Способ получения антикоагулянта из сапропеля

 

Изобретение относится к медицине и биохимии. Из сапропеля получают экстракт с помощью трехкратного объема 0,1 М раствора аммиака. Экстракт экспонируют при -15°С в течение 24 ч. После размораживания при комнатной температуре декантируют надосадок и концентрируют упариванием под вакуумом. Концентрированную фракцию центрифугируют и диализуют. Недиализующуюся фракцию обрабатывают сульфатом аммония при 100% степени насыщения и выпавший осадок удаляют. Очищенную фракцию обессоливают 96%-ным этиловым спиртом. Затем подвергают гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-50. Порции элюента объединяют и высушивают. Изобретение позволяет повысить чистоту продукта. 1 табл.

Способ относится к биохимии, точнее к способам выделения биологически активных веществ из природного сырья, и может быть использован научно-исследовательскими учреждениями биологического профиля.

Известны способы получения экстрактов с антикоагулянтной активностью из растительного сырья, характеризующиеся использованием дорогостоящих реагентов и ограниченностью сырьевой базы.

Так, известен способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью из растительного сырья (Чирятьев Е.А. и соавт. Авт. св. "Способ выделения антикоагулянта из травы медуницы мягчайшей" N 1622981, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений 22 сентября 1990 г.). Сущность способа заключается в том, что высушенную траву медуницы мягчайшей экстрагируют 0,01 н раствором аммиака, подвергая полученный экстракт диализу через целлофан Т-100 против дистиллированной воды, диализирующую жидкость подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - Тойопале HW - 50 в ступенчатом градиенте хлорида натрия в аммонийно - ацетатном буфере с pH 7,6-7,8, а фракции содержащие, антикоагулянт, объединяют, обессоливают на геле Тойопала HW-50, объединяют фракции, содержащие антикоагулянт, и удаляют воду выпариванием, получая целевой продукт в виде концентрированного водного экстракта.

Приведенный выше способ мы рассматриваем в качестве аналога заявляемого способа. Его недостатки - ограниченность сырьевой базы, гетерогенность получаемого целевого продукта и связанная с этим сложность стандартизации целевого продукта.

Известен способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью, из сапропеля (Чирятьев Е.А. и соавт. Патент на изобретение "Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью" N 2101023 зарегистрировано в Государственном реестре изобретений 10 января 1998 г), который мы рассматриваем в качестве прототипа предлагаемого изобретения.

Сущность способа прототипа заключается в том, что нативный сапропель настаивают с 3-кратным объемом 0,05 М раствора аммиака в течение 2-3 ч при постоянном перемешивании, настой отстаивают в течение суток при комнатной температуре и собирают надосадок, порции надосадка объединяют и упаривают на водяной бане или с помощью ротационного испарителя в 80-100 раз, концентрат центрифугируют (15 мин, 3000- 4000 g), надосадок выдерживают при температуре -15^oC в течение 24 ч после размораживания при комнатной температуре центрифугируют (15 мин, 3000-4000 g), супернатант диализуют против дистиллированной воды через целлофан Т-100 в соотношении 1:200 в течение 12 ч, недиализующуюся часть надосадка выпаривают досуха на ротационном испарителе. Полученный сухой порошок является целевым продуктом.

Недостатком способа является гетерогенность и токсичность целевого продукта, обусловленная содержанием помимо антикоагулянта значительного количества гуминовых веществ, обладающих собственным биологическим действием, в том числе антиоксидантным (Комиссаров И.Д., Климова А.А. Влияние гуминовых кислот на биокаталитические процессы // В кн.: Гуминовые препараты: Тюменский сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. - Тюмень, 1971. - С. 225-242), генотоксическим (Ribas G., Carbonell Е., Creus A., Xamena N., Marcos R. Genotoxicity of humic acid in cultured human lymphocytes and its interaction with the herbicides alachlor and maleic hydrazide. // Environmental And Molecular Mutagenesis. -1997 - Vol.29, N.3.- P.272-276) и способностью активировать гемостаз (Yang H.L., Hseu Y.C., Lu F.J., Tsai H. D. Humic acid reduces protein-C-activating cofactor activity of thrombomodulin of human umbilical vein endothelial cells.// British Journal Of Haematology. -1998 -Vol. 101, N 1. - P. 16-23).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Цель изобретения - получение гомогенного целевого продукта без примеси гуминовых веществ.

Технический результат изобретения заключается в следующем: 1. Для освобождения целевого продукта от гуминовых веществ используется высаливание с помощью сульфата аммония при степени насыщения экстракта до 100%; 2. В том, что при гель-фильтрации целевого продукта обнаруживаются два гомогенных носителя антикоагулянтной активности, отличающиеся как по своим физико-химическим характеристикам, так и по механизму действия.

