Способ получения циклоспорина a высокой чистоты из сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс

 

Изобретение относится к способу получения циклоспорина А высокой чистоты путем очистки сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, путем многоступенчатой хроматографии на силикагеле при высокой загрузке колонны от 10 до 52%, с использованием в качестве элюента смеси толуола с ацетоном в количестве от 10 до 30 об.% или толуола с этилацетатом в количестве от 10 до 35 об.%, циклоспорина А высокой чистоты с содержанием в нем циклоспорина L, U и D менее 0,05% и содержанием в нем циклоспорина В и С < 0,02 об.%, промышленного способа очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс. 3 с. и 7 з.п.ф-лы, 1 табл.

Объектом этого изобретения является способ хроматографической очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, с использованием колонки, заполненной силикагелем, и посредством применения многоступенчатой хроматографии с колонкой, заполненной нормальной фазой силикагеля, и растворяющей смеси, содержащей в качестве основного компонента толуол.

Циклоспорины представляют собой N-метилированные в нескольких местах ундекапептиды и большинство из них обладает фармакологическим действием. До сих пор были известны 25 членов этой группы соединений, которые обозначены буквами от А до Z. Сначала из них выделили циклоспорин А, который представляет собой природный материал, выделенный из культуральной жидкой среды (бульона) штамма Тоlypocladium inflatum Gams (Helv. Chim. Acta 59, 1075/1976/). Сперва это соединение стало известным как легкий противогрибковый антибиотик, а позже внимание было привлечено к его иммунодепрессивному действию. (J.F. Borel et al. Immunology 32, 1017/1977/). По этой причине его в основном применяли при трансплантации органов от других субъектов (легкого, сердца, почки, костного мозга, кожи). Фармакологические исследования подтвердили, что он ингибирует как тканевые, так и клеточные иммунные реакции путем воспрепятствования разрастанию Т-клеток и прерывания синтеза интерлейкина-2. Позже стало ясно, что он является эффективным при различных типах аутоиммунных и воспалительных заболеваний, например при аутоиммунных гематологических болезнях, неспецифическом язвенном колите, болезни Грейвса, рассеянном склерозе, псориазе, а также ревматическом артрите. Для лечения инфекционных заболеваний, вызванных простейшими, а также опухолей были проведены дополнительные эксперименты. Важность этой группы показывается тем фактом, что посредством модификации различных аминокислот и заместителей может быть получен ряд синтетических родственных соединений (например, патенты ЕР 56782, СН 630062 и ЕР 29122).

Большую чть циклоспоринов получают путем ферментации. В качестве примеров культур микроорганизмов использовали Cylindrocarpon Lucidum Booth (описание патента N CH 589716); Trichoderma polysporum Rifai (описание патента N CH 603790); Tolypocladium varium (описание патента N HU 201557). В конце ферментации в зависимости от характера процесса образуется циклоспориновый комплекс, который может также содержать другие примеси (ингредиенты культуральной среды, противовспенивающее вещество, метаболиты и т.д.).

Обычно продукт отделяют от бульона посредством процесса экстракции. Его можно осуществлять путем выделения из бульона мицелия посредством центрифугирования или фильтрации, затем растворения активного ингредиента из мицелия метанолом или ацетоном и экстракции фильтрата водонесмешивающимися растворителями. Другим известным способом выполнения является способ без фильтрации, в котором применяют экстракцию всего бульона водонесмешивающимся органическим растворителем. Растворитель, содержащийся в органической фазе, выпаривают посредством вакуумной перегонки. Однако во время экстракции органическим растворителем соединения, имеющие липидные свойства, также переносятся в органическую фазу, что вызывает трудности при дальнейшей очистке. Для отделения этих соединений известны следующие способы (например, описание патента Швейцарии N 589716 или опубликованная заявка на патент Германии N 2455859), где после удаления экстрагирующего растворителя остаток растворяют в смеси метанола-воды и затем несколько раз экстрагируют таким же объемом петролейного эфира. Порции петролейного эфира соединяют и из них посредством смеси метанола-воды извлекают циклоспорины. Активное вещество посредством многоступенчатой экстракции переносят из фазы смеси метанола-воды в этиленхлорид, которое затем промывают водой и выпаривают до сухого остатка. Полученный вышеуказанным способом сырой продукт, содержащий циклоспорины, можно очистить более эффективно одним из хроматографических методов.

