Комплексы включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида с полициклическими производными глюкопиранозы, способ их получения, фармацевтическая композиция

 

Изобретение относится к новым комплексам включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида общей формулы I, где ¹=R²=CN или вместе с соседними атомами углерода образуют аннелированный 3,6-бис(низший алкил)пиридазин-1,2-диоксидный цикл, с полициклическими производными глюкопиранозы общей формулы II, где если n= 1, то R³ - фрагмент 11-оксо-18β, 20β-олеан-12-ен-29-овой кислоты формулы III, R⁴=H, R⁵ -β-D-глюкуронопиранозил, R⁶=R⁷=H и R⁸= C(O)OH или, если n= 7, то R³=Н, R⁴ и R⁷ - простые связи, R⁵ и R⁶ = H или (CH₂CH(CH₃)O)_mH, где m=1-14, и R⁸=CH₂OH или СН₂О(CH₂CH(CH₃)O)_mH, где m=1-14, генерирующим оксид азота и активирующим растворимую форму гуанилатциклазы (рГЦ), как спазмолитическим, сосудорасширяющим и гипотензивным средствам быстрого действия и ингибиторам агрегации тромбоцитов, способу их получения и фармацевтическим композициям на их основе. Продукты настоящего изобретения получают способом, заключающимся во взаимодействии исходного производного 1,2,5-оксадиазол-2-оксида вышеприведенной общей формулы I, где R¹ и R² имеют указанные значения с соответствующим полициклическим производным глюкопиранозы вышеприведенной общей формулы II, где R³-R⁸ имеют указанные значения в водно-органической среде (например, в водном растворе диоксана, низшего алканола, в частности этанола, или смеси органических растворителей) при повышенной температуре (30-60^oС) с последующим выделением целевого продукта упариванием при пониженном давлении, его промыванием малополярным инертным органическим растворителем (диэтиловым эфиром или его смесью с гексаном) и высушиванием при пониженном давлении. Новые инклюзионные комплексы настоящего изобретения являются эффективными донорами NO, а также генерируют его редоксформу (нитроксил), образуют нитрозотиолы и активируют рГЦ, а также обладают сильным спазмолитическим, сосудорасширяющим и быстрым гипотенсивным действием. Описанные продукты проявляют выраженные антиагрегантные свойства. 3 с. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл.

Изобретение относится к новым комплексам включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида (фуроксана) общей формулы I: где R¹= R²= CN или вместе с соседними атомами углерода образуют аннелированный 3,6-бис(низший алкил)пиридазин-1,2-диоксидный цикл, с полициклическими производными глюкопиранозы общей формулы II: где, если n= l, то R³- фрагмент 11-оксо-18β, 20β-олеан-12-ен-29-овой кислоты формулы III: R⁴= H, R⁵-β-D-глюкуронопиранозил, R⁶=R⁷=H и R⁸=C(O)OH, или, если n-7, то R³=H, R⁴ и R⁷- простые связи, R⁵ и R⁶= H или (СН₂-СН(СН₃)O)_mН, где m=1-14. и R⁸= CH₂OH или СН₂О(СН₂-СН(СН₃)O)_mН, где m=1-14, генерирующим оксид азота и активирующим растворимую форму гуанилатциклазы (рГЦ), как спазмолитическим, сосудорасширяющим и гипотензивным средствам быстрого действия и ингибиторам агрегации тромбоцитов, способу их получения и фармацевтическим композициям на их основе.

Данное изобретение может быть использовано в биохимии, физиологии, фармакологии и медицине.

Оксид азота (NO), синтезируемый эндотелиальными клетками и другими типами клеток и тканей, играет одну из ключевых ролей в поддержании нормального тонуса гладких мышц сосудов, влияющего на системное давление крови. Кроме того, NO оказывает спазмолитическое действие на мышцы желудочно-кишечного тракта, желчных путей, мочеточников, матки, бронхов и других органов (Машковский, М.Д. "Лекарственные средства", т.1, "Торсинг", Харьков, 1998 г. , стр. 385). Механизм молекулярного действия эндогенного оксида азота, синтезируемого NO-синтазой из аминокислоты L-аргинина в эндотелии кровеносных сосудов, включает его диффузию через плазматические мембраны в полость кровеносного сосуда и в гладкомышечные клетки сосуда, где происходит связывание с гемовой группой рГЦ. Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2; гуанозин-5'-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/ является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3', 5'-циклофосфата (цГМФ) - вторичного мессенджера, выполняющего роль универсального регулятора внутриклеточного метаболизма (F. Murad "Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: The NO-cGMP signal transduction system" Adv. Pharmacol. 1994, v,26, p. 19-33). ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что в результате взаимодействия NO с атомом железа гема, входящего в состав фермента, и образования комплекса нитрозил-гем возникают конформационные изменения активного центра фермента, которые приводят к активации рГЦ и повышению синтеза цГМФ. Возрастание внутриклеточной концентрации данного вторичного мессенджера в гладкомышечных клетках сосуда вызывает активацию цГМФ-зависимых протеинкиназ, что индуцирует дефосфорилирование молекулы миозина, а следовательно, и расслабление гладких мышц коронарных и других кровеносных сосудов (сосудов мозга, брюшной полости, периферических сосудов), снижение сосудистого тонуса и сопротивления, то есть приводит к расширению просвета кровеносного сосуда. Таким образом, NO снижает давление крови, повышает кровоток и способствует восстановлению сосудистой функции (см. фиг.1).

Нарушения, связанные с нормальным протеканием вышеуказанных реакций, лежат в основе патофизиологических процессов, характерных для развития различных заболеваний сердечно-сосудистой системы (гипертонии, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности) и других органов. При таких заболеваниях наблюдаются множественные нарушения синтеза эндогенного NO, его рецепции рГЦ, а также регуляции уровня циклических нуклеотидов и ионов кальция.

К настоящему времени доказано образование оксида азота в результате биотрансформации тринитроглицерина (глицерилтринитрата, ГТН) и других нитратов, которые используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в качестве антиишемических и антиангинальных препаратов (Машковский, М.Д. "Лекарственные средства", т. 1, "Торсинг", Харьков, 1998 г., стр. 385-392). Однако их существенным недостатком является возникновение толерантности и других побочных эффектов при длительном применении. В связи с этим, проводится поиск новых соединений, способных образовывать NO в живом организме неэнзиматическим путем (напр., спонтанно или тиолзависимо), что рассматривается как актуальный и перспективный подход для создания новых, более эффективных антигипертензивных фармпрепаратов, обладающих антиангинальной и антиишемической активностью.

Среди NO-генерирующих лекарственных средств, применяемых в терапии сердечно-сосудистых заболеваний, особое место занимают гипотензивные препараты быстрого действия, основными представителями которых являются ГТН и нитропруссид натрия (ННП). Показано, что период полужизни (τ_1/2) ГТН в плазме крови составляет 2-4 мин. В последнее время в литературе появились данные о физиологической активности нового донора NO сверхбыстрого действия (τ_1/2= 1,8 с)-N-диазенийдиолата l-пролина (PROLI/NO) (Saavedra I.E., Southan G. J. , et al. "Localizing antithrombotic and vasodilatory activity with a novel, ultrafast nitric oxide donor" J. Med. Chem. 1996, v. 39, p. 4361-4365). Данное соединение, в отличие от ННП и других доноров оксида азота, при локальном внутривенном введении в низких дозах вызывало селективную вазодилатацию гладких мышц легочной артерии (Andrie, С., Hirani, W.M., et al. "Selective pulmonary vasodilation by intravenous infusion of an ultrashort half-life nucleophile/nitric oxide adduct" Anesthesiology 1998, v. 88, 1, р. 190-195), значительно снижало пролиферацию клеток гладких мышц (Chen, С. , Hanson, S.R., et al. "Boundary layer infusion of nitric oxide reduces early smooth musle cell prolifertion in the endarterectomized canine artery" J. Surg. Res. 1997, v. 67, 1, р. 26-32), а также оказывало высокоэффективное действие при защите от вазоспазма и его купировании в условиях церебральной ишемии (Pluta, R.M., et al. "Reversal and prevention of cerebral vasospasm by intracarotid infusion of nitric oxide donors in a primate model of subarachnoid hemorrage" J. Neurosurg. 1997, v. 87, 5, р. 746-51) и при восстановлении эректильной дисфункции (Сhampion, Н.С., Bivalacqua, T.J., et al. "Induction of penile erection by intracavernosal and transurethral administration of novel nitric oxide donors in the cat" J. Urol. 1999, v. 161, 6, р. 2013-2019), не вызывая во всех случаях системной гипотензии.

