Способ получения сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины

 

Изобретение относится к медицинским иммунобиологическим препаратам, в частности к сибиреязвенным вакцинам, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для профилактики сибирской язвы. Сущность изобретения заключается в использовании для приготовления сухой формы комбинированной сибиреязвенной вакцины протективного антигена, получаемого из микробной культуры Bacillus anthracis штамма-продуцента 55/5, выборе эффективной среды высушивания и лиофилизации препарата. Изобретение позволяет увеличить срок хранения вакцины (до 4 лет) и расширить температурный режим хранения (до плюс 25^oС в течение месяца) при доставке вакцины потребителю. 4 табл.

Изобретение относится к медицинским иммунобиологическим препаратам, в частности к сибиреязвенным вакцинам, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для специфической профилактики сибирской язвы.

Известна живая сухая сибиреязвенная вакцина, выпускаемая НИИМ МО РФ (г. Киров). Общим признаком ее приготовления с заявляемым способом является использование в качестве иммуногена спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1 и криопротектора - сахарозы в конечной концентрации 8...10%. Недостатком живой вакцины является длительный период формирования напряженного иммунитета (до 3 недель) и относительно короткий период высокой специфической резистентности (Бургасов П.Н., Черкаский Б.Л. // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1976, 9, с. 27-35).

Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления жидкой комбинированной сибиреязвенной вакцины (патент РФ 2115433), содержащей сорбированный на носителе протективный антиген (ПА) и споры Bacillus anthracis вакцинного штамма СТИ-1. Содержание компонентов в одной прививочной человеко-дозе (0,5 см³) вакцины следующее: спор - 40...60 млн, ПА - 30...40 среднеэффективных иммунизирующих доз (ИД₅₀) для белых мышей (Дербин М.И. с соавт.//Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1977, 2, с. 63-67), гидроокиси алюминия - не более 2,5 мг. Общим существенным признаком с заявляемым способом является использование в жидкой комбинированной вакцине спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1. Недостатком вышеуказанной вакцины является относительно непродолжительный срок хранения (до 2-х лет) и необходимость в течение всего времени хранения, в том числе и при ее транспортировании, использовать температуры от 0 до плюс 4^oС. Увеличение сроков хранения жидкой комбинированной вакцины, а также изменение температурного режима при хранении или транспортировании сопровождается ослаблением защитных свойств вакцины за счет снижения иммуногенности ПА и жизнеспособности спор (споры и ПА находятся в препарате в физиологическом растворе без стабилизатора и в большей степени подвержены отрицательному воздействию факторов внешней среды, в том числе и температурным колебаниям).

Задачей изобретения является получение сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины, длительно сохраняющей иммуногенные свойства в рациональных и удобных для потребителя условиях хранения и транспортирования.

Поставленная задача решается выбором нового штамма с более высокой и устойчивой продукцией ПА, достаточной для приготовления жидкого полуфабриката, разработкой рациональных отношений компонентов вакцины и защитной среды, отработка режимов технологического процесса лиофильного высушивания, обеспечивающих стабильность иммунологических свойств комбинированной вакцины, длительность ее хранения и рациональные температурно-временные режимы транспортирования.

Сухая форма комбинированной сибиреязвенной вакцины обеспечивает длительное хранение (до 4 лет) препарата, по иммунологическим и физико-химическим показателям удовлетворяющего требованиям, предъявляемым национальным органом контроля медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) к вакцинам.

Изобретение позволяет: 1. Повысить стабильность иммунологических свойств вакцины и увеличить срок ее хранения до 4 лет; 2. Сократить расходы на пополнение запасов вакцины, упростить и удешевить условия транспортирования, снизить риск ухудшения ее качества на этапах хранения, транспортирования и применения.

Сухая комбинированная сибиреязвенная вакцина состоит из следующих компонентов: - сорбированного ПА, получаемого из Bacillus anthracis штамма 55/5. Штамм Bacillus anthracis 55/5, регистрационный номер 11 депонирован 15.10.95 г. в музейной коллекции стандартизованных микроорганизмов института микробиологии МО РФ (НИИМ МО РФ, г. Киров); - спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1; - сахарозы; - геля гидроокиси алюминия.

Одна прививочная доза вакцины (в объеме 0,5 см³) содержит (40...60) млн спор штамма СТИ-1, (30...40) ИД₅₀ ПА, не более 0,2 мг общего азота, не более 2,5 мг окиси алюминия, не более 0,0005% формальдегида и (18...22) мг сахарозы.

Возможность практического использования заявляемого изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Выбор штамма-продуцента протективного антигена.