В соответствии со способом, описанным в патенте США N 4117118, циклоспориновую смесь сначала переносят в колонку Sephadex LH-20 (Сефадекса) и элюируют метанолом, затем ее последовательно элюируют в колонке с оксидом алюминия смесью толуола и этилацетата (15%) и в колонке с силикагелем смесью хлороформа и этанола (2%). Несмотря на повторную хроматографию, полученный продукт не является чистым, а представляет собой смесь циклоспорина А и В.

Подобный хроматографический способ раскрыт среди прочих в патенте США N 4215199, в котором грубую очистку осуществляют в колонке с силикагелем смесью хлороформа и метанола при объемном соотношении компонентов в смеси 98:2. Затем элюат выпаривают до сухого остатка. Остаток растворяют в метаноле и подвергают хроматографии в колонке Сефадекса LH-20 с применением в качестве элюента метанола. Фракции элюата выпаривают до сухого остатка, затем остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола при объемном соотношении компонентов в смеси 98:2. Затем его опять подвергают силикагельной хроматографии. В элюате первым появляется циклоспорин А. Эту и последующие фракции отделяют и посредством выпаривания элюента получают чистые компоненты.

В соответствии с патентом Германии N DD 298276 маслянистый сырой продукт растворяют в небольшом количестве хлороформа, затем подвергают хроматографии в колонке с оксидом алюминия с применением хлороформа. Содержащие циклоспорин А фракции выпаривают в вакууме, растворяют в хлороформе, подвергают подобной колоночной хроматографии и затем элюируют хлороформом. Фракции, содержащие активное вещество, опять выпаривают в вакууме. К остатку добавляют гексан и кристаллизуют циклоспорин А. Продукт промывают гексаном, затем сушат и наконец повторно кристаллизуют из смеси простого эфира и гексана или ацетона.

В соответствии с патентом Венгрии N 201577 сырой продукт, полученный после выпаривания, может быть очищен в колонке с силикагелем путем элюирования смесью хлороформа и метанола при постепенно возрастающей концентрации метанола. Процесс начинают с применения чистого хлороформа и продолжают при увеличении концентрации метанола в элюате на последующих ступенях на 0,5 об. %. Циклоспорин А элюируют из колонки хлороформом, содержащим метанол в количестве 2 об.%, циклоспорин В-хлороформом, содержащим метанол в количестве 2,5 об.%, циклоспорин С-хлороформом, содержащим метанол в количестве 3 об.%. Компоненты получают путем выпаривания фракций.

Упомянутые выше способы описывают в основном методы ферментации циклоспорина, в которых основной целью ступеней очистки является идентификация полученного продукта. Поэтому продукт выделяют лишь в небольшом количестве, причем приводятся только физические и химические свойства без публикации данных, относящихся к чистоте продукта и к количествам примесей.

Rueger и Со. /Helv. Chim. Acta 59(4), р-1075-92 (1976)/ для идентификации и структурного анализа выделили небольшие количества чистого циклоспорина А и С посредством повторных хроматографий и других стадий очистки. В соответствии с этой статьей сырой продукт, полученный в результате ферментации Trichoderma polysporum Rifai, содержащий в основном циклоспорины А и С, обезжиривают метанолом и петролейным эфиром. После выпаривания остаток растворяют в хлороформе и подвергают хроматографии посредством градиентного элюирования с применением в качестве элюента смеси хлороформа и метанола при объемном соотношении компонентов в смеси 98,5:1,5. Посредством дальнейшей хроматографии получают чистый кристаллический циклоспорин А. Фракцию, содержащую циклоспорин А, растворяют в метаноле и подвергают хроматографии в колонке Сефадекса LP-20 с использованием в качестве элюента метанола. Фракции выпаривают, растворяют в толуоле и подвергают хроматографии в колонке, заполненной оксидом алюминия, с применением в качестве элюента толуола в присутствии увеличивающейся концентрации уксусной кислоты. После выпаривания фракций и обработки активированным углем в спиртовом растворе получают кристаллический продукт.