Известен 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-1,5,6-триоксид (ДОПТО) вышеуказанной общей формулы I, где R¹ и R² вместе с соседними атомами углерода образуют аннелированный 3,6-диметилпиридазин-1,2-диоксидный цикл, тиолзависимо генерирующий оксид азота и его активные формы - нитроксил и нитрозотилы, активирующий рГЦ и обладающий вазорелаксантным, спазмолитическим и антиагрегантным действием (A.Ya.Kots, M.A.Grafov et. al. "Vasorelaxant and antiplatelet activity of 4,7-dimethyl-l,2,5-oxadiazolo[3,4-d] pyridazine 1,5,6-trioxide: role of soluble guanylate cyclase, nitric oxide and thiols" Brit. J. Pharm, 2000, v.129, p. 1163-1177).

Известен также другой представитель класса фуроксанов - 3,4-дициано-1,2,5-оксадиазол-2-оксид (3,4-дицианофуроксан, ДЦФ) вышеуказанной общей формулы I, где R¹=R²=CN, генерирующий NO в присутствии тиолов, активирующий рГЦ и обладающий вазорелаксантным, спазмолитическим и антиагрегантным действием (Ferioli R., Folco G.C., Ferretti С., Gasco A.M., Medana C., Fruttero R. , Civelli M., Gasco A. "A new class of furoxan derivatives as NO-donors: mechanism of action and biological activity." Brit. J. Pharmacol. 1995, v. 144, 3, p. 816-820).

Существенным недостатком ДОПТО и ДЦФ являются не растворимость в воде и сравнительно невысокая растворимость ДОПТО в водно-органической среде, что затрудняет их применение.

Один из подходов к созданию новых лекарственных средств или биологически-активных соединений (БАС) с улучшенными физико-химическими свойствами основан на использовании веществ, способных образовывать комплексы включения (или инклюзионные комплексы) типа "хозяин - гость". В соответствии с принятым обозначением "хозяином" называют молекулу с внутренней полостью, а "гостем" - молекулу другого соединения, которая входит в эту полость и задерживается там за счет целой совокупности межмолекулярных взаимодействий. В случае образования комплекса физические и химические свойства "гостя" значительно меняются, что в ряде случаев позволяет модифицировать (улучшать) фармакологические свойства включаемого БАС.

В настоящее время в качестве комплексообразователей нашли широкое применение циклический гептамер α-D-глюкозы-β-циклодекстрин (β-ЦД) вышеуказанной формулы II, где n= 7, R³= Н, R⁴ и R⁷- простые связи, R⁵=R⁶=Н и R⁸=СН₂ОН (Saenger, W., "Cyclodextrin-Einschlussverbindungen in Forschung und Industrie" Angew. Chem. 1980, v.92, p.343-361) и его производные, в частности 2-гидроксипропилированный β-циклодекстрин (β-ГПЦД) вышеуказанной общей формулы II, где n=7, R³= Н, R⁴ и R⁷- простые связи, R⁵ и R⁶=(СН₂-СН(СН₃)O)_mН, где m= 1-14, и R⁸=СН₂O(СН₂-СН(СН₃)O)_mН, где m=1-14 (Pitha J., Szabo L,, Fales H.M. "Reaction of cyclodextrins with propylene oxide or with glycidol: analysis of product distribution" Carbohydrate Res. 1987, v.168, 1, p. 191-198). Кроме вышеуказанных веществ с аналогичной целью использовалась также 3β-[2'-O-(β-D-глюкуронопиранозил)-β-D-глюкуронопиранозилокси]-11 -оксо-18β, 20β-олеан-12-ен-29-овая кислота (глицирризиновая кислота, ГК) вышеуказанной формулы II, где n= l, R³ - фрагмент 11-оксо-18β, 20β-олеан-12-ен-29-овой кислоты вышеуказанной формулы III, R⁴=Н, R⁵-β-D-глюкуронопиранозил, R⁶= R⁷= Н и R⁸=С(O)ОН (Толстиков Г. А., Балтина Л. А., и др. "Глицирризиновая кислота" Биоорг. химия, 1997, т. 23, 9, с. 691-709).

Известны многочисленные комплексы включения различных БАС и лекарственных средств с вышеуказанными комплексообразующими соединениями (напр., Папель, К.Э., Дихтярев, С.И., Сугробова, Н.П., "Циклодекстрин" в сер. "Итоги науки и техники. Микробиология", ВИНИТИ, М., 1988 г., т. 21, ч. 2; Дихтярев С. И., Штейнгарт М.В., и др. "Перспективы применения соединений включения на основе циклодекстринов в фармации" в сб. "Науковi основы розробки лiкарьских препаратiв", изд. "Основа", Харкiв, 1998 г., с. 225-228; Толстиков Г.А., Муринов Ю.И., и др. "Комплексы -глицирризиновой кислоты с простагландинами - новый класс утеротонически активных веществ" Хим.-фарм. ж. 1991, т. 25, 3, с. 42-44). Полученные продукты обладают более низкой токсичностью, повышенными растворимостью, устойчивостью и биодоступностью по сравнению с исходными БАС и фармпрепаратами, а также, в ряде случаев, проявляют улучшенное фармакологическое действие.

Так, известен инклюзионный комплекс дипиридамола (2,6-бис[бис(2-гидроксиэтил)амино] -4,8-ди(пиперидин-1-ил)пиримидо[5,4-d] пиримидина) формулы IV:
с β-ЦД, проявляющий антиагрегантное и сосудорасширяющее действие (Fregnan G.B., Berte F. "Enhancement of specific biological activity of dipyridamole by complexation with β-cyclodextrin" Pharmacology 1990, v. 40, p. 96-102). Данный комплекс обладает более высокой растворимостью (в 4,5 раза) в фосфатном буфере (рН 5.5) и улучшенной биодоступностью при пероральном введении в виде капсул по сравнению с исходным дипиридамолом. Кроме этого, было показано, что комплекс β-ЦД-дипиридамол вызывает более сильную и продолжительную коронарную вазодилатацию в опытах in vivo по сравнению с эффектом исходного препарата.

Данный комплекс, как и исходный лиганд, не обладает способностью генерировать NO, его влияние на рГЦ не изучено, а фармакологические свойства проявляются в сравнительно высоких дозах (1-8 мг/кг в пересчете на активный лиганд).

Известны комплексы включения нестероидных противовоспалительных средств (ортофена, аспирина, индометацина) с ГК (авторские свидетельства СССР 1566699, 1566700, C 07 J 63/00, А 61 К 31/705, 1988 г.; 1616925, C 07 J 63/00, А 61 К 31/705, 1989 г.). Указанные продукты были получены при взаимодействии исходных компонентов, взятых в стехиометрическом соотношении, в водно-органической среде (водном этаноле) при повышенной температуре (50^oС).

Данные комплексы, как и исходные лиганды, не обладают способностью генерировать NO, а их фармакологические свойства (противовоспалительное действие) не связаны с влиянием на рГЦ.

Известна стабилизация водных растворов донора NO - N-ацетил-S-нитрозопеницилламина формулы V:

различными циклодекстринами и их производными, в частности β-ЦД и β-ГПЦД (Bauer, J. A., Fung, H.L., "Chemical stabilisation of a vasoactive S-nitrosothiol with cyclodextrins without loss of pharmacologic activity" Pharm. Res. 1991, v. 8, 10, p. 1329-1334]. Предполагается, что данный эффект обусловлен образованием комплексов включения. N-Ацетил-S-нитрозопеницилламин в присутствии указанных комплексообразователей обладал более высокой стабильностью и по своим фармакологическим (вазорелаксантным) свойствам был биоэквивалентен исходному нитрозотиолу. Выделение полученных продуктов и изучение их состава не проводились.

Общим недостатком соединений, содержащих в составе молекулы нитрозотиольную группу, является их выраженная токсичность, в частности канцерогенные и мутагенные свойства.

Известно, что различные моно- и бициклические N-оксиды способны образовывать инклюзионные комплексы с β-ЦД (Uno, В., Kaida, N. et al. "Spectroscopic study of hydrophobic interaction of heterocyclic amine N-oxides with cyclodextrins" Chem. Pharm. Bull. 1988, v. 36, 10, p. 3753-3759), В группу таких соединений входит 4-нитрохинолин-1-оксид формулы VI:

оказывающий активирующее действие на рГЦ (Craven, P.A., De Rubertis, F. R. , "Inhibition by retinol and butylated hydroxyanisol of carcinogen-mediated increases in guanylate cyclase activity and guanosine 3',5'-monophosphate accumulation" Cancer Res., 1977, v. 37, p. 4083-4097).

Вышеуказанный комплекс включения не был выделен, а его биохимические свойства и физиологическая активность не исследовались.

