Способ получения стабильного кристаллического аналога цинк- инсулина

 

Описывается новый способ получения кристаллического Лиз^B28 Про^B29 человеческого инсулина, который включает кристаллизацию Лиз^B28 Про^B29 человеческого инсулина из раствора, содержащего Лиз^B28 Про^B29 человеческого инсулина, цинк в концентрации от около 400 мг на 1 г Лиз^B28 Про^B29 человеческого инсулина, по меньшей мере, 0,3 N органическую кислоту, выбранную из группы, состоящей из уксусной, лимонной кислоты или глицина, и фенольное соединение в концентрации от 0,15 до 0,25 об.% при рН приблизительно от 5,5 до 6,5. Предложенный способ позволяет получать аналоги инсулина с более быстрыми правлением активности при сохранении биологической активности нативного инсулина человека. 3 з.п. ф-лы.

Настоящее изобретение относится к мономерному аналогу инсулина человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения кристаллического аналога инсулина. Этот способ используется в очистке и производстве Лиз^B28Про^B29-инсулина человека. Лиз^B28Про^B29-инсулин человека применяется для лечения диабета.

Со времен открытия инсулина в 1920 гг. не прекращаются попытки усовершенствования лечения диабета. Большой прогресс был достигнут в способах очистки и доступности инсулина. Были разработаны также различные препараты разного срока действия. Несмотря на эти улучшения, терапия с помощью подкожных инъекций все еще не обеспечивает пациенту должной регуляции и контроля уровня сахара в крови.

В течение жизни пациента частые отклонения от нормальных уровней сахара в крови приводят к гипер- или гипогликемическим состояниям и осложнениям, включающим ретинопатию, нефропатию, невропатию и микро-, макроангиопатию.

Чтобы избежать крайних уровней гликемии, диабетики зачастую практикуют множественные инъекции, когда инсулин вводится во время каждого приема пищи. Эта терапия, однако, далеко еще не оптимизирована.

Самый быстродействующий коммерческий инсулин слишком поздно достигает пика после инъекции, а действие его продолжается чересчур долго, что не позволяет эффективно контролировать уровни глюкозы. В недавнем времени были предприняты серьезные попытки создания препаратов инсулина и его аналогов, которые ускоряют процесс всасывания препарата при подкожном введении.

Поскольку все коммерческие фармацевтические препараты инсулина содержат инсулин в самосвязанном состоянии и, в основном, в форме цинк-гексамера, считают, что фактором, ограничивающим скорость всасывания инсулина с места подкожной инъекции, является диссоциация самосвязанного инсулинового гексамера. Чтобы ускорить процесс всасывания, были разработаны мономерные аналоги инсулина.

Эти мономерные аналоги обладают более быстрым по сравнению с инсулином проявлением активности, в то же время сохраняя биологическую активность нативного инсулина человека. Они обеспечивают быстрое всасывание с места инъекции и достигают пика своего действия близко по времени к повышению уровня глюкозы в крови, связанному с приемом пищи.

В настоящем изобретении предложен новый способ приготовления кристаллов одного из таких мономерных аналогов, Лиз^B28Про^B29-инсулина человека (Лиз^B28Про^B29-чИ). Лиз^B28Про^B29-чИ раскрывается в публикации EPO N 383472. Однако эта публикация не раскрывает коммерчески доступного способа приготовления кристаллического Лиз^B28Про^B29-чИ.

Кристаллизация инсулина хорошо известна специалистам. Первые открытия датируются 1926 годом, когда Абель получил кристаллический инсулин в изоэлектрической точке из раствора с буфером в виде бруцина, пиридина и ацетата аммония (Abel J.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 12: 132, (1926). Peterson и др. в патенте США 2920104 описывает кристаллы инсулина, препараты и способы их приготовления.

