Полинуклеотидные композиции

 

Изобретение представляет композиции для стабилизации полинуклеиновых кислот и увеличения способности полинуклеиновых кислот проникать через мембраны клеток и действовать внутри клетки. Описывается новая полинуклеотидная композиция, содержащая: (а) ковалентно модифицированные полинуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты и (b) сополимер полимерных сегментов, где указанные сегменты включают (i) по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (а) гомополимер этиленокси мономера -ОСН₂СН₂ - или (b) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -ОСН(СН₃)СН_2-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит примерно от 5 до 400 мономерных звеньев и (ii) по меньшей мере один поликатионный сегмент, который представляет собой катионный гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который является продуктом реакции по меньшей мере трех аминосодержащих мономеров или их четвертичных солей, причем указанные аминосодержащие мономеры содержат: (а) одинаковые или различные звенья формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ представляет алкилен с прямой цепью, содержащий от 2 до 6 атомов углерода; (b) катионную аминокислоту; (с) (-OPO(NH-R⁹-NH₂)O-R⁸-), в которой R⁹ представляет собой алифатическую группу с прямой цепью, содержащую от 1 до 12 атомов углерода и R⁸ представляет собой -(CH₂)_n-CH(R¹³)-, где n представляет собой целое число от 0 до 5, a R¹³ представляет собой водород, циклоалкил, содержащий 3-8 атомов углерода или алкил, содержащий 1-6 атомов углерода; или (d) 4-винилпиридин. 4 с. и 11 з.п. ф-лы, 14 табл.

Данная заявка является частичным продолжением заявки на патент США N 08/342209, поданной 18 ноября 1994 г. , озаглавленной "Полинуклеотидные композиции" и приведенной здесь в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к композициям полимеров полинуклеиновой кислоты, таких как полимеры РНК и ДНК, и поликатионов, которые являются ассоциированными либо ковалентно, либо нековалентно с блок-сополимерами алкилэфиров. В предпочтительном варианте полинуклеиновые кислоты образуют комплекс с поликатионом. Полинуклеиновая кислота стабилизируется комплексом и в комплексе имеет повышенную способность проникать через клеточные мембраны. Соответственно, комплексы хорошо подходят для использования в качестве переносчиков для введения нуклеиновой кислоты в клетки.

Использование "антисмысловой" полинуклеиновой кислоты для лечения генетических нарушений, мутаций клеток (включая вызывающие рак или увеличивающие мутацию) и вирусных инфекций получило широкое распространение. Предполагается, что механизм этого лечения действует в одном аспекте путем связывания "смысловых" нитей мРНК, кодируя протеин, который, как считается, обуславливает болезненное состояние, которое предназначается для лечения, в результате останавливая или ингибируя трансляцию мРНК в нежелательный протеин. В другом аспекте геномная ДНК предназначается для связывания антисмыслового полинуклеотида (образующего тройную спираль), например, с ингибированием транскрипции. Смотри Helene, Anti-Cancer Drug Design, 6:569 (1991). Если последовательность мРНК, предназначенной для соединения, является известной, может быть сконструирована антисмысловая молекула, которая связывает смысловую нить по правилам спаривания с основой Уотсона-Крика, образуя двойную структуру, аналогичную двойной спирали ДНК. Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA. Erikson and Ixzant eds., Raven Press, New York, 1991; Helene, Anti-Cancer Drug Design, 6:569 (1991); Crooke Anti-Cancer Drug Design, 6:609 (1991). Серьезным препятствием для полного использования этой технологии является проблема эффективного введения в клетки достаточного числа антисмысловых молекул для эффективного затруднения трансляции целевых мРНК или функции ДНК.

Одним способом, который используется для решения этой проблемы, является ковалентная модификация 5'-конца или 3'-конца антисмысловой молекулы полинуклеиновой кислоты гидрофобными заместителями. Эти модифицированные нуклеиновые кислоты обычно приобретают доступ к внутренней части клетки с большей эффективностью. Смотри, например, Kabanov et al. , FEBS Lett., 259:327 (1990); Boutorin et al. FEBS Lett., 23:1382-1390, 1989; Shea et al., Nucleic Acids Res. , 18:3777-3783, 1990. К тому же, фосфатная основа антисмысловых молекул модифицируется с удалением отрицательного заряда (смотри, например, Agris et al., Biochemistry, 25:6268 (1986); Cazenave and Helene in Antisense Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications, Mol and Van der Krol, eds. , p. 47 et seq., Marcel Dekker, New York, 1991); или модифицируются пуриновые или пиримидиновые основы (смотри, например, Antisense Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications, Mol and Van der Krol, eds., p. 47 et seq., Marcel Dekker, New York, 1991; Milligan et al., in Gene Therapy For Neoplastic Diseases, Huber and Laso, eds., p. 228 et seq., New York Academy of Sciences, New York, 1994). Другие попытки преодолеть барьер клеточной проницаемости включают введение антисмысловой последовательности полинуклеиновой кислоты в экспрессирующий вектор, который может быть введен в клетку в низком числе копий, но который, будучи в клетке, может направить клеточный механизм на синтез более значительных количеств антисмысловых полинуклеиновых молекул. Смотри, например, Farhood et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. , 716:23 (1994). Эта стратегия включает использование рекомбинатных вирусов, которые имеют участок экспрессии, в который вводится антисмысловая последовательность. Смотри, например, Boris-Lawrie and Temin, Ann. N.Y. Acad. Sci., 716:59 (1994).

Другие авторы пытались увеличить мембранную проницаемость путем нейтрализации отрицательных зарядов на антисмысловых молекулах или других молекулах нуклеиновых кислот поликатионами. Смотри, например, Kabanov et al., Soviet Scientific Reviews, Vol. 11, Part 2, 1992; Kabanov et al., Bioconjugate Chemistry 4: 448 (1993); Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Behr et al., Proc. Natl. Acad Sci U.S.A. 86:6982-6986, 1989.

Конечно, антисмысловые молекулы полинуклеиновых кислот не являются единственным типом молекул полинуклеиновых кислот, которые могут успешно сделать более проницаемыми клеточные мембраны. Для того, чтобы получить рекомбинантные протеиновые экспрессирующие системы, направляющая экспрессию нуклеиновая кислота должна быть перенесена через мембрану в эукариотную или прокариотную клетку, которая даст требуемый протеин. Для генной терапии медицинские работники пытаются вводить в один или более типов клеток организма ДНК-вектор, способный к направленному синтезу недостающего протеина, или использовать клетку или организм при экспрессии в больших количествах. Методы введения ДНК, заставляющие клетку давать новый протеин, рибозиму или большее количество протеина или рибозимы, называются методами "трансфекции". Смотри, в основном, Neoplastic Diseases, Huber and Lazo, eds., New York Academy of Sciences, New York, 1994; Feigner, adv. Drug Deliv. Rev., 5:163 (1990); McLachlin, et al., Progr. Nucl. Acids Res. Mol. Biol., 38:91 (1990); Karlsson, S. Blood, 78:2481 (1991); Einerhand and Valerio, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 177:217-235 (1992); Makdisi et al., Prog.Liver Dis., 10:1 (1992); Litzinger and Huang, Biochim. Biophys. Acta, 1113:201 (1992); Morsy et al., J.A.M.A., 270:2338 (1993); Dorudi et al., British J. Surgery, 80:566 (1993).

Ряд рассмотренных методов увеличения проницаемости клетки по отношению к антисмысловой полинуклеиновой кислоте является общепринятыми методами введения целого ряда полинуклеиновых кислот в клетки. Другие основные методы включают осаждение фосфатом кальция полинуклеиновой кислоты и инкубацию целевых клеток (Gracham and Van der Eb, Virology, 52:456,1983), соинкубацию полинуклеиновой кислоты, DEAE-декстрана и клеток (Sompayrac and Danna, Proc. Natl. Acad. Sci. , 12: 7575, 1981), электропорообразование клеток в присутствии полинуклеиновой кислоты (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 7161, 1984), введение нуклеиновой кислоты в вирусные оболочки с созданием переносчиков трансфекации (Gitman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 7309-7313, 1985) и инкубацию клеток полинуклеиновой кислотой, введенной в липосомы (Wang and Huang, Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7851-7855, 1987).

Другой проблемой в доставке полинуклеиновой кислоты в клетку является чрезвычайная чувствительность полинуклеиновых кислот, особенно рибонуклеиновых кислот, к нуклеазной активности. Эта проблема особенно подходит к попыткам использовать рибонуклеиновые кислоты в качестве антисмысловых олигонуклеотидов. Следовательно, требуются способы защиты полинуклеиновой кислоты от нуклеазной активности.

Краткое описание изобретения Изобретение описывается ниже относительно фрагментарных констант, выведенных Хэншем и Лео. Смотри Hansch and Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, New York, pp. 320-325. Эти константы были выведены для использования в оценке вклада части молекулы в тенденцию молекулы к разделению между фазами, образованными октанол-водными смесями. Эти константы обычно называются фрагментарными константами разделения Хэнша-Лео (далее "фрагментарные константы Хэнша-Лео").

Изобретение в первом варианте относится к полинуклеотидной композиции, содержащей: (a) ковалентно модифицированные полинуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты; и (b) сополимер полимерных сегментов, где указанные сегменты включают (i) по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (a) гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или (b) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 400 мономерных звеньев и (ii) по меньшей мере один поликатионный сегмент, который представляет собой катионный гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который является продуктом реакции по меньшей мере трех аминосодержащих мономеров или их четвертичных солей, причем указанные аминосодержащие мономеры содержат: (a) одинаковые или различные звенья формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ представляет алкилен с прямой цепью, содержащий от 2 до 6 атомов углерода;
(b) катионную аминокислоту;
(c) (-OPO(NH-R⁹-NH₂)O-R⁸- ), в которой R⁹ представляет собой алифатическую группу с прямой цепью, содержащую от 1 до 12 атомов углерода, и R⁸ представляет собой -(CH₂)_n-CH(R¹³)-, где n представляет собой целое число от 0 до 5, а R¹³ представляет собой водород, циклоалкил, содержащий 3-8 атомов углерода, или алкил, содержащий 1-6 атомов углерода; или
(d) 4-винилпиридин.

