Штамм "синлак" вируса pestis suum для изготовления вакцинных препаратов

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцинный штамм "СИНЛАК" вируса КЧС получен перемежающимися пассажами лапинизированного вируса КЧС штамма Chinese на культуре клеток РК-13, гибридах А₄•С₂ и взрослых кроликах. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным наименованием "СИНЛАК"-ДЕП. Штамм "СИНЛАК" отличается как от производственных, так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов вируса КЧС. Вирус штамма "СИНЛАК" хорошо размножается в организме кроликов и перевиваемых культурах клеток РК-13 (до 5,0 lg ТЦД₅₀/см³) и гибридах А₄•С₂ (до 5,5 lg ТЦД₅₀/см³). Сохраняет исходные характеристики при последовательном пассировании в чувствительных биологических системах в течение 9-10 пассажей (срок наблюдения). Штамм обладает широким антигенным спектром действия, высокой биологической и иммуногенной активностью, пригоден для изготовления эффективных вакцинных препаратов. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики классической чумы свиней (КЧС).

КЧС - тяжелое, часто смертельное, заразное вирусное заболевание свиней, характеризующееся многообразием клинических форм и проявлений, а именно - лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем (явления геморрагической септицемии), крупозным воспалением легких и крупозно-дифтеритическим воспалением кишечника. Возбудителем заболевания является вирус, принадлежащий к роду Pestivirus семейства Flaviviridae.

В настоящее время КЧС по актуальности занимает одно из первых мест в инфекционной патологии свиней и считается для стран с интенсивной системой свиноводства одной из экономически важных болезней, а в ветеринарно-санитарном плане - одной из наиболее трудно ликвидируемых эпизоотий.

КЧС длительное время регистрируется в России. За прошедшие годы наблюдалось несколько периодов активизации эпизоотического процесса этой болезни с последующим снижением ее интенсивности. Наблюдается широкое географическое распространение болезни. КЧС регистрируется практически во всех экономических регионах страны (от Калининграда до Дальнего Востока и от Архангельской области до Краснодарского края). Хотя резервуары и пути передачи и распространения инфекции хорошо известны, практический опыт показывает, что осуществить комплекс защиты страны и хозяйств от заноса возбудителя КЧС, а тем более ликвидировать возникшую эпизоотию чрезвычайно трудно.

Для специфической профилактики свиней применяют живые лапинизированные или культуральные вакцины из аттенуированных штаммов вируса КЧС.

Известен лапинизированный штамм "Гудзон" Flavivirus suis "Hudson" вируса КЧС, который использовали в СССР в 60-х годах для изготовления лапинизированной вирусвакцины против КЧС (1,2).

Недостатком этого штамма является его повышенная реактогенность для привитых животных.

Известен штамм "ГМ-94" ВГНКИ вируса КЧС, используемый для изготовления лапинизированной вирусвакцины. Штамм "ГМ-94" ВГНКИ получен из штамма "Гудзон" вируса КЧС путем последовательных пассажей через организм кролика и путем перемежающихся последовательных пассажей на культуре клеток ППС и кроликах с использованием метода предельных разведений с идентификацией возбудителя в реакции нейтрализации (РН) со специфической сывороткой против эталонных штаммов вируса КЧС, а также селекцией вариантов по признакам безвредности для поросят 1,5-3-месячного возраста и интенсивности его репродукции в чувствительной системе организма кролика. Оценку иммуногенной активности полученного штамма осуществляли прививкой свиней с последующим их контрольным заражением эпизоотическим штаммом "Ши-Мынь" (3). Недостатком этого штамма является его низкая иммуногенная активность.

Однако в основе многих вакцин против КЧС лежит китайский аттенуированный лапинизированный штамм вируса КЧС. Он нашел широкое применение в мировой практике вакцинации свиней против КЧС (4).

Существенным его недостатком является низкая иммуногенная активность и низкий уровень накопления в перевиваемых культурах клеток.