Известен инклюзионный комплекс [(морфолин-4-ил)нитрозоамино]ацетонитрила (SIN-1A) формулы VII:

с различными циклодекстринами (Vicmon, M., Szente, L.,. et al. "SIN-1A /cyclodextrin complexes. Novel, stable and biologically active NO releasing agents" Portland Press Proc. 1996, v. 10, part 5, p. 188 - прототип). Строение полученных продуктов не исследовалось. Комплексы, получаемые данным способом, проявляли повышенную стабильность, спонтанно генерировали NO и по своим фармакологическим свойствам были биоэквивалентны исходному SIN-1A, который вызывал вазодилятацию на изолированных кольцах торакальной аорты кролика, сокращенных под действием норадреналина (Muramatsu, I., Fujii, К., et al. "Vasorelaxing actions of molsidomine and its metabolites, in comparison with nitroglycerin" Can. J. Physiol. Pharmacol. 1983, v. 61, p. 1071-1078), и обладал гипотензивным действием в течение 2,5 часов (Европейский патент 324408, C 07 D 211/98, oп. 1991 г.). Кроме этого, SIN-1A эффективно ингибировал агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro (Darius, H., Ahland, В., et al. "The effect of molsidomine and its metabolite SIN-1A on coronary vessel tone, platelet aggregation, and eicosanoid formation in vitro - inhibition of 12-HPETE biosynthesis" J. Cardiovasc. Pharmacol. 1984, v. 6, p. 115-121).

Токсичность полученных комплексов не исследовалась. Согласно данным литературы трансформация SIN-1A так же, как и соответствующего циклического сиднонимина (SIN-1), в аэробных условиях сопровождается генерацией супероксиданион-радикала (Feelisch, M., Ostrovski, J., Noack, E., "On the mechanism of NO release from sydnonimines" J. Cardiovasc. Pharmacol. 1989, v. l4, Suppl. 11, p. S13-S22), который, взаимодействуя с выделяющимся NO, может приводить к образованию высокотоксичного пероксинитрита.

Известен инклюзионный комплекс антиангинального органического нитрата-1,4,3,6-диангидро-D-сорбит-2,5-динитрата (изосорбиддинитрата) формулы VIII:

с β-ЦД (Патент Японии 63135402 (С 08 В 37/16) oп. 1988 г.). Строение полученного продукта и его фармакологические свойства не исследованы. Способ получения данного комплекса заключается в том, что к водному раствору β-ЦД добавляли изосорбиддинитрат и реакционную смесь встряхивали при комнатной температуре или слабом нагревании в течение 48 часов, после чего целевой продует отделяли центрифугированием.

Существенным недостатком данного способа является продолжительность процесса.

Наиболее близким к описываемым является известный комплекс включения стехиометрического состава (1:1) известного органического нитрата быстрого действия - тринитроглицерина (ГТН) формулы IX:

с β-ЦД (Stadler-Szoke, A., Szejtii, J., "The inclusion complex of nitroglycerol-β-cyclodextrin" Acta Pharm. Hung. 1979, v. 49, p. 30-34 - прототип). Способ получения данного продукта включает смешивание водного раствора -ЦД, предварительно нагретого до температуры 60^oС, с 20%-ным раствором ГТН в этаноле при мольном соотношении реагентов, равном ~1:1,04, с последующим выдерживанием при данной температуре, охлаждением до 4^oС, фильтрованием выпавшего осадка, его промыванием диэтиловым эфиром и высушиванием.

Аналогичный продукт был получен другими авторами в условиях, близких к вышеописанным (Tomono, К., Goton, H., et al. "Interaction of nitroglicerin with 6-О-α-maltosylcyclomaltoheptaose" Carbohydrate Res. 1989, v. 192, p. 351-356). Было показано, что ГТН в составе данного комплекса обладал повышенной стабильностью (сохранялось 80% лиганда в течение 6 дней) по сравнению с иходным ГТН, который в тех же условиях полностью распадался за 1,5 дня. Согласно известным данным таблетки для сублингвального применения, полученные на основе этого продукта, по своим фармакологическим показателям (пульсовому давлению у анестезированных собак, систолическому давлению крови и содержанию ГТН в плазме у здоровых людей) были биоэквивалентны обычным таблеткам с таким же содержанием ГТН (0,3 мг) (Idzu, G., Terada, Т., et al. "Stability and bioequivalence of sublingual tablets of nitroglycerin-β-cyclodextrin complex" Byoin Yakugaku 1989, v. l5, 1, p. 36-42, Chem. Abstr. 1989, v. lll, 28417а). Таким образом, рассматриваемый комплекс включения так же, как и сам лиганд, проявлял высокоэффективное непродолжительное гипотензивное действие в результате биотрансформации ГТН с образованием NO и последующей активации рГЦ.

Данный комплекс так же, как и исходный лиганд (ГТН), по-видимому, способен вызывать толерантность при его длительном применении и проявляет слабовыраженные антиагрегантные свойства.

Цель изобретения - создание новых комплексов включения, обладающих улучшенными биохимическими и фармакологическими свойствами, разработка способа их получения и создание фармацевтических композиций на их основе.

Указанная цель достигается описываемыми новыми комплексами включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида вышеприведенной общей формулы I, где R¹ и R² имеют указанные значения, с полициклическими производными глюкопиранозы вышеприведенной общей формулы II, где R³-R⁸ имеют указанные значения, генерирующими NO, активирующими рГЦ и являющимися спазмолитическими, сосудорасширяющими, гипотензивными средствами быстрого действия и ингибиторами агрегации тромбоцитов, способом их получения и фармацевтическими композициями на их основе.

Предпочтительно, настоящее изобретение относится к следующим новым инклюзионным комплексам:
- 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-1,5,6-триоксида с β-ЦД (1:3) (1),
- 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-1,5,6-триоксида с β-ЦД (1:2) (2),
- 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-1,5,6-триоксида с β-ГПЦД (3),
- 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-1,5,6-триоксида с ГК (4),
- 3,4-дициано-1,2,5-оксадиазол-2-оксида с β-ЦД (2:3) (5),
- 3,4-дициано-1,2,5-оксадиазол-2-оксида с β-ГПЦД (6).

Продукты настоящего изобретения получают способом, заключающимся во взаимодействии исходного производного 1,2,5-оксадиазол-2-оксида вышеприведенной общей формулы I, где R¹ и R² имеют указанные значения с соответствующим полициклическим производным глюкопиранозы вышеприведенной общей формулы II, где R³-R⁸ имеют указанные значения, в водно-органической среде (напр., в водном растворе диоксана, низшего алканола, в частности этанола, или смеси органических растворителей) при повышенной температуре (30-60^oС) с последующей отгонкой растворителей при пониженном давлении, повторным упариванием остатка с этанолом, промыванием целевого продукта малополярным органическим растворителем (напр. , диэтиловым эфиром или его смесью с гексаном) и тщательным высушиванием при пониженном давлении в присутствии фосфорного ангидрида. Существенность отличий настоящего способа определяется совокупностью его отличительных признаков (включая строение исходных реагентов - производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида вышеприведенной общей формулы I и условия выделения целевых продуктов), при которых достигается указанная цель изобретения (см. сравнительный пример 7).

Согласно данному изобретению новые инклюзионные комплексы можно применять для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, включая лечение гипертонических кризов, острого инфаркта миокарда, стенокардии, ишемической болезни сердца, легочной гипертонии, острой недостаточности левого желудочка, токсикогенных спазмов сосудов, для профилактики и купирования приступов стенокардии и спазмов коронарных артерий при использовании сердечных катетеров, ангиографии и ангиопластике, а также других заболеваний сердечно-сосудистой системы, при которых положительный лечебный эффект достигается при снижении сосудистого сопротивления, нормализации сократительной способности миокарда и/или ингибировании активности тромбоцитов, за исключением тех заболеваний, при которых противопоказано снижение кровяного давления и/или ингибирование агрегации тромбоцитов (например, артериальной гипотонии, кардиогенного шока, острого инфаркта миокарда с пониженным давлением наполнения левого желудочка, общего снижения функции левого желудочка с низким давлением наполнения, гипертрофической обструктивной кардиомиопатии, сосудистого коллапса, токсического отека легких, геморрагического инсульта, гемофилии, геморрагического диатеза, гипотромбинемии).

Предпочтительно применение новых соединений вышеуказанной общей формулы I для профилактики и купирования приступов стенокардии, нарушений, вызванных спазмом гладких мышц, и лечения острого инфаркта миокарда.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, генерирующим оксид азота, активирующим растворимую форму гуанилатциклазы и обладающим спазмолитическим, сосудорасширяющим, гипотензивным и антиагрегантным действием, содержащим активный компонент и добавки в необходимом соотношении, при этом в качестве активного компонента используются комплексы включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида вышеприведенной общей формулы I, где R¹ и R² имеют указанные значения, с полициклическими производными глюкопиранозы вышеприведенной общей формулы II, где R³-R⁸ имеют указанные значения, полученные описанным способом.

