Неинфекционный мутированный вирус синдбис e1-ser62 и днк, кодирующая его

 

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано при производстве вакцин. Получен неинфекционный мутированный вирус Синдбис (Синдбис E1-SER⁶²), в котором в белке Е1 в положении 62 консервативная аминокислота цистеин заменена серином. Данная мутация находится в домене вирусного белка, ответственного за тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность. Фрагмент рекомбинантной ДНК, представляющей собой последовательность мутированного неинфекционного вируса Синдбис, встроен в плазмиду, которую амплифицируют в E.coli., и полученной в результате РНК трансфецируют клетки млекопитающих. Последние продуцируют вышеописанный вирус. Изобретение обеспечивает безопасность вирусов, используемых в качестве вакцин. 2 с.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.

Изобретение относится к области вирусологии, иммунологии и химии белков. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым противовирусным средствам и новым способам получения вакцин.

Описание предшествующего уровня техники Вирусы представляют собой сложные трехмерные структуры, которые служат в качестве систем переноса генетического материала. Вирусы содержат РНК- или ДНК-геном, "упакованный" в оболочку, состоящую из белка или комбинации белков, ассоциированных с липидсодержащим мембранным бислоем.

Для воспроизведения вируса в природе вирусный геном реплицируется в соответствующей клетке-хозяине путем разрушения биохимического аппарата этой клетки. Такой процесс инфицирования часто приводит к гибели клетки-хозяина и проявляется, в целом, как заболевание хозяина, растения или животного. Результатом процесса инфицирования является высвобождение из инфицированной клетки или ткани от сотен до тысяч новых дочерних вирусных частиц, способных инфицировать другие клетки или ткани хозяина. Генетический материал клетки защищен от деструктивного воздействия внешних агентов посредством окружающей его оболочки. Однако, хотя эта оболочка и должна препятствовать деградации вирусного генома под действием факторов окружающей среды, она, тем не менее, должна также подвергаться дезинтеграции для высвобождения генетического материала вируса при его инфицировании клетки-хозяина.

До настоящего времени не было разработано сколько-нибудь эффективных способов ингибирования распространения определенных вирусов. Кроме того, до сих пор не было также получено эффективного способа обеспечения безопасности вирусов, используемых в качестве вакцин. Поэтому настоящее изобретение позволяет разрешить проблемы, с которыми долгое время сталкивались исследователи в этой области.

Краткое описание изобретения В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к композиции, рассматриваемой в нижеприведенной заявке, и содержащей неинфекционный мутированный вирус, который может быть использован для получения вакцины.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантной плазмиде, адаптированной для экспрессии в клетках млекопитающих и содержащей ДНК, кодирующую неинфекционный мутированный вирус, а также регуляторные элементы, необходимые для экспрессии этой ДНК в клетке.

В следующем варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к вирус-ассоциированной тиолредуктазной/протеинизомеразной активности.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования распространения вирусной инфекции, включающему в себя стадию контактирования указанного вируса с соединением, которое ингибирует тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность в этом вирусе.

В еще одном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к противовирусному средству, ингибирующему распространение вирусной инфекции, где указанное противовирусное средство ингибирует тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразнуго активность в этом вирусе.

Эти и другие аспекты, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения очевидны из нижеследующего описания предпочтительных вариантов его осуществления, приведенных в целях раскрытия изобретения.

Краткое описание чертежей Для лучшего понимания существа изобретения, а также его отличительных признаков, целей и преимуществ ниже приводится более подробное описание изобретения, кратко изложенное выше и проиллюстрированное прилагаемыми чертежами. Эти чертежи являются частью настоящего описания. Однако, при этом, следует отметить, что прилагаемые рисунки лишь иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и не должны рассматриваться как некое ограничение его объема.

На фиг. 1 проиллюстрирована одна стадия слияния извне (FFWO) в клетках ВНК при рН 5,3 в присутствии 2-меркал-тоэтанола (2-МЕ). Комплексы "вирус-клетка" подвергали воздействию среды для слияния (при низком рН), содержащей различные концентрации восстановителя 2-МЕ, как описано ниже. Слияние оценивали в соответствии с нижеприведенным описанием.

На фиг. 2 проиллюстрирована зависимость множественности заражения (M01) от двухстадийного FFWO в клетках ВНК, обработанных 2-МЕ. Комплексы "вирус-клетка" обрабатывали средой для слияния с низким рН, содержащей 0,05 нМ 2-МЕ (квадраты) и не содержащей 2-МЕ (треугольники), в течение 5 минут, после чего среду доводили до нейтрального рН и оценивали на слияние, как описано ниже.

На фиг. 3 проиллюстрировано прямое действие DTNB на инфекционность вируса Синдбис. Вирус подвергали воздействию 1 мМ DTNB в течение различных периодов времени, а оставшийся инфекционный вирус титровали на монослоях ВНК. Концентрацию инфекционного вируса выражали как процентное содержание от необработанного контроля.