Известен штамм "ЛК-ВНИИВВиМ" вируса КЧС, используемый для изготовления вирусвакцины. Вирус размножают в первичной культуре клеток тестикул ягнят (5).

Недостатками данного штамма являются: нерентабельность использования некондиционных (молодых) сельскохозяйственных животных, непредвиденные последствия контаминации вирусного сырья другими патогенными или условно патогенными агентами от доноров ткани, сезонность поступления донорской ткани (тестикулы ягнят, весенне-летний период), низкая иммуногенность вакцины, полученной из данного штамма.

Известен штамм "ЛК-К" вируса КЧС для изготовления культуральной вирусвакцины. Штамм "ЛК-К" получен из штамма "ЛК-ВНИИВВиМ" клонированием и селективным отбором полученных клонов по признаку высокого накопления в перевиваемой культуре клеток РК-15 (6).

Недостатком данного штамма является низкая иммуногенная активность вакцины, полученной на его основе.

Известен штамм "КС" для изготовления вирусвакцины против КЧС. Вакцину из данного штамма вводят свиньям в неблагополучных хозяйствах многократно в больших дозах с содержанием в прививном объеме 100000-1000000 Ид₅₀ (7).

Недостатком данного штамма является его низкая иммуногенная активность.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм "Chinese" вируса КЧС, используемый в качестве производственного при изготовлении сухой лапинизированной вирусвакцины.

Штамм "Chinese" вируса КЧС имеет следующие характеристики: - обладает слабой реактогенностью для свиней всех возрастов, включая новорожденных поросят и супоросных свиноматок; - не передается неиммунным животным при совместном их содержании с иммунными и не реверсирует при пассировании на свиньях (6-12 пассажей); - не персистирует у привитых свиней, а после экспериментального заражения последних вирулентный вирус не выделяется из организма вакцинированных животных; - хорошо размножается (до 3,0-3,5 lg БОЕ₅₀/см³) только в тканях кролика при введении вируса животному или в тканевых культурах клеток почки эмбриона кролика (8).

Существенным его недостатком является низкий уровень накопления вируса в тканях кролика, а также низкая антигенная и иммуногенная активность.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса КЧС, обладающего широким антигенным спектром действия, высокой биологической и иммуногенной активностью и обеспечивающего изготовление эффективной вирусвакцины.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении нового производственного штамма вируса КЧС, обладающего широким спектром действия, высокой биологической и иммуногенной активностью и пригодного для изготовления сухой лапинизированной вирусвакцины.

Указанный технический результат достигнут получением штамма "СИНЛАК" вируса КЧС. Штамм "СИНЛАК" является новым, ранее неизвестным. Штамм "СИНЛАК" получен путем проведения перемежающихся пассажей лапинизированного вируса КЧС штамма "Chinese" на культуре клеток РК-13, гибридах А₄•С₂ и взрослых кроликах. Штамм "СИНЛАК" стабильно вызывает заболевание кроликов с ярко выраженной гипертермией и является авирулентным для свиней.

Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (ВГНКИ) 5 октября 1999 года под регистрационным наименованием "СИНЛАК"-ДЕП.

По сравнению с прототипом штамм "СИНЛАК" обладает более высокой иммуногенной активностью. Экспериментально подтверждена высокая иммунологическая активность вирусвакцины из штамма "СИНЛАК". Результаты широких производственных испытаний вирусвакцины из штамма "СИНЛАК" в зонах профилактической вакцинации, а также в очагах инфекции дают основания для подтверждения достаточно выраженной эффективности указанного препарата.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на: фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность региона основных антигенных доменов гликопротеина Е2 (gp55) вируса КЧС штамма "СИНЛАК"; фиг.2 изображена дендрограмма, отражающая родственные связи между различными штаммами вируса КЧС на основе структурной гомологии их геномов.

Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Происхождение Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС получен во ВНИИ защиты животных в 1995 году перемежающимися пассажами лапинизированного вируса КЧС штамма "Chinese" на культуре клеток РК-13, гибридах А₄•С₂ и взрослых кроликах. Полученный штамм стабильно вызывает заболевание кроликов с ярко выраженной гипертермией. Титр вируса в крови зараженных животных в период максимального повышения температуры тела достигает 4,5-5,0 lgИД₅₀/2мл. Вакцинный штамм "СИНЛАК" вируса КЧС прошел 20 пассажей на культуре клеток РК-13, 25 пассажей на гибридной культуре клеток А₄•С₂ и 17 пассажей на взрослых кроликах.

Таксономическая характеристика Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus. Криптограмма - код таксономических параметров вируса КЧС-имеет вид: R/1; 4/? ; S/S; V/O, что выражает следующие его характеристики: однонитевая линейная РНК с молекулярной массой 4•10 дальтон, % содержания РНК в вирионе не установлен (?), вирион и нуклеокапсид сферической формы (S), естественным хозяином являются свиньи (V-позвоночные), распространяется без переносчиков.

Морфологические и физические признаки При электронно-микроскопическом исследовании штамм "СИНЛАК" представлен типичным для флавивирусов отдельными вирионами сферической или округлой формы диаметром 40-44 нм. На ультратонких срезах величина нуклеокапсида определена в 34-38 нм, а толщина липопротеиновой оболочки 3 нм. Коэффициент седиментации равен 104±18 по Сведбергу, плавучая плотность 1,16-1,20 г/см³.

Антигенные свойства
При парентеральном введении в организм свиньи и кролика штамм "СИНЛАК" вызывает образование вируснейтрализующих антител в титре 1:16-1:64.

Для определения антигенных свойств использовали методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования. Результаты исследований представлены на фиг.1 и 2. Методом ПЦР выявлена только геномная РНК вируса КЧС. В результате проведенного нуклеотидного секвенирования по 5' концу определено, что штамм "СИНЛАК" относится к группе "Chinese" и легко идентифицируется от существующих вакцинных штаммов вируса КЧС (см. фиг.2). Процент нуклеотидной гомологии со штаммом "Chinese" составляет 99,26. Специфичность сыворотки, полученной на штамм "СИНЛАК" вируса КЧС, определяли с вирусом вирулентного штамма "Ши-мынь" в реакции нейтрализации флюоресцирующих микробляшек (РНФМБ) на гибридных клетках А₄•С₂. Результаты исследований в РН показали специфичность штамма "СИНЛАК".

Биотехнологические характеристики
Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность. Штамм предназначен для использования в качестве сырья при изготовлении вирусвакцины против КЧС. Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС хорошо размножается в организме кроликов. На внутривенное введение вируса наиболее четко реагируют взрослые кролики массой 2,0-2,5 кг. У таких кроликов повышение температуры отмечается через 26-30 ч после заражения и держится до 72-96 ч. Наибольший титр вируса в крови 5,0 lg ИД₅₀/2 см³ отмечается через 44-50 ч после введения материала. Для выращивания штамма "СИНЛАК" испытаны культуры клеток СПЭВ, VIRO, ВНК-21, РК-15 и другие перевиваемые клетки. Наибольшее накопление вируса отмечено на культуре РК-13 (до 5,0 lgТЦД₅₀/см³) и гибридах А₄•С₂ (5,5 lgТЦД₅₀/см³). Оптимальными условиями для выращивания штамма "СИНЛАК" явились 3-суточные перевиваемые культуры клеток РК-13 и гибриды А₄•C₂ с внесением в поддерживающую среду 5-10% фетальной сыворотки КРС.

Штамм "СИНЛАК" сохраняет свои исходные характеристики при последовательном пассировании в чувствительных биологических системах в течение 9-10 пассажей (срок наблюдения).