В качестве добавок используются компоненты, общепринятые для приготовления лекарственных форм спазмолитических, сосудорасширяющих и гипотензивных средств. В зависимости от вида введения препарата и цели его применения лекарственные формы могут быть выполнены в виде растворов для инъекций или инфузий, капсул, гранул, драже или пилюль для постепенного дозирования (при необходимости из полимерного материала, например из ацетилфталоилцеллюлозы, или другого пригодного для данной цели материала, например желатина), а также в качестве порошков для аэрозолей.

Твердая форма для приема внутрь может содержать в качестве добавок инертный наполнитель (например, лактозу, сахарозу, сорбит, крахмал, маннит), поверхностно-активные вещества (например, стеарат магния или кальция, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль) и фармакологически приемлемые неорганические соли (например, хлорид натрия).

Жидкие композиции могут быть получены при растворении или диспергировании активного компонента в водном или неводном растворителе (например, этаноле, растительном масле) в присутствии стабилизирующих добавок (например, компонентов буферных смесей, поверхностно-активных веществ, пищевых углеводов), консервантов, пищевых красителей. Жидкие композиции могут быть использованы для различных способов введения, в частности в форме капель или аэрозолей, а также в ампульной форме для внутривенного или внутримышечного введения.

Вышеуказанные фармацевтические композиции на основе соединений вышеуказанной общей формулы I могут быть получены комбинированием комплексов включения настоящего изобретения с активными компонентами других известных фармпрепаратов, в частности, используемых для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. Например, с этой целью можно использовать блокаторы α₁-адренергических рецепторов (празозин), агонисты центральных α₂-адренергических и I₁ имидазолиновых рецепторов (клофелин, моксонидин), блокаторы β(β₁)-адренергических рецепторов (пропранолол, атенолол, метопролол), блокаторы кальциевых каналов (нифедипин, дилтиазем), ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (лизиноприл, фозиноприл), коронарорасширяющие препараты (карбокромен), диуретики (дихлортиазид), сердечные гликозиды (дигитоксин), антигипертензивные средства (безафибрат, гемфиброзил).

Описание данного изобретения содержит 23 примера, 6 таблиц и 4 чертежа, иллюстрирующих экспериментальный материал.

Примеры 1-6 содержат описание синтеза новых инклюзионных комплексов с помощью описываемого способа, а также физико-химические характеристики полученных продуктов.

Сравнительный пример 7 подтверждает существенность отличий описываемого способа.

Пример 8 содержит результаты изучения полученных продуктов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, подтверждающие образование новых комплексов включения.

Примеры 9-11 и табл.1 показывают химические основы молекулярного механизма фармакологического действия новых инклюзионных комплексов, заключающиеся в генерации NO и его редоксформы (нитроксила), а также образовании нитрозотиолов.

Пример 12 и табл.2 подтверждает образование NO новыми инклюзионными комплексами в тесте с оксигемоглобином.

Пример 13 и табл. 3 содержат результаты исследования скорости реакции новых инклюзионных комплексов с низкомолекулярными тиолами, способствующей образованию NO и его активных форм.

Пример 14 иллюстрируют биохимический эффект новых инклюзионных комплексов, опосредованный генерацией оксида азота, - активацию рГЦ из легких крысы.

Пример 15 и табл.4 иллюстрируют фармакологические свойства новых инклюзионных комплексов - спазмолитическую и сосудорасширяющую активности в условиях in vitro.

Пример 16 и табл.5 демонстрируют наличие у новых инклюзионных комплексов гипотензивной активности в условиях in vivo.

Пример 17 показывает способность новых инклюзионных комплексов ингибировать агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro.

Пример 18 иллюстрирует изучение острой токсичности новых инклюзионных комплексов.

Пример 19 содержит описание некоторых физико-химических свойств новых инклюзионных комплексов (растворимость, стабильность).

Примеры 20-23 включают описание состава различных фармацевтических композиций на основе новых инклюзионных комплексов.

Пример 1. Комплекс включения 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-1,5,6-триоксида с β-ЦД (1:3) (1).

К нагретому до температуры 50^oС раствору 59 мг (0,3 ммоль) ДОПТО в смеси, содержащей 70 мл 60%-ного водного раствора этанола и 42 мл диоксана, по каплям и при интенсивном перемешивании добавляли нагретый до температуры 50^oС раствор 324 мг (0,25 ммоль) β-ЦД в 30 мл 40%-ного водного раствора этанола. Полученный раствор выдерживали в течение 2 ч при температуре 50^oС, упаривали досуха при пониженном давлении, повторно упаривали с этанолом (3•5 мл), остаток промывали диэтиловым эфиром (10 мл) и тщательно высушивали при пониженном давлении в присутствии фосфорного ангидрида. Получили 318 мг целевого продукта (выход 98,6%). Т. пл. 149-151^oС (разл.).

УФ-спектр (λ_max, нм): 256 (lg ε 4,09), 359 (lg ε 3,35). ИК спектр (KBr, ν см^-1): 3550-3200 (ОН), 2800-3000 (СН), 1710, 1625, 1550, 1520 (C=N-O), 1415, 1360 (N-N-O), 1320, 1160, 1080, 1030 (С-O), 950. 860 (C=N-O),760.

Найдено, %: С 41,06; Н 6,70; N 1,50. C₁₃₂H₂₁₆N₄O₁₀₉•15Н₂О
Вычислено, %: С 40,93; Н 6,40; N 1,45.

Полученный комплекс содержит исходные компоненты (ДОПТО и β-ЦД) в мольном сотношении, равном 1:3, соответственно.

Пример 2. Комплекс включения 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-1,5,6-триоксида с β-ЦД (1:2) (2).

В условиях примера 1 смешивали нагретые до температуры 60^oС растворы 60 мг (0,3 ммоль) ДОПТО в 10 мл диоксана и 324 мг (0,25 ммоль) β-ЦД в 30 мл 40%-ного водного раствора этанола и выдерживали при температуре 60^oС в течение 2 ч. После этого полученный раствор упаривали при пониженном давлении, повторно упаривали с этанолом, остаток промывали смесью (4 мл) гексан-диэтиловый эфир (1:2) и высушивали при пониженном давлении в присутствии фосфорного ангидрида. Получили 314 мг целевого продукта (выход 97,7%). Т. пл. 147-149^oС (разл.).

УФ-спектр (λ_max, нм): 256 (lg ε 6,07), 359 (lg ε 4,98). ИК спектр (KBr, ν см^-1): 3380 (ОН), 1520 (C=N-O), 1360 (N=N-O), 860 (C=N-O).

Найдено, %: С 41,86; Н 6,40; N 2,20. C₉₀H₁₄₆O₇₄•6H₂O
Вычислено, %:С41,96; Н 6,18; N 2,17.

Полученный комплекс содержит исходные компоненты (ДОПТО и β-ЦД) в мольном сотношении, равном 1:2, соответственно.

Пример 3. Комплекс включения 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-1,5,6-триоксида с β-ГПЦД (3).

В условиях примера 1 из 60 мг (0,3 ммоль) ДОПТО и 355 мг (0,25 ммоль) β-ГПЦД (средняя мол. масса 1420) после упаривания при пониженном давлении, повторного упаривания с этанолом, промывания диэтиловым эфиром (10 мл) и высушивания получили 357 мг целевого продукта. Т. пл. 164-167^oС (разл.).

УФ-спектр (λ_max, нм): 257 (lg ε 7,36), 360 (lg ε 6,61).

Полученный комплекс содержит исходный активный компонент (ДОПТО) в количестве, равном 9,4 мас.% (средняя мол. масса продукта в пересчете на 1 моль связавшегося ДОПТО ~2100).

Анализ ¹Н-ЯМР-спектров растворов комплексов ДОПТО, полученных в примерах 1-3, в ДМСО-D₆ показывает, что данные продукты не содержат заметных количеств (не более 0,4 мас.%) использованных при их синтезе органических растворителей (диоксана, этанола, гексана или диэтилового эфира).

Пример 4. Комплекс включения 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-1,5,6-триоксида с ГК (4).

В условиях примера 1 из 60 мг (0,3 ммоль) ДОПТО и 246 мг (0,3 ммоль) ГК после упаривания при пониженном давлении, повторного упаривания с этанолом, промывания 10 мл смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1) и высушивания получили 258 мг целевого продукта. Т. пл. 142-145^oС (разл.). ИК спектр (KBr, ν см^-1): 3550-3200 (ОН), 2800-3000 (CH), 1732 (СО), 1680 (СО в СООН), 1524 (фуроксановый цикл), 1456, 1444 (фуроксановый цикл), 1376 (N=N-O).

Полученный комплекс содержит исходный активный компонент (ДОПТО) в количестве, равном 18,7 мас.% (условная мол. масса продукта в пересчете на 1 моль связавшегося ДОПТО ~ 1060).

Пример 5. Комплекс включения 3,4-дициано-1,2,5-оксадиазол-2-оксида с β-ПД (2:3) (5).