Способ очистки, осуществляемый в промышленном масштабе, описан в патенте США 5382655. В соответствии со способом сырой продукт, содержащий различные циклоспориновые компоненты, подвергают термообработке до хроматографии в колонке с силикагелем с применением в качестве элюента смесей хлороформа-этанола-дихлорметана и хлороформа-этилацетатаэтанола. Затем полученный продукт подвергают дальнейшей хроматографии и перекристаллизации, в результате получают высококачественный чистый продукт, подходящий для инъекции.

Очистка сырого продукта, содержащего смесь циклоспоринов, является очень трудной, так как примеси, имеющие подобные химические структуры, имеют хроматографические характеристики, очень похожие на хроматографические характеристики циклоспорина А, являющегося основным продуктом. Способы, которые описаны ранее, доказывают, что независимо от применяемой растворяющей смеси и из-за перекрытия хроматографических пиков для получения определенных компонентов в чистой форме следует осуществлять дополнительные стадии хроматографии или очистки. Способы очистки, известные до сих пор, обычно характеризуются не только тем фактом, что при их применении предъявляются большие требования к растворителю, а также тем, что необходимо применение 3-4 различных типов растворителей или растворяющих смесей и 2-3 типов набивки колонки. Как следствие этих фактов в способе необходимы несколько типов хроматографических методов и способов регенерации, которые создают трудности при разработке конструктивно простой и одинаково управляемой экономичной технологии для осуществления в промышленном масштабе.

При применении хлорированных углеводородов с точки зрения охраны окружающей среды возникают дополнительные проблемы, поэтому все большее количество стран предпринимает попытки для ограничения их использования.

Что касается материалов набивки колонки, то применение алюминиоксидной набивки для промышленных целей вызывает большие сомнения, потому что вследствие ее небольшой удельной поверхности ее несущая способность и способность к разделению являются очень малыми. Кроме того, она является невыгодной для промышленных целей, потому что алюминийоксидная набивка является жесткой и хрупкой, вследствие чего возникает необходимость в специальном оборудовании и технологии. Такие набивки не могут быть использованы в часто опорожняемых колонках из нержавеющей стали, обычно применяемых в химической промышленности.

Набивки типа Сефадекса являются очень дорогостоящими и в случае циклоспоринового комплекса их эффективность очень ограничена, так как размеры различных молекул являются очень близкими.

Целью настоящего изобретения является создание легко применимого в промышленном масштабе хроматографического способа очистки, который является подходящим для производства ингредиента циклоспорина А, содержащего гораздо меньше примесей, вследствие чего его можно использовать безопасным путем в медицинской практике.

Нашей целью является создание такой технологии хроматографической очистки, для которой необходим только один тип растворяющей смеси и один тип набивки колонки.

Вследствие его выгодных свойств - высокой удельной поверхности, большого размера пор, высокой поглощающей способности, легкого манипулирования и относительно низкой стоимости - в качестве набивки колонки применяли силикагель. Для этой набивки, которая является подходящей для отделения циклоспориновых компонентов с высокой селективностью, следует выбрать идеальную растворяющую смесь и способ.