В наши дни производственный процесс кристаллизации инсулина включает доведение основности раствора инсулина, содержащего 0,25 N уксусную кислоту, около 2 г/л инсулина и 2% цинка, до pH 5,9-6,0 с помощью основания, предпочтительно, гидроксида аммония. Jehr Brange, Galenics of Insulin, Springer-Verlag (1987). Важно, что, когда Лиз^B28Про^B29-чИ помещают в условия, которые позволяют инсулину человека образовать цинк-кристаллы, такой кристаллизации не наблюдается.

Настоящим изобретением предложен способ кристаллизации Лиз^B28Про^B29-чИ, при котором инсулин человека не кристаллизуется. Этот способ обеспечивает получение высококачественных цинк-кристаллов при высоком выходе. Эти кристаллы представляют стабильную твердую форму вещества.

Кристаллические твердые вещества особенно удобны в практике, поскольку их легко характеризовать, очищать, они более элегантны с фармацевтической точки зрения, чем аморфные твердые вещества. Помимо этого, этот процесс удобен для производства.

Настоящее изобретение обеспечивает способ получения кристаллического Лиз^B28Про^B29-инсулина человека, включающий: кристаллизацию Лиз^B28Про^B29-инсулина человека из раствора, содержащего Лиз^B28Про^B29-инсулин человека, цинк, по меньшей мере 0,3 N органическую кислоту, выбранную из группы: уксусная, лимонная кислоты и глицин, и фенол при pH около 5,5-6,5.

Как указывалось выше, настоящее изобретение обеспечивает способ получения кристаллического инсулина человека Лиз^B28Про^B29. Термин Лиз^B28Про^B29-инсулии человека" или "Лиз^B28Про^B29-чИ" представляет быстродействующий аналог инсулина, который меньше склонен к димеризации или самоассоциации. Лиз^B28Про^B29-чИ является инсулином человека, в котором пролин в положении B28 B-цепи замещен на лизин, а лизин в положении B29 B-цепи замещен на пролин, как описано в публикации EPO N 383472, включенной в настоящий документ в качестве ссылки.

Все аббревиатуры аминокислот, используемые в настоящем описании, представляют собой сокращения, принятые патентным ведомством США и приведенные в 37 C.F.R. 1. 822 (в) (2).

Термин "фенол" или "производное фенола" означает собирательное обозначение фенола, м-крезола, резорцинола, метил-п-гидроксибензоата или их смесей.

Термин "кристаллизация" относится к образованию кристаллов Лиз^B28Про^B29-инсулина человека.

Термин "физиологически приемлемое основание" хорошо известен специалистам. Физиологически приемлемые основания включают гидроксид натрия, гидроксид калия и гидроксид аммония. Предпочтительно применять гидроксид аммония.

Кристаллообразование инсулина интенсивно изучалось. В промышленном производстве инсулин человека кристаллизуется в присутствии 0,25 N уксусной кислоты, 1,6-2,1 г/л инсулина и 2% цинка при pH 5,95-6,05. Кристаллизация происходит при приближении к точке кристаллизации с кислой стороны путем прибавления основания, обычно, гидроксида натрия.

Неожиданно оказалось, что растворимый Лиз^B28Про^B29-чИ не кристаллизуется при обычных условиях кристаллизации инсулина. Самоассоциация и аггрегация у Лиз^B28Про^B29-чИ сведена к минимуму. Тот факт, что Лиз^B28Про^B29-чИ не аггрегирует, был впервые отмечен Brems и др. Protein Engineering, 5:6, 527-533 (1992).

Считают, что минимальная самоассоциация и аггрегация, которая вызывает мономерность аналога, является причиной отсутствия кристаллизации Лиз^B28Про^B29-чИ при условиях, разработанных для инсулина.

Настоящее изобретение описывает условия, при которых Лиз^B28Про^B29-чИ кристаллизуется с цинком и фенольным соединением и образует стабильное твердое кристаллическое вещество. Предпочтительные фенолы выбирают из группы, состоящей из фенола, резорцинола и их смесей. Как цинк, так и фенол являются существенными факторами для достижения кристаллизации.

