Способ индикации и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса классической чумы свиней

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к молекулярной диагностике. Предлагаемый способ включает синтез внешних универсальных и внутренних ВКЧС-специфичных олигонуклеотидных праймеров, выделение вирусной РНК из вакцинных препаратов или патматериала, синтез кДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции. Далее проводят первую стадию амплификации фрагмента генома вируса в полимеразной цепной реакции с использованием внешних универсальных олигонуклеотидных праймеров. Проводят вторую стадию амплификации фрагмента генома вируса в полимеразной цепной реакции с использованием внутренних ВКЧС-специфичных олигонуклеотидных праймеров. Затем проводят рестрикцию полученных фрагментов кДНК ферментом эндонуклеазой Taq I. Дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС проводят на основе данных о количестве и массе полученных рестрикционных фрагментов после проведения электрофореза в полиакриламидном геле. Способ повышает специфичность и чувствительность метода, а также позволяет дифференцировать вакцинные штаммы и полевые изоляты ВКЧС. 1 ил.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к молекулярной диагностике вирусных заболеваний животных, и может быть использовано для индикации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса классической чумы свиней (ВКЧС).

Классическая чума свиней (КЧС) - высококонтагиозное инфекционное заболевание, характеризующееся многообразием клинических форм и проявлений: лихорадкой, поражением кровеносной, кроветворной и нервной систем, воспалениями легких и кишечника. Возбудителем заболевания является вирус, принадлежащий к роду Pestivirus семейства Flaviviridae.

В настоящее время КЧС занимает по актуальности одно из первых мест в инфекционной патологии свиней и считается для стран с интенсивной системой свиноводства одной из экономически важных болезней, а в ветеринарно-санитарном плане - одной из наиболее трудно ликвидируемых эпизоотий. КЧС регистрируется длительное время в России. За прошедшие годы наблюдалось несколько периодов активизации эпизоотического процесса этой болезни с последующим снижением интенсивности. Наблюдается широкое географическое распространение болезни. КЧС регистрируется практически во всех экономических регионах страны (от Калининграда до Дальнего Востока и от Архангельской области до Краснодарского края). Борьба с этим заболеванием осуществляется путем применения вакцин на основе живых аттенуированных штаммов ВКЧС (1, 2).

В связи с широким использованием живых вакцин увеличилась частота случаев хронической, персистентно протекающей КЧС, бессимптомных и атипичных форм течения болезни, при которых постановка диагноза по клиническим признакам, патоморфологическим изменениям затруднена и требуются лабораторные исследования, позволяющие дифференцировать вакцинные штаммы и полевые изоляты вируса.

До недавнего времени основным способом диагностики КЧС являлась процедура, основанная на иммунофлюоресцентном методе выявления возбудителя болезни.

Известен способ иммунофлюоресцентной диагностики КЧС, включающий выделение вируса в перевиваемой культуре клеток почки поросенка РК-15, инокулированной испытуемыми материалами от павших или вынужденно убитых больных свиней, и идентификация его прямой иммунофлюоресценцией, затем выявление и титрование специфических антител к ВКЧС непрямой иммунофлюоресценцией в сыворотках крови переболевших свиней и на последнем этапе выявление и титрование вируснейтрализующих антител КЧС методом нейтрализации флюоресцирующих микробляшек (3).

К недостаткам данного способа кроме длительности процедуры относится то, что размножение вируса в диагностических целях проводится на культурах, в большинстве случаев контаминированных вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), однако известный способ не позволяет отличать ВКЧС от близкородственного вируса ВД КРС, что значительно снижает диагностическую ценность метода и затрудняет интерпретацию результатов. Кроме того, плановая вакцинация предполагает не только диагностическую задачу специфической детекции ВКЧС, но и дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса, что еще более проблематично при использовании данного способа.

Быстрая и точная постановка диагноза в случае такого высококонтагиозного заболевания, как КЧС является ключевым этапом в ликвидации болезни. Совершенствование методов лабораторной диагностики КЧС позволяет не только повысить чувствительность и специфичность, но и существенно ускорить процедуру диагностики.

Перспективным направлением в этом плане является использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанного на амплификации участка вирусного генома с использованием специфических праймеров и термостабильной ДНК-полимеразы. Определение и сравнительный анализ первичной структуры фрагмента генома, характеризующегося высокой степенью вариабельности, позволяет наиболее точно дифференцировать вакцинные штаммы от полевых изолятов, а также предоставляет возможность изучения генетической вариабельности вирусной популяции.