В результате наших экспериментов мы поняли, что наша цель может быть реализована посредством многоступенчатой хроматографии в колонке с силикагелем с применением в качестве элюента растворяющей смеси, основным компонентом которой является толуол. Неожиданно было обнаружено, что посредством трехступенчатой хроматографии в колонке с силикагелем с применением в качестве элюента толуола, содержащего ацетон, могут быть отделены даже компоненты циклоспорин U и L, которые являются самыми близкими к циклоспорину А. Эти компоненты отличаются от циклоспорина А только метильной группой.

В соответствии с первым примером заявки No. WO 94/16091 растворяющую смесь толуола и ацетона также применяют на одной стадии. Полученный продукт перекристаллизовывают из растворяющей смеси простого эфира и гексана (Выход: 66,6%). Оптическое вращение продукта является достаточным, но его температура плавления значительно ниже той, которая описана в литературе, что указывает на то, что продукт является нечистым. Таким образом, даже перекристаллизация из растворителя будет давать продукт с невысокой степенью чистоты и низким выходом.

Способ в соответствии с настоящим изобретением является подходящим для разделения наиболее часто встречающихся примесей, например циклоспоринов В и С, которые присутствуют в больших количествах и, кроме того, циклоспориновых компонентов D, U и L, которые присутствуют в следовых количествах. Содержание циклоспоринов В и С в конечном продукте циклоспорине А, полученном этим способом, составляет менее 0,02 об.%, тогда как содержание циклоспоринов L, U и D составляет ниже 0,05 об.%.

Объектом нашего изобретения является усовершенствованный способ очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, который обеспечивает также получение высокочистого циклоспорина А в большом масштабе хроматографическим методом в силикагельной колонке с применением многоступенчатой хроматографии, которую осуществляют с помощью растворяющей смеси, содержащей в качестве основного компонента толуол. Другой новой особенностью способа является применение нами высокой колоночной нагрузки. В общепринятой хроматографической практике степень колоночной нагрузки составляет не более 5-10% от загрузки колонки, и это значение для циклоспоринов является более низким.

Многоступенчатая хроматография, растворяющая смесь, содержащая в качестве основного компонента толуол, и высокая колоночная нагрузка взаимосвязаны, и желательный результат может быть также достигнут посредством их совместного применения. Поэтому для получения очень чистого продукта следует одновременно применять все три вышеуказанных свойства.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно последовательно применяют 2-4 хроматографические ступени и более целесообразно три ступени.

Перенагрузка колонки является самой высокой на первой ступени хроматографии. Точное разделение активного вещества и примесей обеспечивает также высокую колоночную нагрузку на двух последующих стадиях хроматографии.

Для очистки выгодно использовать растворяющую смесь толуола-ацетона, которая содержит не более 30 об.% ацетона.

В соответствии с другим подходящим способом применяют растворяющую смесь толуола-этилацетата, в которой концентрация этилацетата ниже 35 об.%.

В способе очистки благоприятно, по меньшей мере, один раз применять градиентное элюирование.

В соответствии с нашими экспериментами было найдено, что для очистки циклоспоринового комплекса в нашем случае выгодно использовать 10-30 об.% и более подходящие 13-18 об.% ацетона и 10-35 об.% или 15-20 об.% этилацетата.

В соответствии с возможным способом настоящего изобретения в случае трехступенчатой хроматографии элюирование осуществляют толуолом, содержащим 15 об. % ацетона или 18 об.% этилацетата. На первой ступени отделяют основную часть циклоспорина С, на второй ступени удаляют большую часть циклоспориновых компонентов В, L и U, и на последней третьей ступени некоторые количества компонентов L и U и других неидентифицируемых примесей могут быть уменьшены до содержания менее 0,05 об.%. На первой ступени потери циклоспорина А являются минимальными, однако в предварительно полученных фракциях второй и третьей ступеней вместе с циклоспориновым компонентом D, который очень близок к циклоспорину А, удаляется значительное количество циклоспорина А. Этот циклоспорин А можно извлечь на четвертой ступени в очень чистой форме.

