Среда для консервации клеток печени

 

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано при создании клеточных банков. Среда для криоконсервации клеток печени в качестве криопротектора содержит низкомолекулярный поливинилпирролидон, в качестве жизнеобеспечивающих компонентов - питательную среду RPM1-1629, 1%-ный раствор альбумина человеческого, калий оротат при следующем соотношении компонентов, мас.ч.: среда RPM1-1629 10 - 10,5, поливинилпирролидон 1 - 1,5, 1%-ный раствор альбумина человеческого 3 - 3,6, калий оротат 1 - 1,2, рН 7,6. Изобретение обеспечивает высокую жизнеспособность клеток печени при длительном хранении в замороженном состоянии, отсутствие слипания клеток, возможность трансплантации клеток без удаления среды криоконсервирования.

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к сохранению клеток и тканей человека и может быть использовано при создании клеточных банков для нужд тканевой терапии.

Долгосрочное хранение клеточной ткани проводят в питательных средах, содержащих специальные вещества - консерванты. При хранении клеток в замороженном состоянии в качестве консерванта используют криопротекторы. Присутствие криопротектора снижает интенсивность процессов вымораживания воды из клеток и стабилизирует концентрацию внутриклеточных солей. В то же время, при размораживании после криоконсервирования внутриклеточный криопротектор выступает в роли повреждающего фактора, если не приняты меры по его удалению из клеток. Удаление консерванта основано на постепенном его выведении из клеток гипертоническими растворами или непроникающими в клетки веществами /1/.

Известна среда для консервации гепатоцитов, содержащая в качестве криопротектора 20%-ный раствор диметилсульфоксида (ДМСО). Соотношение криопротектора с количеством взвеси гепатоцитов составляет 1:1 /2/.

К недостаткам данной среды следует отнести токсичность консерванта по отношению к гепатоцитам, невозможность полного удаления ДМСО из клеток, т.к. он относится к внутриклеточным консервантам. Следствием является низкий процент выхода жизнеспособных клеток - 65,4%.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является среда для криоконсервации суспензии клеток фетальной печени /3/. Сущность известной среды заключается в том, что в качестве криоконсерванта она содержит поливинилпирролидон. Известная среда имеет следующий состав, %: Поливинилпирролидон /низкомолекулярный/ - 9 Глюкоза - 3,5 Лактоза - 2,5 Фосфорнокислый натрий - 0,75 Гидроцитрат натрия - 1,5 Остальное - вода К недостаткам известной среды следует отнести ее скудный состав, что не обеспечивает высокой жизнеспособности клеток при их длительном хранении в замороженном состоянии. Как отмечают авторы известного способа, при замораживании-оттаивании /без какого-либо срока хранения/ количество неповрежденных клеток уменьшается на 6,35% по сравнению с исходными, а процент осмотически стойких клеток уменьшается на 16%. Очевидно, что при длительном хранении количество поврежденных клеток значительно увеличится.

Также необходимо отметить, что при длительном хранении клетки печени предрасположены к объединению в единый конгломерат, что значительно повышает трудоемкость работ по их разъединению для дальнейшей трансплантации.

Задачей заявляемого изобретения является разработка среды, обеспечивающей высокую жизнеспособность клеток печени при длительном хранении в замороженном состоянии.

Эта задача решается применением среды, содержащей в качестве криоконсерванта поливинилпирролидон и в качестве жизнеобеспечивающих компонентов дополнительно содержит питательную среду RPMI-1629, 1%-ный раствор альбумина человеческого, калия оротат, при следующем соотношении компонентов, маc.ч.: Среда RPMI-1629 - 10 - 10,5 Поливинилпирролидон - 1 - 1,5
1%-ный раствор альбумина человеческого - 3 - 3,6
Калий оротат - 1 - 1,2
pH - 7,6
Экспериментальными исследованиями авторов заявляемого изобретения установлено, что предлагаемая среда обеспечивает высокую жизнеспособность клеток печени при длительном хранении /в течение 6 месяцев/ в замороженном состоянии и отсутствие слипания клеток.

Основой предлагаемой среды служит стандартная среда RPMI-1629 /4/, которая является питательным субстратом при культивации клеток печени.

