Штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент фибробластного интерферона человека, рекомбинантная плазмидная днк phif и способ ее конструирования

 

Изобретение относится к биотехнологии, к генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и может быть использовано для получения фибробластного интерферона человека. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHIF содержит EcoR1-Xhol фрагмент бактериально-дрожжевого вектора pPIC9 и Xhol-EcoR1 фрагмент, включающий кодирующую часть гена бета-интерферона человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид. Ген бета-интерферона получают ПЦР с использованием матрицы рНВI с помощью прямого и обратного праймера. Плазмиду рHIF трансформируют в штамм дрожжей с получением трансформированного штамма Pichia pastoris PS99 (pHIF). Изобретение позволяет обеспечить получение бета-интерферона человека, секретируемого в культуральную жидкость. 3 с.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, к генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой дрожжевой штамм - продуцент фибробластного интерферона человека, содержащий сконструированную in vitro плазмиду, которая обеспечивает синтез фибробластного интерферона человека.

Фибробластный интерферон человека, бета-интерферон, относится к обширной группе эволюционно родственных белков, получивших название интерферонов. Образование интерферонов стимулируется воздействием вирусов на различные группы клеток. Интерфероны способны активировать противовирусные защитные механизмы клетки. Клинические испытания показали возможность использования бета-интерферона для лечения ряда вирусных, аутоиммунных заболеваний человека (Ершов Ф. И. Система интерферона в норме и патологии, 1996). Получены обнадеживающие результаты применения бета-интерферона при рассеянном склерозе (Paty D.W. et al. Neurology, 1993, v. 43, р. 662-667; Yong V.W. et al. Neurology, 1998, v. 51, p. 682-689). Однако систематические исследования спектра биологического действия бета-интерферона, как и его применение в клинике затруднены, так как высокоочищенные препараты этого белка практически отсутствуют. Видоспецифичность интерферонов не позволяет использовать в клинических испытаниях препараты бета-интерферона других млекопитающих. Использование в качестве источника бета-интерферона донорской крови или культуры фибробластов не дает нужных количеств препарата, а кроме того, несет опасность заражения гепатитом В, С и ВИЧ.

Перспективным подходом для получения бета-интерферона человека в значительных количествах является использование микроорганизмов в качестве продуцентов этого препарата. Существует ряд штаммов Escherichia coli, продуцирующих бета-интерферон человека. Уровень продукции колеблется от 1.5 до 6000 млн. ед. биологически активного бета-интерферона на литр культуры и составляет в последнем случае несколько десятков миллиграммов (Taniguchi Т. et al. Nature, 1980, v. 285, р. 547-549; Goeddel D.V. et al. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, p. 4057-4074; Remaut E. et al. Nucl. Acids Res., 1983, v. 7, p. 4677-4688). Содержание его в клетках может достигать около 2% суммарного клеточного белка. Но Escherichia coli являются условно патогенными для человека, и препараты бета-интерферона, полученные из бактериальных клеток, могут содержать эндотоксины. Полное освобождение бета-интерферона от примеси эндотоксинов, являющееся обязательным условием применения его в клинической практике, значительно затрудняет процедуру очистки рекомбинантного белка. В настоящее время зарегистрирован и разрешен к применению только один препарат рекомбинантного бета-интерферона человека, экспрессированного в Escherichia coli, производимый фирмой "Шеринг". Длительное применение его может приводить к нежелательным побочным эффектам, обусловленным условной патогенностью штамма-продуцента (Neilley L.K. et al. Neurology, 1996, v. 46, p. 552-554; Brod S. A. et al. Neurology, 1996, v. 46, p. 1633-1638; Huber S. et al. Schweiz. Med. Wochenschr., 1996, v. 126, p. 1475-1481).

