Экспресс-способ определения жизнеспособности конидий грибов

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к экспресс-способу определения жизнеспособности конидий грибов Ascomycota, используемых в качестве посевного материала. Сущность способа состоит в том, что перед посевом конидии смачивают эталоном, среду готовят на основе цитратно-фосфатного буфера с добавлением агара, в качестве источника углерода используют глюкозу, азота - пептон. Питательную среду наносят на предметное стекло, культивирование осуществляют во влажной камере, контроль за стадиями прорастания конидий проводят путем микроскопирования в световом микроскопе, при этом перед микроскопированием на поверхность среды помещают окулярную сетку. Способ позволяет выявить значительно больше жизнеспособных конидий, ускорить процесс прорастания конидий на 1,5-2 ч. 2 з. п. ф-лы.

Способ относится к области биотехнологии, в частности к установлению жизнеспособности (всхожести) конидий грибов, используемых в качестве посевного материала.

В последние годы все большее внимание уделяется развитию биотехнологических производств, которые дают возможность быстрее и дешевле экологически чистым способом получать лекарственные препараты, пищевые добавки, заменители пищевого белка и даже нетканые материалы.

Основными продуцентами большинства современных биотехнологических производств являются мицелиальные грибы, относящиеся к Neomycota и Eomycota. В таких производствах используют в качестве посевного спорового материала конидии и спорангиоспоры. Известно, что эти споры находятся в особом состоянии, получившем название экзогенного покоя, когда большая часть метаболических процессов находится в стадии торможения и не происходит роста и пролиферации клеток. В таком "спящем" состоянии грибные споры могут находиться достаточно долгое время без потери жизнеспособности. Однако при нарушении условий хранения часть спор может потерять всхожесть и поэтому перед внесением спорового материала в ферментер необходимо провести проверку на его способность к прорастанию.

Такая процедура является очень важным звеном в любом биотехнологическом производстве, например для получения лимонной кислоты с помощью аскомицета Aspergillus niger. В данном случае достаточно часто наблюдается почти 100% потеря всхожести конидий, которая иногда сопровождается появлением "кислого" запаха. Следует также особо отметить, что процесс прорастания конидий является достаточно мало изученным биологическим феноменом, а биотехнологические производства нуждаются не только в корректном и достоверном способе определения жизнеспособности спорового посевного материала, но и в экспресс-способе, методически простом, не требующем сложного специализированного оборудования и дорогостоящих реактивов.

Известно несколько способов установления жизнеспособности посевного материала, которые используются в микробиологических производствах одновременно как для определения жизнеспособности, так и для обнаружения инфекции [1-6] . Наиболее распространены способы определения жизнеспособности на жидких средах [1] , либо на твердой (агаризованной) среде путем рассева спор на чашках Петри [2,3] . Для обнаружения жизнеспособных микроорганизмов, в том числе патогенных, используют такой признак, как качественное и количественное изменение состава питательных сред, например потребление источников углерода и азота, образование токсинов, пигментов и др. [4] . Для целей обнаружения жизнеспособных микроорганизмов используют также автоматический анализ микробиологических объектов (анализатор микрообъектов АБ-3) или автоматический цитоспектрофлуориметр с применением люминесцентного метода окрашивания живых клеток [5] .

Определение жизнеспособности зооспорангиев патогенных грибов определяют биологическим способом, т. е. путем высаживания восприимчивых к раку сортов картофеля в почву, содержащую зооспорангии патогена, либо путем окрашивания зооспорангиев 0,5% раствором трифенилтетразолхлорида при 35oС, или 0,5-0,7% раствором нитросинего тетразолия при 35-36oС в присутствии гомогенатов гриба Aspergillus fumigatus или A. niger [6] . Используют также биохимический метод обнаружения жизнеспособных спор грибов по содержанию в них АТФ [7] .

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения жизнеспособности конидий мицелиального гриба Cunninghamella japonica [1] , согласно которому споры в количестве 2-5106 помещали в колбы вместимостью 250 мл, содержащие 10 мл среды и инкубировали на качалке (160 об/мин) при температуре 28oС. Контроль за прорастанием спор проводили с интервалом 1 ч с использованием фазово-контрастного микроскопа. Для подбора оптимальной среды использовали бидистиллированную воду с добавлением следующих соединений (%): углеводов - 0,2; аминосахаров - 0,2; жирных кислот - 0,1; пептона - 0,1; белкозина - 0,5; цАМФ - 0,001; аминокислот - 0,01 М и твинов - 1: 100 (v/v). В качестве оптимальной среды использовали бидистиллированную воду с добавлением 0,01 М L-пролина, которая обеспечивала максимальное прорастание конидий С. japonica. В опытах проросшими считали конидии, у которых длина проростковых трубочек достигала половины диаметра конидии.