В условиях примера 1 смешивали нагретые до температуры 30^oС растворы 16 мг (0,12 ммоль) ДЦФ в 10 мл этанола и 130 мг (0,1 ммоль) β-ЦД в 30 мл 40%-ного водного раствора этанола и выдерживали при температуре 30^oС в течение 2 ч. После этого полученный раствор упаривали при пониженном давлении, остаток промывали 10 мл смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1) и высушивали при пониженном давлении в присутствии фосфорного ангидрида. Получили 129 мг целевого продукта (выход 94,7%). Данный комплекс не имеет выраженной температуры плавления (разложения) в интервале температур 0-250^oС.

УФ-спектр (λ_max, нм): 272 (lg ε 5,49)
ИК спектр (KBr, ν см^-1): 3550-3200 (ОН), 2800-3000 (СН), 22,08 (CN), 1628, 1454 (фуроксановый цикл).

Найдено, %: С 39,28; Н 6,52; N 2.74. C₁₃₄H₂₁₀N₈O₁₀₉•24Н₂О
Вычислено, %: С 39,16; Н 6,33; N 2,73.

Пример 6. Комплекс включения 3,4-дициано-1,2,5-оксадиазол-2-оксида с β-ГПЦД (6).

В условиях примера 1 из 41 мг (0,3 ммоль) ДЦФ и 355 мг (0,25 ммоль) β-ГПЦД (средняя мол. масса 1420) после упаривания при пониженном давлении, повторного упаривания с этанолом, промывания 10 мл смеси гексан-диэтиловый эфир (1: 1) и высушивания получили 344 мг целевого продукта. Т. пл. 118-120^oС. УФ-спектр (λ_max, нм): 273 (lg ε 3.62). ИК спектр (KBr, ν, см^-1): 3550-3200 (ОН), 2800-3000 (СН), 2208 (CN), 1636, 1454 (фуроксановый цикл).

Полученный комплекс содержит исходный активный компонент (ДЦФ) в количестве, равном 9,2 мас.% (средняя мол. масса продукта в пересчете на 1 моль связавшегося ДЦФ ~1470).

Анализ ¹Н-ЯМР-спектров растворов комплексов ДЦФ, полученных в примерах 5 и 6, в ДМСО-D₆ показывает, что данные продукты не содержат заметных количеств использованных при их синтезе органических растворителей (диоксана, этанола, гексана или диэтилового эфира).

Пример 7 (сравнительный). Изучение взаимодействия бензотрифуроксана с β-ЦД.

В условиях примера 1 из раствора 75 мг (0,3 ммоль) бензотрифуроксана в 50 мл диоксана и 324 мг (0,25 ммоль) β-ЦД после упаривания при пониженном давлении, повторного упаривания с этанолом, промывания 10 мл диоксана и высушивания получили продукт, анализ которого с помощью УФ-спектроскопии показал практически полное отсутствие выраженного максимума поглощения в области 252-258 нм, соответствующего свободному лиганду.

Пример 8. Изучение новых комплексов включения с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.

Для подтверждения образования комплексов включения фуроксансодержащих соединений общей формулы I с β-ЦД, β-ЦДГП и ГК использовали метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), в основе которого лежит различие в термических эффектах, возникающих при программированном нагреве образцов смеси компонентов и комплекса в целом. На фиг. 2-4 представлены термограммы ДСК индивидуальных веществ (ДОПТО, ДЦФ, β-ЦД, β-ЦДГП), механической смеси β-ЦД и ДОПТО, а также полученных новых инклюзионных комплексов.

Как показано на фиг. 2, термограмма ДСК ДОПТО имеет четкий пик в области температур 60-65^oС, который соответствует эндотермическому эффекту, возможно связанному с диссоциацией азин-N, N'-диоксидной группы ДОПТО, а в области температур 160-180^oС наблюдается пик, который отражает плавление вещества, сопровождающееся его разложением и выделением большого количества энергии. Аналогичный эндотермический эффект имеется в области ≈200^oС на термограмме ДСК ранее исследованного известного комплекса ТНГ с β-ЦД.

Для β-ЦД на термограмме ДСК отсутствуют четкие пики термических эффектов в области температур 60-65^oС и 160-180^oС, а отклонение температурной кривой от базовой линии и наличие минимума при температуре ≈113^oC свидетельствуют о процессе, связанном с деградацией β-ЦД в данной температурной области.

В случае механической смеси ДОПТО с β-ЦД, взятых в мольном соотношении 1:3, наблюдается суммарный термический эффект, характеризуемый наличием пика в вышеуказанных (или близких) областях температур, которые соответствуют температурам рассмотренных выше эффектов отдельно взятых исходных компонентов.

Термограмма ДСК полученного комплекса 1 /ДОПТО с β-ЦД (1:3)/ существенно отличается от кривых ДСК для индивидуальных компонентов и их механической смеси и имеет минимум при температуре ≈82^oС и максимум при температуре ≈147-151^oС. Анализ температурных кривых, представленных на фиг. 2, показывает, что в полученном комплексе отсутствует ДОПТО в свободном (несвязанном) состоянии, и на этом основании можно сделать вывод об образовании комплекса включения. Аналогичные закономерности в проявлении термических эффектов в условиях ДСК были обнаружены и для других продуктов настоящего изобретения (фиг. 3, 4).

Пример 9. Образование оксида азота из новых комплексов включения.

Для определения NO использовали известный способ, основанный на реакции оксида азота с кислородом воздуха в водной среде с образованием нитрита, количество которого измеряли по интенсивности окрашивания пробы продуктом реакции азосочетания с помощью спектрофотометра. В качестве доказательства того, что данный способ дает возможность измерить именно оксид азота, выделяющийся из соединения в результате химической реакции, а не нитрит, реакцию проводят в присутствии оксигемоглобина, который количественно реагирует с оксидом азота (но не нитритом), образуя нитрат, который не вступает в реакцию азосочетания.

Проба конечным объемом 1 мл содержала 50 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,4) или 20 мМ калий-цитратный буфер (рН 5,0), 0,5 мМ цистеин или глутатион, изучаемое соединение в концентрации 0,1 мМ и 0,2% диметилсульфоксид (ДМСО), а при инкубации с оксигемоглобином его концентрация составляла 0,1 мМ. В качестве отрицательного контроля использовали водный раствор ДМСО в концентрации 0,2%, а в качестве положительного контроля 0,1 мМ нитрит натрия, содержащий 0,2% ДМСО. Пробы инкубировали 60 мин при 37^oС и добавляли последовательно 100 мкл 3 М ацетата натрия, 400 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте и 400 мкл 0,05% N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 10 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре.

В вышеуказанных условиях при рН 7,4 не наблюдалось образование заметного количества нитрита (<0,01 моль нитрита/моль комплекса включения) в отсутствие тиолов. В присутствии тиолов комплексы 1-6 генерировали 0,057-0,411 моль нитрита на моль комплекса в присутствии цистеина и 0,017-0,162 моль нитрита на моль комплекса в присутствии глутатиона (см. табл. 1). Дальнейшая инкубация не приводила к дополнительному образованию нитрита. При инкубации комплексов настоящего изобретения в вышеуказанных условиях в присутствии оксигемоглобина и цистеина или глутатиона наблюдалось образование метгемоглобина (см. пример 11).

Согласно данным прототипа NO-генерирующие свойства известного аналога (комплекса ГТН) в условиях, близких к описанным, не исследовались. Известно, что ГТН в присутствии 1-100 мМ 1-цистеина способен генерировать оксид азота (Feelisch, V., Noack, E., Schroder, H. "Explanation of the discrepancy between the degree of organic nitrate decomposition, nitrite formation and guanylate cyclase stimulation" Eur. Heart Journal 1988, v. 9, Suppl. A, p. 57-62).

Пример 10. Образование S-нитрозотиолов (S-нитрозоглутатиона) новыми комплексами включения.

Для определения S-нитрозотиолов использовали известный способ, основанный на реакции с хлоридом ртути (II), в ходе которой происходит образование нитрита. Для учета образования нитрита в ходе реакции соединений настоящего изобретения с глутатионом реакцию проводили, как описано в примере 8, а затем определяли нитрит по способу, описанному в примере 8, в отсутствии и в присутствии хлорида ртути (II) в концентрации 0,1%. Разность полученных значений соответствует количеству S-нитрозоглутатиона.

В вышеуказанных условиях продукты настоящего изобретения способны образовывать S-нитрозотиолы. Аналогичные свойства известного комплекса включения ГТН не исследовались.

Пример 11. Образование восстановленной формы оксида азота новыми инклюзионными комплексами.