Все вышеизложенное свидетельствует о перспективности создания штаммов-продуцентов бета-интерферона человека на основе других микроорганизмов, в частности дрожжей. Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов белков человека позволяет использовать рекомбинантные белки в клинической практике. Однако созданные ранее в лаборатории биохимической генетики БиНИИ СПбГУ штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae - внутриклеточные и секреторные продуценты фибробластного интерферона человека - отличались низкой продуктивностью. Уровень продукции составлял от 100 мкг до 1 мг биологически активного бета-интерферона на литр культуры (Мясников А.Н., Останин К.В., Смирнов М.Н. и др. Авторское свидетельство 1530749). Кроме того, углеводный компонент белков, экскретируемых дрожжами-сахаромицетами, существенно отличается от такового гликопротеинов высших эукариота (Kukuruzinska M.A. et al. Ann. Rev. Biochem., 1987, v. 56, p. 915-944). Углеводная часть гликопротеинов является сильной антигенной детерминантой, поэтому рекомбинантный бета-интерферон человека, секретируемый дрожжами Saccharomyces cerevisiae, может применяться только для лабораторных исследований (Ballou C.E. J. Biol. Chem., 1970, v. 245, p. 1197-1203).

Использование для гетерологичной экспрессии метилотрофных дрожжей Pichia pastoris представляет особый интерес. Это, во-первых, дает возможность существенно повысить выход рекомбинантных белков. Во-вторых, гликопротеины, секретируемые дрожжами Pichia pastoris, не содержат маннозных остатков, связанных α1-3 связями и являющихся сильными антигенными детерминантами, что позволяет получать наряду с внутриклеточными аутентичные секреторные формы рекомбинантных белков (Montesino R. et al. Protein Expr. Purif., 1998, v. l4, p. 197-207).

Получение секреторного продуцента бета-интерферона человека особенно актуально. Белок является гликопротеином, и только в процессе секреции он претерпевает гликозилирование и приобретает правильную конформацию. Накопление рекомбинантного белка в культуральной жидкости значительно упрощает процедуру его очистки.

Задачей данного изобретения является создание штамма дрожжей Pichia pastoris, синтезирующего бета-интерферон человека и секретирующего его в культуральную жидкость, создание рекомбинантной плазмиды ДНК pHIF и способа ее конструирования.

Для решения указанной задачи разработан способ конструирования плазмиды pHIF, обеспечивающей синтез бета-интерферона в клетках дрожжей и его секрецию в культуральную жидкость, в результате создан штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент бета-интерферона человека.

Плазмида pHIF, обеспечивающая синтез и секрецию бета-интерферона человека трансформированными ею клетками дрожжей, состоит из следующих элементов: - EcoRl-Xhol - фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора рРIС9 размером 8,00 т.п.о., включающий бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, ген HIS4 дрожжей; фрагмент 5'-некодирующей области дрожжевого гена АОХ1 размером 0,95 т.п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; препрообласть гена MFα дрожжей Saccharomyces cerevisiae размером 0,27 т.п.о., обеспечивающую секрецию бета-интерферона в культуральную среду; фрагмент гена АОХ1 размером 0,33 т.п.о., содержащий область терминации транскрипции этого гена; фрагмент 3'-нетранслируемой области гена АОХ1 размером 0,76 т.п.о.; - Xhol-EcoRI - фрагмент размером 0,52 т.п.о., содержащий кодирующую часть гена бета-интерферона человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид; Схема плазмидной ДНК pHIF с рестрикционной картой изображена на фиг.1. Общий размер плазмиды 8,52 т.п.о.

Схема конструирования плазмиды pHIF приведена на фиг.2.

Плазмиду pHBI (Падкина М.В. и др. гос. регистрации 98106452, дата приоритета 7 апреля 1998 г.) используют в качестве матрицы для синтеза гена бета-интерферона человека при помощи ПЦР. В качестве прямого праймера служит олигонуклеотид 5'-ccgctcgagaaaagaatgagctacaacttg, содержащий сайт для рестриктазы Xhol. В качестве обратного праймера используют олигонуклеотид 5'-ggaattcctcagtttcggaggtaac, который содержит сайт для рестриктазы EcoR1. Синтезированный ген бета-интерферона человека размером 0,52 т.п.о. выделяют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле, обрабатывают рестриктазами Xhol и EcoR1 и лигируют с плазмидой pPIC9 ("Invitrogen"), предварительно обработанной этими же рестриктазами.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5α Escherichia coli (F'/endA1 hsdR17 (r_k ^-m_k ⁺) supE44 thi-1 recA1 gyrA с помощью рестрикционного анализа отбирают трансформанты, содержащие плазмиду pHIF. Для доказательства идентичности гена бета-интерферона, синтезированного при помощи ПЦР, нативному гену бета-интерферона человека проводят определение его нуклеотидной последовательности (Sanger F.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1977, v. 74, p. 5463-5467).