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 4•10⁶ Д. Процент содержания РНК в вирионе не установлен. Вирусный геном представляет собой однонитевую плюс-РНК, состоящую из 12284 нуклеотидов с единственной длинной открытой рамкой считывания, соответствующей полипротеину длиной в 3898 аминокислотных остатков. В составе генома вируса КЧС гены располагаются от Т-конца к С-концу в следующей последовательности: gp44/48-gp33-gp55.

Данные о структурных белках штамма "СИНЛАК" получены путем проведения исследований методом электрофореза и ПААГ. Очищенные в градиенте вирионы содержат 3 основных вида вирусспецифических белков с мол. массой 54-55К. 45-47К и 35-37К. Два наиболее крупных по размеру полипептида представляют собой гликопротеины, расположенные на поверхности вириона. Вирусное происхождение этих полипептидов подтверждено методом радиоиммунной преципитации. Штамм "СИНЛАК" имеет полипептиды Еl(gp55), Е2(gp46) и С(р36). Полипептид gp55 содержит основные иммунореактивные доминанты, участвующие в нейтрализации инфекционности вируса КЧС.

Биологическая активность
Биологическую активность штамма "СИНЛАК" определяли титрованием на кроликах массой 2,0-2,5 кг. Готовили 10-кратные разведения вируса от 10^-3-10^-5. Суспензию каждого разведения, начиная с наибольшего, вводили внутривенно в объеме 2 см³ 4 кроликам. В качестве контроля использовали 2 кроликов, которым вводили фосфатный буферный раствор в таком же объеме. Учет результатов титрования проводили в течение 7 суток по наличию гипертермии. Биологическая активность вируссодержащей суспензии составила 4,67 lg ИД₅₀/2 см³.

Иммуногенные свойства
Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС при парентеральном введении взрослым кроликам и свиньям стимулирует образование напряженного иммунитета и устойчивость свиней к заболеванию при заражении вирусом КЧС штамма "Ши-Мынь". В опытах на поросятах установлено, что на 10-14 день после внутримышечного введения суспензии вируса у них при исследовании в РНФМБ появляются антитела в титре 1: 16 с последующим увеличением к 21 дню до 1:32-1:64. При контрольном заражении через 21 день после иммунизации вирулентным штаммом "Ши-Мынь" в дозе 10^4,5 ЛД₅₀ привитые поросята не заболели. У контрольных животных повышение температуры тела наступило на 3 день после заражения, а на 5-7 сутки они пали.

Реактогенные свойства
После инъекции штамма "СИНЛАК" вируса КЧС поросятам в дозе 100-1000 ИД₅₀ у 20-25% привитых животных отмечается повышение температуры тела до 40,1-41^oС, которая удерживается в течение 1-4 суток без угнетения общего состояния. Средний привес животных (за месяц) после инъекции им штамма снижается (в сравнении с контролем) всего на 0,6-1,2 кг.

Стабильность
Приобретенные свойства (отсутствие реверсии и ослабленная реактогенность) штамм "СИНЛАК" вируса КЧС сохраняет в течение 9-10 последовательных пассажей на свиньях.

Сохраняемость
Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС хорошо хранится при -70^oС в нативном или лиофилизированном виде во флаконах под герметично закрытыми пробками и металлическими колпачками. Титр вируса за 12 месяцев хранения практически не снижался, а иммуногенная активность не изменялась. Однако, хранение нативного вируса в течение одного месяца при +4^oС существенно снижает его инфекционную активность.

Дополнительные сведения о штамме
Вакцинный штамм "СИНЛАК" не обладает контагиозностью. При введении серонегативным подсвинкам не вызывает признаков болезни животных КЧС.

Свободен от вирусных, бактериальных и микоплазменных контаминантов.

По безопасности и иммуногенности штамм "СИНЛАК" полностью отвечает требованиям О.I.E. (МЭБ).

Комиссионные испытания подтвердили полное соответствие штамма "СИНЛАК" предъявляемым требованиям и явились основанием для его депонирования в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпрепаратов под регистрационным наименованием "СИНЛАК"-ДЕП.