В предпочтительном варианте сополимер полимерных сегментов имеет формулу:
A-R, A-R-A' или R-A-R',
где каждый из A и A' представляет собой гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, а каждый из R и R' представляет собой поликатионный сегмент, как определено выше.

В другом предпочтительном варианте R и R' при физиологическом значении pH включают по меньшей мере шесть катионных групп. Еще в одном предпочтительном варианте R и R' при физиологическом значении pH содержат множество катионных групп, разделенных расстоянием от примерно 3 A до примерно 12 A.

В другом предпочтительном варианте в полинуклеотидной композиции каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 80 мономерных звеньев, а указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который содержит от примерно 2 до примерно 180 одинаковых или различных звеньев формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ такой, как определено выше.

В более предпочтительном варианте указанный полиэфирный сегмент представляет собой гомополимер -OCH₂CH₂- и указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂- или является сополимером -NHCH₂CH₂CH₂- и NHCH₂CH₂CH₂CH₂-
В еще более предпочтительном варианте указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер - NHCH₂CH₂CH₂-
Настоящее изобретение также относится к сополимеру связанных полимерных сегментов, где указанные сегменты содержат:
(i) по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой:
(а) гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или
(b) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-,
причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 400 мономерных звеньев и
(ii) по меньшей мере один поликатионный сегмент, который представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, включающий по меньшей мере три аминосодержащих мономера или их четвертичные соли, которые представляют собой одинаковые или различные звенья формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ представляет алифатическую группу с прямой цепью, содержащую от 2 до 6 атомов углерода, которые могут быть замещены. В предпочтительном варианте сополимер имеет формулу:
A-R, A-R-A' или R-A-R',
где каждый из A и A' представляет собой гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, а каждый из R и R' представляет собой поликатионный сегмент, как определено выше. В предпочтительном варианте в сополимере каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 80 мономерных звеньев, а указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который содержит от примерно 2 до примерно 180 мономерных звеньев.

В другом предпочтительном варианте в сополимере указанный полиэфирный сегмент представляет собой гомополимер -OCH₂CH₂- и указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂- или является сополимером -NHCH₂CH₂CH₂- и NHCH₂CH₂CH₂CH₂-. В еще более предпочтительном варианте поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂-. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидной композиции, содержащей:
(а) полинуклеотид, молекулу нуклеиновой кислоты или их производное и
(b) до примерно 15% (масса/объем) полиэфирного блок-сополимера, содержащего полимерные сегменты, где указанные сегменты содержат по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой:
(i) гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или
(ii) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-,
причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 400 мономерных звеньев; и
где указанный блок-сополимер присутствует в количествах, недостаточных для образования геля.

В предпочтительном варианте заявленная полинуклеотидная композиция дополнительно включает полимер, содержащий катионные повторяющиеся единицы.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидной композиции, содержащей:
полинуклеотид или полинуклеотидное производное, ковалентно связанные с полиэфирным блок-сополимером, содержащим полимерные сегменты, где указанные сегменты содержат:
(а) по меньшей мере один сополимерный сегмент, который представляет собой сополимер или блок-сополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂-; и
(b) по меньшей мере один сополимерный сегмент, который представляет собой сополимер или блок-сополимер пропиленокси мономера -OCH(CH₃)CH₂- или -OCH₂CH(CH₃)- и каждый из указанных сополимерных сегментов, содержащих от примерно 5 до примерно 400 мономерных звеньев.

Подробное описание изобретения.

Одновременно поданной с основной данной заявкой была заявка, озаглавленная "Связанные полимером биологические агенты", серийный номер 08/342079, зарегистрированная 18 ноября 1994 г на имя Александра Викторовича Кабанова и Валерия Юльевича Алахова в качестве авторов. Одновременно поданной с этой заявкой является Выписка N 313257-101A, которая является частичным продолжением заявки на патент N 08/342089. Полное раскрытие заявки N 08/342079 и ее частичного продолжения - Выписки N 313257-101A приводится здесь в качестве ссылки.

Степень полимеризации гидрофильных блоков (A-типа) или гидрофобных блоков (B-типа) общих формул (I)-(XIII) предпочтительно составляет от примерно 5 до примерно 400. Более предпочтительно степень полимеризации составляет примерно 5-200, еще более предпочтительно примерно 5-80. Степень полимеризации поликатионных блоков R-типа составляет от примерно 2 до примерно 300. Более предпочтительно степень полимеризации составляет примерно 5-180, еще более предпочтительно примерно 5-60. Степень полимеризации поликатионного полимера составляет, предпочтительно от примерно 10 до примерно 10000. Более предпочтительно степень полимеризации составляет примерно 10-1000, еще более предпочтительно примерно 10-100.

Повторяющиеся единицы, которые составляют блоки, для блоков A-типа, B-типа и R-типа обычно имеют молекулярную массу примерно 30-500, предпочтительно примерно 30-100, еще более предпочтительно примерно 30-60. Обычно в каждом из блоков A-типа или B-типа по крайней мере около 80% связей между повторяющимися единицами является простыми эфирными связями, предпочтительно по крайней мере около 90% является простыми эфирными связями, более предпочтительно по крайней мере около 95% является простыми эфирными связями. Эфирные связи для целей данной заявки охватывают гликозидные связи (например, связи сахаров). Однако в одном аспекте простые эфирные связи являются предпочтительными.

Предпочтительно, все повторяющиеся единицы, которые составляют блоки A-типа, имеют фрагментарную константу Хэнша-Лео менее примерно -0,4, более предпочтительно менее -0,5, еще более предпочтительно менее примерно -0,7. Предпочтительно все повторяющиеся единицы, которые составляют блоки B-типа, имеют фрагментарную константу Хэнша-Лео менее примерно -0,30, или более, более предпочтительно около -0,20 или более.

Полинуклеотидный компонент pN общих формул (IX-XIII) предпочтительно содержит от примерно 5 до примерно 1000000 оснований, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 100000 оснований, еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 10000 оснований.

Поликатионные полимеры и блоки R-типа имеют несколько положительно ионизирующихся групп и чистый положительный заряд при физиологическом pH. Полиэфир/поликатионные полимеры общих формул (V)-(VIII) также могут служить в качестве поликатионных полимеров. Предпочтительно поликатионные полимеры и блоки R-типа имеют не менее примерно 3 положительных заряда при физиологическом pH, более предпочтительно не менее примерно 6, еще более предпочтительно не менее примерно 12. Также предпочтительными являются полимеры или блоки, которые при физиологическом pH могут иметь положительные заряды с интервалом между зарядами от примерно до примерно Интервалы, устанавливаемые аминопропиленовыми повторяющимися единицами или смесями аминопропиленовых и аминобутиленовых повторяющихся единиц, являются наиболее предпочтительными. Следовательно, например, поликатионные сегменты, которые используют повторяющуюся единицу (NHCH₂CH₂CH₂) или смесь повторяющихся единиц (NHCH₂CH₂CH₂) и (NHCH₂CH₂CH₂CH₂), являются предпочтительными.

Полиэфир/поликатионные полимеры общих формул (V)-(VIII), содержащие повторяющуюся единицу -NH-R₀-, также являются предпочтительными. R₀ - предпочтительно этилен, пропилен, бутилен или пентилен, который может быть модифицирован. В предпочтительном варианте по крайней мере в одной из повторяющихся единиц R₀ включает ДНК-интеркалирующую группу, такую как этидиумбромидная группа. Такие интеркалирующие группы могут увеличивать сродство полимера для нуклеиновой кислоты. Предпочтительные замещения на R₀ включают алкил с 1-6 углеродами; гидрокси; гидроксиалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; алкокси, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкилкарбонильную группу, имеющую 2-7 углеродных атомов; алкоксикарбонил, в котором алкокси имеет 1-6 углеродных атомов; алкоксикарбонилалкил, в котором алкокси и алкил каждый независимо имеет 1-6 углеродных атомов; алкилкарбоксиалкил, в котором каждая алкильная группа имеет 1-6 углеродных атомов; аминоалкил, в котором алкильная группа имеет 1-6 углеродных атомов; алкиламино или диалкиламино, где каждая алкильная группа независимо имеет 1-6 углеродных атомов; моно- или диалкиламиноалкил, в котором каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; хлоро; хлоралкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; фторо; фторалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; циано или цианоалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; или карбоксильную группу. Более предпочтительно R₀ является пропиленом или бутиленом.

Полимеры согласно первому варианту изобретения являются, например, блок-сополимерами, имеющими общие формулы (XIV)-(XVII):

или

или

или

в которых x, y, z, i и j имеют значения от примерно 5 до примерно 400, предпочтительно от примерно 5 до примерно 200, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 80, и в которых в каждой паре R₁ и R₂ один является водородом, а другой - метильной группой.

Формулы (XIV) - (XVI) являются сверхупрощенными в том, что на практике ориентация изопропиленовых радикалов в блоке B является беспорядочной. Эта беспорядочная ориентация указывается в формуле (XVII), которая является более сложной. Такие полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые соединения описаны в работах by Santon. Am. Perfumer Cosmet. 72/4/:54-58 (1958); Schmolka. Loc. cit 82/7/:25-30 (1967); Non-ionic Surfactants. Schick. ed. (Dekker, NY, N 4, 1967) p. p. 300-371. Целый ряд таких соединений является коммерчески доступным под такими родовыми названиями, как "полоксамеры", "плуроники" и "синпероники". Плуроникевые полимеры общей формулы B-A-B часто называются "реверсивными" плурониками, "плуроником R'' или "мероксаполом". "Полиоксаминный" полимер общей формулы XVII поставляется фирмой БиЭйЭсЭф (Уайяндот, Мичиган) под торговой маркой Тетроник. Порядок полиоксиэтиленовых и полиоксипропиленовых блоков, представленных в общей формуле (XVII), может быть реверсивным, создавая Тетроник R, также поставляемый фирмой БиЭйЭсЭф. Смотри Schmolka, J. Am. Oil. Soc., 59:110 (1979). Полиоксипропилен-полиоксиэтиленовые блок-сополимеры могут также быть разработаны с гидрофильными блоками, содержащими статистическую смесь этиленоксидных и пропиленоксидных повторяющихся единиц. Для сохранения гидрофильного характера блока этиленоксид является численно преобладающим. Аналогично гидрофобный блок может быть смесью этиленоксидных и пропиленоксидных повторяющихся единиц. Такие блок-сополимеры поставляются фирмой БиЭйЭсЭф под торговой маркой "Плюрадот".