Выбор конструкции плазмиды для продукции бета-интерферона обусловлен следующими причинами. Плазмида pHIF получена на основе челночного бактериально-дрожжевого интегративного вектора рРIС9. В результате трансформации линеаризованной плазмидой и последующей гомологичной рекомбинации происходит встраивание экспрессионной кассеты в хромосому дрожжей Pichia pastoris, что обеспечивает стабильной поддержание клонированного гена бета-интерферона. В состав плазмиды входит ген HIS4 дрожжей, что позволяет селективно отбирать трансформантов при использовании в качестве реципиентов штаммов дрожжей с мутациями в этом гене.

Экспрессия гена бета-интерферона человека в составе плазмиды pHIF находится под контролем промотора гена АОХ1, содержащим области, обеспечивающие активацию транскрипции в присутствии метанола в культуральной среде, а также область инициации транскрипции. Промотор гена АОХ1 относится к числу наиболее сильных дрожжевых промоторов. Уровень экспрессии генов, находящихся под контролем АОХ1 промотора, эффективно регулируется источниками углерода. Транскрипция гена АОХ1 полностью блокирована при выращивании дрожжей на среде с глюкозой, на среде с глицерином наблюдается только базальный уровень экспрессии гена. Использование метанола в качестве единственного источника углерода значительно усиливает экспрессию гена АОХ1 и, следовательно, генов, находящихся под контролем АОХ1 промотора. Это позволяет регулировать синтез бета-интерферона в клетках дрожжей. На необходимость подобной регуляции указывают полученные нами данные, свидетельствующие о токсичности бета-интерферона для клеток дрожжей. Наличие в составе плазмиды препрообласти гена MFα дрожжей Saccharomyces cerevisiae обеспечивает секрецию синтезированного бета-интерферона человека в культуральную жидкость.

В качестве продуцента бета-интерферона используют штамм PS99(pHIF). Штамм PS99(pHIF) получен при трансформации штамма дрожжей PS99 (his4 pep4:: PHО85) плазмидой pHIF. Штамм PS99 несет мутацию в гене HIS4, что позволяет селективно отбирать трансформантов, несущих плазмиду pHIF. Мутация в гене РЕР4 приводит к отсутствию активности протеаз А и В, а также карбоксипептидазы Y в клетках дрожжей, что сопровождается повышением стабильности гетерологичных рекомбинантных белков (Hisch H.H. et al. In: Walton E.F., Yarranton G.T., Eds., Molecular and Cell Biology of Yeast, 1989, p. 134-200).

Штамм дрожжей Pichia pastoris PS99(pHIF) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки округлой, слегка овальной формы, размером 5-10 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на полной органической среде YEPD - 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы или 1% глицерина.

Кроме того, клетки хорошо растут на минеральной среде SC: 1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США), 2% глюкозы (1% глицерина, 0,5% метанола), а также на других синтетических средах для дрожжей.

При росте на твердых средах клетки образуют гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью, светло-кремового цвета, край неровный.

При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 37^o. Оптимальной температурой выращивания является 30^o. При росте в аэробных условиях клетки незначительно защелачивают среду.

Оптимум рН для роста составляет 4,5-6,5.

В качестве источника углерода клетки подходят многие простые соединения, такие как глюкоза, глицерин, метанол.

В качестве источника азота клетки подходят минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевина.

Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.

Существенными признаками штамма является отсутствие потребности в гистидине.

Заявляемое изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

ПРИМЕР 1.

Способ получения плазмиды pHIF.