Для сравнения ниже в таблице представлены профили примесей стандартного циклоспорина А фармацевтической чистоты согласно Фармакопеи США (USP), активный ингредиент циклоспорин А из инъекции SANDIMMUN®, а также данные продукта циклоспорина А, полученного настоящим изобретением.

Стандартная инъекция SANDIMMUN® согласно фармакопеи США продукт в соответствии с примером 1 (см. таблицу в конце описания).

Из данных можно видеть, что качество циклоспорина А, полученного настоящим изобретением, значительно превосходит свойства инъекции SANDIMMUN®, более того, циклоспорин А, полученный настоящим изобретением, даже перевыполняет требования фармакопеи США.

Способ в соответствии с настоящим изобретением применим для очистки сырого продукта как в небольшом, так и в большом масштабе.

Кроме того факта, что способ в соответствии с изобретением обеспечивает получение чистого циклоспорина А, он имеет также некоторые весьма значительные технологические преимущества. Поскольку применяют только один вид технологического метода (хроматографию), способ очистки является легко управляемым, кроме того он воспроизводим и может быть превращен в непрерывный процесс. Более того, имеется еще одно определенное преимущество, состоящее в том, что на трех ступенях хроматографии применяют только один тип растворяющей смеси, в связи с чем регенерация как колонок, так и растворителей упрощается.

Дополнительная выгода способа заключается в том, что во время первой ступени хроматографии значительно связывающиеся примеси остаются в колонке, что значительно облегчает регенерацию загрузок колонки на двух последующих стадиях.

Изобретение объясняется далее примерами, приведенными не с целью ограничения защиты, а с целью иллюстрации.

В сравнительном примере (примере 4) показано, что при применении в трехступенчатой хроматографии растворяющей смеси дихлорметана-ацетона, используемой до сих пор в известных способах, невозможно получить конечный продукт подобной чистоты.

Пример 1 Очистка сырого цикдоспоринового продукта трехступенчатой хроматографией с применением растворяющей смеси толуола-ацетона.

Качество исходного циклоспоринового продукта,об.%: Содержание циклоспорина А - 60,9 Содержание циклоспорина В - 11,2 Содержание циклоспорина С - 8,3 Содержание циклоспорина L - 1,79 Содержание циклоспорина U - 1,58 Содержание циклоспорина D - 1,25 1^-я Ступень
Хроматографию осуществили с помощью соединенных последовательно двух хроматографических колонок, каждая колонка вместе с кожухом имела объем 8 л, диаметр 10 см, длину 100 см. Каждая из двух колонок содержала 3,95 кг силикагеля Kieselgel типа Мерка с размером зерна 0,04-0,063 мм. На первой ступени хроматографии обе колонки содержали свежий силикагель. На следующей ступени хроматографии первую колонку отделили, и вторую колонку соединили с колонкой, содержащей свежий силикагель. В дальнейшем на каждой ступени хроматографии применяли только одну новую колонку.

Получение сырого продукта
4,1 кг сырого продукта чистотой 60,9 об.% загрузили в пару последовательно соединенных колонок, предварительно растворив его в 15 л толуола. Получили 19 л раствора, который подали на вершину первой колонки через фильтр со скоростью подачи 2,4 л/ч. После загрузки материал элюировали растворяющей смесью ацетона-толуола при их объемном соотношении в смеси 13:87 до тех пор, пока объем вытекающего потока на дне второй колонки составил 39 л. Содержание циклоспорина в вытекающем потоке анализировали TLC (тонкослойной хроматографией). В виде отхода собрали фракции, не содержащие циклоспорин. В качестве основной фракции приняли 28 л вытекающего потока после появления циклоспорина. Содержание сухого вещества в полученном этим способом промежуточном соединении I составило 3,23 кг.

Состав,об.%:
Циклоспорин А - 75
Циклоспорин В - 10,1
Циклоспорин С - 1,6
Циклоспорин L - 1,7
Циклоспорин U - 1,5
Циклоспорин D - 1,3
Выход в пересчете на циклоспорин А составил 97%.