Диаминосвязанный плуроник общей формулы (XVII) также может быть членом семейства диаминосвязанных полиоксиэтилен-полиоксипропиленовых полимеров общей формулы (XVIIa):

в которой пунктирные линии представляют симметричные копии полиэфира, отходящие от второго азота, R^* - алкилен с 2-6 углеродами, циклоалкилен с 5-8 углеродами или фенилен; для R₁ и R₂ - либо (а) оба являются водородом, либо (в) один является водородом, а другой - метил; для R₃ и R₄ - либо (а) оба являются водородом, либо (в) один - водород, а другой - метил; если оба R₃ и R₄ являются водородом, тогда один из R₅ и R₆ - водород, а другой - метил, а если один из R₃ и R₄ является метилом, тогда оба R₅ и R₆ являются водородом.

В свете рассмотренного специалисты разберутся, что, даже когда осуществление изобретения включает, например, полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые соединения, вышеприведенные общие формулы являются также включенными. Важной характеристикой является то, что средняя фрагментарная константа Хэнша-Лео мономеров в блоке A-типа составляет -0,4 или менее. Таким образом, не требуется, чтобы единицы, составляющие первый блок, состояли исключительно из этиленоксида. Аналогично, не требуется, чтобы весь блок B-типа состоял исключительно из пропиленоксидных единиц. Вместо этого блоки могут включать мономеры, отличные от мономеров, определенных в общих формулах (XIV) - (XVII), пока сохраняются параметры первого варианта. Таким образом, в простейшем из примеров по крайней мере один из мономеров в блоке A может быть замещен группой боковой цепи, как описано ранее.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидному комплексу, содержащему блок-сополимер по крайней мере одной из общих формул (I) - (XIII), в котором блоки A-типа и B -типа по существу выполнены из повторяющихся единиц общей формулы -O-R₅, где R₅ является:
(1) -(CH₂)_n-CH(R₆)-, где n - целое число от 0 до примерно 5, а R₆ - водород; циклоалкил, имеющий 3-8 углеродных атомов; алкил, имеющий 1-6 углеродных атомов; фенил; алкилфенил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; гидрокси; гидроксиалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; алкокси, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкилкарбонильная группа, имеющая 2-7 углеродных атомов; алкилоксикарбонил, в котором алкокси имеет 1-6 углеродных атомов; алкоксикарбонилалкил, в котором алкокси и алкил каждый независимо имеет 1-6 углеродных атомов; алкилкарбонилалкил, в котором каждая алкильная группа имеет 1-6 углеродных атомов; аминоалкил, в котором алкильная группа имеет 1-6 углеродных атомов; алкиламин или диалкиламино, где каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; моно- или диалкиламиноалкил, в котором каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; хлоро; хлоралкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; фторо; фторалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; циано или алкилциано, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов, или карбоксил;
(2) карбоциклической группой, имеющей 3-8 углеродных атомов в кольце, где группа может быть, например, циклоалкильной или ароматическими группами, и которая может включать алкил, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкокси, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкиламино, имеющий 1-6 углеродных атомов; диалкиламино, в котором каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; амино; сульфонил; гидрокси; карбокси; фтор или хлорзамещения; или
(3) гетероциклической группой, имеющей 3-8 атомов в кольце, которая может включать гетероциклоалкильные или гетероароматические группы, которые могут включать от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из кислорода, азота, серы и их смесей, и которые могут включать алкил, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкокси, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкиламино, имеющий 1-6 углеродных атомов; диалкиламино, в котором каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; амино; сульфонил; гидрокси; карбокси; фторо- или хлорзамещения.

Предпочтительно, n - целое число от 1 до 3. Карбоциклические или гетероциклические группы, содержащие R₅, предпочтительно имеют 4-7 атомов в кольце, более предпочтительно 5-6. Гетероциклы, предпочтительно включают 1-2 гетероатома, более предпочтительно гетероциклы имеют один гетероатом. Предпочтительно гетероциклом является углевод или углеводный аналог. Специалисты поймут, что мономеры, требующиеся для получения этих полимеров, могут быть синтезированы. В некоторых случаях полимеризация мономеров требует использования защитных групп, как будет понятно специалистам. Обычно блоками A-типа и B-типа являются блоки, содержащие по крайней мере примерно 80% повторяющихся единиц -OR₅-, более предпочтительно не менее примерно 90%, еще более предпочтительно не менее примерно 95%.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидному комплексу, содержащему блок-сополимер, одной из общих формул (I) - (XIII), в котором блоки A-типа и B-типа в основном состоят из повторяющихся единиц общей формулы -O-R₇-, где R₇ - C_1-6-алкильная группа.

Оценка Хэнша-Лео коэффициента октанол-водного разделения (P) для органической молекулы рассчитывается по следующей формуле:
lgP = ∑a_nf_n+∑b_mF_m,
где значения f_n являются фрагментарными константами для различных групп молекул, значения a_n являются числом любого типа группы в молекуле, значения F_m являются коэффициентами некоторых молекулярных характеристик, таких как простые связи или двойные связи, а значения b_m являются числом любых таких молекулярных характеристик. Например, фрагментарная константа Хэнша-Лео для этиленоксидной повторяющейся единицы (-CH₂CH₂O-) будет равняться:
2f_C + 4f_H + f_O (4-1)F_в = 2(0,20) + 4(0,23) + (-1,82) + 3(-0,12) = -0,86.

Фрагментарная константа Хэнша-Лео для пропиленоксидной повторяющейся единицы (-CH₂CHCH₃)O-) будет равняться:
2f_C + + 3f_H + f_O + (4-1)F_в = 2(0,2) + 0,89 + 3(0,23) + (-1,82) + 3(-0,12) = -0,2.

Специалистам будет понятно, что приближение Хэнша-Лео для оценки констант разделения, в котором применяются приближенные фрагментарные константы Хэнша-Лео, не дает точные эмпирические константы разделения. Смотри Hansch and Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, New York, 1979, James, Solubility and Related Properlies, Marsel Dekker, New York, 1986, p.p. 320-325. Однако приближение является достаточно точным для определения характеристик гидрофобности полимерного подающего переносчика.

Широкий ряд молекул полинуклеиновых кислот может быть полинуклеиновокислотным компонентом композиции. Они включают молекулы синтетических ДНК и РНК и молекулы нуклеиновой кислоты, которые ковалентно модифицируются (с введением групп, включающих липофильные группы, фотоиндуцируемые сшивающие группы, алкилирующие группы, металлорганические группы, интеркалирующие группы и группы, которые модифицируют фосфатную основу). Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, среди других, антисмысловые молекулы нуклеиновой кислоты, генкодирующая ДНК (обычно включающая соответствующую промоторную последовательность), олигонуклеотидные α-аномеры рибозим, этилфосфотрисложноэфирные аналоги, алкилфосфоматы, фосфоротионатные и фосфородитионатные олигонуклеотиды и т.п. В действительности нуклеиновокислотным компонентом может быть любая нуклеиновая кислота, которая может быть успешно перенесена в клетку с большей эффективностью или стабилизирована от процессов разрушения, или может быть улучшено ее биораспределение после введения животному.

Примеры используемых полимеров, соответствующих общим формулам (V) - (VIII), включают двухблочный сополимер полиоксиэтилен-поли-L-лизина следующей общей формулы (XVIII):

в которой i - целое число от примерно 5 до примерно 100, a j - целое число от примерно 4 до примерно 100.

Вторым примером является двухблочный сополимер полиоксиэтилен-поли(L-аланин-L-лизин)'a общей формулы (XIX):

в которой i - целое число от примерно 5 до примерно 100, a j - целое число от примерно 4 до примерно 100.

Третьим примером является двухблочный сополимер полиоксиэтилен- поли(пропиленимин/бутиленимин)'a следующей общей формулы (XX):

в которой i - целое число от примерно 5 до примерно 200, а j - целое число от примерно 1 до примерно 10.

Четвертым примером является полиоксиэтилен-поли(N-этил-4- винилпиридинбромид) или ("pOE-pEVP-Br'') общей формулы (XXI):

в которой i - целое число от примерно 5 до примерно 100, а j - целое число от примерно 10 до примерно 500.

Еще одним примером является полимер общей формулы (XXII):
CH₃O-(CH₂CH₂O)_iCO[NH(CH₂)₃) NH(CH₂)₄]_j-(NH(CH₂)₃)₂-NHCO-O- -(CH₂CH₂O)_k-CH₃ (XXII),
в которой i - целое число от примерно 10 до примерно 200, j - целое число от примерно 1 до примерно 8 и k - целое число от примерно 10 до примерно 200.

Еще одним примером является полимер общей формулы (XXIII):
H-G_j-(NH(CH₂)₃)₂-NH-CO-O- (CH₂CH₂O)_iCO-G_m-(NH(CH₂)₃)₂- NH₂ (XXIII)
в которой "G" содержит -(NH(CH₂)₃)₃-CH₂-, i и j - такие, как определено для формулы (XVIII), а m - целое число от примерно 1 до примерно 8.