На фиг. 4 показаны конформационные изменения в Е1 в процессе трансмембранного проникновения вируса Синдбис и слияние мембран (вирусной и клеточной), индуцированное низким рН. Как видно из фиг. 4А, гликопротеин в зрелом вирионе имеет функциональный и структурный домены, которые ответственны за слияние мембран и целостность оболочки соответственно. На фиг. 4В показано, что конформационные изменения, индуцированные взаимодействием рецептор-вирус или экспонированием средой с низким рН, демаскируют критические дисульфидные мостики, способствуя тем самым перестановке дисульфидных мостиков.

На фиг. 4С показано, что восстановление критических дисульфидных мостиков, ответственное за поддержание белок-белковых ассоциаций оболочки, разрушает жесткую икасаэдрическую решетку белка, что приводит к последующему слиянию оболочки с клеточной мембраной (черные квадратики обозначают пептид слияния).

На фиг. 5 показан мутант El-ser⁶² вируса Синдбис. Клетки были помечены ³⁵S-метионином/цистеина через 5 ч после инфицирования, и вытеснение метки проводят через 0 (дорожка 1), 5 (дорожка 2), 10 (дорожка 3), 20 (дорожка 4) мин в присутствии циклогексимида. Клеточный лизат подвергали иммунопреципитации с использованием антисыворотки, продуцированной против очищенного вируса. Ser⁶² продуцирует вирусные белки PE1, E1, E2 и С, и белок РЕ2 превращается в Е2. На электронной микрофотографии изображены вирионы, концентрированные из среды трансфецированных клеток, и очищенные путем центрифугирования в градиенте плотности. Содержание белков радиоактивного мутантного вируса показано на дорожке 5.

На фиг. 6 проиллюстрировано действие тиол-блокирущего агента DTNB на инфицирование клеток моделью коронавируса, вирусом мышиного гепатита (MHV).

Подробное описание изобретения В настоящем изобретении с использованием мембраносодержащего вируса Синдбис (прототип альфа-вирусов) было показано, что этот вирус имеет в качестве компонента одного из своих двух гликопротеинов, ассоциированных с мембраной-оболочкой, белковый домен, который, по своей структуре и функции, гомологичен белкам, имеющим известную тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность. Настоящее изобретение также показало, что модель коронавируса (вирус мышиного гепатита) имеет такой же механизм инфицирования, как и вышеописанный вирус Синдбис, и что этот механизм используется другими вирусами для инфицирования клеток.

Поверхностные белки многих вирусов животных содержат комплексные дисульфидные мостики, которые могут стабилизировать частицы и которые должны разрушаться для того, чтобы происходил процесс инфицирования и высвобождения вирусного генома. С помощью настоящего изобретения был идентифицирован механизм, который объясняет основной процесс, протекающий при инфицировании хозяина вирусом. Полученные уникальные и ранее не описанные данные иллюстрируют новую стратегию борьбы с вирусными инфекциями и новые способы получения вакцин.

Настоящее изобретение показало, что сам вирус обладает способностью восстанавливать свои дисульфидные мостики после связывания с соответствующим рецептором клетки-хозяина. Взаимодействие вирусного структурного белка с рецептором хозяина инициирует конформационные изменения в вирусном белке, стимулируя тем самым явление восстановления.

Настоящее изобретение показало, что тиол-дисульфидный обмен имеет решающее значение для инфицирования клеток альфа- и коронавирусов. В случае альфа-вирусов, такое восстановление осуществляет посредством тиолредуктазной/дисульфидизомеразной активности, присутствующей в самом вирусе. Многие вирусы (включая ВИЧ) содержат дисульфидные мостики, которые, как было показано, играют важную роль в структуре и сборке вируса. От этих дисульфидных мостиков зависит структурная целостность вируса, и для осуществления процесса инфицирования хозяина указанные дисульфидные мостики должны быть разрушены. В настоящем изобретении предлагается новый способ получения неинфекционного вируса, который может быть использован в качестве вакцины, а именно, получение мутантного вируса. По сравнению с другими вакцинами мутантные вирусы настоящего изобретения имеют то преимущество, что они не требуют инактивации путем химической или физической обработки. Поэтому они представляются иммунной системе антигенами, которые являются более идентичными антигенам, присутствующим в инфекционном вирионе. В настоящей заявке также описаны способы идентификации химических соединений, которые способны ингибировать эндогенную тиолредуктазную активность и которые тем самым могут служить в качестве лекарственного средства, предотвращающего распространение вирусной инфекции. Вирус-ассоциированная тиолредуктаза является гомологичной известным ферментам этого типа. Таким образом, соединения, обладающие способностью блокировать действие одного из этих ферментов в одном вирусе, будут блокировать активность такого фермента в других вирусах.