Раствор Лиз^B28Про^B29-чИ приготавливают путем растворения аналога инсулина в водном растворителе. Концентрация Лиз^B28Про^B29-чИ составляет приблизительно от 1,8 до 2,5 г/л. Предпочтительна концентрация аналога около 2 г/л. Растворению может способствовать так называемое кислотное растворение, т. е. pH снижают приблизительно до 3,0-3,5 с помощью физиологически переносимой кислоты, предпочтительно, хлористоводородной. Другие физиологически приемлемые кислоты включают уксусную кислоту, лимонную кислоту и фосфорную кислоту.

Концентрация органической кислоты, выбранной из группы, состоящей из уксусной, лимонной кислот или глицина, составляет по крайней мере 0,3 N; при более низкой концентрации получается в большой степени аморфный продукт. Предпочтительно, Лиз^B28Про^B29-чИ растворяют в 0,8-1,2 N растворе уксусной кислоты; более предпочтительно - в 1 N растворе уксусной кислоты.

Концентрация добавляемого цинка такова, что конечная концентрация составляет приблизительно от 40 до 400 мг на грамм аналога. Предпочтительно добавлять цинк в виде соли. Примерами солей цинка могут служить ацетат цинка, бромид цинка, хлорид цинка, фторид цинка, йодид цинка и сульфат цинка.

Опытному специалисту известно, что существует множество других солей цинка, которые также можно использовать в способе настоящего изобретения. Предпочтительно использовать ацетат цинка или хлорид цинка, поскольку эти соли не добавляют новых химических ионов к промышленно разработанным способам. Оптимальная концентрация цинка для кристаллизация составляет приблизительно от 100 до 300 мг на грамм Лиз^B28Про^B29-чИ.

Условия кристаллизации чувствительны к присутствию фенола, основания и концентрации цинка; поэтому специалист, выполняющий процесс кристаллизации, подберет оптимальные параметры, упомянутые выше, для получения хорошо оформленных кристаллов. Оптимальные условия для каждой комбинации фенол-основание варьируют в изложенных пределах. Предпочтительно в качестве фенольного соединения использовать фенол в концентрации приблизительно от 0,15 до 0,25% (об./об., конечная концентрация). Более предпочтительно использовать фенол в концентрации 0,2%.

Способ, которым производится растворение Лиз^B28Про^B29-чИ, или порядок, в котором фенол, цинк и Лиз^B28Про^B29-чИ добавляют в раствор, не являются принципиальными для настоящего способа. Однако, принципиальным является тот факт, что фенол взаимодействует с Лиз^B28Про^B29-чИ ниже изоэлектрической точки Лиз^B28Про^B29-чИ.

Соответственно, кристаллизация может быть инициирована как добавлением цинка, так и переводом кислотности раствора от кислого pH до приблизительно 5,5-6,5 с помощью физиологически переносимого основания. Физиологически приемлемые основания включают гидроксид натрия, гидроксид калия и гидроксид аммония. Предпочтительно использовать гидроксид аммония.

Кристаллизацию можно выполнять посредством перевода кислотности раствора, содержащего Лиз^B28Про^B29-чИ, цинк, по крайней мере, 0,3 N органической кислоты, выбранной из группы уксусной кислоты, лимонной кислоты или глицина, и фенол до приблизительно pH 5,5-6,5 с помощью физиологически приемлемого основания. Предпочтительно pH доводят до значений приблизительно 5,9-6,2, после чего формируются кристаллы.

Более предпочтительно, Лиз^B28Про^B29-чИ растворяют приблизительно в 1 N растворе уксусной кислоты (если необходимо способствовать растворению, pH можно довести до 3,0-3,5). Затем к раствору добавляют фенол, и раствор уравновешивается. pH раствора доводят до приблизительно 5,5-6,5 с помощью физиологически приемлемого основания. Предпочтительно использовать гидроксид аммония, а pH доводят до приблизительно 5,9-6,2. Затем инициируется кристаллизация посредством прибавления цинка.