Используемые в изобретении блок-сополимеры обычно в некоторых условиях образуют мицеллы диаметром от примерно 10 нм до примерно 100 нм. Мицеллы являются надмолекулярными комплексами некоторых амфифильных молекул, которые образуются в водных растворах благодаря микрофазному отделению неполярных частей от амфифилий. Мицеллы образуются, когда концентрация амфифилии достигает для данной температуры критической мицеллярной концентрации (КМК), которая является характеристикой амфифилии. Такие мицеллы обычно включают от примерно 10 до примерно 300 блок-сополимеров. При различии размеров гидрофильной и гидрофобной частей блок-сополимеров тенденция сополимеров к образованию мицелл при физиологических условиях может быть различной. Мицеллы имеют поступательную и вращательную свободу в растворе, и растворы, содержащие мицеллы, имеют низкую вязкость, подобную воде. Мицеллообразование обычно имеет место при концентрациях сополимера от примерно 0,001 до 5% (м/о). Обычно концентрация поликатионных полимеров и полинуклеиновой кислоты является меньше концентрации сополимеров в полинуклеотидных композициях, предпочтительно не менее чем в 10 раз меньше, более предпочтительно по крайней мере примерно в 50 раз.

При высоких концентрациях некоторые блок-сополимеры, используемые в изобретении, образуют гели. Эти гели являются вязкими системами, в которых поступательная и вращательная свобода молекул сополимера значительно ограничена непрерывной сетью взаимодействий между молекулами сополимера. В гелях может иметь место или отсутствовать микросегрегация повторяющихся единиц блока В. Для того, чтобы избежать образования гелей, концентрация полимеров (как для блок-сополимеров, так и для полиэфир/поликатионных полимеров), предпочтительно составляет менее примерно 15% (м/о), более предпочтительно менее примерно 10%, еще более предпочтительно менее примерно 5%. В первом варианте изобретения более предпочтительно избегать гелей.

Когда полинуклеотидная композиция включает катионные компоненты, катионы ассоциируются с фосфатными группами полинуклеотида, нейтрализуя заряд на фосфатных группах и делая полинуклеотидный компонент более гидрофобным. Нейтрализация предпочтительно питается катионами на полимерных сегментах R-типа или на поликатионных полимерах. Однако фосфатный заряд может быть также нейтрализован химической модификацией или ассоциацией с гидрофобными катионами, такими как N-[1-2,3- диолеилокси-N,N'-3-метиламмонийхлорид]. Считается, что в водном растворе полинуклеотиды с нейтрализованным зарядом осаждаются с образованием надмолекулярных мицеллоподобных частиц, которые могут быть названы "полинуклеотидными комплексами". Гидрофобное ядро комплекса содержит полинуклеотиды с нейтрализованным зарядом и сополимерные блоки B-типа. Гидрофильная оболочка содержит сополимерные блоки A-типа. Размер комплекса обычно варьируется от примерно 10 нм до примерно 100 нм в диаметре. В некоторых контекстах целесообразно выделить комплекс из необъединенных компонентов. Это может быть сделано, например, гельфильтрующей хроматографией.

Соотношение компонентов полинуклеотидной композиции является важным фактором в оптимизации проницаемости через мембрану полинуклеотидов в композиции. Это соотношение может быть идентифицировано как отношение [φ], которое является отношением положительно заряженных групп к отрицательно заряженным группам в композиции при физиологическом pH. Если φ < 1, комплекс содержит ненейтрализованный фосфат из полинуклеотида. Считается, что части полинуклеотидов, смежные с ненейтрализованными зарядами, являются частью оболочки полинуклеотидного комплекса. Соответственно, если φ > 1, поликатионный полимер или сегмент R-типа имеет у ненейтрализованные заряды, и ненейтрализованные части складываются так, что они образуют часть оболочки комплекса. Обычно φ варьируется от примерно 0 (где нет катионных групп) до примерно 100, предпочтительно φ находится в пределах от примерно 0,01 до примерно 50, более предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 20, φ может варьироваться для увеличения эффективности переноса через мембрану и, когда композиция содержит полинуклеотидные комплексы, для увеличения стабильности комплекса. Варьирование φ может также влиять на биораспределение комплекса после введения животному. Оптимальное φ зависит среди прочего от (1) контекста, в каком используется полинуклеотидная композиция, (2) используемых конкретных полимеров и олигонуклеотидов, (3) меченых клеток или тканей и (4) способа применения.

В некоторых предпочтительных вариантах считается, что способность конъюгата образовывать мицеллу коррелируется с некоторыми желательными характеристиками, такими как способность солюбилизироваться в водной и неводной среде, характеристики растворимости которого облегчают перенос через мембрану. Считается, что мицеллообразующая способность блок-сополимера коррелируется с наличием гидрофобных и гидрофильных полимерных блоков. Гидрофобные блоки обеспечиваются блоками B-типа и полинуклеотидными сегментами, у которых заряд нейтрализован поликатионными полимерами, блоками R-типа или некоторыми гидрофобными неполимерными катионами. Гидрофильные блоки обеспечиваются блоками A-типа и в некоторой степени полинуклеотидными сегментами, которые неполностью нейтрализуются ионными частицами, которые придают гидрофобность. Блок-сополимеры изобретения предпочтительно включают блок A-типа, который служит для увеличения растворимости и снижения взаимодействий с немечеными молекулами и клетками.

В некоторых условиях требуется ввести путем нековалентной ассоциации метящие молекулы. Смотри, например, Kabanov et al., J. Controlled Release, 22: 141 1992. Метящие молекулы, которые могут ассоциироваться с композицией, обычно имеют метящую группу, имеющую сродство с участком клетки и гидрофобной группой. Метящая молекула самопроизвольно ассоциируется с полинуклеотидным комплексом и "прикрепляется" к нему через гидрофобную группу. Эти метящие аддукты обычно содержат около 10% или менее сополимеров в композиции.

В метящей молекуле гидрофобной группой может быть среди других липидная группа, такая как жирная ацильная группа. Альтернативно ею может быть блок-сополимер или другой природный, синтетический полимер. Метящая группа метящей молекулы часто содержит антитело, обычно со специфичностью к антигену некоторой поверхности клетки. Это также может быть гормоном, имеющим специфическое взаимодействие с рецептором поверхности клетки, или лекарством, имеющим рецептор поверхности клетки. Например, гликолипиды могут служить для мечения полисахаридного рецептора. Должно быть отмечено, что метящая молекула может быть присоединена к любому из полимерных блоков, идентифицированных здесь, включая полимерные блоки R-типа, и к поликатионным полимерам. Например, метящая молекула может быть ковалентно присоединена к концевой -OH-группе полимеров общих формул (XVIII), (XIX), (XX) и (XXI), к концевой -NH₂-группе полимеров общих формул (XVIII) (предпочтительно к ∈-амино-группе концевого лизильного остатка), (XX) или (XXIII) или к концевой -COOH-группе полимеров общих формул (XVIII) и (XIX). Отметим, что метящие молекулы могут быть использованы для облегчения внутриклеточного переноса полинуклеотидной композиции, например, переноса к ядру клетки, например, при использовании в качестве метящих молекул фузогенных пептидов, описанных в работах Soukchareun et al., Bioconjugate Chem. 6, 43, 1995, Arar et al., Bioconjugate Chem. 6, 43, 1995, кариотипных пептидов или других биоспецифических групп, обеспечивающих направленный перенос в клетку (в частности, выход из эндосомных участков в цитоплазму или подача к ядру).

Полинуклеотидным компонентом композиций изобретения может быть любой полинуклеотид, но предпочтительно им является полинуклеотид по крайней мере с примерно 3 основаниями, более предпочтительно по крайней мере с примерно 5 основаниями. В соответствующие полинуклеотиды входят вирусные геномы и вирусы (включая липидную или протеиновую вирусную оболочку). Вирусы являются особенно пригодными для использования вместе с первым, третьим или пятым вариантами изобретения. Термины "полинуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" используются взаимозаменяемо. Олигонуклеотид является полинуклеотидом. ДНК и РНК являются полинуклеотидами.

Полинуклеотидным производным является полинуклеотид, имеющий один или более остатков, (i) в котором остатки расщепляются, инактивируются или преобразуются иначе, так что получаемый материал может функционировать в качестве полинуклеотида, или (ii) в котором остаток не мешает производному функционировать в качестве полинуклеотида.

Функции полинуклеотида включают одно или более из следующего: связывание с другим полинуклеотидом, являющимся эффективным для трансфекции, являющимся репрессивным, направление синтеза протеина, введение в РНК или ДНК или геном, действие в качестве рибозимы и тому подобное.

Для полиэтиленоксид-полипропиленоксидного сополимера гидрофильно-гидрофобные свойства и мицеллообразующие свойства блок-сополимера в некоторой степени относятся к коэффициенту n. Коэффициент n определяется как:

где |В| и |A| - число повторяющихся единиц в гидрофобном и гидрофильном блоках сополимера соответственно, a b и a- молекулярные массы соответствующих повторяющихся единиц. Значение n обычно составляет от примерно 0,2 до примерно 9,0, более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 1,5. Когда используются смеси блок-сополимеров, n является средневесовым n для каждого из составляющих сополимеров с усреднением по отношению к массовым частям составляющих сополимеров. Когда используются сополимеры, отличные от полиэтиленоксидных-полипропиленоксидных сополимеров, подобные приближения могут быть выведены относительно гидрофобно-гидрофильных свойств одного члена класса полимеров к свойствам другого члена класса.