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей неинфекционный мутированный вирус, который может быть использован для получения вакцины. Таким вирусом является, в основном, мутированный вирус, полученный путем замещения консервативной цисетиновой аминокислоты другой аминокислотой. При этом следует отметить, что в способах и композициях настоящего изобретения цистеин может быть замещен лишь очень небольшим числом аминокислот. Так, например, в композициях настоящего изобретения конкретная цистеиновая аминокислота замещается серином. Для создания мутантных вирусов настоящего изобретения предпочтительно, чтобы замещаемыми аминокислотами были консервативные цистеины, которые находятся в домене вирусного белка, ответственного за тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность.

В способах настоящего изобретения для получения нужной композиции может быть использован любой известный вирус. Мутированным вирусом является предпочтительно мутант вируса, выбранного из группы альфа-вирусов и коронавирусов. Характерным представителем альфа-вирусов является вирус Синдбис, а характерным представителем коронавируса является вирус мышиного гепатита. Характерным примером мутированного вируса Синдбис является мутант El-Ser⁶².

Настоящее изобретение относится к новым плазмидам адаптированным для экспрессии в клетках, и содержащим рекомбинантную ДНК, кодирующую неинфекционный мутированный вирус и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии указанной ДНК в этих клетках. Плазмиды настоящего изобретения могут быть адаптированы для экспрессии в бактериальных клетках, дрожжевых клетках, клетках насекомых или клетках млекопитающих. Типичными примерами дрожжей являются Saccaromyces, Pichia и Kluyveromyces. Типичными примерами бактериальных клеток являются E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. Типичными примерами клеток млекопитающих являются клетки BHK-21, Vero, Hela и клетки яичника китайского хомячка (CНО).

Плазмида настоящего изобретения содержит мутированный вирус настоящего изобретения. Таким вирусом является, предпочтительно, альфа-вирус или коронавирус. В качестве типичного примера мутированного альфа-вируса может служить мутированный вирус Синдбис. Конкретным характерным примером мутированного вируса Сандбис является мутант El-Ser⁶².

Настоящее изобретение также относится к новым трансфепированным клеткам. Характерными примерами трансфецированных клеток являются трансфецированные клетки, содержащие плазмиду, определенную в п.5 формулы изобретения, и трансфецированные клетки, содержащие плазмиду, определенную в п.12 формулы изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к неинфекционным мутированным вирусам, продуцированным трансфецированными клетками настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования распространения вирусной инфекции, включающему в себя стадию контактирования указанного вируса с соединением, ингибирующим тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность в указанном вирусе. В настоящем описании также рассматривается противовирусное средство, ингибирующее распространение вирусной инфекции, а в частности, ингибирующее тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность в указанном вирусе. В соответствии с описанием настоящего изобретения любой средний специалист может легко получить дополнительные соединения, ингибирующие тиолредуктазную/протеиндисульфидизомеразную активность в соответствующем вирусе.

Нижеследующие примеры приводятся в целях иллюстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должны рассматриваться как некое ограничение его объема.

Пример 1. Клетки, вирусы и среды Клетки BHK-21 культивировали при 37^oС в минимальной поддерживающей среде Игла (МЕМ), в которую были добавлены 10% фетальной телячьей сыворотки (GIBCO), бульон с 5% триптозофосфатом, и 2 мМ L-глутамина. Теплоустойчивый вирус Синдбис (SHVR), первоначально полученный E. Pfeffer-korn (Darmouth Medical College) пассировали при низкой множественности, а затем титровали на клетках BHK-21, как описано Renz и Brown (J. Virol. 19: 775-781 (1976)).

Пример 2. Слияние извне (FFWO), опосредованное вирусом Синдбис Вариации опосредованного вирусом Синдбис FFWO получали при 1000 БОЕ SVHR на клетку для монослоев ВНК при 4^oС в течение 60 минут. Затем вирусный инокулят заменяли средой для слияния (37^oC), состоящей из минимальной поддерживающей среды (МЕМ) Игла без бикарбоната, 10 мМ ME [2(N-морфолино)этансульфоновой кислоты] и 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты) (рН 5, 3) в отсутствии или в присутствии различных концентраций меркаптоэтанола (2-МЕ). После 5-часового инкубирования при 37^oС слияние оценивали с помощью фазово-контрастного микроскопа по следующей шкале: - слияние отсутствует; + наблюдается менее, чем 25% слитых клеток; ++ имеет место 25% слитых клеток (короче говоря, FFWO при низком рН было индуцировано при адсорбции до 50% слитых клеток); +++ означает 50-95% слитых клеток; ++++ означает более чем 95% слитых клеток. Степень слияния вычисляли по формуле 1-(число клеток/число ядер). FFWO в две рН-стадии индуцировали, как описано выше, за исключением того, что использовали различные множественности заражения SVHR, а среда для слияния содержала 0.05 нМ 2-МЕ. После 5-минутного инкубирования в среде для слияния с низким рН комплексы "вирус-клетка" возвращали в ростовую среду. После 1-часового инкубирования при 37^oС монослои были сфотографированы при фазово-контрастном освещении и оценены, как описано выше.