При различных способах кристаллизации кристаллы образуются при перемешивании или без перемешивания и могут быть собраны и отмыты. Предпочтительно выполнять кристаллизацию с перемешиванием. Для облегчения фильтрования, если требуется, можно рекристаллизовать Лиз^B28Про^B29. Кристаллы могут быть собраны и высушены с помощью стандартных методик.

Если кристаллы собирают фильтрованием, к фильтрату можно добавить дополнительное количество цинка, или к маточному раствору, для дальнейшего восстановления Лиз^B28Про^B29-чИ. Кристаллы, приготовленные согласно настоящему изобретению, являются высококачественными и дают большой выход в промышленном масштабе.

Кристаллы обеспечивают стабильную твердую форму массы лекарственного вещества, удобную для хранения, а также для выполнения последующих технологических операций. Процедура кристаллизации не изменяет чистоту и аггрегационные характеристики материала.

Температура кристаллизации не является принципиальной. Приемлемый температурный режим составляет приблизительно от 4 до 26^oC. Предпочтительно поддерживать температуру приблизительно от 22 до 24^oC.

Лиз^B28Про^B29-чИ можно получить с помощью любого из способов пептидного синтеза, включая классический способ (раствор), способ твердой фазы, полусинтетические способы и наиболее современные способы с рекомбинантной ДНК. Например, Chance и др., публикации EPO N 383472, раскрывают приготовление -инсулина человека.

Следующие примеры приводятся для целей иллюстрации приготовления аналогов инсулина и настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие рамки настоящего изобретения.

Пример 1 846,5 г Лиз^B28Про^B29-чИ в 116 л уксуснокислого буфера разводили до поглощения 2,25 на 276 нм очищенной водой (260,6 л) и ледяной уксусной кислотой (19,44 л) в барабане из нержавеющей стали до конечной концентрации уксусной кислоты 1 N.

К раствору добавляли жидкий фенол до концентрации 2 мл/л (общее количество 792 мл) и pH полученного раствора был ниже 3. Далее pH раствора доводили до 6,01 путем добавления 24 л гидроксида аммония и подогревали до 22^oC.

После этого добавляли 5,35 л раствора хлорида цинка (2% вес./об. в воде). Затем убеждались, что pH раствора находится в желаемых пределах (5,9-6,1), и раствор перемешивали в течение 12 часов. Затем раствор охлаждали до 8^oC, прекращали перемешивание и кристаллам позволяли осесть в течение 18 часов при 2-8^oC.

После оседания кристаллов 370 л надосадочного раствора декантировали, а оставшийся надосадок и кристаллы перемещали в барабан меньшего размера для добавочного оседания с использованием декантированного надосадка для промывания первого барабана. После 14 часов оседания 61 л надосадка декантировали, оставляя приблизительно 9 л сырых кристаллов и надосадка.

Кристаллы суспендировали в этом объеме и центрифугировали в шести литровых центрифужных колбах при 4000 об./мин (приблизительно 4000 · G) на центрифуге DPR6000 в течение 45 минут. Для центрифугирования всего кристаллического шлама потребовались две загрузки центрифуги. Центрифугат декантировали.

Кристаллы (приблизительно 250 мл на колбу) суспендировали в 500 мл очищенной воды на центрифужную колбу и вновь центрифугировали на 4000 об./мин в течение 45 минут. Кристаллы затем вновь суспендировали в центрифужных колбах в приблизительно 500 мл охлажденного (2-8^oC) абсолютного спирта SD N 3A на колбу и рецентрифугировали на 4000 об./мин в течение 15 минут.

Спиртовой центрифугат сливали и такое спиртовое отмывание повторяли еще два раза. Кристаллы, отмытые спиртом (1,9 кг сырого веса), высушивали в вакууме.