Полинуклеотидные композиции изобретения могут применяться орально, локально, ректально, вагинально, легочным путем при использовании аэрозоля, или парентерально, например внутримышечно, подкожно, интраперитонеально или внутривенно. Полинуклеотидные композиции могут применяться в отдельности, или они могут комбинироваться с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем в соответствии с обычной фармацевтической практикой. Для орального способа применения полинуклеотидные композиции могут быть использованы в виде таблеток, капсул, лепешек, пастилок, порошков, сиропов, эликсиров, водных растворов и суспензий и т.п. В случае таблеток, носители, которые могут быть использованы, включают лактозу, цитрат натрия и соли фосфорной кислоты. Общеприменимыми в таблетках являются различные дезинтегранты, такие как крахмал, и смазывающие добавки, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. Для орального применения в виде капсул используемыми разбавителями являются лактоза и высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Когда для орального использования требуются водные суспензии, полинуклеотидные композиции могут комбинироваться с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При необходимости могут быть введены некоторые подслащивающие добавки и ароматизирующие добавки. Для парентерального применения обычно получаются стерильные растворы конъюгата, и pH растворов соответственно корректируется и регулируется добавлением буфера. Для внутривенного использования общая концентрация растворенных веществ должна регулироваться для способствования получению изотоники. Для глазного применения мази или капли могут подаваться известными в технике глазными подающими системами, такими как аппликаторы или глазные капельницы. Такие композиции могут включать мукомиметики, такие как гиалуровая кислота, хондроитинсульфат, гидроксипропилметилцеллюлоза или поливиниловый спирт, консерванты, такие как сорбиновая кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота, бензилхромхлорид, и обычные количества разбавителей и/или носителей. Для легочного применения разбавители и/или носители выбираются так, чтобы быть пригодными для образования аэрозоля.

ПРИМЕР 1. Эффективность трансфекции. Комплекс первого варианта.

В данном эксперименте плазмида pβ-GaI вводится в клетки NIH 3Т3 линии клеток опухоли сосков мыши. В плазмиде pβ-GaI содержится плазмида pUC19 (поставщик - Институт Генной Биологии Российской Академии наук), в которую вводится гибрид эукариотной транскрипционной единицы и E.coli β-галактозидазы. С этой плазмидой эффективность потребления клетки может быть определена путем определения активности β-галактозидазы, экстрагируемой из обработанных клеток. Используемым сополимером является трехблочный сополимер общей формулы (XIV), где x + z = 51, и y = 39 (далее "плуроник A"). Используемым поликатионом является поли-(N-этил-4- винилпиридинбромид) (pEVP-Br). 10 мкг/мл раствор pβ-GaI (преимущественно суперспиральной) получается в растворе PBS, содержащем 10 мг/мл плуроника A и 45 мкг/мл pEVP-Br. Эти количества являются рассчетными для обеспечения отношения групп оснований поликатиона к фосфатным группам плазмиды около 10. Отношение плуроника A к ДНК равняется примерно 10⁴. Это исходное сырье отфильтровывается и стерилизуется, и часть разбавляется в 10 раз не содержащей сыворотку модифицированной по способу Дульбекко средой Игла (DMEM), так что концентрация pβ-GaI равняется 1 мкг/мл. Этот раствор является "плуроник A - трансфекцирующей средой".

Клетки NIH 3Т3 выращиваются в монослойной культуре при 37^oC под 5% CO₂ с использованием DMEM-среды, содержащей 2 мМ глутамина и 10% сыворотки внутриутробного плода (FCS). Клетки, выращенные в монослойной культуре, соскабливаются и готовятся для процесса транзакции промывкой три раза свежей средой.

Аликвоты промытых клеток, предназначенных для преобразования способом изобретения, суспендируются при концентрации 10⁶ клеток/мл в плуроник A - трансфекцирующей среде. Суспендированные клетки инкубируются в течение 24 ч при 37^oC и под 5% CO₂. Клетки затем промываются свежей средой и повторно высеваются.

Аликвоты клеток, предназначенных для трансфекции осаждением фосфата кальция, трансфекцируются, как рекомендовано в работе Promega of Madison, Wisconsin, Profection Mammalian Transfection Systems, Technical Manual, 1990. Отдельно pβ-GaI смешивается с 0,25 M CaCl₂. Смесь смешивается с равным объемом 2xHBS (буферная соль Хэнкса, поставляемая фирмой ДжиАйБиСиОу, Грэнд Айсленд, Нью-Йорк), с получением смеси, содержащей 1 мкг/мл pβ-GaI. Непрозрачная смесь инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин и затем подается к клеткам. Суспендированные клетки инкубируются в течение 2 ч при 37^oC и под 5% CO₂. Клетки затем промываются свежей средой и повторно высеваются.

Повторно посеянные клетки инкубируются в течение 48 ч в DMEM-среде, содержащей 10% FCS. В процессе инкубации среда заменяется новой средой через 16 ч. После 48 ч инкубации клетки каждой инкубации собираются соскабливанием, промываются PBS и повторно суспендируются в 100 мкл 0,2 М трис-HCl (pH 7,4). Клетки лизируются несколькими циклами замораживание-оттаивание и центрифугируются при избытке 6000 х/г. 50 мкл надосадочной жидкости удаляется из каждой пробирки с лизатом и смешивается с 50 мкл раствора 0,1 мМ 4-метил-умбеллиферрил-β-D-галактопиранизида (субстрат), 0,1 М фосфата натрия (pH 7,4). Каждая смесь инкубируется в течение 20 мин при 37^oC с обеспечением возможности любой присутствующей β-галактозидазе действовать на субстрат. 50 мкл 0,4 глицина (pH 10,5) добавляется для окончания реакции β-галактозидазы. Активность β-галактозидазы определяется наличием метилбеллиферона, которое может быть определено флюоресцентной спектроскопией _ex = 365 нм, λ = 450 нм.

Результаты представлены в табл. 1.

ПРИМЕР 2. Эффективность трансфекции. Комплекс первого варианта.

В этих экспериментах исследуется эффективность трансфекции с MDCK-клетками (производное от почки собаки). Снова pβ-GaI является индикатором полинуклеотида. Поликатионным компонентом полинуклеотида является сополимер N-этил-4-винилпиридинбромида и N-цeтил-4-винилпиpидинбpoмидa, мономеров, введенных в мольном отношении 97:3, соответственно (далее pEVP-co-pCVP-Br). Блок-сополимером является трехблочный сополимер общей формулы (XIV), где x + z = 18, и y = 23 (далее плуроник В). Плуроник В- трансфекцирующий раствор 1 мкг/мл pβ-GaI, 3 мкг/мл pEVP-co- pCVP-Br и 1% (м/о) плуроника В получается, как в примере 1. Отношение групп поликатионного основания к нуклеотидным фосфатам равняется примерно 7. Массовое отношение плуроника В к pβ-GaI равняется примерно 5•10³.

MDCK-клетки высеваются при 8•10⁵ клеток на планшет на 90 мм планшетах и инкубируются до утра в содержащей сыворотку среде для выращивания. Содержащая сыворотку среда затем заменяется средой, не содержащей сыворотку, и клетки инкубируются при 37^oC под 5% CO₂ в течение 24 ч. Для клеток, обрабатываемых полинуклеотидным комплексом, среда затем заменяется 5 мл плуроник B-трансфекцирующего раствора. Клетки инкубируются с легким покачиванием при 37^oC под 5% CO₂ в течение 2 ч. В контрольных экспериментах клетки трансфекцируются с использованием кальцийфосфатной методики, как описано выше (за исключением того, что трансфекцируются посеянные клетки, не суспендированные клетки).

После обработки плуроник В-трансфекцирующим раствором или фосфатом кальция клетки промываются 5-6 раз свежей средой. Они затем инкубируются в DMEM, содержащей 10% FCS, в течение 48 ч при 37^oC под 5% CO₂. После первых 16 ч этой инкубации среда заменяется. После инкубации клетки промываются PBS, высвобождаются из своих планшетов трипсинизацией и снова промываются PBS. β-Галактозидаза определяется, как описано в примере 1.

Результаты представлены в табл. 2.

ПРИМЕР 3. Трансфекционные эксперименты. Комплекс первого варианта.

В этих экспериментах исследуется трансфекционная эффективность с клетками яичника китайского хомячка (CHO). Полинуклеотидным компонентом полинуклеотидного комплекса является pβ-GaI . Поликатионным компонентом является pEVP-Br. Блок-сополимером является восьмиблочный сополимер общей формулы (XVII), где i = 10 и j = 12 (далее плуроник C, поставляемый фирмой БиЭйЭсЭф).

Плуроник C-трансфекцирующий раствор из 1 мкг/мл pβ-GaI, 4 мкг/мл pEVP-Br и 1% (м/о) плуроника C получается, как в примере 1. Отношение групп основания к нуклеотидным фосфатам равняется 10. Массовое отношение плуроника C к pβ-GaI равняется 10³. Методика трансфекции является такой же, как в примере 2.

Результаты представлены в табл. 3.

ПРИМЕР 4. Бактериальная трансформация. Комплекс второго варианта.

В этих экспериментах исследуется эффективность трансформации с использованием штамма МС5 Bacillus subtilis. Полинуклеотидным компонентом полинуклеотидного комплекса является плазмида рВС16, плазмида, кодирующая тетрациклиновую резистентность. Используется блок-сополимер общей формулы (VI). В частности, блок-сополимером является полиоксиэтилен-поли(N-этил-4-винилпиридинбромид) общей формулы (XXI), где i = 44, a j = 20. Исходный раствор полинуклеотидного комплекса второго варианта получается совместным с трансфекционными растворами, описанными выше. Отношение групп оснований сополимера к ДНК-фосфатам в растворе равняется 0,2. Бактерии суспендируются в преобразующей среде Spizizen II (смотри Spizizen, F. N.A.S., USA, 411 - 1072 (1958)), и аликвоты клеток инкубируются в различных концентрациях либо полинуклеотидного комплекса, либо свободного рВС16. Клетки инкубируются с комплексом или свободной ДНК в течение 1 ч при 37^oC. После инкубации клетки высеваются на среду агара, содержащую 10 мг/мл тетрациклина. Результаты по целому ряду тетрациклинрезистентных колоний, полученные в каждых из экспериментальных условий, представлены в табл. 4.

ПРИМЕР 5. Защита от нуклеазы.