Пример 3. Лекарственные средства DTNB солюбилизировали в бессывороточной среде МЕМ. Как показал анализ, проведенный путем включения [³Н] уридина в ТСА-осажденную РНК (ТСА-трихлоруксусная кислота), с последующим его вытеснением трипановым синим или поглощением нейтрального красного, DTNB при концентрациях вплоть до 5 мМ не оказывает какого-либо заметного воздействия на жизнеспособность клетки. Прямое действие DTNB на инфекционность вируса Синдбис определяли путем инкубирования этого реагента с вирусом в течение различных интервалов времени, с последующим прекращением инкубирования путем серийного разведения в фосфатно-буферном солевом растворе, содержащем 3% детальную телячью сыворотку, и титрования на клетках ВНК стандартным методом бляшек, как описано Renz и Brown, J. Virol. 19: 775-781 (1976).

Пример 4. Анализ на проникновение вируса Синтез вирусной РНК оценивали путем определения включения [³H] уридина в ТСА-осажденный материал в клетках ВНК, обработанных за 90 мин до инфицирования 4 микрограммами дактиномицина на 1 мл и выдерживаемых все это время в дактиномицине. Монослои равного числа клеток ВНК обрабатывали 1 мМ DTNB в течение 30 мин при 37^oС в трех различных временных вариантах по отношению к 1-часовой адсорбции 5 БОЕ SVHR на клетку при 4^oС. После адсорбции все монослои промывали бессывороточной МЕМ и инкубировали при 37^oС для осуществления проникновения адсорбированного вируса. 30-минутную DTNB-обработку проводили либо непосредственно до адсорбции, либо в процессе проникновения вируса при 37^oС, либо сразу после периода проникновения. После DTNB-обработки монослои промывали. Через 90 мин после периода проникновения, добавляли [³H] уридин (10 мкКи/мл), и через 5 ч монослои подвергали лизису путем добавления додецилсульфата натрия и преципитации с использованием 10%-ной охлажденной льдом ТСА, после чего подсчитывали радиоактивность. Проникновение вируса оценивали по образованию бляшек на монослоях ВНК, которые были экспонированы 1 мМ DTNB в течение 60 мин в условиях обработки, описанных выше. Образование бляшек оценивали, как описано выше Renz и Brown, J. Virol. 19: 775-781 (1976).

Пример 5. FFWO при низком рН Скорость FFWO, опосредованного вирусом Синдбис, зависит от рН среды, в которую возвращают клетки после их экспонирования средой С низким рН (Edwards & Brown, J. Cen, Virol., 67: 377-380 (1966)). Слияние протекает тем быстрее, чем выше значения рН, и не происходит при пороговом низком рН 5,3, а поэтому для создания условий для слияния необходимо возвращение в нейтральную среду. Аналогичным образом реакции тиолдисульфидного обмена являются рН-зависимыми, то есть, рН непосредственно влияет на скорость реакции, являющейся эффективной лишь в нейтральных или щелочных условиях, как было показано Fееner и др. (J. Biol. Chem. 265: 18780-18785 (1990)). В случае, если восстановление критических вирусных дисульфидных мостиков необходимо для разрушения ригидной решетчатой структуры оболочки белка перед осуществлением слияния мембран, то это слияние может быть блокировано при низком рН.

Для иллюстрации роли указанного явления восстановления в SV - опосредованном (SV-вирус Синдбис) FFWO клеток ВНК была сделана попытка осуществления слияния при низком рН в присутствии восстановителя 2-МЕ. В отличие от DTT и цистеина, 2-МЕ является эффективным восстановителем при рН 5,0 и выше (Torchinskii, Sulfhydryl and Disulfide Groups of Proteins, Plenum Publishing, N.Y. 1974). Было обнаружено, что обработка 2-МЕ в различных концентрациях широкого диапазона индуцирует FFWO при рН 5,3, хотя этот диапазон концентраций варьировался. 2-МЕ-индуцированное слияние при низком рН является высокочувствительным к ряду факторов, включая число пассажей клеток, и степень конфлюэнтности монослоев, которые не играют решающей роли в процессах слияния после возвращения в среду с нейтральным рН. Обработка монослоев восстановителем 2-МE в отсутствии вируса и инкубирование комплексов "вирус-клетка" при рН 5,3 в отсутствии 2-МЕ не индуцировали слияния. Тот факт, что для индуцирования FFWO требуются исключительно небольшие концентрации восстановителя, позволяет предположить, что восстановленные нужные дисульфидные мостики являются в высокой степени растянутыми. Высокие концентрации 2-МЕ не стимулируют слияния, возможно, из-за того, что вирусная оболочка разрушается перед тем, как происходит слияние. Описанное SV-опосредованное-FFWO, происходящее при низком рН и в присутствии низких концентраций 2-МЕ, обусловлено восстановлением нужных вирусных дисульфидных мостиков, играющих важную роль для слияния клетки с вирусом. Кроме того, это явление может объяснить необходимость для FFWO возвращения в среду с нейтральным рН.

Пример 6. Влияние 2-МЕ на множественность заражения, необходимую для FFWO
2-МЕ-индуцирование слияния при низком рН означает, что эффективность индуцируемого вирусом Синдбис (SV) FFWO зависит от события восстановления.