Для определения восстановленной формы оксида азота (NО^-/HNО) использовали известный способ, основанный на том, что образовавшийся в ходе реакции нитроксил реагирует с тиолами с образованием гидроксиламина (или происходит конкурентное образование N₂O), который после окисления ионами I₃ ^- дает нитрит, определяемый по реакции азосочетания (см. пример 8). Поскольку изучаемые соединения также генерируют и нитрит, который аналогичным образом вступает в реакцию азосочетания на заключительном этапе, в качестве положительного контроля использовали гидроксиламина гидрохлорид и нитрит натрия в концентрации 0,1 мМ, а инкубацию проводили так же, как описано в примере 1, при рН 7,4. После инкубации в пробы добавляли 100 мкл 3 М ацетата натрия, 400 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте, 100 мкл 1,25% I₂ в 2% KI, 30 мкл 0,5 М 2-меркаптоэтанола и 400 мкл 0,05% N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 15 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре. Параллельно с этим опытом проводили измерения образования нитрита, как описано в примере 8. Содержание гидроксиламина рассчитывали по формуле: Х=(А-Y•N)/H, где Х соответствует концентрации гидроксиламина, мкМ; А - оптическая плотность пробы, содержащей исследуемый комплекс; Y - концентрация образовавшегося нитрита натрия, определенная как описано в примере 1, мкМ; N - оптическая плотность положительного контроля, содержащего нитрит натрия, мкМ^-1; и Н - оптическая плотность положительного контроля, содержащего гидроксиламина гидрохлорид, мкМ^-1.

В вышеуказанных условиях наблюдалось образование гидроксиламина из продуктов настоящего изобретения в присутствии цистеина или глутатиона. Возможность генерации известным аналогом восстановленной формы оксида азота не исследована.

Результаты, представленные в табл.1, показывают, что продукты настоящего изобретения являются донорами NO, а также его активных форм - нитрозотиолов и NO^-/HNO, что отражает молекулярные основы фармакологического действия рассматриваемых комплексов.

Пример 12. Образование метгемоглобина из оксигемоглобина под действием новых инклюзионных комплексов общей формулы I.

Определение генерации NO в присутствии оксигемоглобина, сопровождающееся образованием метгемоглобина, изучали известным способом в спектрофотометрической кювете конечным объемом 1 мл при 25^oС. Пробы содержали 25 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,4), 3 мкМ оксигемоглобин, 0,5 мМ цистеин или глутатион и исследуемые комплексы в концентрации 0,1 мМ. Определяли скорость возрастания оптической плотности при 401 нм и по линейному начальному участку рассчитывали скорость образования оксида азота (коэффициент молярного поглощения метгемоглобина принимали равным 39,9 ммоль^-1•см^-1). В отсутствии тиолов заметного прироста оптической плотности при 401 нм не наблюдалось. Кажущуюся константу скорости реакции первого порядка выражали в мин^-1. Из данных литературы известно, что процесс превращения оксигемоглобина в метгемоглобин может сопровождаться образованием гемихрома или холеглобина, поэтому в отдельных экспериментах проверяли отсутствие этих форм гемоглобина. Для этого пробы инкубировали в калий-фосфатном буфере рН 7,4 в присутствии 25 мкМ оксигемоглобина, 0,2 мМ цистеина или глутатиона и 20 мкМ соединений. Измеряли оптическую плотность при 560, 577, 630 и 700 нм и рассчитывали концентрации оксигемоглобина, гемихрома, метгемоглобина и холеглобина. Эти эксперименты показали, что при инкубации изучаемых комплексов с оксигемоглобином в отсутствии тиолов или в присутствии цистеина или глутатиона не наблюдается образования холеглобина или гемихрома, а происходит исключительно превращение оксигемоглобина в метгемоглобин.

В вышеуказанных условиях продукты настоящего изобретения вызывали образование метгемоглобина из оксигемоглобина, причем данный эффект усиливался в присутствии цистеина и глутатиона. Результаты исследований (константы скорости реакции NO+Гм-O₂-->NО₃ ^-+метГм) представлены в табл.2. Исследованные комплексы не реагировали в аналогичных условиях с метгемоглобином.

Пример 13. Изучение реакции новых инклюзионных комплексов ДОПТО с низкомолекулярными тиолами.

Кажущуюся константу скорости реакции второго порядка определяли известным способом, измеряя скорость убыли концентрации комплексов в реакции с цистеином или глутатионом. Пробы конечным объемом 0,2 мл содержали 50 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,4), изучаемые продукты в концентрации 20 мкМ и 20, 50 и 100 мкМ растворы цистеина или глутатиона. Контрольные пробы содержали соответствующее количество ДМСО (0,2%). Инкубацию проводили при температуре 20^oС. Убыль концентрации комплексов определяли по изменению оптической плотности при длине волны 360 нм, учитывая поглощение продуктов реакции при этой длине волны. Регистрацию оптической плотности начинали сразу после добавления раствора тиола в реакционную смесь. Убыль оптической плотности рассчитывали по линейному участку графика зависимости оптической плотности от времени. Кажущуюся константу скорости реакции второго порядка вычисляли по следующей формуле:
k=v/(c_к•c_т),
где k - кажущаяся константа скорости реакции второго порядка комплексов с тиолами, (М•сек. )^-1; v - скорость реакции, М/сек.; c_к - концентрация комплекса, М; c_т -концентрация тиола, М.

В дополнительном эксперименте было установлено, что кажущаяся константа скорости реакции второго порядка комплексов с тиолами не зависит от концентрации тиолов.

Пример 14. Активация растворимой формы гуанилатциклазы новыми инклюзионными комплексами.

Активность рГЦ измеряли в препарате из легких крысы, полученном известным способом. Для получения данного препарата рГЦ 0,3 мг ткани гомогенизировали в 5 объемах 50 мМ трис-НСl-буфера (рН 7,6), содержащего 10 мМ MgCl₂, с помощью гомогенизатора "стекло-стекло". Гомогенат центрифугировали в течение 30 мин при 16000 g, супернатант отбирали и определяли активность фермента по количеству [³²Р]цГМФ, образовавшегося из [α-³²P]ГТФ, известным способом. Супернатант (300 мкл), разводили 450 мкл трис-HCl-буфера (рН 7,6) и аликвотами по 10 мкл на льду добавляли в инкубационную смесь (конечный объем проб 100 мкл), содержащую (конечные концентрации) 50 мМ трис-HCl-буфера (рН 7,6), 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин, 5 мМ MgCl₂, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 5 мМ креатинфосфат, 2 мМ цГМФ, 0,2 мМ ГТФ, 10000-20000 имп/мин/пмоль [α-³²Р] ГТФ (Изотоп, ИЯФ, Обнинск), а также 10 мМ ДТТ или другие тиолы, как указано в тексте дополнительно. При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в концентрации 10 мкМ в виде раствора в водном ДМСО, а в контрольные пробы добавляли ДМСО до концентрации 0,02%. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали при 37^oС в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением проб в течение 2 мин. После охлаждения до комнатной температуры в пробы добавляли 0,5 мл 30 мM Na₂CO₃ и 0,6 мл 36 мМ Zn(СН₃СОО)₂, перемешивали, инкубировали при 4^oС в течение 10 мин и центрифугировали при 15 000 g в течение 5 мин. Супернатант наносили на колонки с подкисленной известным способом окисью алюминия, которые промывали водой. Элюцию [³²P] цГMO проводили 0,2 М формиатом аммония во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика известным способом Черенкова.

Определение белка проводили по известному способу Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Как вытекает из данных табл. 3, продукты настоящего изобретения в концентрации 29-64 мкМ в 8,2-23,3 раза повышали активность рГЦ в препарате из легких крысы. Биохимические свойства известного аналога в данном тесте не изучены. Из данных литературы известно, что ГТН эффективно активирует рГЦ только после биотрансформации или в присутствии высоких концентраций цистеина.

Пример 15. Сосудорасширяющая и спазмолитическая активности новых инклюзионных комплексов.