Аттенуированный высокоиммуногенный бескапсульный штамм Bacillus anthracis 55/5 был получен из гетерогенной (до 30%) по детерминантам раg, lef, cya исходной культуры Bacillus anthracis штамма 55 ВНИИВВиМ. Способ получения включал в себя ряд последовательно выполняемых операций: - термовоздействие на споры (при температуре плюс 83^oС в течение 10 мин); - пассаж микробных клеток через организм морской свинки; - отбор на содержащей сибиреязвенный глобулин и бикарбонат-ион (индуктор синтеза токсина) плотной питательной среде Тох⁺ - клонов с наиболее выраженной зоной иммунопреципитации;
- тестирование методом полимеразной цепной реакции ДНК клеток на полноразмерность и целостность детерминант протективного антигена, летального и отечного факторов (раg, lef, cya) и отбор генетически полноценного Тох⁺ - клона 5;
- приготовление стабилизированной споровой однородной культуры В. anthracis штамма 55/5 НИИМ МО РФ, обладающего высокой и стабильно воспроизводимой продукцией защитного антигена.

Характеристика ПА, получаемого с использованием штаммов Bacillus anthracis СТИ-1 и 55/5 НИИМ МО РФ, приведена в таблице 1. Антигенную активность ПА определяли в реакции диффузионной преципитации с сибиреязвенным иммуноглобулином, а иммуногенность на белых мышах путем расчета ИД₅₀.

Из приведенных в таблице 1 данных видно, что, в сравнении со штаммом Bacillus anthracis СТИ-1, использование штамма Bacillus anthracis 55/5 НИИМ МО РФ позволяет стабильно получать как нативный, так и концентрированный ПА с более высокими иммунологическими показателями, что обеспечивает возможность его использования для приготовления жидкого полуфабриката комбинированной вакцины и последующего лиофильного высушивания.

Пример 2. Выбор оптимальной среды высушивания.

В качестве протектора при приготовлении сухих форм иммунобиологических препаратов используется сахароза, отличающаяся хорошим защитным эффектом. Так как в состав комбинированной вакцины входит чувствительный к колебаниям температуры ПА, необходимо было определить, какое влияние оказывает сахароза при его высушивании. Концентрат ПА, лиофильно высушенный с добавлением сахарозы в различной концентрации, оценивали по показателю антигенной активности в реакции диффузионной преципитации с иммуноглобулином и содержанию ИД₅₀. Результаты приведены в таблице 2. Анализ представленных в таблице 2 результатов показывает, что при лиофильном высушивании ПА с добавлением сахарозы в конечной концентрации 8...10% по объему антигенная и иммуногенная активность препарата практически сохраняется на исходном (до высушивания) уровне.

Пример 3. Способ приготовления сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины.

Споровую суспензию Bacillus anthracis штамма СТИ-1 разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 0,8...1,2 млрд спор•см^-3. Полученную суспензию смешивают со стерильным 40%-ным раствором сахарозы в объемных соотношениях 1:1 и тщательно перемешивают в течение 15...20 мин. Концентрат сорбированного ПА разводят стерильным физиологическим раствором до содержания 400 ИД₅₀•см^-3. Равные объемы приготовленных компонентов объединяют и тщательно перемешивают. В приготовленном жидком полуфабрикате комбинированной вакцины должно содержаться 200. . . 300 млн спор•см^-3 и 180...220 ИД₅₀•см^-3 ПА. Приготовленный полуфабрикат вакцины разливают по 2 см³ (10 прививочных доз) в ампулы вместимостью 6 см³ или флаконы объемом 10 см³. В процессе розлива содержимое емкости с приготовленным полуфабрикатом перемешивают каждые 20...25 мин с целью получения однородного состава препарата.

Лиофильное высушивание вакцины осуществляют в камерных сушильных установках, обеспечивающих нижеуказанный режим:
- температура замораживания суспензии - минус 35...40^oС;
- время выдерживания - 3...4 ч;
- разряжение в сублиматоре - 20...25 Па;
- досушивание материала при температуре плюс 30...32^oС в течение 10...12 ч.

Пример 4. Влияние температуры хранения на иммуногенные свойства сибиреязвенного ПА.

Влияние температуры хранения на иммуногенные свойства ПА Bacillus anthracis штамма 55/5, сорбированного на геле гидроокиси алюминия, изучали в опытах на лабораторных животных. В опыте использовали лиофильно высушенный в 10% сахарозе сорбированный ПА. Контролем служил исходный жидкий сорбированный препарат. Из представленных в таблице 3 данных следует, что процесс лиофильного высушивания с криопротектором (сахароза) не сопровождается снижением иммуногенных свойств препарата. После хранения при температуре плюс 25^oС в течение месяца у исходного жидкого сорбированного ПА происходит снижение в 3 раза величины ИД₅₀. Вместе с тем, при тех же условиях хранения лиофильно высушенного сорбированного ПА не происходит изменения защитной эффективности препарата (величина ЛД₅₀ практически не изменяется).