Поливинилпирролидон, являющийся внеклеточным криоконсервантом, защищает клетки при замораживании и оттаивании, препятствуя их повреждению кристаллами льда, и не оказывает на них токсического влияния. Кроме этого, поливинилпирролидон является иммуностимулятором и обладает антитоксичным действием /5/. Концентрация поливинилпирролидона от 10-20% зависит от скорости и температуры замораживания. При ступенчатом замораживании - 10%-ная концентрация, при моментальном - 20%-ная концентрация поливинилпирролидона обеспечивает сохранность клеток.

Стандартный 1%-ный раствор альбумина человеческого является питательной добавкой к среде криоконсервации, обеспечивающей высокую сохранность клеток.

Известно, что при замораживании клетки интенсивно теряют калий, что приводит к "свинчиванию" цитоплазмы и потере их жизнеспособности. Авторами заявляемого изобретения установлено, что перенасыщение среды калием, достигаемое за счет введения калия оротата, повышает жизнеспособность клеток при криоконсервации. Кроме этого, также установлено, что калий оротат не позволяет клеткам слипаться при длительном хранении в замороженном состоянии.

Величина pH 7,4 является оптимальной для жизнедеятельности гепатоцитов. Экспериментальным путем авторами заявляемого способа установлено, что клетки печени закисляют питательную среду, поэтому величина pH заявляемой среды выбрана равной 7,6.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемая среда для криоконсервации клеток печени отличается от известной введением новых компонентов, а именно: питательной среды RPMI-1629, 1%-ного раствора альбумина, калия оротата, pH 7,6.

Заявленная среда обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата - обеспечение высокой жизнеспособности клеток печени при длительном хранении в замороженном состоянии, отсутствие слипания клеток, обеспечение возможности трансплантации клеток без удаления среды криоконсервации.

Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

При анализе известных сред для криоконсервации клеток печени было выявлено в них отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков заявляемой среды на достижение технического результата, следовательно, изобретение соответствует требованию "изобретательский уровень".

Заявляемую среду готовят следующим образом.

К 5 мл 1%-ного раствора стерильного человеческого альбумина, проверенного на цитотоксичность, добавляют 0,75 г стерильного калия оротата. Затем в суспензию вводят раствор консерванта. Для этого концентрированный поливинилпирролидон /М.М. 18 000/ разводят на среде культивации RPMI-1629 до получения 10-20%-ной концентрации (10 мл пит среды RPMI- 1629 + 1-1,5 мл поливинилпирролидона), pH среды консервирования 7,6.

Среда RPMI-1629 /4/ имеет следующий состав:
Аминокислоты - мг/л
L-аланин - 13,90
L-аргинин-HCl - 42,10
L-аспарагин - 45,00
L-аспарагиновая кислота - 19,97
L-цистеин - 31,50
L-глутаминовая кислота - 22,10
L-глутамин - 219,20
Глицин - 7,50
L-гистидин-HCl·H₂O - 20,96
L-гидроксипролин - 19,70
L-изолейцин - 39,36
L-лейцин - 39,36
L-лизин-HCl - 36,50
L-метионин - 14,90
L-фенилаланин - 16,50
L-пролин - 17,30
L-серин - 26,30
L-треонин - 17,90
L-триптофан - 3,10
L-тирозин - 18,10
L-валин - 17,60
Витамины:
аскорбиновая кислота - 0,50
биотин - 0,20
холинхлорид - 5,00
P-Ca-пантотенат - 0,20
фолиевая кислота - 10,00
I-инозит - 36,00
никотинамид - 0,50
никотиновая кислота - 0,50
n-аминобензойная кислота - 1,00
пиридоксаль-HCl - 0,50
пиридоксин-HCl - 0,50
рибофлавин - 0,20
тиамин-HCl - 0,20
витамин В₁₂ - 2,00
Соли:
CaCl₂ - 100,0
HCl - 400,0
MgSO₄·7H₂O - 200
NaCl - 6460,0
NaHCO₃ - 2200,0
NaH₂PO₄·7H₂O - 580,0
Другие компоненты
Феноловый красный - 10,0
Глюкоза - 3000,0
Глутатион - 0,50
Бакто-пептон - 600,0
Сыворотка эмбриона крупного рогатого скота - 0-30%
Выделенные клетки печени концентрируют путем центрифугирования и удаления супернатанта. Далее взвесь клеток аккуратно смешивают со средой криоконсервации, разливают по ампулам, замораживают и хранят при температуре жидкого азота.