На основании полученных сведений можно утверждать, что штамм "СИНЛАК" вируса КЧС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса КЧС.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Штамм "СИНЛАК" используют для изготовления лапинизированной вирусвакцины против КЧС. Для этого кроликам массой 2,5-3,0 кг внутривенно вводят суспензию штамма "СИНЛАК" в дозе 100 ИД₅₀ в объеме 2,0 см³. У животных ежедневно измеряют температуру тела. Кроликов, реагирующих через 42-52 ч повышением температуры до 40,5-41,8^oС, обескровливают тотально. От каждого животного кровь отбирают в отдельный стерильный флакон, содержащий 1000 ЕД гепарина. Затем кровь сливают в одну емкость, перемешивают, отбирают пробу в объеме 10 см³ для контроля титра вируса, охлаждают до температуры 4-8^oС и, соблюдая стерильные условия, центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин для освобождения от оболочек деструктированных эритроцитов и возможных сгустков. Надосадочную жидкость собирают в бутыль и добавляют антибиотики в эффективном количестве. Полученный вируссодержащий материал объединяют со средой высушивания в соотношении, необходимом для получения вакцины с заданной иммуногенной активностью. В качестве ингредиентов защитной среды используют широко применяемые для этих целей вещества: сахарозу, желатин и гидролизат лактальбумина. Для приготовления защитной среды берут 50% раствор сахарозы, 10% раствор желатина и 20% раствор гидролизата лактальбумина. Смесь антигена и защитной среды тщательно перемешивают, при необходимости доводят рН смеси до 7,2-7,4, разливают в стерильные флаконы (ампулы) по 2-4 см³ и подвергают лиофильному высушиванию. По окончании сушки флаконы с вакциной закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивающими герметичность флаконов. Готовый биопрепарат представляет собой сухую аморфную массу красно-коричневого цвета, легко растворимую при добавлении физраствора в течение 1-2 мин.

Вакцину применяют в угрожаемых и неблагополучных по КЧС хозяйствах. Свиней иммунизируют вакциной в объеме 2 см³, содержащей 100 ИД₅₀ для кроликов.

Полученная вакцина против КЧС имеет оптимальный компонентный состав, мас.%, приведенный в таблице в конце описания.

Содержание вируссодержащего материала в диапазоне 70-80 (мас.%) представляет собой эффективное количество антигена в предлагаемой вакцине.

Пример 2.

Серию вирусвакцины против КЧС из штамма "СИНЛАК", изготовленной так, как описано в примере 1, подвергают контролю на стерильность, безвредность, биологическую и иммуногенную активность.

Проверка стерильности
Контролю вакцины на отсутствие бактериального и грибкового загрязнения подвергают среднюю пробу вакцины из пяти флаконов. Испытание проводят в соответствии с ГОСТ 28085-89. Вакцина признана стерильной.

Проверка безвредности вакцины
Испытание безвредности проводят на двух поросятах 3-4-месячного возраста массой 30-35 кг, полученных из благополучного по чуме хозяйства и не подвергавшихся ранее вакцинации против этой инфекции.

Среднюю пробу готовят из 10 флаконов вакцины. В последующем из средней пробы цельную вакцину в объеме 2 см³ (десятикратная прививная доза) вводят свиньям внутримышечно. Перед введением вакцины и в течение последующих 7 дней у животных измеряют температуру тела. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 14 дней.

За этот период у животных не выявляют отклонений от нормы. Вакцина признается безвредной.