Недостатком данного способа является то, что конидии многих грибов, например порядка Eurotiales, при культивировании на жидкой среде слипаются, образуя пеллеты, что сильно затрудняет подсчет жизнеспособных конидий. Кроме того в жидких средах прорастание часто бывает несинхронным, т. е. конидии в одном опыте могут находиться на различных стадиях прорастания, а сам процесс прорастания может продолжаться длительное время и нарушать график, установленный для биотехнологического процесса.

Поэтому целью настоящего изобретения является разработка экспресс-способа определения жизнеспособности конидий грибов, относящихся к порядку Eurotiales, классу Ascomycota.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что готовят питательную среду, споровый посевной материал - конидии - смачивают этанолом и добавляют воду. Получают суспензию конидий определенной концентрации, которой равномерно засевают поверхность агаризованной среды, нанесенной тонким слоем на предметное стекло. Инокулированные стекла помещают в чашку Петри на поверхность фильтровальной бумаги, увлажненной водой, и помещают в термостат при температуре 26-32oС. Затем осуществляют контроль за прорастанием конидий. Для этого через 1,5-2 ч на поверхность среды помещают окулярную сетку и, используя световой микроскоп с увеличением 250-400, подсчитывают количество проросших и непроросших конидий. Конидии проходят следующие стадии прорастания: I - набухание; II - появление проростковой трубочки; III - стадия истинного прорастания, когда длина проростковой трубочки достигает половины диаметра конидии; IV - стадия ветвления гиф. В случае необходимости осуществляют подсчет проросших конидий.

Примеры конкретного выполнения способа определения жизнеспособности спор грибов Пример 1 Определяют жизнеспособность конидий Aspergillus niger ВКПМ F-790. С этой целью готовят суспензию конидий (СК): 20 мг конидий смачивают 0,05 мл этанола и добавляют 10 мл воды. На поверхность предметного стекла наносят тонким слоем 2 мл расплавленной агаризованной среды, содержащей 0,1% пептона и 0,15% глюкозы в фосфатно-цитратном буфере с рН - 4,0. После застывания агара на поверхность среды наносят 1 каплю (0,02-0,04 мл) СК, которую равномерно распределяют стеклянной палочкой по поверхности среды. После засева предметное стекло помещают в чашку Петри на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 мл воды. Чашку Петри помещают в термостат при 32oС. Контроль за процессом прорастания осуществляют микроскопически, в случае необходимости подсчитывают количество проросших конидий, для этого на поверхность агаровой среды помещают окулярную сетку, считают конидии в 5-8 квадратах (в сумме 600 конидий) и вычисляют долю проросших конидий. При микроскопическом контроле в световом микроскопе уже через 2 ч обнаруживают на 30% больше набухших конидий (стадия I), чем по методу прототипа, а через 6 ч (стадия II) - на 15% больше проросших конидий.

Пример 2 То же, что и в примере 1, но в качестве питательной среды используют среду следующего состава (г/л): сахароза - 30,0; КН2РO4 - 10,0; MgSO42О - 10,0; КСl - 0,5; FeSO4 - 0,01; ZnSO4 - 0,05. В I стадии прорастания обнаружено на 12% больше жизнеспособных конидий, а через 6 ч (II стадия) - на 15% больше, чем по методу, описанному в прототипе.

Пример 3 То же, что и в примере 1, но в качестве питательной среды используют 0,3% пептона и 0,5% глюкозы в фосфатно-цитратном буфере с рН 5,1. При микроскопическом контроле в световом микроскопе уже через 2 часа обнаруживают на 11% больше набухших конидий (стадия I), чем по методу прототипа, а через 6 ч (стадия II) - на 13% больше проросших конидий.

Пример 4 То же, что в примере 1, но в качестве продуцента используют Penicillium lanosum BKM F-1956. При микроскопическом контроле в световом микроскопе уже через 2 ч обнаруживают на 25% больше набухших конидий (стадия I), чем по методу прототипа, а через 6 ч (стадия II) - на 14% больше проросших конидий.

Пример 5.