В последнее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) широко используется для диагностики особо опасных вирусных и бактериальных заболеваний животных и индикации их возбудителей: африканской чумы свиней, КЧС, катаральной лихорадки овец и др. (4, 5, 6).

Известен способ индикации ВКЧС в ПЦР, включающий выделение РНК из ВКЧС-инфицированных тканей, обратная транскрипция РНК ревертазой AMV, амплификация полученной комплементарной ДНК (кДНК) с помощью Taq-полимеразы ДНК в присутствии двух ВКЧС-специфичных праймеров, обнаружение амплифицированного фрагмента ДНК электрофорезом в агарозном геле и для повышения чувствительности повторная амплификация ДНК набором гнездовых праймеров (7).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он не позволяет обнаруживать значительную часть циркулирующих штаммов ВКЧС, так как структура олигонуклеотидных праймеров определена по нуклеотидной последовательности одного штамма, что детерминирует недостаточную специфичность способа при выявлении других штаммов ВКЧС. Дифференциация ВКЧС от вируса ВД КРС этим способом не проводилась.

Известен способ индикации ВКЧС, включающий определение и синтез олигонуклеотидных праймеров, структура которых консервативна для большинства штаммов ВКЧС и отличается от гомологичных структур РНК ВД КРС, а затем синтез кДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции и амплификацию синтезированной кДНК в ПЦР с использованием вышеупомянутых праймеров. В качестве праймеров определяют и синтезируют следующие последовательности олигонуклеотидов: 1-5'-CTG CTG GCC TGG GTG ACT ACG-3' и 2-5'-АТА ACT CAA TGG ААС CTG-3'(8).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он обладает недостаточной чувствительностью и специфичностью, так как позволяет осуществлять лишь идентификацию ВКЧС с дифференциацией от ВД КРС, но не штаммовую дифференциацию ВКЧС.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ индикации и дифференциации ВКЧС от родственных пестивирусов в ПЦР, включающий синтез внешних и внутренних олигонуклеотидных праймеров, синтез кДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции, амплификация синтезированной кДНК методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, рестрикцию полученных амплифицированных фрагментов и анализ размера продуктов ПЦР методом электрофореза (9), К недостаткам способа-прототипа можно отнести то, что он позволяет осуществлять лишь индикацию ВКЧС и его дифференциацию от других родственных пестивирусов, однако с его помощью невозможно осуществить дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа индикации и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС, обеспечивающего повышение специфичности и чувствительности метода и возможность дифференцировать вакцинные штаммы и полевые изоляты ВКЧС, а также ускорение процесса и снижение его себестоимости.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении его специфичности и чувствительности, обеспечении возможности дифференцировать вакцинные штаммы и полевые изоляты ВКЧС, а также в ускорении процесса и снижении его себестоимости.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1. Способ индикации и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС.

2. Изучение первичной структуры фрагмента генома вакцинных штаммов ВКЧС.

3. Изучение первичной структуры фрагмента генома полевых изолятов ВКЧС.

4. Выбор региона основных антигенных доменов гликопротеина gp55 (Е₂) ВКЧС в качестве мишени амплификации.

5. Определение структуры внешних олигонуклеотидных праймеров, универсальных для рода пестивирусов (внешние универсальные праймеры).

6. Синтез внешних универсальных праймеров.

7. Внешние универсальные праймеры имеют следующие последовательности олигонуклеотидов: 1 - 5'-ACCACGGCATTCCTCATCTGCTTG-3' и 2 - 5'-CACACATGTCCAGTTGCCC-3'.

8. Праймер 1 используют для синтеза первой цепи кДНК в реакции обратной транскрипции.

9. Праймеры 1 и 2 используют для амплификации участка генома ВКЧС, полученного в процессе первой стадии ПЦР.

10. Определение структуры внутренних олигонуклеотидных праймеров, специфичных для ВКЧС (внутренние ВКЧС-специфичные праймеры).

11. Синтез внутренних ВКЧС - специфичных праймеров.

12. Внутренние ВКЧС-специфичные праймеры имеют следующие последовательности олигонуклеотидов: 3 - 5'-TCATCAACCAATGAGATAGGGCT-3' и 4 - 5'-TCCCTTGACTACAGGACTCGT-3'.