Для этого примера получается комплекс плазмиды рТ219 и двухблочного сополимера общей формулы (XXI) - полиоксиэтилен- поли(N-этил-4-винилпиридинбромида), где i = 44, a j = 20. В растворе полинуклеотидного комплекса, растворенного в PBS, содержится около 4 мкг/мл плазмиды и 20 мкг/мл двухблочного сополимера. При этих количествах получается отношение групп оснований в поликатионном блоке к фосфатным группам ДНК, равное 5. Для контрольных инкубаций эквивалентное количество свободной плазмиды растворяется в буфере. Нуклеаза PVUII добавляется к образцам раствора, содержащего свободную ДНК или полинуклеотидный комплекс, и количество неразложившейся кольцевой плазмидной ДНК, после различных временных интервалов разложения, определяется электрофорезом в полиакриламидном геле. Смотри Kabanov et al., Biopolymers, 31:1437-1443 (1991).

Результаты представлены в табл. 5.

ПРИМЕР 6. Олигонуклеотидная стабилизация.

Для этого примера комплекс, содержащий олигонуклеотид, комплементарный с участком инициирования транскрипции ВИЧ-1-тат-гена ("анти-тат", содержащий GGCTCCATTTCTTGCTC), получается с использованием двухблочного сополимера общей формулы (XIX) полиоксиэтилен-поли(L-аланин-L-лизина), в котором i = 44, a j = 8. Олигонуклеотидный комплекс получается в буфере PBS (pH 7,0) при концентрации 0,75 ОП₂₆₀/мкл олигонуклеотида. Отношение имино- и аминогрупп поликатиона к фосфатным группам полинуклеотида равняется примерно 50. Смесь инкубируется в течение 1 ч при комнатной температуре для обеспечения образования комплекса. Затем комплекс очищается гельфильтрационной хроматографией на установке Сефадекс G-25 с использованием 0,05 М NaCl в качестве элюента. Концентрация полученного раствора комплекса равняется 0,11 ОП₂₆₀/мкл олигонуклеотида. Получается сравнительный раствор нуклеотида, не образовавшего комплекс. Аликвота плазмы мышиной крови (10 мкл) смешивается с равным объемом раствора олигонуклеотидного комплекса или раствора свободного олигонуклеотида. Образцы инкубируются при 37^oC в течение различных периодов времени. Для прекращения реакции олигонуклеотидов с энзимами в плазме образцы разбавляются водой и экстрагируются водонасыщенной смесью фенил: хлороформ (1: 1). Водная фаза от экстракции отделяется, и олигонуклеотид осаждается 3% перхлоратом лития. Осадок промывается ацетоном и затем растворяется в 100 мкл воды. Наличие некондиционного олигонуклеотида определяется методом высокоразрешающей жидкостной хроматографии с использованием C₁₈-силасорбколонки (4х90 мм, Джилсон, Франция) и градиента ацетонитрила в 0,05 М триэтиламмонийацетате (pH 7,0) в качестве элюента.

Результаты представлены в табл. 6.

ПРИМЕР 7. Олигонуклеотидная стабилизация.

В данном примере исследуется стабильность олигонуклеотида, описанного в примере 6, когда рассматривается его комплекс с двухблочным сополимером общей формулы (XX) - полиоксиэтилен-полипропиленимин/бутиленимином, в котором i = 44, a j = 4-8. Методика, использованная в примере 6, используется для данного примера, за исключением того, что используется концентрация олигонуклеотида примерно 0,13 ОП₂₆₀/мкл.

Результаты представлены в табл. 7.

ПРИМЕР 8. Эффективность введения антисмысловой клетки.

В эксперименте исследуется "анти-MDR", антисмысловая молекула, содержащая 17-цепочечный олигонуклеотид последовательности CCTTCAAGATCCATCCC комплементарно к положениям 422-438 мРНК, кодируя продукт гена MDR1 в обратимой многолекарственной резистентности (MDP) в клетках SKVLB. Клетки SKVLB являются клетками с многолекарственной резистентностью, производными от линии раковых клеток яичника. Ген MDR1 идентифицируется как ответственный за многолекарственную резистентность в клетках SKVLB. Смотри: Endicott and Ling, Ann. Pev. Biochem., 58:137 (1989). В частности, сравнивается эффективность анти-MDR- олигонуклеотида в полинуклеотидном комплексе изобретения и в свободном состоянии. В качестве контрольных используются свободная и комплексная формы анти-тат-олигонуклеотида, описанного выше. Полинуклеотидные комплексы образуются с двухблочным сополимером общей формулы (XX) - полиоксиэтилен-полипропиленимин/бутиленимином, где i = 44, а j = 9-10. Комплексы получаются по методике, описанной в примере 6. Концентрация олигонуклеотида в комплексе или в свободном состоянии равняется 0,17 ОП₂₆₀/мкл. Концентрация сополимера является достаточной для определения отношения имино- и аминогрупп поликатионного блока к фосфатным группам олигонуклеотида, равного 10.

Клетки SKVLB инкубируются в течение 3 дней при 37^oC под 5% CO₂ в присутствии свободного или входящего в состав комплекса олигонуклеотида (при концентрации 20 мкМ по отношению к содержанию олигонуклеотида). Каждые 12 ч добавляется свежая среда, содержащая свободный или входящий в состав комплекса олигонуклеотид.

Цитотоксичность (IC₅₀) дауномицина по отношению к клеткам, обработанным, как описание выше, определяется в соответствии с методом, приведенным в работе Alley et al., Cancer Res., 48:589- 601.

Результаты представлены в табл. 8.

ПРИМЕР 9. Антисмысловой олигонуклеотид, предназначенный для подавления вируса герпеса.

В данном эксперименте используется 12-цепочечный олигонуклеотид, который ковалентно модифицируется по его 5'-концу ундецилфосфатным заместителем и по его 3'-концу акридиновой группой. Эта модификация олигонуклеотида описывается в работе Cho-Chung et al., Biochemistry Int., 25:767-773 (1991). Использованная последовательность олигонуклеотида CGTTCCTCCTGU является комплементарной к области сплайсинга при 983-994 вируса герпеса человека-1 ("ВГЧ-1"). В качестве контрольной используется эквивалентно модифицированная последовательность AGCAAAAGCAGG, комплементарная к РНК, полученной вирусом гриппа. Олигонуклеотиды были употреблены с инфицированными ВГЧ-1 клетками либо в комплексе, либо в свободном состоянии. При использовании комплекса комплекс образуется с двухблочным сополимером общей формулы (XIX) - полиоксиэтилен-поли(L-аланин-L-лизином), в котором i = 44, a j = 8. Олигонуклеотидные комплексы образуются, как описывается в примере 6.

Клетки почки африканской мармозетки ("Vero-клетки") инфицируются вирусом ВГЧ-1 (штамм L2, полученный из Музея вирусных штаммов, D.I. lvanovskii, Inst. of Virol., Russian Federation), как описывается в работе Vinogradov et al., BBRC, 203:959 (1994). Инфицированные клетки промываются PBS. После промывки в клетке добавляется свежая RPM1-1640-среда, содержащая 10% сыворотки внутриутробного плода и свободный или в составе комплекса олигонуклеотид. Клетки затем инкубируются при 37^oC под 5% CO₂ в течение 24 ч. ВГЧ-1-инфективность клеточной среды определяется затем с использованием метода получения бляшек, описанного в работе Virology, A Practical Approach, Mahy, Ed., IRL Press, Washington, DC, 1985.

Результаты, использующие изменяющиеся концентрации олигонуклеотида, представлены в табл. 9.

ПРИМЕР 10. Антисмысловой олигонуклеотид, предназначенный для подавления вируса герпеса.

Если не указано особо, в данном примере используются те же методики, что и в примере 9. Используются ВНК-клетки, линия клеток почки китайского хомячка. При использовании комплексной формы олигонуклеотидов комплекс образуется с двухблочным сополимером общей формулы (XVII) - полиоксиэтилен-поли-L-лизином, в котором i = 44, и j = 30, с использованием методики, описанной в примере 6. Концентрация исходного раствора комплекса равняется 0,09 ОП₂₆₀/мкл. Отношение имино- и амино-групп поликатионного блока к фосфатам олигонуклеотида равняется 10. Олигонуклеотиды в комплексной или свободной форме используются с клетками при концентрации 3,0 мкМ.

Результаты представлены в табл. 10.

ПРИМЕР 11. In vivo подавление ВГЧ.

Полинуклеотидные комплексы между блок-сополимером общей формулы (XVII) - полиоксиэтилен-поли-L-лизином, в котором i = 44, а j = 30, и анти-ВГЧ и противогриппными олигонуклеотидами образуются с использованием методик, приведенных в примере 9. Концентрация исходных растворов комплексов равняется 0,9 ОП₂₆₀/мкл. Отношение имино- и амино-групп поликатионного комплекса к фосфатам олигонуклеотида равняется 10.

Инбредные белые мыши (масса тела: 6-7 г) инфицируются ВГЧ-1 (штамм C1 от Belorussian Res. Inst. of Epidemiol. and Microbiol., Minsk) путем интраперитонеальной инъекции 30 мкл вирусной суспензии (титр: 10⁷ LD₅₀/мл). Либо анти-ВГЧ-комплекс, антигриппный комплекс, свободный анти-ВГЧ, либо свободный анти-грипп инъецируются (10 мкл) в хвостовую вену данной мыши через каждые 2, 12, 24, 48 или 72 ч постинфекции.

Результаты представлены в табл. 11.

ПРИМЕР 12. Продолжительность жизни полинуклеотидного комплекса в плазме.

В данном примере используется P³²-меченый 17-цепочечный олигомер GGCTCCATTTCTTGCTC, комплементарный к области инициирования транскрипции ВИЧ-1-тат-гена. Олигонуклеотид модифицируется по его 5'-концу холестеролом, как описано в работе Boutorin et al., Bioconjugate Chemistry, 2:350-356 (1990). Полинуклеотидный конъюгат олигонуклеотида образуется с блок-сополимером общей формулы (XX) - полиоксиэтилен- поли(пропиленимин/бутиленимин)"ом, в котором i=44 и j=9-10. Концентрация исходного раствора (растворенного в PBS) комплекса равняется 0,18 ОП₂₆₀/мкл. Отношение имино- и аминогрупп поликатионного блока к фосфатам олигонуклеотида равняется 50.