Клетки бактерий Escherichia coli, содержащие плазмиду pHBI, выращивают при 37^o в течение ночи в 1 л питательной среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% хлористого натрия), содержащей ампициллин в концентрации 50 мг/л. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут при 4^o, суспендируют в 20 мл 25 мМ трис-хлоридного буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы, добавляют 30 мг лизоцима и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Далее добавляют 40 мл 0,2 М гидроокиси натрия, содержащей 1% додецилсульфата натрия, осторожно перемешивают и инкубируют в течение 10 минут при 4^o. Раствор нейтрализуют добавлением 30 мл 3 М ацетата натрия (рН 5,0) и выдерживают в течение 10 минут при 4^o. После этого центрифугируют при 14000 об/мин в течение 40 минут при 4^o. К супернатанту добавляют 0,6 объема изопропилового спирта, выдерживают 20 минут при комнатной температуре и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 минут при 20^o. Полученный осадок промывают 70% этиловым спиртом, высушивают в вакууме и растворяют в 4 мл дистиллированной воды. Далее добавляют 4,2 г хлористого цезия и 0,36 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Полученный раствор выдерживают в течение 1 часа при 4^o, затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант центрифугируют при 70000 об/мин в течение 16 часов в центрифуге TL100 ("Beckman"). После центрифугирования отбирают полосу плазмидной ДНК (нижнюю из двух флюоресцирующих в ультрафиолетовом свете полос), дважды экстрагируют бромистый этидий равным объемом изоамилового спирта, разбавляют в два раза дистиллированной водой и осаждают плазмидную ДНК двумя объемами этилового спирта и 1/15 объема 3 М ацетата натрия (рН 5,0). Осадок собирают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 минут, промывают 70% этиловым спиртом и растворяют в 0,5-1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-хлоридный буфер, рН 8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА). Концентрацию плазмидной ДНК определяют по поглощению раствора при длине волны 260 нм. Чистоту препарата контролируют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле в буфере ТВЕ (0,1 М трис-боратный буфер, рН 8,3, содержащий 1 мМ ЭДТА).

Полученную плазмиду pHBI используют в качестве матрицы для синтеза гена бета-интерферона человека при помощи ПЦР.

К 0,1 мкг плазмидной ДНК, растворенной в 5 мкл буфера ТЕ, добавляют 1 мкл 0.5 М NaOH и нагревают при 85^o в течение 3 минут. Затем пробу быстро переносят в лед, добавляют 1 мкл 0.5 М НСl и далее используют в ПЦР.

В качестве прямого праймера служит олигонуклеотид 5'-ccgctcgagaaaagaatgagctacaacttg, содержащий сайт для рестриктазы Xho1. В качестве обратного праймера используют олигонуклеотид 5'-ggaattcctcagtttcggaggtaac, который содержит сайт для рестриктазы EcoR1.

Проба для ПЦР содержит 5 мкл матрицы, 30 рМ каждого праймера (по 2 мкл), 10 мкл 10-кратного раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), содержащего 1,25 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), 10 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (100 mM KCl, 100 mМ (NH₄)₂SО₄, 200 mМ Трис-HCl, рН 8,8, 20 mM MgSО₄, 1% тритон Х-100). В пробу добавляется дистиллированная Н₂О до конечного объема 100 мкл.

Далее пробу прогревают 5 мин при 95^oС, охлаждают, добавляют 2,5 ед. (2,5 мкл) Вент-ДНК-полимеразы ("BioLabs") и проводят 50 циклов ПЦР в следующих условиях: 1 мин при 95^o (плавление цепей ДНК), 1 мин при 43^o (отжиг праймеров), 1 мин при 72^o (полимеразная реакция). После окончания ПЦР пробу инкубируют при 72^o 5 мин.

Для доказательства того, что в ходе ПЦР синтезируется ген бета-интерферона человека проводят электрофорез в 0,7% агарозном геле в буфере ТВЕ. Реакционную смесь вносят в лунки агарозного геля и проводят разделение фрагментов ДНК в течение 1-2 часов в условиях, описанных выше. По окончании разделения вырезают полоску геля, содержащую фрагмент ДНК размером 0,52 т.п. о. , соответствующий гену бета-интерферона человека. Выделение ДНК из агарозного геля проводят по методике, разработанной фирмой QIAGEN. Полоску геля с фрагментом ДНК помещают в пробирку и добавляют раствор QX1 (300 мкл на 100 мг геля). Пробу нагревают до 50^o, добавляют реактив QIAEX (10 мкл на 5 мкг ДНК) и инкубируют при 50^o в течение 10 минут, периодически перемешивая. Далее центрифугируют 30 секунд при 15000 об/мин, супернатант отбрасывают, осадок дважды экстрагируют растворами QX2 и QX3, удаляют супернатант центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 секунд. Осадок высушивают на воздухе, растворяют в 20 мкл буфера ТЕ, центрифугируют 30 секунд при 15000 об/мин, супернатант переносят в новую пробирку.

