Способ определения функциональной активности c1-ингибитора комплемента человека

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Способ обеспечивает снижение затрат для определения функциональной активности С1-ингибитора системы комплемента человека и упрощение исследования на основе иммуноферментного метода. Проводят сорбцию в лунках микропанели фибринолизина (аптечный препарат плазмина), затем вносят в лунки раствор анализируемой пробы, содержащей С1-ингибитор комплемента человека с неизвестной активностью, и проводят инкубацию, во время которой происходит ковалентное связывание С1-ингибитора с фибринолизином. После осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1-ингибитора и субстрат этого фермента. Количество связавшегося С1-ингибитора определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С1-ингибитору - фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного С1-ингибитора ковалентно связываться с фибринолизином. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. В патенте США [1] использован модифицированный метод определения активности Сl-ингибитора, основанный на тест-системе производства Cycotech (Сан Диего, Калифорния, США). Способ предусматривает следующие этапы: 1 - на микропанели сорбируют авидин, 2 - получают высокоочищенный ферментативно активный препарат субкомпонента Сls, 3 - синтезируют биотинилированный препарат Сls, 4 - образцы проб, содержащих определяемый функционально активный Сl-ингибитор, инкубируют с биотинилированным препаратом Сls, 5 - образующийся комплекс функционально активного Сl-ингибитора с Сls сорбируют в лунках микропанели, покрытых авидином, 6 - количество связавшегося в лунках Сl -ингибитора определяют с помощью конъюгата козьих антител против Сl-ингибитора с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата для пероксидазы.

К недостаткам метода можно отнести его многостадийность (использование дополнительной стадии взаимодействия биотин-авидин, а также необходимость получения биотинилированного Сls) и трудную доступность ферментативно активного Сls (присутствует в сыворотке крови в проферментной форме в количестве 30 мг/л, коммерчески недоступен).

Задачей заявленного изобретения является снижение затрат на проведение определения функциональной активности Сl-ингибитора комплемента человека на основе иммуноферментного метода и упрощение способа путем уменьшения числа стадий и использования доступных препаратов.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели фибринолизина (аптечный препарат плазмина), образцы проб, содержащих определяемый функционально активный Сl -ингибитор, вносят в лунки микропанели и проводят инкубацию, во время которой происходит ковалентное связывание Сl-ингибитора с фибринолизином, количество связавшегося в лунках Сl-ингибитора определяют с помощью конъюгата антител против Сl-ингибитора с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата для пероксидазы. Способ основан на способности функционально активного Сl-ингибитора ковалентно связываться с фибринолизином.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения функциональной активности Сl-ингибитора комплемента человека, использующего доступные препараты.

Пример. Определение функциональной активности препарата Сl-ингибитора. Растворяют фармакопейный препарат фибринолизина в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, с конечной активностью 1-10 ед./мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oС. Три раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), по 200 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл VBS². В лунки планшета каждого ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый Сl-ингибитор в VBS²⁺ в виде прогрессивных двукратных разведений. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, трехкратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М МаСl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против Сl -ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3%-ной перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14%-ной серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата Сl-ингибитора рассчитывают по стандартной кривой, полученной в результате проведения такого же эксперимента со стандартным раствором с известной активностью Сl-ингибитора.

Этим методом проведено определение активности Сl-ингибитора в 10 образцах сыворотки крови человека и сравнение с количественным определением его в тех же сыворотках стандартным методом радиальной иммунодиффузии (РИД). Полученные результаты приведены в таблице.

Из данных таблицы следует, что результаты, полученные двумя методами, согласуются между собой, т.е. заявленным способом действительно определяется функциональная активность Сl-ингибитора комплемента. Небольшие расхождения, наблюдаемые в отдельных результатах, объясняются тем, что метод РИД является менее точным из-за трудностей измерения диаметров колец преципитации (определяемая концентрация пропорциональна квадрату диаметра), что является причиной возрастания ошибок.

ЛИТЕРАТУРА 1. Pilatte Y. M. , Hammer C.H., Frank M.M., Fries L.F. Process for the purification of Сl-inhibitor. Patent US 5030578. July 9, 1991.

Формула изобретения

Способ определения функциональной активности С1-ингибитора комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели для иммуноферментного анализа фибринолизин, затем в лунки микропанели вносят раствор анализируемой пробы, содержащий С1-ингибитор комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1-ингибитора и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет содержания активного С1-ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

РИСУНКИ

Рисунок 1