Проверка иммуногенной активности
Для контроля иммуногенной активности вакцины используют 14 поросят в возрасте 3-4 месяцев массой 30-45 кг. Из средней пробы, приготовленной смешиванием регидратированного содержимого 10 флаконов вакцины, готовят на физрастворе разведения с 10^-2 до 10^-4, которые в объеме 2 см³ вводят свиньям внутримышечно из расчета 4 головы на каждое разведение. Два невакцинированных поросенка служат контролем и содержатся в отдельном боксе. У всех животных перед вакцинацией и перед заражением исследуют сыворотки крови на содержание вируснейтрализующих антител. Наблюдение за животными ведут в течение 20 дней с ежедневным изменением температуры тела в первые 7 суток. На 14 день всех привитых и группу контрольных животных заражают вирусом КЧС штамма "Ши-Мынь" путем его внутримышечного введения в объеме 1 см³, содержащего 10⁴ ЛД₁₀₀. За зараженными животными ведут наблюдение в течение 15 дней с ежедневной термометрией. Установлено, что все привитые животные после контрольного заражения не проявили отклонений от нормы и оставались здоровыми весь период наблюдения. Активность сывороток крови у них в РН составила от 5.23 до 6,0 лог₂(1:36-1:64), в то время как перед вакцинацией составила меньше 1: 2.

У контрольных животных подъем температуры тела отмечен на 5-7 день. В последующем они отказались от корма, мало двигались. Летальный исход наступил на 11-13 день после заражения. При патанатомическом исследовании установлены характерные для чумы изменения в коже, селезенке, лимфоузлах, кровоизлияния в сердце, почках, толстом отделе кишечника.

Таким образом, сухая лапинизированная вирусвакцина против КЧС из штамма "СИНЛАК" стерильна, безвредна, ареактогенна. Вакцина обладает выраженной иммуногенностью, т.к. стимулирует выработку вируснейтрализующих антител через 14 дней после прививки в титрах от 5,23 до 6,0 лог₂ и обеспечивает защиту от контрольного заражения привитых животных. Иммуногенная активность вакцины на свиньях составила 4,5 lg ИмД₅₀/2 см³, а биологическая активность на кроликах 4,0 lg ИмД₅₀/2 см³.

Пример 3.

Очередную серию вирусвакцины против КЧС из штамма "СИНЛАК", изготовленной так, как описано в примере 1, проверили на иммуногенную активность на серонегативных подсвинках массой 16-25 кг, ранее не подвергавшихся вакцинации против КЧС. Для этого содержимое 10 флаконов препарата регидратировали добавлением 2 см³ физраствора в каждый и смешивали в одной емкости. Для вакцинации свиней из исходной смеси готовили десятикратные разведения с конечной концентрацией 1000, 100, 10 и 1 ИД₅₀/2 см³ для кроликов, что соответственно составляет 10; 1; 0,1 и 0,01 прививных доз для свиней. Каждое разведение вводили 3 подсвинкам в объеме 2 см³ внутримышечно за ухом. Перед вакцинацией и в течение 14 дней после вакцинации и 14 дней после заражения у животных ежедневно измеряли температуру тела и вели наблюдение за общим состоянием. Контрольные подсвинки в количестве 4 голов содержались весь период эксперимента в одном боксе с иммунизированными животными. У животных до вакцинации и перед заражением получали пробы крови для исследования вируснейтрализующей активности сыворотки в РНФМБ. Через 21 день всех привитых и 2 контрольных животных заражали вирусом КЧС штамма "Ши-Мынь". Исходную вируссодержащую суспензию после размораживания и центрифугирования смешивали с фосфатно-буферным раствором (ФБР) в соотношении 1:30 и вводили животным в объеме 1 см³ внутримышечно с внутренней стороны бедра. Наблюдение вели в течение 14 дней.

При титровании вакцины на кроликах из исходной смеси содержимого 10 флаконов готовили десятикратные разведения до 10^-5, которые вводили внутривенно в объеме 2 см³. Перед вакцинацией у животных измеряли температуру тела, а в процессе наблюдения в течение 7 дней измерение проводили ежедневно трехкратно.