Существенные признаки изобретения заключаются в следующем: 1. Нативный сапропель экстрагируют 3-кратным объемом 0,1 н раствора аммиака; 2. Аммиачный экстракт подвергают вымораживанию при -15^oC в течение 24 часов. После размораживания и отстаивания в течение 6 часов надосадок декантируют и концентрируют на ротационном испарителе под вакуумом; 3. Концентрированную фракцию центрифугируют и диализуют через целлофан Т-100 против дистиллированной воды; 4. Полученную концентрированную фракцию сапропеля обрабатывают сульфатом аммония, выпавший осадок гуминовых веществ удаляют центрифугированием; 5. Фракцию, освобожденную от гуминовых веществ, обессоливают этанолом, а затем подвергают гель-фильтрациии на колонке Sephadex G-50, собирают элюент, находят порции элюента, содержащие антикоагулянт; 6. Фракции, содержащие антикоагулянт, объединяют и высушивают выпариванием на кипящей водяной бане до получения сухого порошка. Полученный порошок является целевым продуктом, растворимым в 0,14 М растворе натрия хлорида и обладающим антикоагулянтной активностью. За единицу активности (ЕА) принимали количество порошка, которое после растворения в 0,14 М растворе натрия хлорида в 2 раза удлиняет время свертывания равного объема рекальцифицированной плазмы человека. В продукте, полученном из 1 кг нативного сапропеля, содержится 6500-8000 ЕА.

Положительный эффект заявляемого способа по сравнению со способом-прототипом заключается в получении гомогенного целевого продукта и отсутствии в нем посторонних примесей.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. 1 кг сапропеля (800 мл) экстрагируют 3-кратным объемом 0,1 н раствора аммиака и экстрагируют при постоянном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Полученный экстракт отстаивают в течение 24 ч и декантируют надосадок.

2. Супернатант подвергают вымораживанию при -15^oC в течение 24 ч. После размораживания и отстаивания в течение 6 часов надосадок декантируют и концентрируют на ротационном испарителе под вакуумом в 40 раз при температуре 45-50^oC.

3. Концентрированную фракцию центрифугируют (7000 g, 30 мин) и диализуют через целлофан Т-100 против дистиллированной воды в соотношении 1:150, дважды меняя воду через 12 и 24 ч.

4. Полученную концентрированную фракцию сапропеля титруют 0,1 н раствором аммиака до pH 7,3-7,5 и вносят сульфат аммония, создавая 50% степень насыщения.

5. Выпавший осадок гуминовых веществ удаляют центрифугированием (4000g, 30 мин), а надосадок концентрируют на водяной бане до появления кристаллов сульфата аммония, создавая 100% степень насыщения раствора. Вновь выпавший осадок гуминовых веществ удаляют центрифугированием (4000g, 30 мин).

6. Фракцию, освобожденную от гуминовых веществ, смешивают с 96% этанолом в соотношении 1:1 и экспонируют при -4^oC в течение 30 минут. Выпавший осадок сульфата аммония удаляют фильтрацией под вакуумом, надосадок концентрируют на водяной бане до появления кристаллов соли и повторяют вышеописанную операцию. Полученную водно-спиртовую смесь выпаривают на водяной бане досуха и остаток растворяют в 96% этаноле и выдерживают на холоду (-4^oC, 30 минт), выпавшую в осадок соль удаляют фильтрацией, этанол отгоняют, а сухой остаток растворяют в дистиллированной воде.

7. Раствор, содержащий антикоагулянт, подвергают гель-фильтрациии на колонке Sephadex G-50 (10х300 мм, проток - 1 мл/мин), собирают элюент, в качестве которого используется дистиллированная вода, порциями по 2 мл. Находят порции элюата, содержащие антикоагулянт, объединяют и высушивают выпариванием на кипящей водяной бане до получения сухого порошка.

8. Полученный порошок является целевым продуктом, растворимым в 0,14 М растворе натрия хлорида и обладающим антикоагулянтной активностью. За единицу активности (ЕА) принимали количество порошка, которое после растворения в 0,14 М растворе натрия хлорида в 2 раза удлиняет время свертывания равного объема рекальцифицированной плазмы человека. В продукте, полученном из 1 кг нативного сапропеля, содержится 6500-8000 ЕА.

Приведенная ниже таблица характеризует заявляемый способ в сравнении со способом-прототипом.

Таким образом, целевой продукт, полученный с помощью заявляемого способа, получен в гомогенном виде без примеси посторонних биологически активных веществ. Выход целевого продукта в заявляемом способе составляет в среднем 80% от способа прототипа.

Получаемый гомогенный целевой продукт содержит индивидуальный антикоагулянт пептидной природы, внутривенное введение которого в терапевтической дозе сопровождается снижением свертывающей активности крови на 16-18 ч, что позволяет использовать целевой продукт как материал для проведения доклинических испытаний, а сам заявляемый способ может служить основой для создания регламента лабораторного производства антикоагулянта прямого действия.

Формула изобретения

Способ получения антикоагулянта из сапропеля путем экстракции сапропеля раствором аммиака, выдерживания экстракта в течение суток при -15^oC, очистки надосадочной жидкости диализом и высушивания продукта, отличающийся тем, что после очистки диализом проводят высаливание примесей сульфатом аммония, создавая 100% степень насыщения раствора, выпавший осадок отделяют, из оставшейся фракции удаляют сульфат аммония замещением растворителя 96%-ным этиловым спиртом, выпавший осадок удаляют, этиловый спирт отгоняют, сухой остаток растворяют в очищенной воде и подвергают гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-50.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2