То же, что и в примере 3, но в качестве продуцента используют Aspergillus niger BKM F-33. При микроскопическом контроле в световом микроскопе уже через 2 ч обнаруживают на 21% больше набухших конидий (стадия I), чем по методу прототипа, а через 6 ч (стадия II) - на 13% больше проросших конидий.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить значительно больше, практически на 30% (см. пример 1), жизнеспособных конидий, не требует применения фазово-контрастной микроскопии, методически более прост (не нуждается в стерильном отборе проб, применении качалок), более точен, так как на его результат не влияет процесс агрегации (слипания) конидий, процесс прорастания ускоряется на 1,5-2 ч.

ЛИТЕРАТУРА 1. Грязнова М. В. Образование липидов и экзогенный покой клеток в цикле развития мукорового гриба Cunninghamella japonica // Дисс. . . . канд. биол. наук. 1988. Москва: Институт микробиологии АН СССР. С. 57, 79-82.

2. Postgate J. R. , Crumpton J. E. , Hunter J. R The measurement of bacterial viabilities by slide culture //J. Gen. Microbiol. 1961. V. 24. P. 15-24.

3. Феофилова Е. П. , Волохова М. В. , Величко Б. А. , Полотебнова М. В. , Терешина В. М. , Широкова Е. А. , Дараган-Сущова М. В. Способ получения посевного материала для культивирования грибов рода Aspergillus, продуцирующих экзоферменты. //А. С. 1449584. 1988.

4. Принципы быстрого обнаружения патогенных микроорганизмов и вирусов. 1969. Саратов. С. 39-72.

5. Поглазова М. Н. , Феофилова Е. П. , Алексеева В. М. Труды конференции, посвященной специальным методам микроскопии для микробиологического производства//Микробиология. 1966. Т. 35. В. 2. С. 378-379.

6. Сурнакова Н. Е. , Феофилова Е. П. , Кругликова К. Е. Способ определения жизнеспособности зооспорангиев возбудителей опухолей картофеля // А. С. 1014880. 1983 г.

7. Yo S. Q. , Trione E. J. Biochemical determination of the viability of fungal spores and hyphae //Mycologia. 1984. V. 76. 4. Р. 608-613.

Формула изобретения

1. Способ определения жизнеспособности конидий грибов, включающий приготовление питательной среды, содержащей источники углерода и азота, последующий посев конидий на среду, культивирование их и контроль стадий прорастания конидий путем микроскопирования, отличающийся тем, что перед посевом конидии смачивают этанолом, среду готовят на основе фосфатно-цитратного буфера с рН 3,8-5,1, с добавлением агара, среду наносят на предметное стекло, после посева конидий на среду предметное стекло помещают во влажную камеру при 26-32oС, культивируют конидии, микроскопирование осуществляют в световом микроскопе.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют подсчет проросших конидий.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода при определении жизнеспособности грибов порядка Eurotiales, в частности Aspergillus и Penicillium, в качестве источника углерода используют глюкозу в количестве 0,15-0,5%, а в качестве источника азота-пептон в количестве 0,1-0,3% от объема среды.

PC4A Государственная регистрация перехода исключительного права без заключения договора

Лицо(а), исключительное право от которого(ых) переходит без заключения договора:Закрытое акционерное общество "Цитробел"

(73) Патентообладатель:Общество с ограниченной ответственностью "Цитробел"

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 09.06.2010 № РП0000823

Извещение опубликовано: 20.07.2010        БИ: 20/2010




 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой штамм микроскопческого гриба Aspergillus fumigatus Frezenius 157/32

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при переработке целлюлозосодержащего сырья с целью получения кормов для сельскохозяйственных животных

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, ремедиации загрязненных земель

Изобретение относится к фитопатологии, в частности к способу определения грибковых патогенов с использованием специфических праймеров в реакции полимеризации
Изобретение относится к биотехнологии и медицине
Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в кожевенной промышленности и ветеринарии
Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано при создании клеточных банков

Изобретение относится к микробиологии и касается гранулированного состава, содержащего микроорганизмы, и способа его получения

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при хранении пространственно организованных клеточных культур и клеточных ассоциаций

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности, а именно к технологиям получения пищевых добавок
Изобретение относится к экологической микробиологии

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологии и микробной экологии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, биологии, научных исследованиях

Изобретение относится к биологической промышленности и может быть использовано в ветеринарной практике

Изобретение относится к биотехнологии, касается производства сухих бакпрепаратов
Изобретение относится к микробиологии, в частности к области хранения микроорганизмов, и может быть использовано в научной и практической медицине, в биотехнологии для хранения штаммов-продуцентов различных веществ

Изобретение относится к области обработки биологических, физических и химических объектов для изменения их свойств
Наверх