Гидролиз фрагмента ДНК, содержащего синтезированный ген бета-интерферона человека, рестриктазами Xho1 и EcoRI проводят в 10 мМ трис-хлоридном буфере (рН 7,5), содержащем 50 мМ хлористого натрия, 10 мМ хлористого магния и 1 мМ дитиотреитол. К 5 мкг плазмидной ДНК в объеме 20 мкл добавляют по 5 ед. каждой рестриктазы, после чего пробу инкубируют в течение 25 часов при 37^o.

Выделение плазмиды рРIС9 проводят в условиях, аналогичных для плазмиды pHBI. Гидролиз ее рестриктазами Xho1 и EcoRI осуществляют в условиях, описанных для расщепления синтезированного при помощи ПЦР гена бета-интерферона человека. Линеаризованную плазмидную ДНК выделяют по описанной выше методике фирмы QIAGEN, исключая стадию нагревания.

Для получения плазмиды pHIF проводят лигирование плазмиды рРIC9, гидролизованной рестриктазами XhoI и EcoRI, и XhoI/EcoRI фрагмента гена бета-интерферона человека, синтезированного при помощи ПЦР. Для этого смешивают 0,5 мкг ДНК вектора и 0,1 мкг ДНК встройки в 10 мкл 70 мМ трис-хлоридного буфера (рН 7,6), содержащего 5 мМ дитиотреитола, 5 мМ хлористого магния, 1 мМ АТФ, добавляют 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 14^o в течение ночи.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5α Escherichia coli (F'/endAl hsdR17 (r_k ^-m_k ⁺) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nal^r) . Для этого клетки Escherichia coli выращивают в 100 мл среды LB при 37^o до достижения культурой густоты клеточной суспензии, соответствующей 0,4-0,6 ед. оптической плотности при длине волны 550 нм. Клеточную суспензию охлаждают в ледяной бане, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 минут при 4^o. Клетки суспендируют в 100 мл 10 мМ хлористого натрия, собирают центрифугированием в тех же условиях. Далее клетки суспендируют в 50 мл 75 мМ хлористого кальция, выдерживают в ледяной бане в течение 40 минут, осаждают центрифугированием в тех же условиях и суспендируют в 1 мл 75 мМ хлористого кальция. К суспензии компетентных клеток добавляют глицерин до конечной концентрации 15%, разделяют на аликвоты и хранят при -70^o. Перед трансформацией суспензию компетентных клеток размораживают в ледяной бане, добавляют лигазную смесь и инкубируют в ледяной бане в течение 40 минут. Далее клетки подвергают действию теплового шока при 42^o в течение 2 минут, после чего инкубируют в 1,5 мл среды LB при 37^o в течение 1 часа. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут и высевают на чашки Петри со средой LB, содержащей 2% агара и 50 мг/л ампициллина. Чашки инкубируют при 37^o в течение 12-16 часов.

Из выросших отдельных клонов трансформантов выделяют плазмидную ДНК при помощи методики, использованной для получения плазмиды pHBI, за исключением того, что клетки Escherichia coli выращивают в 10 мл LB, и, соответственно, объемы всех растворов уменьшают в 100 раз. Кроме того, вместо стадии центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия проводят обработку ДНК панкреатической РНКазой. Для этого нуклеиновые кислоты, осажденные изопропиловым спиртом, растворяют в 100 мкл буфера ТЕ, добавляют 10 мкл раствора РНКазы (1 мг/мл) и инкубируют 30 минут при 37^o.

Далее проводят гидролиз полученной плазмидной ДНК рестриктазой PvuII. При рестрикции искомой плазмиды pHIF и последующем электрофорезе в 0,7% агарозном геле обнаруживаются фрагменты 0,60, 2,95 и 4,97 т.п.о. Из выявленного таким образом клона препаративно выделяют плазмиду pHIF так же, как описано для плазмиды pHBI, и гидролизуют рестриктазой BglII в 50 мМ трис-хлоридном буфере (рН 7,5), содержащем 100 мМ хлористого натрия, 10 мМ хлористого магния. BglII-фрагмент плазмиды рРIС9 размером 5,63 т.п.о., выделяют по описанной выше методике фирмы QIAGEN, исключая стадию нагревания, и используют его для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 2.

ПРИМЕР 2.