Таким образом, показано, что лиофильное высушивание с сахарозой сорбированного ПА Bacillus anthracis штамма 55/5 позволяет сохранить его иммуногенные свойства при температуре плюс 25^oС в течение месяца по сравнению с исходным жидким препаратом.

Пример 5. Влияние продолжительности хранения и температуры на иммуногенные свойства и реактогенность жидкой и сухой комбинированных сибиреязвенных вакцин.

В экспериментах использовали жидкую комбинированную вакцину на основе спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1 и ПА этого же штамма и сухую комбинированную вакцину из спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1 и ПА Bacillus anthracis штамма 55/5, которые характеризовали по индексу иммунитета (ИИ) на момент приготовления, после хранения в течение 2-х и 4-х лет при температуре плюс 2...6^oС, а также после переменных режимов хранения: 4-х лет хранения в условиях субнулевых температур с последующим переводом на режим транспортирования при температуре плюс 25^oС в течение 25 суток. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 4. Из данных таблицы 4, видно, что исследуемые жидкая и сухая комбинированные вакцины обладали практически одинаковым защитным эффектом после приготовления. Результаты оценки иммуногенности этих препаратов после хранения в течение 2-х лет при температуре плюс 2...6^oС свидетельствуют о том, что величина ИИ для морских свинок у обоих препаратов практически не изменилась, что подтверждает сохранение препаратами защитных свойств при хранении в указанных условиях. Оценка вакцин после хранения в течение 4-х лет в условиях субнулевых температур показала, что величина ИИ у сухой комбинированной вакцины практически сохранилась на исходном уровне и более чем в 2 раза превысила значение данного показателя у жидкой комбинированной вакцины. Изучение иммуногенных свойств препаратов после 4-х лет хранения с переводом режима хранения на режим транспортирования при температуре плюс 25^oС в течение 25 суток показало, что при этом режиме жидкая комбинированная вакцина в 2,5 раза снижает свои защитные свойства. Снижение величины ИИ у жидкой комбинированной вакцины объясняется уменьшением иммуногенности входящего в состав вакцины ПА. Наблюдаемый при этом защитный эффект препарата обеспечивается за счет спорового компонента вакцины. Изучение иммуногенных свойств сухой комбинированной вакцины после 4-х лет хранения при температуре плюс 2...6^oС с переводом режима на плюс 25^oС в течение 25 суток показало, что сухая комбинированная вакцина сохраняет высокие иммуногенные свойства практически без изменений, в то время как у жидкой комбинированной вакцины наблюдается дальнейшее снижение защитных свойств.

Реактогенность сухой комбинированной вакцины после 4-х лет хранения с переводом на режим транспортирования изучали в экспериментах на кроликах в сравнении с жидкой комбинированной вакциной. Для обеих вакцин на 2...6 сутки после вакцинации наблюдалось кратковременное и незначительное до 7% снижение массы животных, восстановление которой происходило уже на 10 сутки. Повышение в ряде случаев температуры тела у животных не превышало 1^oС от принятых физиологических значений. Наблюдаемые у вакцинированных животных отклонения массы и температуры тела укладывались в требования нормативных документов.

Таким образом, в результате исследований установлено, что сухая форма комбинированной вакцины из спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1 и ПА Bacillus anthracis штамма 55/5 при заданных сроках ее хранения и транспортирования обеспечивает сохранение умеренной реактогенности в тех же значениях показателей как и у применяемой жидкой комбинированной в нормативные сроки ее хранения.

Для производства и выпуска вакцины в Научно-исследовательском институте микробиологии Министерства обороны Российской Федерации создана технологическая линия. Инструкция по применению сухой комбинированной вакцины утверждена зам. министра здравоохранения РФ 18.07.1996 г.

Формула изобретения

Способ получения сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины, включающий приготовление композиции из сорбированного на носителе протективного антигена и спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1, отличающийся тем, что протективный антиген получают из Bacillus anthracis штамма 55/5 НИИМ МО РФ, дополнительно вводят в указанную композицию сахарозу в конечной концентрации 8-10% по объему и лиофильно высушивают в установке камерного типа при температуре замораживания минус 35-40^oС, времени выдерживания 3-4 ч, разрежении в сублиматоре не выше 20-25 Па и досушивают материал при температуре плюс 30-32^oС в течение 10-12 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4