2^-я Ступень
Разделение осуществили в снабженной кожухом 8 л колонке, имеющей длину 1 м. Колонка содержала силикагель Kieselgel 60 типа Мерка (0,015-0,040 мм). Масса набивочного материала составила 3,95 кг. Раствор промежуточного соединения 1 объемом около 3 л, содержащий 370 г сухого вещества, полученного на первой ступени, загрузили в колонку со скоростью подачи 2,4 л/ч, затем его промыли 1 л толуола.

После загрузки материала колонку элюировали 10 л смеси ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 15:85 и затем 20 л раствора ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 25:75. Скорость потока растворителя до получения 17 л фракции составила 2,4 л/ч, затем начиная с 18 л фракции - 5 л/ч. Фракции анализировали TLC (тонкослойной хроматографией). 1-11 л фракции представляли собой отходы, 12-19 л фракции рассматривали как критические и из них взяли пробы. Посредством HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) анализировали профиль содержащихся в них примесей и ими манипулировали как предварительными фракциями или смешивали с основными фракциями. Таким способом можно получить предварительную фракцию, содержащую 80 г сухого вещества, которую затем выпарили до образования сухого остатка. 20-25 л фракции соединили в качестве основной фракции. 26-31 л фракции рассматривали как критические фракции и после анализа их соединили с основной фракцией или манипулировали ими как последующей фракцией.

Полученную вышеуказанным образом основную фракцию выпарили до сухого остатка в пленочном испарителе, снабженном вибрирующей мешалкой. Получили 234 г промежуточного соединения П с выходом 80%, имеющего следующее качество,об.%:
Циклоспорин А 95
Циклоспорин U 1,2
Циклоспорин L 0,7
Циклоспорин В < 0,1
Циклоспорин D 0,5
Циклоспорин С 0,1
3^-я Ступень
Хроматографию осуществили в колонках с той же самой конструкцией и теми же самыми геометрическими размерами, которые были описаны для первой и второй ступеней. Из промежуточного соединения II, полученного на второй ступени, приготовили 1,7 л толуолового раствора, содержащего 220 г сухого вещества, и подали на вершину колонки со скоростью 2,4 л/ч, затем его промыли 1 л толуола.

Колонку элюировали смесью 20 л ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 15:85, и затем циклоспорин элюировали смесью 20 л ацетона и толуола при соотношении компонентов в смеси 25:75. Скорость потока элюента до получения 31 л фракции составила 2,4 л/ч, затем начиная с 32 л фракции - 5 л/ч 1-18 л фракции представляли собой отходы, 19-23 л фракции представляли собой предварительные фракции и их рассматривали как критические фракции I. Для анализа содержания сухого вещества и профиля примесей высокоэффективной жидкостной хроматографией из них взяли пробы.

После анализа ими манипулировали как предварительными фракциями или смешивали с основными фракциями. 29-38 л фракции соединили в качестве основной фракции, 39-41 л фракции собрали в 1 л порции и рассматривали как критические фракции II. После анализа их соединили с основной фракцией или манипулировали как последующими фракциями II. После анализа их смешали с основной фракцией или манипулировали как последующей фракцией. В результате сбора фракций после выпаривания до сухого остатка можно получить 70 г предварительной фракции.

Основные фракции соединили и после выпаривания до сухого остатка получили 157 г чистого циклоспорина с выходом 75%. Качество продукта было следующим,об.%:
Циклоспорин А 99,6
Циклоспорин L < 0,05
Циклоспорин U < 0,05
Циклоспорин D < 0,05
Циклоспорин В < 0,02
Циклоспорин С < 0,02
Пример 2
Очистка сырого циклоспоринового продукта четырехступенчатой хроматографией в колонке с неподвижным слоем силикагеля с применением растворяющих смесей толуола-ацетона или толуола-этилацетата.