В результате проведенных исследований установлено, что вирус КЧС штамма "СИНЛАК" и вакцина, изготовленная из этого вируссодержащего материала, не контагиозны. Интактные поросята при содержании в течение 21 дня в одном боксе с привитыми не проявили признаков заболевания КЧС и в сыворотке крови этих животных не выявлено нейтрализующих антител к вирусу КЧС. Вакцина, а следовательно, и штамм "СИНЛАК", из которого изготовлен препарат, обладают выраженной биологической (титр вируса на кроликах 4,5 lg ИД₅₀/2 см³) и иммуногенной активностью. У поросят, иммунизированных вакциной с содержанием 10; 1; 0,1 и 0,01 прививной дозы для свиней, титры вируснейтрализующих антител через 21 день после вакцинации составили от 5,25 до 6,33 лог₂, а животные были устойчивы к экспериментальному заражению вирусом КЧС штамма "Ши-Мынь".

Пример 4.

Эффективность вирусвакцины против КЧС из штамма "СИНЛАК" проверена по отношению к эпизоотическому изоляту вируса КЧС "Молдова-98", вызвавшему заболевание свиней в Молдове. Эпизоотический изолят, поступивший во ВНИИ защиты животных, постановкой биопробы на свиньях, а также методом ПЦР и нуклеотидным секвенированием части генома диагностировали как вирус КЧС. Одновременно дополнительному исследованию в ПЦР и нуклеотидном секвенировании был подвергнут вируссодержащий материал из штамма "СИНЛАК" и вакцина, из которого она была изготовлена. В настоящем эксперименте была использована 10% суспензия селезенки, лимфоцитов и крови поросят, зараженных эпизоотическим вирусом КЧС "Молдова-98", прошедшим 2 пассажа на свиньях. Проверку эффективности вирусвакцины против КЧС из штамма "СИНЛАК" осуществили так, как описано в примере 2.

В результате проведенных исследований установлено следующее. Вирусвакцина против КЧС из штамма "СИНЛАК" специфична, так как сыворотка крови привитых свиней нейтрализует в РНФМБ антиген вируса КЧС штамма "Ши-Мынь". Титр антител у иммунизированных животных составил от 5,17 до 5,75 лог₂ и не зависел от прививной дозы.

Вирусвакцина против КЧС из штамма "СИНЛАК" обладает достаточной иммуногенностью и против эпизоотического вируса, так как при введении подсвинкам 1 или 10 прививных доз в объеме 2 см³ стимулирует выработку специфических антител в титрах выше 5,0 лог₂ и обеспечивает защиту животных от заболевания при экспериментальном заражении изолятом "Молдова-98".

Пример 5.

Эффективность вирусвакцины против КЧС из штамма "СИНЛАК", изготовленной так, как описано в примере 1, проверена на поголовье свиней в АО "Коммунар" Владимирской области. Все поголовье свиней в АО "Коммунар" подвергается иммунизации против вируса КЧС. Последний раз животных иммунизировали вирусвакциной против КЧС из штамма "ЛК-ВНИИВВИМ". Перед началом испытаний у животных различных возрастов была отобрана кровь с целью исследования уровня вируснейтрализующих антител к вирусу КЧС. Было установлено, что титр антител у основных свиноматок составлял 4,23-5,33 лог₂ (M±m=4,75±0,32), в группе откорма 3,83±5,76 лог₂ (4,92±0,43), у подсосных поросят в возрасте 32-40 дней 2,83±4,24 лог₂ (3,61±0,42).

Вакцинации подвергнуто 74 свиноматки, 115 голов подсвинков в возрасте 35-40 дней. Животных вакцинировали по следующей схеме: свиноматок за 3-40 дней до случки, поросят в возрасте 35-40 дней с последующей ревакцинацией через 3-4 недели. Уровень вируснейтрализующих антител через 21 день после вакцинации составлял у свиноматок 5,76-7,17 лог₂ (6,33±0,52), у молодняка 5,0-6,55 лог₂ (5,81±0,28). Через 30 дней после ревакцинации титр вируснейтрализующих антител у молодняка составлял от 5,75 до 7,0 лог₂ (6,35±0,24).