Мыши-самцы C57/B1/6 (масс: 20-24 г, полученные из Российского Исследовательского Центра Молекулярной Диагностики и Терапии, Москва) инъецируются путем 50 мкл внутривенных инъекций анти-ВИЧ- конъюгата или свободного анти-ВИЧ при 0,18 ОП₂₆₀/мкл, растворенных в PBS. Через определенные промежутки времени после инъекций из хвостовой вены берутся образцы крови, и животные умерщвляются. Количество радиоактивного материала в образце крови или ткани определяется жидкостным сцинтилляционным счетчиком (после соответствующей солубилизации).

Результаты представлены в табл. 12.

ПРИМЕР 13. Синтез катионного блок-сополимера.

1,4-дибромбутан (5,4 г, 25 ммолей, от Олдрич Ко., Милуоки, Висконсин) добавляется к раствору N-(3-аминопропил)-1,3-пропандиамина (6,55 г, 50 ммолей, от Олдрич Ко.), растворенного в 100 мл 1,4-диоксана. Эта реакционная смесь перемешивается при 20^oC в течение 16 ч. Продукт реакции самопроизвольно высаждается из раствора в виде гидробромидной соли. Это осажденное первое промежуточное соединение собирается и дважды сушится ротационным испарением из раствора 10% триэтиламина в метаноле. Этот процесс испарения является эффективным для удаления значительных количеств бромидной соли. Первое промежуточное соединение растворяется в 50 мл 1,4-диоксана, и проводится его реакция с 2,7 г (12,5 ммоля) 1,4-дибромбутана. Снова реакция проводится в течение 16 ч при 20^oC, и извлекается второе промежуточное соединение, которое сушится, как указано выше. Второе промежуточное соединение нейтрализуется уксусной кислотой до pH 7-8 и очищается гельфильтрацией на Сефадекс G-25 с использованием водного элюента. Получаются три главных полииминных фракции, имеющие кажущиеся молекулярные массы 1060, 700 и 500 соответственно.

Полиоксиэтиленгликоль (1,5 г, ММ 1500, от Флюка) растворяется в 8 мл 1,4-диоксана, и проводится его реакция с 0,17 г (1 ммоль) N,N'- карбонилимидазола (Олдрич Ко.) при 20^oC в течение 3 ч. Реакционная смесь делится на две части. Каждая часть смешивается с 4 мл 10% (м/о) раствором полииминной фракции либо с ММ 1060, либо с ММ 700, в растворе которой содержится дополнительно 0,01 н. NaOH. Смесь перемешивается в течение 16 ч при 20^oC. Гельфильтрацией из этой смеси выделяются блок-сополимеры общей формулы (XX) с различными интервалами молекулярной массы.

ПРИМЕР 14. Синтез катионного блок-сополимера.

0,5 г сукцинимидилкарбоната метокси-ПЭГ (ММ 5000, Шиеуотер Полимерз, Инк., США) растворяется в 1,4-диоксане. Этот диоксановый раствор добавляется к водному раствору, содержащему 0,2 г полииминного полимера с ММ 1060, описанного выше, причем в водном растворе дополнительно содержится 0,01 н. NaOH. Эта реакционная смесь перемешивается при 20^oC в течение 16 ч. Гельфильтрацией из реакционной смеси выделяется полимер общей формулы (XXII).

ПРИМЕР 15. Синтез катионного блок-сополимера.

1,5 г полиоксиэтиленгликоля (ММ 8000, от Флюка) растворяется в 8 мл 1,4-диоксана. К раствору добавляется 0,34 г (2 ммоля) N,N'- карбонилимидазола (Олдрич Ко.), и проводится реакция в течение 3 ч при 20^oC. Затем к первой реакционной смеси добавляется 8 мл водного раствора, содержащего 0,01 н. NaOH и 15% (м/о) полииминного полимера с ММ 500, описанного выше в примере 13. В полученной реакционной смеси проводится реакция в течение 16 ч при 20^oC с перемешиванием. С помощью гельфильтрации из второй реакционной смеси выделяется полимер общей формулы (XXIII).

ПРИМЕР 16. Синтез конъюгата с олигонуклеотидом.

12-мерный олигонуклеотид 5'-CGTTCCTCCTGU ("Олиго А"), комплементарный к области сплайсинга (положения 983-994 на вирусном геноме) ранней мРНК типа вируса герпеса ВГЧ-1, синтезируется с использованием синтезатора ДНК 380В-02 (Эпплайед Биосистемз, Калифорния). При синтезе в синтезаторе используется фосфорамидитная химия и 8-минутный цикл синтеза. Условия цикла и получение сырого продукта осуществляются в соответствии с рекомендациями Эпплайед Биосистемз. Синтезированный Олиго А осаждается из 1 М раствора LiCl (0,5 мл) ацетоном (2 мл). Осадок растворяется в триэтиламмонийацетатном буфере и очищается высокоразрешающей жидкостной хроматографией с обращенной фазой на Силасорб 18-колонке (9х250 мм, Джилсон, Франция), с использованием ацетонитрильного градиента в 20 мМ ТЕАА-буфере (pH 8,5).

3'-конец очищенного Олиго А окисляется периодатом с созданием альдегида и конъюгируется восстановительным алкилированием с гексаметилендиаминным линкером с созданием аминного производного. Смотри Che-Chung et al., Biochem. Internat. , 25: 767(1991); Vinogradov et al., BBRC, 203:959 (1994). "Плуроник А", блок-сополимер общей формулы (XIV) (x = 25, y = 38, z = 25) окисляется аналогично с получением концевых альдегидов. Аминное производное (1 мг) растворяется в 100 мкл 0,1 М боратного буфера (pH 9,0) и смешивается с 2 мг плуроник A-производного. 1,5 мг натрийцианоборогидрида добавляется к смеси для восстановления оснований Шиффа, образованных между амином и альдегидными группами. Эта реакция проводится в течение 12 ч при 4^oC. Полимерный продукт этой реакции выделяется гельфильтрующей хроматографией на Сефадекс LH-20 с использованием 90% водного изопропанола в качестве элюента. Полученный таким образом конъюгат далее называется "Олиго А конъюгатом".

ПРИМЕР 17. Влияние Олиго А конъюгата на вирусную активность.

Олиго А и Олиго А конъюгат растворяются отдельно в среде RPM1 1640 (АйСиЭн Биомедикалз Инк. , Коста Меза, ЦА) до конечной концентрации 0,2 мМ (на основании оптической плотности). Эти исходные растворы затем фильтруются через 0,22 мкм фильтры для удаления возможных бактериальных или грибковых загрязнений.

Монослои Vera-клеток инкубируются в течение 1 ч при 37^oC в свободной от сыворотки среде RPM1 1640 вместе с различными концентрациями Олиго А или Олиго А конъюгата. Монослои, еще при выдержке с олигонуклеотидами, затем инфицируются 1 бляшкообразующей единицей на клетку ВГЧ-1, штамм L2 (из Музея вирусных штаммов Института Вирологии им. Д.И. Ивановского, Российская Академия наук, Российская Федерация). Метод инфицирования описывается в работе Виноградов и др. , BBRC, 203:959 (1994). Через 8 ч экспозиции с вирусом и олигонуклеотидами среда на клетках заменяется свежей средой, содержащей 10% FCS. Среда с клеток собирается через 22 и 39 ч после инфекционной инкубации, и в собранной среде определяется вирусный титр, как описано в работе Virology, A Practical Approach, Mahy, Ed., IRL Press, Oxford Univ. Press, Washington, DC, 1985.

Результаты представлены в табл. 13.

ПРИМЕР 18. Синтез фосфонатного мономера.

Проводится реакция 40 ммолей бутандиола-1,3 (Мерк), растворенного в 50 мл безводного пиридина (Олдрич), с 20 ммолями 4,4'-диметокситритилхлорида (Сигма) в течение 1,5 ч при температуре 20^oC. Реакция контролируется с использованием тонкослойной хроматографии на силикагельных пластинах (Мерк), проявляемых смесью хлороформ: метанол (95:5). R_f продукта равняется 0,6. Реакционная смесь добавляется к 200 мл 8% водного раствора бикарбоната натрия, и продукт экстрагируется хлороформом. Хлороформный экстракт испаряется в вакууме, и полученное маслянистое первое производное используется на следующей стадии синтеза.

12 ммолей первого производного растворяется в 30 мл безводного 1,4-диоксана, содержащего 3,14 мл (18 ммолей) диизопропилэтиламина (Олдрич). 18 ммолей салицилхлорофосфита (Сигма), растворенного в 10 мл безводного 1,4-диоксана, добавляется к раствору диизопропилэтиламина в небольших порциях в инертной атмосфере аргона. Реакционная смесь инкубируется в течение 1 ч при 20^oC. Реакция контролируется тонкослойной хроматографией, как описано выше. R_f продукта равняется 0,05. К реакционной смеси добавляется 10 мл воды. Через 30 мин растворитель испаряется. Продукт растворяется в 100 мл хлороформа, и полученный раствор промывается поэтапно (1) 100 мл 8% водного раствора бикарбоната натрия, (2) 100 мл 0,2 М раствора триэтиламмонийацетата (pH 7,2) и (3) 100 мл воды. Органический растворитель испаряется, и маслянистый остаток, содержащий фосфонатный мономер, очищается хроматографией на силикагельной колонке с использованием поэтапно градиент (1) хлороформа, (2) 3% метанол в хлороформе и (3) 6% метанол в хлороформе. Выход мономера равняется 4,1 г (7,3 ммоля, 63%).

Продукт, имеющий структуру

где DMT представляет диметокситритил-группу, называется "Фосфонатным мономером А".

ПРИМЕР 19. Синтез поликатионного BDP.