На фиг. 2 показано влияние 2-МE на множественность заражения, требуемую для типичного SV-опосредованного FFWO. Восстановитель, в случае, если он присутствует в течение кратковременного экспонирования комплекса "вирус-клетка" средой с низким рН, проводимого в процессе FFWO, повышает эффективность слияния после возвращения в среду с нейтральным рН. Оптимальное слияние в 2-МЕ-обработанных монослоях получали уже при множественности заражения 100 БОЕ/кл., тогда как при отсутствии 2-МЕ-обработки обычно требовалась множественность заражения от 500 до 100 БОЕ/кл.

Требование высокой множественности заражения для FFWO должно частично коррелировать с частотой, с которой прикрепляющиеся вирионы образуют множественные контакты с клетками, то есть, это требование должно коррелировать со стерическими возможностями для осуществления слияния "клетка-вирус-клетка". Если осуществление такого слияния зависит от тиолдисульфидной реакции обмена, то требование высокой множественности заражения может также коррелировать с частотой, с которой нужные вирусные дисульфидные мостики ассоциируются с соответствующими тиоловыми донорами. Увеличение доступности тиолов, обусловленное введением экзогенного восстановителя 2-МЕ, должно приводить к снижению числа вирионов, требуемых для продуцирования максимального уровня слияния клеток. Этот вывод подтверждается тем, что для максимального слияния после кратковременной обработки 2-МЕ требуется более низкая множественность заражения.

Пример 7. Тиолдисульфидные обменные реакции, протекающие во время проникновения вируса Синдбис в клетки ВНК.

Настоящее изобретение показало, что для слияния мембран во время проникновения вируса требуется восстановление дисульфидных мостиковых связей в ригидной решетке белка оболочки. DTNB является мембранонепроницаемым сульфгидрил-блокирующим реагентом, который ковалентно модифицирует сульфгидрил посредством тиолдисульфидной обменной реакции. Поскольку этот реагент не оказывает непосредственного воздействия на инфекционность вируса Синдбис (фиг. 3) или на жизнеспособность клеток ВНК, то DTNB представляет собой наилучший реагент для иллюстрации тиолдисульфидных обменных реакций, происходящих в плазматической мембране во время проникновения вируса Синдбис.

Пример 8. Влияние DTNB на проникновение вируса
Влияние DTNB на проникновение вируса при низкой множественности инфекции оценивали путем введения [³H] на в вирусную РНК при тех условиях обработки, как описано в примере 4 и табл. 1. В присутствии дактиномицина клетки ВНК обрабатывали в течение 30 мин 1 мМ DTNB, либо до адсорбции вируса при 4^oС, либо во время проникновения вируса при 37^oС, либо сразу после проникновения вируса. В каждом случае, через 5 ч после периода проникновения, вирусную РНК исследовали путем измерения включения [³H] уридина в ТСА-осажденный материал. DTNB-oбpaбoткa клеток до инфицирования оказывала незначительное ингибирующее действие на синтез вирусной РНК, а обработка во время проникновения вируса ингибировала продуцирование РНК приблизительно на 40% от контрольных уровней. Снижение синтеза РНК, наблюдаемое при обработке до инфицирования, вероятно, обусловлено невозможностью удаления всего лекарственного средства до инфицирования. DTNB-обработка после начального периода проникновения имела ограниченное ингибирующее действие. Однако подавление синтеза РНК после этой обработки может быть обусловлено тем фактом, что инфицирование вирусом Синдбис увеличивает проницаемость клеток, открывая тем самым некоторым мембранонепроницаемым реагентам прямой доступ к цитоплазме, где они могут оказывать вторичное действие.

Действие DTNB на проникновение вируса Синдбис было также определено путем оценки образования бляшек, как показано в табл. 1. В экспериментах, проиллюстрированных в табл. 1, вирус был адсорбирован на равное число клеток ВНК в течение одного часа при 4^oС, где указанные клетки помещали в теплую среду МЕМ и инкубировали при 37^oС для осуществления проникновения вируса. Клетки обрабатывали в течение 30 мин (А) или 60 мин (В) 1 мМ DTNB в указанное выше время. Затем монослои промывали для удаления лекарственного средства, после чего снова инкубировали при 37^oС в среде, не содержащей DTNB. Результаты выражали как средние значения по пяти независимым экспериментам ± среднеквадратическое отклонение. Через 5 ч после нагревания клеток до 37^oС для инициации проникновения вируса проводили анализ на полную вирусную РНК. Монослои покрывали агарозой и окрашивали нейтральным красным через 48 ч после инфицирования.