Сырой циклоспориновый продукт очистили трехступенчатой хроматографией, описанной в примере 1. Полученные трехступенчатой хроматографией предварительные фракции очистили на четвертой ступени в неподвижном слое растворяющей смесью толуола-этилацетата.

4^-я ступень
Конструкция и геометрические размеры хроматографической колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Колонка, которая описана в примере 1, содержала силикагель типа Kieselgel 60 Мерка (0,015-0,40 мм).

Колонку обработали концентратом со скоростью подачи 2,4 л/ч, полученным из предварительной фракции в количестве 260 г материала, растворенного в 2,5 л толуола.

Содержание циклоспорина А 80,6 об.%.

Содержание циклоспорина D 4,2 об.%.

Подвергнутую обработке пробу промыли 1 л толуола, затем колонку элюировали смесью 20 л этилацетата и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 17: 83 со скоростью потока 2,4 л/ч, затем элюирование продолжили смесью 40 л этилацетата и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 28:72. 1-19 л фракции во время сбора фракций представляли собой отход. После анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией 20-25 л фракции представляли собой отход или их смешивали с основной фракцией. 26-35 л фракции собрали в качестве основной фракции. После отбора проб и анализа HPLC 36-42 л фракции или соединяли с основной фракцией или манипулировали как отходом. Собранную 23-42 л основную фракцию выпарили до сухого остатка. Таким способом получили 195 г чистого циклоспорина А, содержащего 99,6 об.% активного ингредиента с выходом 75%, имеющего следующее качество,об.%:
Циклоспорин А 99,6
Циклоспорин D < 0,05
Циклоспорин U
Циклоспорин L
Пример 3
Очистка сырого циклоспоринового продукта двухступенчатой хроматографией в колонке с неподвижным слоем силикагеля с применением растворяющей смеси толуола-ацетона
Сырой циклоспориновый продукт очистили в соответствии с тем же самым способом, который описан на первой стадии примера 1, получив при этом промежуточное циклоспориновое соединение I, имеющее такое же качество. Далее способ осуществили следующим образом:
2^-я Ступень
Колонку подвергли обработке 3 л промежуточного соединения I, содержащего 370 г высушенного материала, со скоростью подачи 2,4 л/ч, затем обработанную пробу промыли 1 л толуола.

После загрузки колонку элюировали 10 л смеси ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 15:85, затем элюирование продолжили 20 л смеси ацетона и толуола при объемном соотношении компонентов в смеси 25: 75. Скорость потока растворителя до получения 17 л составила 2,4 л/ч и начиная с 18 л - 5 л/ч.

В соответствии с тонкослойной хроматографией и высокоэффективной жидкостной хроматографией 1-11 л фракции представляли собой отходы, 12-20 л фракции представляли собой предварительные фракции, 21-24 л фракции рассматривали как основные фракции и фракциями от 25 л до конца манипулировали как последующими фракциями. Промытые ацетоном фракции представляли собой отходы.

После фракционирования собранные основные фракции соединили и выпарили до сухого остатка, получив при этом 114 г циклоспорина А с выходом 41% и с таким же высоким качеством продукта, которое описано в примере 1.

Пример 4
Сравнительный пример очистки сырого продукта трехступенчатой хроматографией с применением растворяющей смеси дихлорметана-ацетона
Качество исходного сырого циклоспоринового продукта (того же самого, который применяли в примере 1,об.%:
Содержание циклоспорина А 60,9
Содержание циклоспорина В 11,2
Содержание циклоспорина С 8,3
Содержание циклоспорина L 1,79
Содержание циклоспорина U 1,58
Содержание циклоспорина D 1,25
1^-я Ступень
Хроматографическое оборудование и набивки колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Одну пару соединенных последовательно колонок подвергли обработке 4,1 кг сырого продукта чистотой 60,9% в 15 л раствора дихлорметана.

