему изобретению демонстрирует очень высокий защитный эффект и очень высокое терапевтическое воздействие на инфекцию Pseudomonas aeruginosa. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 14.

Как описано выше, каждый ослабленный штамм Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению значительно более безопасен по сравнению с взятыми наугад или патогенными смесями. Кроме того, так как их протеины клеточной оболочки демонстрируют превосходную безопасность и способность к перекрестной защите, а также очень хорошую способность образования нейтрализующих антител, то протеины клеточной оболочки могут быть использованы не только в качестве вакцины для профилактики против инфекции Pseudomonas aeruginosa, но также как терапевтическое средство для инфекции Pseudomonas aeruginosa. Следовательно, можно видеть, что штаммы Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению являются очень полезными микроорганизмами для получения профилактической вакцины и терапевтического средства для инфекции Pseudomonas aeruginosa.


Формула изобретения

1. Штамм Pseudomonas aeruginosa, зарегистрированный в Корейской Федеральной Коллекции Культур под номером KCCM 10029 (CFCPA 10142).

2. Штамм Pseudomonas aeruginosa, зарегистрированный в Корейской Федеральной Коллекции Культур под номером KCCM 10030 (CFCPA 20215).

3. Штамм Pseudomonas aeruginosa, зарегистрированный в Корейской Федеральной Коллекции Культур под номером KCCM 10031 (CFCPA 30720).

4. Штамм Pseudomonas aeruginosa, зарегистрированный в Корейской Федеральной Коллекции Культур под номером KCCM 10032 (CFCPA 40057).

5. Штамм Pseudomonas aeruginosa, зарегистрированный в Корейской Федеральной Коллекции Культур под номером KCCM 10033 (CFCPA 50243).

6. Штамм Pseudomonas aeruginosa, зарегистрированный в Корейской Федеральной Коллекции Культур под номером KCCM 10034 (CFCPA 60534).

7. Штамм Pseudomonas aeruginosa, зарегистрированный в Корейской Федеральной Коллекции Культур под номером KCCM 10035 (CFCPA 70018).

8. Способ иммунизации против заболевания, вызванного Pseudomonas aeruginosa, включающий инъекцию пациенту непатогенного антигена, содержащего смесь протеинов клеточной оболочки по крайней мере одного ослабленного непатогенного штамма Pseudomonas aeruginosa, выбранного из группы штаммов, имеющихся в Корейской Федеральной Коллекции Культур номера KCCM 10029 (CFCPA 10142), KCCM 10030 (CFCPA 20215), KCCM 10031 (CFCPA 30720), KCCM 10032 (CFCPA 40057), KCCM 10033 (CFCPA 50243), KCCM 10034 (CFCPA 60534) и KCCM 10035 (CFCPA 70018).

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что используют протеины клеточных оболочек с молекулярным весом в диапазоне 10000 - 100000.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что инъекцию проводят внутримышечно.

11. Непатогенная вакцина для индуцирования иммунной реакции против заболевания, вызванного Pseudomonas aeruginosa, содержащая смесь протеинов клеточной оболочки, по меньшей мере, одного ослабленного штамма Pseudomonas aeruginosa, выбранного из группы штаммов Pseudomonas aeruginosa, имеющихся в Корейской Федеральной Коллекции Культур номера KCCM 10029 (CFCPA 10142), KCCM 10030 (CFCPA 20215), KCCM 10031 (CFCPA 30720), KCCM 10032 (CFCPA 40057), KCCM 10033 (CFCPA 50243), KCCM 10034 (CFCPA 60534) и KCCM 10035 (CFCPA 70018).

12. Вакцина по п.11, отличающаяся тем, что она содержит протеины клеточной оболочки, по меньшей мере, трех ослабленных штаммов Pseudomonas aeruginosa, выбранных из группы, содержащей KCCM 10029 (CFCPA 10142), KCCM 10030 (CFCPA 20215), KCCM 10031 (CFCPA 30720), KCCM 10032 (CFCPA 40057), KCCM 10033 (CFCPA 50243), KCCM 10034 (CFCPA 60534) и KCCM 10035 (CFCPA 70018).

13. Вакцина по п. 11, отличающаяся тем, что использованы штаммы KCCM 10029 (CFCPA 10142), KCCM 10030 (CFCPA 20215) и KCCM 10031 (CFCPA 30720).

14. Вакцина по п. 13, отличающаяся тем, что использованы штаммы KCCM 10029 (CFCPA 10142), KCCM 10030 (CFCPA 20215) и KCCM 10031 (CFCPA 30720) и KCCM 10034 (CFCPA 60534).

15. Вакцина по п.13, отличающаяся тем, что использованы все перечисленные штаммы.