Для получения штамма дрожжей Pichia pastoris - продуцента бета-интерферона человека клетки дрожжей штамма PS99 трансформируют плазмидой pHIF.

Клетки дрожжей выращивают в 100 мл среды YEPD при 30^o до достижения культурой оптической плотности, соответствующей 2-4 ед. поглощения при длине волны 600 нм. Клетки дважды промывают стерильной водой, после чего суспендируют в 0,3 мл 100 мМ раствора ацетата лития и инкубируют при 30^o в течение 30 минут. К 50 мкл полученной суспензии клеток добавляют 0,1-1 мкг плазмидной ДНК, 50 мкг ДНК спермы лосося, предварительно денатурированной нагреванием (10 минут при 100^o), и 0,3 мл раствора 100 мМ ацетата лития, содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000. Далее пробу инкубируют 30 минут при 30^o и 20 минут при 42^o, помещают на 15 секунд в ледяную баню и центрифугируют 10 секунд при 10000 об/мин. Клетки суспендируют в 1 мл стерильной воды и высевают на твердую среду SC. Клоны трансформантов вырастают через 2-3 суток. Выросшие клоны пересевают на чашки со средой SC, содержащей 2% глюкозу, отдельными колониями, затем перепечатывают на среду ММ (1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США), 0,5% метанола, 2% агара ("Difco", США) для отбора трансформантов, не растущих на среде с метанолом, что свидетельствует об интеграции чужеродного гена в локус AOXI (фенотип Met-).

Для анализа продукции бета-интерферона клетками трансформантов фенотипа Met- их выращивают при 30^o в 100 мл жидкой среды BMGY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 1% глицерина, 10 мл 1М калий-фосфатного буфера, рН 6,0, 1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США) до стационарной фазы роста в течение 2 суток. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают и переносят всю биомассу в 20 мл жидкой среды BMMY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5% метанола, 10 мл 1М калий-фосфатного буфера, рН 6,0, 1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США) для индукции экспрессии бета-интерферона. Индукцию проводят при 30^o в течение 4 суток. По окончании индукции культуральную среду отделяют от клеточной биомассы центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. В культуральной среде определяют содержание бета-интерферона при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и последующей гибридизации со специфическими антителами к бета-интерферону человека. Разделение белков проводят в 15% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ трис-хлоридный буфер, рН 8,8). Параллельно проводят разделение белков контрольного штамма, выращенного в идентичных условиях. В качестве стандартов молекулярной массы используют карбоангидразу, ингибитор трипсина, миоглобин, лизоцим. По окончании электрофореза белки ренатурируют, выдерживая гели 15 минут в 10 мМ трис-хлоридном буфере (рН 7,5), содержащем 4 М мочевину, 20 мМ ЭДТА, и переносят на нитроцеллюлозную мембрану в 25 мМ трис-192 мМ глициновом буфере (рН 8,3), содержащем 20% метилового спирта, при 30-40В, в течение 1,5 часов. Далее мембрану выдерживают в буфере TBST (10 мМ трис-хлоридный буфер (рН 8,0), 150 мМ хлористого натрия, 0,05% твин-20, 1% бычьего сывороточного альбумина) в течение 2 часов при 37^o. Затем помещают мембрану в тот же буфер, содержащий разведенные в 1000 раз лошадиные поликлональные антитела к бета-интерферону человека ("Boehringer"), и инкубируют 2 часа при 37^o. Далее трижды промывают мембрану буфером TBST и инкубируют 1 час при 37^o с разбавленным в 7000 раз конъюгатом видоспецифических антител к иммуноглобулинам лошади и пероксидазы хрена ("Sigma"). После отмывки мембраны буфером PBST (58 мМ двузамещенного фосфата натрия, 17 мМ однозамещенного фосфата натрия, 68 мМ хлористого натрия, 0,1% твин-20) добавляют раствор субстратов для пероксидазы: 0,02% DAB (3, '3-диаминобензидин тетрагидрохлорид), 0,006% перекись водорода в 10 мМ трис-хлоридном буфере, рН 7,5. Параллельно окрашивают гели 0,15% раствором кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывают в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков двух штаммов у штамма PS99(pHIF) обнаруживают появление двух дополнительных белковых полос, дающих положительную реакцию с антителами к бета-интерферону человека: основной - с молекулярной массой 23КДа, что соответствует молекулярной массе гликозилированного бета-интерферона, и минорной - 21КДа. Оба белка являются гликопротеинами, о чем свидетельствует прокрашивание реактивом Шиффа. Появление минорной фракции бета-интерферона с молекулярной массой 21КДа можно объяснить различной степенью гликозилирования белковой молекулы. Уровень синтеза бета-интерферона определяют, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой стандартного бета-интерферона.