После загрузки пробы колонку элюировали дихлорметаном со скоростью потока 2,4 л/ч до сбора 35 л вытекающего потока.

1-10 л фракции представляли собой отходы, тогда как 11-35 л фракции рассматривали как основные фракции.

Содержание сухого вещества в промежуточном соединении 1, полученном этим способом, составило 2,9 кг, содержание активного ингредиента - 75 об.%.

2^-я Ступень
Хроматографическое оборудование и набивка колонки были такими же, которые описаны в примере 1. Колонку подвергли обработке на вершине 3 л промежуточного соединения I, содержащего 350 г сухого вещества, со скоростью подачи 2,4 л/ч. Элюирование осуществили 10 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 1:9, затем элюирование продолжили 25 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 2:8 и закончили со скоростью 2,4 л/ч.

В соответствии с тонкослойной хроматографией объем предварительной фракции составил 13 л, объем основной фракции - 22 л и объем последующей фракции - 11л. 22 л основной фракции выпарили до сухого остатка и вследствие этого получили 220 г промежуточного продукта II, имеющего чистоту 91%.

3^-я Cтупень
Хроматографическое оборудование и набивка колонки были такими же, как в примере 1. При подаче в колонку дихлорметанового концентрата со скорость 2,4 л/час набивку нагрузили 220 г промежуточного соединения П. Элюирование осуществили 20 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 1:9, затем элюирование продолжили 30 л смеси ацетона и дихлорметана при объемном соотношении компонентов в смеси 2:8 и закончили ацетоном со скоростью его подачи 2,4 л/ч.

Первые 26 л фракции рассматривали как предварительные фракции, затем собрали 26 л основной фракции и наконец 11 л последующих фракций. 26 л основной фракции выпарили до сухого остатка и вследствие этого получили 140 г промежуточного продукта III, имеющего следующее качество,об.%:
Циклоспорин А 98,6
Циклоспорин U 0,6
Циклоспорин D 0,3
Циклоспорин L 0,2
Циклоспорин В 0,1
Циклоспорин С 0,1с

Формула изобретения

1. Способ получения циклоспорина А высокой чистоты путем очистки сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси растворителей, включающей толуол, отличающийся тем, что используют многоступенчатую хроматографию при высокой загрузке колонны от 10 до 52%, элюирование осуществляют смесью толуола с ацетоном в количестве от 10 до 30 об. % или толуола с этилацетатом в количестве от 10 до 35 об. %.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что последовательно осуществляют 2-4 хроматографические ступени.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что последовательно осуществляют 3 хроматографические ступени.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве растворяющей смеси используют толуол-ацетон.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что используют толуол, содержащий не более 30% ацетона.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют растворяющую смесь толуола и этилацетата.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что используют толуол, содержащий не более 35 об. % этилацетата.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что градиентное элюирование применяют в случае, по меньшей мере, одной хроматографической ступени.

9. Циклоспорин А высокой чистоты, где содержание в нем циклоспорина L, циклоспорина U и циклоспорина D составляет менее 0,05 об. % и содержание в нем циклоспорина В и С составляет менее 0,02 об. %.

10. Способ промышленного масштаба для очистки циклоспорина А от сырого продукта, содержащего циклоспориновый комплекс, хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси растворителей, включающей толуол, отличающийся тем, что используют многоступенчатую хроматографию при высокой загрузке колонны от 10 до 52%, элюирование осуществляют смесью толуола с ацетоном в количестве от 10 до 30 об. % или толуола с этилацетатом в количестве от 10 до 35 об. %.

РИСУНКИ

Рисунок 1

PD4A - Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:
ТЕВА Дьедьсердьяр Зарткёрюен Мюкодо Ресвенитарсасаг (HU)

Адрес для переписки:
129090, г. Москва, ул. Б. Спасская, 25, стр. 3, ООО «Юридическая фирма Городисский и Партнеры»

Извещение опубликовано: 27.03.2007        БИ: 09/2007