16. Вакцина по любому из пп.11 - 15, отличающаяся тем, что использованы протеины клеточной оболочки каждого из штаммов в эквивалентных количествах.

17. Вакцина по п.11, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель.

18. Способ получения непатогенной вакцины для иммунизации против инфекции Pseudomonas aeruginosa, включающий сбор Pseudomonas aeruginosa от пациентов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa, выбор и выделение, по меньшей мере, одного штамма Pseudomonas aeruginosa в чистом виде, инкубирование выделенного штамма на культуральной среде, выделение культивированного штамма, инактивация штамма и выбор целевого компонента, применяемого для приготовления вакцины, отличающийся тем, что инкубирование выделенного штамма проводят последовательно на первой культуральной среде, ослабляют каждый чистый инкубированный штамм посредством повторных инъекций его лабораторному животному с выбором наиболее ослабленного штамма из каждого ослабляемого штамма Pseudomonas aeruginosa, затем инкубирование каждого указанного ослабленного штамма на второй культуральной среде с выделением ослабленного штамма, инактивацию проводят действием органического растворителя с удалением липидных компонентов клеточной оболочки, далее экстрагируют протеин клеточной оболочки из обработанного штамма Pseudomonas aeruginosa с одновременным определением по оценке наличия лактата дегидрогеназы или гексокиназы в качестве цитоплазменной метки энзима, выделяют ультрафильтрацией экстрагированных протеинов клеточной оболочки протеины клеточной оболочки, молекулярный вес которых лежит в пределах 10000 - 100000, последующим ультрацентрифугированием удаляют липополисахариды и бактериальные вещества, и выделяют целевой компонент в виде очищенных протеинов клеточной оболочки.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют при помещении обрабатываемых клеток Pseudomonas aeruginosa в буферный раствор.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что буферный раствор выбирают из группы, содержащей фосфатный буферный раствор и трисбуферный раствор.

21. Способ по п.18, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют при выдержке бактериальной массы или при воздействии на обрабатываемые клетки Pseudomonas aeruginosa смесителем или гомогенизатором.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что используют смеситель, развивающий скорость 100 - 2000 об/мин при 4oC.

23. Способ по п.18, отличающийся тем, что экстракцию проводят 5 - 6 раз.

24. Способ по п.18, отличающийся тем, что органический растворитель выбирают из группы, содержащей ацетон, хлороформ, бутанол, причем наиболее предпочтительно использовать ацетон.

25. Способ по п.18, отличающийся тем, что выделяют штаммы Pseudomonas aeruginosa KCCM 10029 (CFCPA 10142), KCCM 10030 (CFCPA 20215), KCCM 10031 (CFCPA 30720), KCCM 10032 (CFCPA 40057), KCCM 10033 (CFCPA 50243), KCCM 10034 (CFCPA 60534) и KCCM 10035 (CFCPA 70018).

26. Способ по п.18, отличающийся тем, что в качестве второй культуральной среды используют трипсиновый соевый бульон и среду, содержащую 30 г/л глюкозы, 15 г/л пептона, 0,5 г/л сульфата магния, 5 г/л карбоната кальция, 1 г/л однозамещенного фосфата калия, 5 мг/л сульфата железа (II), 5 мг/г сульфата меди и 5 мг/л сульфата цинка.

27. Способ по п. 18, отличающийся тем, что инкубирование ослабленного штамма Pseudomonas aeruginosa проводят при температуре 37oC, скорости аэрации 1 об/об в минуту, скорости перемешивания 100 об/мин в течение первых 2 ч и при 600 об/мин в течение следующих 10 - 20 ч, предпочтительно 12 - 16 ч, причем объем высеваемого раствора составляет 5% об/об раствора культуральной среды.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к средствам специфической профилактики чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита собак
Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается получения холодоадаптированного штамма "H" вируса болезни Ньюкасл, используемого для получения человеческого лейкоцитарного интерферона

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологической очистке окружающей среды от продуктов деструкции ФОВ (продуктов деструкции фосфорорганических отравляющих веществ) при различных технологиях их уничтожения
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при промышленном производстве пробиотика для жвачных животных
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при промышленном производстве побиотика для молодняка жвачных животных

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок капустной совки (КС)

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для селективного выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологической очистке окружающей среды от продуктов деструкции ФОВ (продуктов деструкции фосфорорганических отравляющих веществ) при различных технологиях их уничтожения
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при промышленном производстве пробиотика для жвачных животных

Изобретение относится к биотехнологии, клинической и санитарной микробиологии, ветеринарии
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при промышленном производстве побиотика для молодняка жвачных животных

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине для получения бактериальных препаратов и как аутоштамм для приготовления препарата пробиотика индивидуального назначения, а также в пищевой промышленности при производстве кисломолочных продуктов и БАДов

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для селективного выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого)
Наверх