Пример 2 Раствор Лиз^B28Про^B29-чИ приблизительно 2 г/л приготавливали до конечной концентрации 1 N уксусной кислоты (определяли по поглощению на 280 нм). После добавления жидкого фенола (3,3 мл/л) pH раствора доводили до 5,9-6,2 концентрированным гидроксидом аммония и добавляли хлорид цинка в воде 2% (вес. /об. ) или 20% (вес./об.) до конечной концентрации 40-160 мг хлорида цинка на грамм Лиз^B28Про^B29-чИ.

Полученные кристаллы оседали, а маточный раствор удаляли декантированием после центрифугирования. Кристаллы отмывали последовательным суспендированием и центрифугированием в воде и в абсолютном этаноле, после чего высушивали в вакууме.

Второй сбор кристаллов можно получить путем добавления цинка к маточному раствору до предела в 160 мг/г Лиз^B28Про^B29-чИ.

Пример 3 Лиз^B28Про^B29-инсулин человека (222 мг) растворяли в 100 мл воды Milli-Q. В растворе определили содержание 2,0 мг на миллилитр раствора Лиз^B28Про^B29-чИ с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения. Раствор осветляли путем доведения pH приблизительно до 3,0 с помощью 10% HCl. Отбирали четыре 5 мл аликвоты, прибавляли ледяную уксусную кислоту до концентрации 1 N, и pH был ниже 3,5.

К каждому образцу добавляли по десять микролитров жидкого фенола и затем по шесть микролитров раствора хлорида цинка (20% вес./об. в воде). pH доводили до 6,0 путем прибавления концентрированного гидроксида аммония, гидроксида натрия (10% вес./об.) или гидроксида калия (10% вес./об.).

Растворы перемешивали приблизительно 15 минут, а затем оставляли стоять под крышкой при комнатной температуре. Спустя приблизительно 2 часа, во всех трех растворах хорошо определялись ромбоэдрические кристаллы, причем наиболее быстро кристаллы образовывались в растворе, в который добавляли гидроксид калия.

Пример 4 Приблизительно 42 мг Лиз^B28Про^B29-чИ растворяли в 20 мл (по два образца) воды Milli-Q, содержащей 1,2 мл ледяной уксусной кислоты. В первый образец добавляли сорок четыре микролитра жидкого фенола, а во второй - 34 микролитра жидкого фенола. В обоих случаях pH доводили до 6,0 путем прибавления концентрированного гидроксида аммония, а затем добавляли по сорок пять микролитров раствора хлорида цинка (20% вес./об. в воде).

Растворы перемешивали приблизительно 5 минут, после чего их оставляли стоять под крышкой при комнатной температуре. Спустя приблизительно 24 часа наблюдали хорошо оформленные ромбоэдрические кристаллы.

Пример 5 Лиз^B28Про^B29-инсулин человека (222 мг) растворяли в 100 мл воды Milli-Q. В растворе определяли содержание 2,0 мг Лиз^B28Про^B29-чИ в миллилитре раствора посредством жидкостной хроматографии высокого разрешения. Раствор осветляли доведением pH приблизительно до 3,0 прибавлением 10% HCl. Отбирали четыре 5 мл аликвоты, прибавляли ледяную уксусную кислоту до концентрации 1 N, и pH был определен ниже 3,5.

В аликвоты добавляли или м-крезол (12 мкл), или фенол (10 мкл), или резорцинол (2,1 мкл 100 мг/мл раствора в воде), или метилпарабен (1,6 мл 10 мг/мл раствора в воде), что вызывало в аликвотах одинаковые молярные соотношения пептида и фенольного соединения.

К каждому образцу добавляли по шесть микролитров раствора хлорида цинка (20% вес. /об. в воде) и pH доводили до 6,0 с помощью концентрированного гидроксида аммония. Растворы перемешивали приблизительно 15 минут, а затем оставляли стоять под крышкой при комнатной температуре.

Спустя приблизительно 24 часа в растворах, содержавших фенолы, наблюдали хорошо оформленные ромбоэдрические кристаллы. В растворе, содержавшем метилпарабен, образовалось небольшое количество плохо определяемых плоских кристаллов. Растворы, содержавшие м-крезол и резорцинол, при этих условиях кристаллы не образовывали.