Пример конкретного выполнения
0,75 г стерильного калия оротата в 5 мл 1%-ного водного раствора стерильного человеческого альбумина, проверенного на цитотоксичность, смешивают с концентрированной клеточной взвесью, приготовленной из эмбриональной печени свиньи. Затем в суспензию добавляют 10-10,5%-ный раствор поливинилпирролидона в среде RPMI-1629, при pH 7,6. Соотношение объемов поливинилпирролидона к клеточной взвеси с суспензией, как 1:2.

Оценку жизнеспособности консервированных клеток проводили с помощью теста "на исключение красителя", подсчет абсолютного количества клеток в 1 мкг, суправитальная окраска трипановым синим /6/.

Для экспериментальной проверки были проведены исследования на 59 образцах клеточной взвеси, приготовленной из эмбриональной печени свиньи.

В суспензию клеток добавляли водный раствор красителя (трипановый синий) и в камере Фукса - Розенталя подсчитывали число неокрашенных клеток.

Подсчет клеток лучше проводить при их концентрации 0,5 - 2·10⁶ кл/мл и в течение 1 - 5 минут после смешивания суспензии с красителем.

Число неповрежденных клеток после замораживания - оттаивания составило:
на заявляемой среде - 96,4 + 0,3%
на среде с ДМСО (аналог) - 83,7 + 0,7%
среда С.С. Лаврика (прототип) - 77,8 + 1,2%
После криоконсервирования в заявляемой среде и хранения в течение 6 месяцев число жизнеспособных клеток составило 89,3 + 0,9%, после хранения в течение 12 месяцев - 87,5 + 0,5%. Данные обработаны по методу Стьюдента.

При использовании среды-прототипа через 6 месяцев наблюдали тотальное повреждение клеток, а при использовании среды-аналога через 6 месяцев хранения жизнеспособность клеток составила 59,87 ± 0,6%.

Таким образом, предложенная среда обеспечивает высокую жизнеспособность клеток печени при длительном /6-12 месяцев/ хранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика приготовления клеток к транслантации, так как не требуется удаления среды криоконсервации и тем самым снижается травмирование клеток.

Литература
1. Биохимия мембран: Учеб. Пособие для биол. и мед. спец. вузов/Под ред. А.А. Болдырева. Кн. 3. А.М. Белоус, Е.М. Гордиенко, Л.Ф. Розанов. Замораживание и криопротекция. - М.: Высш. школа - С. 68- 77.

2. Маргулис М. С. , Ерухимов Е.А. и др. Применение гемоперфузии через взвесь криоконсервированных гепатоцитов при острой печеночной недостаточности// Вестник хирургии. - 1992. N 1. - С.83-87.

3. Лаврик С. С., Когут Г.И. и др. Криоконсервирование суспензии клеток фетальной печени для клинического применения // Врачебное дело. - 1990. - N 1. - С. 90 - 92.

4. Методы культуры клеток для биохимиков: Пер. с англ. /Р.Адамс. - М.: Мир, 1983. - С. 230-231.

5. Климанский В. А., Рудаев Я.А. Трансфузионная терапия при хирургических заболеваниях. - М.: Медицина, 1984, С. 39.

6. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Р.Фрешни. - М.: Мир, 1989. С. 116.

Формула изобретения

Среда для консервации клеток печени, содержащая в качестве криопротектора низкомолекулярный поливинилпирролидон, отличающаяся тем, что в качестве жизнеобеспечивающих компонентов дополнительно содержит питательную среду RPMI-1629, 1%-ный раствор альбумина человеческого, калий оротат при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:
Среда RPMI-1629 - 10 - 10,5
Поливинилпирролидон - 1 - 1,5
1%-ный раствор альбумина человеческого - 3 - 3,6
Калий оротат - 1 - 1,2
рН - 7,6