Предварительная обработка клеток DTNB приводит к слабому ингибированию образования бляшек, а обработка клеток в период инфицирования ингибирует образование бляшек приблизительно на 46% от уровня необработанного контроля. Аналогично указанному выше, снижение образования бляшек, наблюдаемое в случае DTNB-обработки монослоев до осуществления инфицирования, вероятно, обусловлено невозможностью удалить весь реагент до инфицирования. DTNB-обработка после инфицирования не оказывала ингибирующего действия на образование бляшек, что свидетельствует о том, что подавление уровней РНК путем DTNB-обработки после инфицирования не является результатом прямого воздействия DTNB на проникновение вируса. Хотя это и парадоксально, но немного большее число бляшек, обнаруженных в клеточных культурах, обработанных после инфицирования, оказалось в высокой степени репродуцируемыми.

Интересно отметить, что проникновение вируса Синдбис наиболее эффективно ингибируется DTNB в том случае, когда этот реагент присутствует во время инфицирования, что дает основание предположить, что тиоловые группы-мишени являются демаскированными во время проникновения несмотря на кооперативное взаимодействие между вирусом и его рецептором. Такое кооперативное и быстрое взаимодействие может создавать условия, при которых DTNB не может эффективно конкурировать с вирусным дисульфидным мостиком, подвергаясь тиолдисульфидной обменной реакции. Эта реакция протекает с большой скоростью, около 10⁴с при рН 8,0, и неэффективность алкилирования критических тиолов должна приводить к неспособности полностью блокировать проникновение вируса Синдбис.

На фиг. 4 проиллюстрированы конформационные изменения в EI во время проникновения вируса Синдбис и слияния мембран, индуцированного низким рН. Как показано на фиг. 4А, гликопротеин в зрелом вирионе имеет функциональный и структурный домены, которые ответственны за слияние мембран и целостность оболочки соответственно. На фиг. 4В можно видеть, что конформационные изменения, индуцированные взаимодействием "рецептор-вирус" или экспонированием низким рН, демаскируют критические дисульфидные мостики, что способствует тем самым перестановке дисульфидных мостиков. На фиг. 4С показано, что восстановление критических дисульфидных мостиков, ответственное за поддержание белок-белковых ассоциаций, разрушает ригидную икосаэдрическую решетку белка, что приводит к последующему слиянию оболочки с клеточной мембраной. На фиг. 4 черные квадратики обозначают EI-EI-ассоциацию, а заштрихованные квадратики обозначают пептид слияния.

Слияние вирусов в оболочке с клеточными мембранами во время проникновения вируса является белок-опосредованным, как и внутриклеточное и межклеточное слияния. Присутствие домена слияния в оболочечном белке EI ответственно за слияние альфа-вирусов с клеточной мембраной. Кроме того, в настоящем изобретении показано, что стабилизированные дисульфидными мостиками EI-EI-ассоциации оболочки должны быть разрушены для того, чтобы произошло слияние мембран. Наиболее вероятным механизмом разборки оболочки вируса Синдбис после белок-белковых взаимодействий в процессе проникновения вируса является восстановление указанных стабилизирующих дисульфидных мостиков посредством реакций тиолдисульфидного обмена.

Тиолдисульфидная обменная реакция происходит посредством нуклеофильной атаки ионизированного тиола на дисульфидном мостике и является в высокой степени зависимой от рН среды, рКа тиола и стерического препятствия. Поэтому цистеин-опосредованные тиолдисульфид-обменные реакции требуют нейтрального или щелочного рН. FFWO, опосредованное штаммом HP вируса Синдбис, требует экспонирования средой с рН 5,3 и последующего возвращения, для индуцирования слияния в среду с рН, превышающим 6. Скорость слияния возрастает по мере возрастания рН среды, в которую возвращаются комплексы "вирус-клетка", при этом слияния не происходит, если рН ниже порогового значения, необходимого для осуществления слияния. Аналогичным образом для быстрой "разборки" вирусной оболочки с помощью DTT также требуется кратковременное присутствие в среде с рН 5,3 и последующее возвращение в среду с нейтральным рН. Эти наблюдения показали, что среда с нейтральным рН играет определенную роль в тиолдисульфид-обменных реакциях. В соответствии с настоящим изобретением было проиллюстрировано, что указанные реакции тиолдисульфидного обмена играют важную роль в процессе слияния вируса с клеткой.

Процесс FFWO, опосредованного низким рН, отличается от процесса инфицирования тем, что он требует высокой множественности вируса и не зависит от рецептора белка. Однако оба эти процесса должны обеспечивать механизм разрушения решетки оболочечного белка перед стадией слияния.

Настоящее изобретение показало, что оба эти процесса равным образом зависят от тиолдисульфидных обменных реакций. Добавление очень небольших концентраций восстановителя 2-МE (который, в отличие от DTT и биологических тиолов, осуществляет эффективное восстановление при рН 5,3) стимулирует слияние клеток в кислой среде, позволяя тем самым предположить, что химическое восстановление нужных дисульфидных мостиковых связей может индуцировать слияние в каких-либо других неблагоприятных условиях восстановления. Тот факт, что для стимуляции такого слияния требуются чрезвычайно низкие концентрации 2-МЕ, означает, что критические дисульфидные мостики, подвергаемые восстановлению, имеют очень вытянутую конформацию. Индуцированные низким рН конформационные изменения в оболочечных белках могут быть ответственны за формирование таких вытянутых критических дисульфидных мостиков и могут служить объяснением очень быстрой природы DTT-опосредованной in vitro "разборки" вируса после воздействия среды с низким рН.