По истечении 60 дней после вакцинации уровень специфических антител у свиноматок к вирусу классической чумы составлял 7,5-8,23 лог₂.

Таким образом, вирусвакцина против КЧС из штамма "СИНЛАК" вызывает формирование напряженного иммунитета у свиней различных возрастных групп. Уровень антител против вируса КЧС свидетельствует о высокоактивном препарате. В процессе проведения испытаний разработанного препарата не отмечено каких-либо отклонений у животных от нормального физиологического состояния.

Пример 6.

Эффективность вирусвакцины против КЧС из штамма "СИНЛАК", изготовленной так, как описано в примере 1, проверена на поголовье свиней в неблагополучном по КЧС АО "Сызранское" Радищевского района Ульяновской области. В очаге заболевания однократными и десятикратными дозами вакцины были привиты 3840 голов свиней разновозрастных групп, в том числе поросята с 7-дневного возраста. Через 10 дней после применения вакцины заболевание в очаге прекратилось.

Карантин с хозяйства был снят. Применение вакцины в однократной и десятикратной дозах имело одинаково положительный результат.

Пример 7.

Эффективность вирусвакцины против КЧС из штамма "СИНЛАК", изготовленной так, как описано в примере 1, проверена на поголовье свиней на благополучном по КЧС свинокомплексе совхоза "Горноуральский" Пригородного района Свердловской области. Вакцина использовалась для профилактической вакцинации. Было привито 70000 голов свиней, в том числе 19980 свиноматок основных и ремонтных, а также 50020 голов молодняка. Для иммунизации свиней использовано вакцины в количестве 110800 доз. После применения препарата осложнений у привитых животных не выявлено. Периодически исследовались сыворотки крови от вакцинированных животных в РНФМБ на напряженность иммунитета. Всего было исследовано 53 пробы. Титры антител были в пределах от 5,0 до 6,0 лог₂, т.е. на достаточно высоком уровне. Хозяйство осталось благополучным по КЧС.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм "СИНЛАК" вируса КЧС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его использования с помощью приведенных в описании или известных до даты приоритета средств и методов;
- штамм "СИНЛАК" вируса КЧС, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной, биологической и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления сухой лапинизированной вирусвакцины против КЧС.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации,
принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на "Штамм "СИНЛАК" вируса КЧС для изготовления вакцинных препаратов"
1. Hudson L. R. Peste porcine. L'adaptation du virus au papin et I'utilisation du virus adapte pour immuniser les porcs. Bull. Off. Epis., 1953, 40, 60-73.

2. Лихачев Н.В. Достижения в области вирусных биопрепаратов и вакцин по дальнейшему их усовершенствованию. Труды ВГНКИ ветпрепаратов, 1972, 18, 22-29.

3. Патент РФ 2096454; МПК⁶ С 12 N 7/00, А 61 К 39/187; 20.11.97 г.

4. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Киев, "Урожай", 1993, 285-294.

5. Патент РФ 2064302, МПК⁶ A 61 К 39/187, 27.07.96 г.

6. Патент РФ 2057805; МПК⁶ C 12 N 7/00, А 61 К 39/187; 10.04.96 г.

7. Патент РФ 2129443; МПК⁶ A 61 K 39/187, C 12 N 7/00, 27.04.99 г.

8. Kojnok F. , Palatka Z et al. Requirements of rabbit-adapted swine fever vaccine. Arch. Exp. Veterinarmed., 1980, 34(1), 67-72 (прототип).

Формула изобретения

Штамм вируса Pestis suum, сем. Flaviviridae, род Pestivirus, коллекция ВГНК, регистрационное наименование "СИНЛАК"-ДЕП, для изготовления вакцинных препаратов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.03.2004

Извещение опубликовано: 10.03.2005        БИ: 07/2005