Согласно полученным данным клетки дрожжей штамма PS99(pHIF) синтезируют и секретируют около 40 мг бета-интерферона на литр культуры дрожжей.

При проведении анализа на подавление цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в культуре человеческих фибробластов обнаруживается, что препарат бета-интерферона, синтезированного штаммом дрожжей PS99(pHIF), биологически активен. Активность препарата составляет 3 млн. ед./мг белка.

Суммируя вышесказанное можно заключить, что полученный штамм дрожжей Pichia pastoris PS99(pHIF) синтезирует и секретирует бета-интерферон человека в количестве, достаточном для его очистки в лабораторном масштабе. В результате такой очистки могут быть получены препараты бета-интерферона, пригодные для исследования его биологических свойств и терапевтической ценности. Преимуществом данного продуцента по сравнению с прототипами ВКМП-У876 и ВКМП-У2286 является более высокий уровень продукции бета-интерферона и большая стабильность рекомбинантного белка. Он обеспечивает секрецию бета-интерферона, что значительно упрощает процедуру очистки рекомбинантного белка. Кроме того, рекомбинантный бета-интерферон, синтезируемый и секретируемый штаммом PS99(pHIF), является гликопротеином, как и бета-интерферон человека, и в то же время не содержит дополнительных маннозных остатков, характерных для белков, секретируемых дрожжами-сахаромицетами.

Штамм дрожжей Pichia pastoris PS99(pHIF) - секреторный продуцент бета-интерферона интерферона человека депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-Y2470.

Формула изобретения

1. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS99 (pHIF), депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-Y2470, - продуцент бета-интерферона человека.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHIF, обеспечивающая биосинтез и секрецию бета-интерферона человека, имеющая размер 8,52 т. п. о. (молекулярная масса 5,6 МДа) и состоящая из следующих элементов: - фрагмент ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора рРIC9 размером 8,00 т. п. о. , ограниченный сайтами рестрикции EcoR1-Xhol, включающий бактериальный ген Amp^r, бактериальную область ori, ген HIS4 дрожжей, фрагмент размером 0,95 т. п. о. , содержащий промотор дрожжевого гена АОХ1; фрагмент размером 0,27 т. п. о. , содержащий препрообласть гена MFα дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обеспечивающий секрецию бета-интерферона в культуральную среду; фрагмент размером 0,33 т. п. о. , содержащий область терминации транскрипции гена АОХ1, фрагмент 3'-нетранслируемой области гена АОХ1, размером 0,76 т. п. о. ; - Xhol-EcoR1 - фрагмент размером 0,52 т. п. о. , содержащий кодирующую часть гена бета-интерферона человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид; - уникальные сайты распознавания следующих рестриктаз: BamH1 - 0,94 т. п. о. ; Xhol - 1,19 т. п. о. ; EcoR1 - 1,71 т. п. о. ; Xbal - 2,55 т. п. о. ; Sall - 3,70 т. п. о. ; Sphl - 5,31 т. п. о.

3. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рHIF, обеспечивающей синтез бета-интерферона в клетках дрожжей Pichia pastoris и его секрецию в культуральную жидкость, заключающийся в том, что ген бета-интерферона человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид; получают при помощи ПЦР с использованием матрицы плазмиды рHBI, прямого праймера 5'ccgctcgagaaaagaatgagctacaacttg, содержащего сайт для рестриктазы Xhol, и обратного праймера 5'-ggaattcctcagtttcggaggtaac, содержащего сайт для рестриктазы EcoRl, полученный ген бета-интерферона обрабатывают рестриктазами Xhol и EcoR1 и лигируют с плазмидой pPIC9, предварительно обработанной этими же рестриктазами, затем лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli, и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК pHIF.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

NF4A Восстановление действия патента

Дата, с которой действие патента восстановлено: 10.03.2012

Дата публикации: 10.03.2012

---