Процесс проникновения вируса Синдбис в клетку-хозяина является рецептор-зависимым, и в этой связи было идентифицировано несколько потенциальных рецепторов. Взаимодействие вируса с рецептором клеточной поверхности при нейтральном рН индуцирует конформационные изменения в вирусном гликопротеине, которые предшествуют стадии проникновения вируса.

Настоящее изобретение показало, что кооперативные взаимодействия между рецептором и вирусом индуцируют конформационные изменения, которые способствуют восстановлению нужных дисульфидных мостиков в белках оболочки посредством реакций тиолдисульфидного обмена. Процессы, развивающиеся от момента возникновения рецептор-индуцированных конфармационных изменений до разрушения решетчатой структуры оболочечного белка и слияния, происходят, по всей вероятности, очень быстро. Тот факт, что стабилизирующие дисульфидные мостики и критические тиолы являются недоступными для таких молекул, как DTT и DTNB даже в естественном состоянии, наряду с исключительно высокой скоростью, с которой протекает процесс восстановления после рецептор-индуцированных конформационных изменений, может служить объяснением неэффективности DTNB в блокировании указанного процесса. Тиолы, опосредующие процессы восстановления, могут присутствовать либо в белке рецептора, либо в самом вирусе. В последнем случае перестановка дисульфидных мостиков после связывания может приводить к требуемому разрушению решетки оболочечного белка. В этой модели взаимодействие вируса с соответствующим рецептором приводит к изменению конформации EI, способствуя тем самым перестановке дисульфидных мостиков посредством тиолдисульфидных обменных реакций. Такая перестановка дисульфидных мостиков приводит к разрушению жестких белок-белковых ассоциаций в оболочке, способствуя тем самым последующему слиянию вирусной оболочки с плазматической мембраной.

Пример 9. Продуцирование мутанта Еl-Ser⁶²
Данные о структуре белков, обладающих известной тиолредуктазной/протеиндисульфидизомеразной активностью, получали из Gene Bank. Хотя в функциональных доменах этих белков не имеется абсолютно консервативных аминокислотных последовательностей, однако в домене белка, содержащем положительно заряженные основные аминокислоты, неизменно присутствует "донорный" цистеин. Действительно, тиолредуктазная активность в этих белках может быть увеличена путем увеличения суммарного положительного заряда этого домена. Были исследованы все аминокислотные последовательности гликопротеинов EI всех известных альфа-вирусов. Благодаря этому исследованию были выявлены два цистеина (62 и 79), которые являются консервативными и находятся в типичных положительно заряженных доменах с известной тиолредуктазной активностью. Таким образом мутация с удалением одного из этих цистеинов приведет к потере инфекционности этим вирусом благодаря элиминации тиолредуктазной активности, ассоциированной с этим доменом.

Мутацию путем замены цистеина на серин в положении 62 в последовательности гликопротеина EI вируса Синдбис получали посредством РСR-мутагенеза с использованием мегапраймера, как описано Liu и Brown (J. Gell.Biol., 120: 877-883 (1993). Эти праймеры, представляющие последовательности 9760-9779 (праймер А) и нуклеотиды 10445-10436 (праймер В) в нуклеотидной последовательности Toto 1101 вируса Синдбис, конструировали как "концевые праймеры".

Праймер А = 5' -CGАTGATGATTGGCGTAACT-3' (SEQ ID NO:1)
Праймер В = 5' -CGAAAAATCAAATCCTGCGGCTCC-3' (SEQ ID NO:2)
"Мутантный праймер" с заменой основания G на С состоял из нулеотидов 10236-10259:
5' -CCAAAAATCAAATCCTGC-3' (SEQ ID NO:3)
G (дикого типа).

Мегапраймер конструировали путем присоединения мутантного праймера и праймера В к матрице Toto, в результате чего получали первый продукт, состоящий из нуклеотидов 10236-10445 с мутацией и сайтом расщепления SPL 1 в 10381.

Этот мутантный мегапраймер был удлинен для введения в него второго рестрикционного сайта путем объединения праймера А с продуктом первой PCR-реакции. Матрицу очищенного фрагмента Toto 1101, состоящего ив нуклеотидов 8571-10381, получали путем гидролиза рестриктирующими ферментами STU I и SPL I. Второй продукт состоял из нуклеотидов 9760-10445 и имел необходимую мутацию и рестрикционные сайты BSIW (NT 9804) и SPL 1 (NT 10381).

Ферменты BSIW и SPL I использовали для вырезания нуклеотидов 9804-10381 из Toto 1101 и второго PCR-npoдукта. Мутантный продукт, описанный выше, лигировали в Toto 1101 вместо последовательности дикого типа, в результате чего получали плазмиду, содержащую последовательность вируса Синдбис, в которой цистеин в положении 62 был заменен на серин. Эту плазмиду амплифицировали в Е. coli, и РНК, продуцированную из этой плазмиды путем in vitro -транскрипции, использовали для трансфекции клеток BHK-21 (клетки млекопитающих) и продуцирования вируса, показанного на фиг. 5.