Сосудорасширяющую и спазмолитическую активности продуктов настоящего изобретения изучали на модели изометрического сокращения гладких мышц изолированного сегмента аорты крысы под действием вазоконстриктора (спазмогена)-α-адреноагониста фенилэфрина. Активность производных общей формулы I определяли в условиях in vitro на кольцах торакальной аорты крыс-самцов линии Вистар средней массой 280 г (210-330 г) известным способом. Крыс декапитировали, вырезали торакальную аорту и очищали от жировой ткани. Затем вырезали кольца шириной 2,5 мм, которые подвешивали на двух параллельных крючках из нержавеющей стали. Один из крючков закрепляли на стенке камеры, а другой соединяли с изометрическим датчиком DY1, соединенным с восьмиканальным самописцем (фирмы Beckman, США). Камера содержала 30 мл раствора Кребса (130 мМ NaCl, 4,7 мМ КСl, 2,5 мМ СаСl₂, 1,18 мМ КН₂PO₄, 14,9 мМ NaHCO₃, 1,2 мМ MgSO₄, 11 мМ глюкоза) при 37^oС, который находился в условиях постоянной аэрации 95% O₂/5% СО₂ для поддержания рН 7,4. В раствор Кребса добавляли индометацин до концентрации 1 мкМ. При необходимости эндотелий удаляли механическим способом. Кольца перед опытом уравновешивали в течение часа под нагрузкой 2,5 г. Перед началом эксперимента кольца предсокращали 10 нМ норадреналином, а через 20 мин вызывали сокращение препарата добавлением фенилэфрина в концентрации 0,5 мкМ. После стабилизации состояния мышцы сосуда регистрировали ее расслабление в ответ на кумулятивные дозы изучаемых комплексов в диапазоне концентраций от 0,003 нМ до 50 000 нМ. После этого исследованный комплекс отмывали 6-7 сменами среды инкубации в течение 1 часа и контролировали интактное состояние гладкой мышцы сосуда с использованием 0,5 мкМ нитропруссида натрия. В связи с невысокой растворимостью соединений в воде влияние растворителя (ДМСО) на изометрическое сокращение сосуда определяли в отдельных экспериментах. Было установлено, что ДМСО в концентрации до 0,1-0,2% практически не оказывает влияния на сосудистый тонус, что позволяет тестировать вазорелаксантную активность веществ в концентрации до 100 мкМ. Все эксперименты повторяли не менее 3 раз. Величину концентрации исследуемых новых комплексов, соответствующую 50%-ной релаксации сосуда (IC50), рассчитывали с применением программы SigmaPlot версии 2,0 по стандартному уравнению для сигмоидных зависимостей вида

где R соответствует релаксации сосуда при концентрации комплекса с, R_max соответствует максимальной релаксации под действием того же вещества, а n представляет собой виртуальный коэффициент кооперативности, варьировавший в пределах от 1,1 до 1,8. Достоверность подбора параметров (n и IC50) контролировали по методу наименьших квадратов и она составляла не менее 95-97%. Статистическую обработку результатов проводили по тесту Стьюдента (t). Результаты представлены в табл. 5.

Продукты настоящего изобретения вызывали уменьшение изометрического сокращения сосуда с интактным эндотелием в присутствии фенилэфрина. Согласно данным прототипа изучение известного комплекса включения НТГ в условиях in vitro, близких к вышеописанным, не проводилось. Для НТГ в указанных условиях значение IС₅₀ составило 5,3 нМ.

Пример 16. Гипотензивная активность новых инклюзионных комплексов.

Гипотензивную активность продуктов настоящего изобретения определяли в условиях in vivo у бодрствующих крыс линии Вистар средней массой 280 г известным способом. Для измерения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений и для введения препарата в кровоток за сутки до эксперимента животным имплантировали полиэтиленовые катетеры (марки РЕ-10, РЕ-50) в бедренную артерию и бедренную вену. Свободные концы катетеров выводили и закрепляли на голове. Операция проводилась под гексеналовым наркозом (150 мг/кг). Через сутки крысу брали в опыт. В ходе эксперимента регистрировали артериальное давление датчиком фирмы Stadham (США) с последующей регистрацией данных с помощью компьютера (программа Bioshell, факультет фундаментальной медицины, МГУ им. Ломоносова, Россия). Соединения вводили болюсно внутривенно в дозе 2,5 мг/кг в объеме 0,2 мл в 5% ДМСО. Во время всего эксперимента животные находились в состоянии бодрствования и могли свободно перемещаться по клетке. В течение часа животные свободно адаптировались к условиям эксперимента, а затем начинали регистрацию гемодинамических показателей, которая велась непрерывно в течение всего опыта.

Болюсное введение продуктов настоящего изобретения в использованных дозах вызывало быстрое понижение среднего артериального давления (АД) в течение ~ 5 сек, продолжавшееся в течение 6-20 сек (напр., 6-11 сек в случае компл. 1, 7-15 сек - компл. 2,6-9 сек компл. 4), а затем происходило быстрое восстановление исходных показателей. Аналогичный показатель для НТГ, использованного в качестве препарата сравнения, имел значение 22-47 сек. Частота сердечных сокращений (ЧСС) кратковременно незначительно повышалась только в пике падения артериального давления, а затем снижалась до исходного уровня. В контрольных экспериментах было установлено, что в тех же условиях исходные комплексообразующие вещества - β-ЦД, β-ГПЦД и ГК в дозах 20-140 мкг/кг не оказывали существенного влияния на АД и ЧСС.

Полученные результаты, представленные в табл. 6, показывают влияние болюсного внутривенного введения новых инклюзионных комплексов в дозах 20-140 мкг/кг на среднее артериальное давление (АД) у бодрствующих крыс.

Данные табл.6 показывают высокую эффективность сосудорасширяющего и гипотензивного действия новых инклюзионных комплексов при внутривенном введении.

Согласно данным прототипа влияние инклюзионного комплекса НТТ с β-ЦД на артериальное давление в условиях in vivo соответствовало аналогичному эффекту таблетированного НТГ, при этом сравнение фармакологического действия НТГ и его комплекса при другом способе введения (напр., внутривенной инъекции) не проводилось. Результаты исследований свидетельствуют о том, что NO-генерирующие соединения общей формулы 1 (напр., ДОГТТО) в составе новых инклюзионных комплексов проявляют более сильные гипотензивные свойства по сравнению с аналогичным действием НТГ и эффектом того же лиганда в свободном виде. Так, согласно данным, представленным в табл.6, в условиях эксперимента понижение среднего АД под действием комплекса 1, содержащего ДОПТО в дозе 40 мкг/кг, а также комплекса 2, содержащего ДОПТО в дозе 30 мкг/кг, приблизительно соответствовало изменениям значения данного параметра, вызываемым инъекциями НТГ и ДОПТО в дозах 120 мкг/кг и 100 мкг/кг соответственно. Таким образом, приведенные результаты, полученные в условиях in vivo, впервые показывают, что с помощью образования комплексов включения можно значительно повышать фармакологическую активность (в частности, усиливать гипотензивные свойства) NO-генерирующих соединений.

Пример 17. Ингибирование агрегации тромбоцитов человека под действием новых инклюзионных комплексов.

Влияние продуктов настоящего изобретения на агрегацию тромбоцитов человека изучали известным турбидиметрическим способом Борна. Для этого венозную кровь, взятую в 8 часов утра у здоровых доноров, центрифугировали при 450 g при комнатной температуре в пластиковой посуде в течение 10 мин, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия. Супернатант, то есть богатую тромбоцитами плазму, отбирали и центрифугировали при 650 g в течение 30 мин, получая бедную тромбоцитами плазму. Концентрацию тромбоцитов доводили в богатой тромбоцитами плазме до 2,5•10⁸ клеток/мл с помощью разведения бедной тромбоцитами плазмы и приливали полученную суспензию в кювету объемом 0,5 мл. Агрегацию индуцировали добавлением АДФ до концентрации 2-5 мкМ. Концентрацию АДФ подбирали в каждом эксперименте так, чтобы агрегация была обратимой и максимум приходился на 2 мин после добавления АДФ, не превышая 50%. Светорассеяние суспензии тромбоцитов измеряли с помощью агрегометра, разработанного в лаборатории биоорганической химии Биологического Факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (Россия). Изучаемые соединения добавляли до АДФ.

Продукты настоящего изобретения в концентрации 1-100 мкМ ингибировали агрегацию тромбоцитов, вызванную 12,5 мкМ АДФ. Например, значения концентраций, при которых достигается полумаксимальное ингибирование (IС₅₀), для комплексов 3,4 и 5 составляли 11,2, 6,3 и 0,9 мкМ соответственно. Согласно данным прототипа антиагрегантные свойства известного аналога (комплекса ГТН с β-ЦД) не исследовались. ГТН в вышеописанных условиях имел значение IC₅₀>100 мкМ. Значения IC₅₀ для исходных ДОПТО и ДЦФ составляли 6,3 и 2,9 мкМ соответственно.

Пример 18. Острая токсичность новых инклюзионных комплексов.

Острую токсичность продуктов настоящего изобретения определяли известным способом по ЛД₅₀ с использованием беспородных мышей обоего пола средней массой 21 г при комнатной температуре; стандартное питание и воду давали ad libitum в течение всего эксперимента; подвижность животных не ограничивали. Растворы соединений в ДМСО вводили с помощью стерильного шприца внутрибрюшинно. После инъекции за животными вели наблюдение в течение 48 часов; по истечении этого времени за мышами наблюдали дополнительно в течение 72 часов (ни одно из животных не погибло в течение дополнительного промежутка времени). Полученные результаты свидетельствуют о том, что значение ЛД₅₀ для комплексов 1-4 составляет ~ 300-500 мг/кг, для комплексов 5 и 6 ~150-300 мг/кг.