0,05 М раствора фосфонатного мономера A в смеси безводный пиридин:ацетонитрил (1: 1) помещается в положение 6 ДНК-синтезатора (модель 380-ВO2, Эпплайед Биосистемз, ЦА). 2% раствор адамантоилхлорида (Сигма) в смеси ацетонитрил:пиридин (95:5) используется в качестве конденсирующего агента. Синтез проводится с использованием программы, модифицированной для Н-фосфонатного цикла (Sinna and Striepeke in: Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Eckstein Ed. IRL Press, Oxford, New York-Tokyo, p. 185, 1991), и DMT-группа сохраняется после завершения синтеза. Аденозин (4 мкмоля), фиксированный на стандартной твердой подложке CPG-500, используется в качестве первой единицы в процессе синтеза полимера (Виноградов и др., BBRC, 203, 959 (1994). Синтезатор программируется на присоединение 15 повторяющихся единиц фосфонатного мономера А к мономеру аденозина. На последующих стадиях синтеза Н-фосфонатные группы на фиксированной подложке окисляются раствором 104 мг гексаметилендиамина (Сигма) в 0,6 мл смеси безводный пиридин: CCl₄ (5: 1), используемым в течение 15 мин при 20^oC, затем носитель промывается смесью пиридин: ацетонитрил (1: 1). Деблокирование и удаление блокирующей группы достигается аммонолизом (смотри Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Eckstein Ed. IRL Press, Oxford, New York-Tokyo, 1991). Продукт очищается жидкостной хроматографией высокого давления с использованием Silasorb ₁₆ - колонки (9х250 мм, Джилсон, Франция) в ацетонитрильном градиенте (0-80%). Пик, содержащий диметокситритилированный продукт, собирается, растворитель испаряется, и остаток обрабатывается 80% уксусной кислотой (20 мин). Уксусная кислота испаряется, и поликатион снова очищается жидкостной хроматографией высокого давления. Выход 15-мера (в расчете на фосфонатный мономер A) равняется 50% (2,2 мкмоля). Получается полимер, соответствующий общей формуле А. Полимер определяется здесь как "BDP".

ПРИМЕР 20. Твердофазный синтез двухблочного сополимера полиоксиэтилен-BDP.

Диметокситритил-полиэтиленоксид-H-фосфонат синтезируется, как описано в примере 18, с использованием полиэтиленгликоля (ММ 1500 от Флюка) вместо бутандиола. BDP-поликатион синтезируется, как описано в примере 19, за исключением того, что на последней стадии роста цепи диметокситритил-полиэтиленоксид-H-фосфонат вводится в качестве последнего структурного блока. H-фосфонатные группы блок-сополимера окисляются, как описано в примере 19, с использованием тетраметилендиамина (Сигма) вместо гексаметилендиамина, с получением в результате образования фосфоамидных связей между диаминами и фосфатами главной цепи.

ПРИМЕР 21. Твердофазный синтез двухблочного сополимера олигонуклеотида-BDP.

В ДНК-синтезаторе синтезируются двухблочный сополимер, содержащий 12-мерный олигонуклеотид 5'-GGTTCCTCCTGU (Олиго А, комплементарный к области сплайсинга ранней мРНК типа ВЧГ-1 (смотри Виноградов и др., BBRC, 203, 959 (1994)) и BDP-полимер. Сначала синтезируется BDP-полимер, как описано в примере 19, за исключением того, что он не удаляется с подложки. Затем синтезируется олигонуклеотидная цепь поэтапно на поликатионном BDP-полимере, связанном с подложкой в твердом состоянии, с использованием стандартной фосфорамидитной химии, как описано в работе Виноградов и др., BBRC, 203, 959 (1994). H-фосфонатные группы двухблочного сополимера окисляются, как описано в примере 19, с использованием тетраметилендиамина (Сигма) вместо гексаметилендиамина.

ПРИМЕР 22. Влияние двухблочного сополимера олигонуклеотида-BDP на размножение вируса.

Эксперимент проводится точно, как описано в примере 17, за исключением того, что (1) используется сополимер олигонуклеотид-BDP из примера 21 и (2) используется единственная концентрация сополимера олигонуклеотид-BDP (конъюгата) 4 мкМ.

ПРИМЕР - ТИТР ВИРУСА ЧЕРЕЗ 39 ч
Контрольный образец (без олигонуклеотида) - 500 • 10⁴
Немодифицированный Олиго А - 500 • 10⁴
Двухблочный - 5 • 10⁴
ПРИМЕР 23. Увеличение ВГЧ-инфекции.

Монослои Vero-клеток инфицируются при множественности 0,1 бляшкообразующая единица/клетку вирусом, как описано в примере 9. Различные концентрации поликатионного ВDP (синтезированного, как описано в примере 19) добавляются к вирусу до заражения. Титр вирусной инфекции (бляшкообразующая единица/мл) определяется через 24 ч после инфекции на монослоях Vero-клеток (пример 9). Все эксперименты проводятся в утроенном количестве. Отклонения в определенных титрах инфекции равняются менее 25%.

Результаты эксперимента приводятся в табл. 14.

Формула изобретения

1. Полинуклеотидная композиция, содержащая: (а) ковалентно модифицированные полинуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты и (b) сополимер ковалентно связанных полимерных сегментов, где указанные сегменты включают (i) по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (а) гомополимер этиленокси мономера -ОСН₂СН₂- или (Ь) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -ОСН(СН₃)СН₂-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит примерно от 5 до 400 мономерных звеньев и (ii) по меньшей мере один поликатионный сегмент, который представляет собой катионный гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который является продуктом реакции по меньшей мере трех аминосодержащих мономеров или их четвертичных солей, причем указанные аминосодержащие мономеры содержат: (а) одинаковые или различные звенья формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ представляет алкилен с прямой цепью, содержащий от 2 до 6 атомов углерода; (b) катионную аминокислоту; (c) (-OPO(NH-R⁹-NH₂)O-R⁸-), в которой R⁹ представляет собой алифатическую группу с прямой цепью, содержащую от 1 до 12 атомов углерода и R⁸ представляет собой -(CH₂)_n-CH(R¹³)-, где n представляет собой целое число от 0 до 5, a R¹³ представляет собой водород, циклоалкил, содержащий 3-8 атомов углерода или алкил, содержащий 1-6 атомов углерода; или (d) 4-винилпиридин.

2. Полинуклеотидная композиция по п.1, где указанный сополимер имеет формулу A-R, A-R-A' или R-A-R', где каждый из А и А' представляет собой гомополимер этиленокси мономера -ОСН₂СН₂- или сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -ОСН(СН₃)СН₂-, а каждый из R и R' представляет собой поликатионный сегмент, как определено выше.

3. Полинуклеотидная композиция по п.2, где R и R' при физиологическом значении рН включают по меньшей мере шесть катионных групп.

4. Полинуклеотидная композиция по п.2, где R и R' при физиологическом значении рН содержат множество катионных групп, разделенных расстоянием примерно от 3 А до 12 А.

5. Сополимер ковалентно связанных полимерных сегментов, где указанные сегменты содержат: (i) по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (а) гомополимер этиленокси мономера -ОСН₂СН₂- или (b) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -ОСН(СН₃)СН₂-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит примерно от 5 до 400 мономерных звеньев и (ii) по меньшей мере один поликатионный сегмент, который представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, включающий по меньшей мере три аминосодержащих мономера или их четвертичные соли, которые представляют собой одинаковые или различные звенья формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ представляет алифатическую группу с прямой цепью, содержащую от 2 до 6 атомов углерода, которые могут быть замещены.

6. Сополимер по п.5, имеющий формулу А-R, А-R-А' или R-А-R', где каждый из А и А' представляет собой гомополимер этиленокси мономера -ОСН₂СН₂- или сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -ОСН(СН₃)СН₂-, а каждый из R и R' представляет собой поликатионный сегмент, как определено выше.

7. Полинуклеотидная композиция по п.1, где каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит примерно от 5 до 80 мономерных звеньев, а указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который содержит примерно от 2 до 180 одинаковых или различных звеньев формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ такой как определено выше.

8. Полинуклеотидная композиция по п.1, где указанный полиэфирный сегмент представляет собой гомополимер -ОСН₂СH₂- и указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂- или является сополимером -NHCH₂CH₂CH₂- и -NHCH₂CH₂CH₂-.

9. Полинуклеотидная композиция по п. 8, где указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂-.

10. Сополимер по п. 5, где каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 80 мономерных звеньев, а указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который содержит от примерно 2 до примерно 180 мономерных звеньев.

11. Сополимер по п.5, где указанный полиэфирный сегмент представляет собой гомополимер -ОСН₂СН₂- и указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂- или является сополимером -NHCH₂CH₂CH₂- и -NHCH₂CH₂CH₂CH₂-.

12. Сополимер по п.11, где указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂-.

13. Полинуклеотидная композиция, содержащая: (а) полинуклеотид, молекулу нуклеиновой кислоты или их производное и (b) до примерно 15% (масса/объем) полиэфирного блок-сополимера, содержащего ковалентно связанные полимерные сегменты, где указанные сегменты содержат по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (i) гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или (ii) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит примерно от 5 до 400 мономерных звеньев, и где указанный блок-сополимер присутствует в количествах, недостаточных для образования геля.

14. Полинуклеотидная композиция по п.13, дополнительно включающая полимер, содержащий катионные повторяющиеся единицы.

15. Полинуклеотидная композиция, содержащая: полинуклеотид или полинуклеотидное производное, ковалентно связанные с полиэфирным блок-сополимером, содержащим ковалентно связанные полимерные сегменты, где указанные сегменты содержат: (а) по меньшей мере один сополимерный сегмент, который представляет собой сополимер или блок-сополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂-, и (b) по меньшей мере один сополимерный сегмент, который представляет собой сополимер или блок-сополимер пропиленокси мономера -ОСН(СН₃)СН₂-, или -OCH₂CH(CH₃)- и каждый из указанных сополимерных сегментов, содержащих примерно от 5 до 400 мономерных звеньев.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14