Сходную процедуру предприняли с одной десятой количества резорцинола и доведением pH с помощью гидроксида натрия (10% вес./об. раствора); при этом получались хорошо оформленные ромбоэдрические кристаллы. Этот пример показывает, что с фенольными соединениями могут образовываться хорошо оформленные кристаллы при рутинной оптимизации условий.

Пример 6 Лиз^B28Про^B29-чИ (222 мг) растворяли с 100 мл воды Milli-Q. В растворе определяли содержание 2,0 мг Лиз^B28Про^B29-чИ в миллилитре раствора посредством жидкостной хроматографии высокого разрешения.

Раствор осветляли доведением pH приблизительно до 3,0 с помощью 10% HCl. Отбирали одну аликвоту 5 мл и добавляли ледяную уксусную кислоту до концентрации 0,25 N и подтверждали pH ниже 3,5.

К образцу добавляли двадцать микролитров раствора хлорида цинка (2% вес. /об. в воде). pH раствора доводили до 6,0 добавлением концентрированного гидроксида аммония. Раствор перемешивали приблизительно 15 минут, после чего его оставляли стоять под крышкой при комнатной температуре. Спустя приблизительно 24 часа в растворе не наблюдалось образования кристаллов, но на дно сосуда выпал аморфный осадок.

В качестве контроля брали другую аликвоту в 5 мл и обрабатывали ее гидроксидом аммония, согласно процедуре, описанной в примере 1. Образовывались хорошо оформленные ромбоэдрические кристаллы Лиз^B28Про^B29. Когда инсулин человека (2,3 мг/мл в 1 N уксусной кислоте) подвергали процедуре, описанной в примере 1, с использованием гидроксида аммония, в течение 7 дней кристаллы не образовывались.

Этот эксперимент показал, что условия, обычно применяемые при кристаллизации биосинтетического инсулина человека, не подходят для кристаллизации Лиз^B28Про^B29-инсулина человека, а условия кристаллизации, описанные для кристаллизации Лиз^B28Про^B29-чИ, не производят кристаллов инсулина человека.

Пример 7 Способом, описанным в примере 1, выполняли кристаллизацию, заменяя 1 N уксусную кислоту 1 N лимонной кислотой. Эта кристаллизация дала хорошо оформленные кристаллы Лиз^B28Про^B29-чИ.

Формула изобретения

1. Способ получения кристаллического Лиз^В28 Про^В29 человеческого инсулина, отличающийся тем, что включает кристаллизацию Лиз^В28 Про^В29 человеческого инсулина из раствора, содержащего Лиз^В28 Про^В29 человеческого инсулина, цинк в концентрации около 40 - 400 мг на 1 г Лиз^В28 Про^В29 человеческого инсулина, по меньшей мере, 0,3 N органическую кислоту, выбранную из группы, состоящей из уксусной, лимонной кислоты или глицина, и фенольное соединение в концентрации 0,15 - 0,25 об.% при pH приблизительно 5,5 - 6,5.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация Лиз^В28 Про^В29 человеческого инсулина составляет приблизительно 1,8 - 2,5 г/л; фенольным соединением является фенол и концентрация цинка составляет приблизительно 40 - 400 мг/л Лиз^В28 Про^В29 человеческого инсулина.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что pH составляет приблизительно 5,9 - 6,2.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает добавление фенола в количестве 0,15 - 0,25% от общего объема к раствору Лиз^В28 Про^В29 человеческого инсулина в концентрации приблизительно 1,8 - 2,5 г/л в приблизительно 1N уксусной кислоте; доведение pH до значений приблизительно 5,9 - 6,2 гидроксидом аммония и добавление раствора соли цинка до конечной концентрации приблизительно 40 - 400 мг цинка на 1 г Лиз^В28 Про^В29 человеческого инсулина.