Известно, что острая токсичность комплексов включения в основном зависит от токсичности связанного лиганда ("гостя"), т. к. обычно используются комплексообразователи, имеющие высокое значение ЛД₅₀ (напр., ЛД₅₀ для β-ЦЦ и β-ЦДГП составляет >10000 мг/кг). Значения ЛД₅₀ для ДОПТО и ДЦФ, определенные вышеописанным способом, составляют ~100 и 50 мг/кг соответственно. Согласно известным данным аналогичный показатель для ГТН в близких условиях соответствует 7-9 мг/кг (Патент РФ 2086534 (С 07 С 203/04) 1994 г., табл. 2), что предполагает более высокую токсичность комплексов включения, полученных на его основе, по сравнению с продуктами настоящего изобретения.

Пример 19. Растворимость и стабильность новых инклюзионных комплексов.

Растворимость исследуемых продуктов в условиях эксперимента определяли следующим образом. Готовили исходный раствор вещества в ДМСО в концентрации 50 мМ. Затем 50 мМ растворы в ДМСО разводили деионизованной водой до концентраций 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 мкМ. К полученным растворам добавляли ДМСО до конечной концентрации 4%. Растворы, содержащие вещество в концентрации 100, 250, 500, 1000, 2000 мкМ, были отцентрифугированы при 14000 g в течение 15 мин. Супернатанты были осторожно отобраны и разведены для определения оптической плотности. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре Ultrospec при соответствующей длине волны (360 нм в случае комплексов ДОПТО, 272 нм в случае комплексов ДЦФ).

Результаты измерений показывают, что полученные продукты растворимы при всех концентрациях, использованных в эксперименте (25-2000 мкМ), при этом комплексы включения 1-4 обладают большей растворимостью, чем сам лиганд (ДОПТО). Полная растворимость ДОПТО в описанных условиях наблюдалась при концентрациях, не превышающих 625 мкМ.

Растворы новых инклюзионных комплексов в ДМСО были стабильны в течение 1 месяца при комнатной температуре при хранении в защищенном от света месте и в замороженном виде при -20^oС до 6 месяцев. 0,25 мМ водный раствор комплекса 1, содержащий 0,5% ДМСО, стабилен при комнатной температуре при хранении в защищенном от света месте при нейтральных или слабокислых значениях рН. Водные растворы продуктов настоящего изобретения нестабильны при слабощелочных и щелочных значениях рН (рН>9), на ярком свету и в присутствии тиолов. В сухом виде данные вещества высокоустойчивы при комнатной температуре при хранении в защищенном от света месте.

Пример 20. Раствор инклюзионного комплекса для инъекций.

Компоненты - мг
Активный компонент (комплекс) - 4
Этиловый спирт - 500
Вода для инъекций - До 1 мл
Пример 21. Раствор инклюзионного комплекса для инфузий (концентрат).

Компоненты - мг
Активный компонент (комплекс) - 25
Этиловый спирт - 350
Пропиленгликоль - 300
Вода для инъекций - До 1 мл
Пример 22. Желатиновые капсулы по 0,001 и 0,0005 г, содержащие инклюзионный комплекс в рафинированном подсолнечном масле.

Компоненты - мас.%/капсулу
Активный компонент (комплекс) - 5
Рафинированное подсолнечное масло - 95
Пример 23. Порошок инклюзионного комплекса, нанесенного на инертный носитель, для приготовления аэрозоля.

Компоненты - мас.%
Активный компонент (комплекс) - 2
Инертный носитель (лактоза) - 98
Вышеприведенные примеры 9-12, 13 и 14 показывают, что новые инклюзионные комплексы настоящего изобретения в присутствии тиолов являются эффективными донорами NO, а также генерируют его редоксформу (нитроксил), образуют нитрозотиолы и активируют рГЦ. Из примеров 15 и 16 следует вывод о том, что данные продукты обладают сильным спазмолитическим, сосудорасширяющим и быстрым гипотензивным действием, причем их фармакологический эффект в условиях in vivo (в пересчете на дозу связанного лиганда) превосходит аналогичное действие тринитроглицерина - лиганда, входящего в состав наиболее близкого известного аналога - своего комплекса с β-ЦД. Кроме того, описанные продукты, в отличие от НТГ, проявляют выраженные антиагрегантные свойства (пример 17).

Таким образом, новые комплексы включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида вышеуказанной общей формулы I с полициклическими производными глюкопиранозы вышеуказанной общей формулы II расширяют спектр доноров NO, активаторов рГЦ, высокоэффективных спазмолитических, сосудорасширяющих, гипотензивных средств быстрого действия и ингибиторов агрегации тромбоцитов, а фармацевтические композиции на основе данных продуктов предполагают возможность их применения в медицине.

Формула изобретения

1. Способ получения комплексов включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида с полициклическими производными глюкопиранозы, отличающийся тем, что производное 1,2,5-оксадиазол-2-оксида общей формулы I:

где R¹= R²= CN или вместе с соседними атомами углерода образуют аннелированный 3,6-бис(низший алкил)пиридазин-1,2-диоксидный цикл, вводят во взаимодействие с полициклическим производным глюкопиранозы общей формулы II

где если n= 1, то R³ - фрагмент 11-оксо-18β, 20β-олеан-12-ен-29-овой кислоты формулы III

R⁴=H;
R⁵-β-D-глюкуронопиранозил;
R⁶=R⁷=H;
R⁸=C(O)OH,
или, если n= 7, то R³= Н, R⁴ и R⁷ - простые связи, R⁵ и R⁶ = H или (CH₂CH(CH₃)O)_mH, где m=1-14, и R⁸=CH₂OH или СН₂О(CH₂CH(CH₃)O)_mH, где m=1-14, в водно-органической среде при повышенной температуре с последующим выделением целевого продукта, его промыванием малополярным инертным органическим растворителем или их смесью и высушиванием при пониженном давлении.

2. Комплексы включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида вышеуказанной общей формулы I, где R¹=R²=CN или вместе с соседними атомами углерода образуют аннелированный 3,6-бис(низший алкил)пиридазин-1,2-диоксидный цикл, с полициклическими производными глюкопиранозы вышеуказанной общей формулы II, где, если n=1, то R³ -фрагмент 11-оксо-18β, 20β-олеан-12-ен-29-овой кислоты вышеуказанной формулы III, R⁴= H, R⁵ -β-D-глюкуронопиранозил, R⁶=R⁷=H и R⁸= C(O)OH, или, если n=7, то R³=H, R⁴ и R⁷ - простые связи, R⁵ и R⁶ = H или (CH₂CH(CH₃)O)_mH, где m= 1-14, и R⁸=CH₂OH или СН₂О(CH₂CH(CH₃)O)_mH, где m=1-14, полученные по п.1, генерирующие оксид азота и активирующие растворимую форму гуанилатциклазы, как спазмолитические, сосудорасширяющие и гипотензивные средства быстрого действия и ингибиторы агрегации тромбоцитов.

3. Комплексы включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида по п.1 вышеуказанной общей формулы I, где R¹=R²=CN или вместе с соседними атомами углерода образуют аннелированный 3,6-бис(низший алкил)пиридазин-1,2-диоксидный цикл, с полициклическими производными глюкопиранозы вышеуказанной общей формулы II, где, если n= 1, то R³ - фрагмент 11-оксо-18β, 20β-олеан-12-ен-29-овой кислоты вышеуказанной формулы III, R⁴=H, R⁵-β-D-глюкуронопиранозил, R⁶= R⁷= H и R⁸=C(О)ОН,н или если n=7, то R³=H, R⁴ и R⁷ - простые связи, R⁵ и R⁶=H или (СН₂-СН(СН₃)О)_mH, где m=1-14, и R⁸=СН₂ОН или СН₂О(СН₂-СН(СН₃)О_mH, где m= 1-14, полученные по п.1, предотвращающие и купирующие приступы стенокардии, острый инфаркт миокарда, нарушения, вызванные спазмами гладких мышц.

4. Фармацевтическая композиция, генерирующая оксид азота, активирующая растворимую форму гуанилатциклазы и обладающая спазмолитическим, сосудорасширяющим и гипотензивным действием, содержащая активный компонент и добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента используются комплексы включения производных 1,2,5-оксадиазол-2-оксида вышеуказанной общей формулы I, где R¹=R²=CN или вместе с соседними атомами углерода образуют аннелированный 3,6-бис(низший алкил)пиридазин-1,2-диоксидный цикл, с полициклическими производными глюкопиранозы вышеуказанной общей формулы II, где, если n=1, то R³ - фрагмент 11-оксо-18β, 20β-олеан-12-ен-29-овой кислоты вышеуказанной формулы III, R⁴=H, R⁵ - β-D-глюкуронопиранозил, R⁶=R⁷=H и R⁸= C(O)OH, или, если n= 7, то R³=H, R⁴ и R⁷ - простые связи, R⁵ и R⁶=H или (CH₂CH(CH₃)O)_mH, где m=1-14, и R⁸=CH₂OH или CH₂O(CH₂CH(CH₃)O)_mH, где m=1-14, полученные по п.1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10