Для осуществления программированной реакции транскрипции in vitro с помощью клона настоящего изобретения этот клон использовали с промотором SP6, в результате чего продуцировали матричную РНК, которая была идентичной РНК интактного вируса. Трансфекция РНК-продукта этой реакции в культивируемые клетки млекопитающего приводила к инфицированию, протекающему таким же образом, как и инфицирование интактным вирусом (фиг. 5). При этом были продуцированы зрелые вирусы которые по своей структуре и биохимическим свойствам были идентичны (за исключением замещения серином) нормальным вирусам. Однако, как было установлено с помощью стандартных анализов, эти вирусные частицы оказались абсолютно неинфекционными.

Настоящее изобретение продемонстрировало, что конформационные изменения в структуре мембранных гликопротеинов вируса происходят в том случае, когда вирус взаимодействует с рецептором клеточной поверхности. Такое конформационное изменение является необходимым условием для проникновения вируса через мембрану. Такое конформационное изменение делает тиоловую группу доступной и способной вступать в химическую реакцию с тиол-блокирующим агентом дитионитробензолом. Реакция этого агента с указанным тиолом блокирует процесс проникновения вируса. Указанный целевой критический тиол находится либо в рецепторном белке клеточной поверхности, либо в гликопротеине вирусной мембраны.

В результате разработки настоящего изобретения было получено прямое свидетельство тому, что тиол-донор и дисульфид-мишень находятся в вирусном гликопроетине EI и что домен белка, окружающий и включающий в себя цистеин 62 в последовательности EI, обладает активностью, аналогичной активности известной тиолредуктазы/протеинизомеразы.

Пример 10. Коронавирус
Действие тиол-блокирующего агента DTNB на инфицирование клеток с использованием модели коронавируса (вируса гепатита мыши) показано на фиг.6. Культивируемые клетки тканей были обработаны DTNB до инфицирования, во время инфицирования и после инфицирования вирусом, как показано выше. Вирусную РНК экстрагировали, и вирусную РНК из равного числа клеток выделяли с помощью гель-электрофореза. Наблюдения, проведенные с помощью денситометра, выявили, что количество 6 видов вирусной РНК снижалось на 50% в случае присутствия DTNB, несмотря на то, что инфицирование имело место. В экспериментах, где использовали пред- и пост-обработку, DTNB не оказывал значительного влияния на количество продуцируемой РНК по сравнению с контролем (без добавления DTNB) (крайняя правая дорожка). Таким образом была установлена параллель между вирусом гепатита мыши и вирусом Синдбис и было показано, что тиолдисульфидная обменная реакция играет решающую роль в инфицировании клеток мембраносодержащими коронавирусами.

Все патенты и публикации, упомянутые в данном описании, являются показателем того уровня техники, к области которой относится настоящее изобретение. Все патенты и публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая конкретная публикация вводилась отдельно посредством ссылки.

Следует отметить, что настоящее изобретение может быть легко адаптировано для достижения нужных целей и преимуществ, присущих этому изобретению. Описанные примеры с раскрытыми в них методами, процедурами, молекулами и конкретными соединениями являются характерными для предпочтительных вариантов осуществления изобретения и носят иллюстративный характер, а поэтому не должны рассматриваться как некое ограничение объема изобретения.

В настоящее изобретение могут быть внесены различные изменения, не выходящие, однако, за рамки существа изобретения, сформулированные в формуле изобретения.

Список последовательностей:
(2) Данные последовательности SEQ ID NO:1:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 20
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(A) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:1:
CGATGATGAT TGGCGTAACT 20
(3) Данные последовательности SEQ ID NO:2:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 34
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(А) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:2:
CGAAAAAT AATCCTGCGG СТСС 34
(4) Данные последовательности SEQ ID NO:3:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 18
(B) Тип: нуклеиновая кислота
(C) Цепочечность: двуцепочечная
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы:
(A) Описание: другая нуклеиновая кислота
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Антисмысловая: нет
(vi) Источник происхождения:
(B) Штамм:
(C) Отдельный изолят:
(D) Стадия развития:
(F) Тип ткани:
(G) Тип клетки:
(Н) Клеточная линия:
(ix) Отличительная особенность:
(А) Другая информация:
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO:3:
ССАААААТСА AATCCTGC 18а

Формула изобретения

1. Синдбис E1-SER⁶², неинфекционный, мутированный вирус Синдбис, используемый для получения вакцины, в котором консервативная аминокислота цистеин заменена серином в положении 62 белка Е1, при этом мутация находится в домене вирусного белка, ответственного за тиолредуктазную /протеиндисульфидизомеразную активность.

2. Фрагмент рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей неинфекционный мутированный вирус Синдбис E1-SER⁶², охарактеризованный в п. 1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9