13. Праймеры 3 и 4 используют в процессе второй стадии ПЦР на матрице кДНК, полученной в результате амплификации с использованием внешних универсальных праймеров.

14. Выделение вирусной РНК из исследуемых вирусных препаратов.

15. Синтез кДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции.

16. Проведение первой стадии амплификации фрагмента генома вируса в ПЦР с использованием внешних универсальных праймеров.

17. Проведение второй стадии амплификации фрагмента генома вируса в ПЦР с использованием внутренних ВКЧС-специфичных праймеров.

18. Рестрикция полученных амплифицированных фрагментов кДНК (ампликонов) эндонуклеазой Taq I.

19. Анализ размера продуктов ПЦР методом электрофореза.

20. Дифференциация вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС на основе данных о количестве и массе рестрикционных фрагментов после проведения электрофореза.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1. Способ индикации и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС.

2. Синтез внешних праймеров.

3. Внешние олигонуклеотидные праймеры имеют следующие последовательности: 1 - 5'-ACCACGGCATTCCTCATCTGCTTG-3' и 2 - 5'-CACACATGTCCAGTTGCCC-3'.

4. Синтез внутренних олигонуклеотидных праймеров.

5. Внутренние олигонуклеотидные праймеры имеют следующие последовательности:
3 - 5'-TCATCAACCAATGAGATAGGGCT-3' и
4 - 5'-TCCCTTGACTACAGGACTCGT-3'.

6. Синтез кДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции.

7. Амплификация синтезированной комплементарной ДНК методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров.

8. Рестрикция полученных амплифицированных фрагментов кДНК (ампликонов) эндонуклеазой Taq I.

9. Анализ размера продуктов ПЦР методом электрофореза.

10. Дифференциация вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС на основе данных о количестве и массе рестрикционных фрагментов после проведения электрофореза.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Способ индикации и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС.

2. Синтез внешних олигонуклеотидных праймеров.

3. Синтез внутренних олигонуклеотидных праймеров.

4. Синтез кДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции.

5. Амплификация синтезированной кДНК методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров.

6. Рестрикция полученных амплифицированных фрагментов кДНК.

7. Анализ размера продуктов ПЦР методом электрофореза.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого способа являются:
1. Внешние олигонуклеотидные праймеры имеют последовательности:
1 - 5'-ACCACGGCATTCCTCATCTGCTTG-3' и
2 - 5'-CACACATGTCCAGTTGCCC-3'.

2. Внутренние олигонуклеотидные праймеры имеют последовательности:
3 - 5'-TCATCAACCAATGAGATAGGGCT-3' и
4 - 5'-ТСССТТGАСТАСАGGАСТСGТ-3'.

3. Рестрикция полученных амплифицированных фрагментов кДНК эндонуклеазой Taq I.

4. Дифференциация вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС на основе данных о количестве и массе рестрикционных фрагментов после проведения электрофореза.

Сущность изобретения пояснена на чертеже, на котором представлены продукты амплификации-рестрикции фрагмента генома вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС.

Предлагаемый способ по сравнению со способом-прототипом обеспечивает повышение специфичности метода и возможность дифференцировать вакцинные штаммы и полевые изоляты ВКЧС, а также ускорение и снижение себестоимости процесса по сравнению с методом штаммовой дифференциации, основанным на определении и сравнительном анализе первичной структуры фрагмента генома.

Предлагаемый способ предъявляет меньше требований к подготовке персонала, инструментальной оснащенности диагностических лабораторий и требует меньшего количества времени (2-3 часа), в то время как процедура секвенирования занимает не менее двух рабочих дней.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Проведенные нами исследования по молекулярной характеризации российских вакцинных штаммов и изучению генетической гетерогенности эпизоотических изолятов продемонстрировали уникальные структурные особенности отечественной популяции ВКЧС. Было установлено, что штаммы, используемые в России для производства вакцинных препаратов против ВКЧС, достаточно гетерогенны и относятся к двум различным генетическим подгруппам. К первой подгруппе относятся вакцинные штаммы ВГНКИ (Щелково), СИНЛАК (ВНИИЗЖ), Pestiffa (France), Riems С (Germany), Pliva (Slovakia), Pest-vac (Brasilia) и Romvac (Romania), а ко второй подгруппе - вакцинные штаммы ЛК-ВНИИВВиМ (Покров), ЛК-К (Покров) и КС-Нарвак (Москва). Уровень структурной гомологии между данными подгруппами составляет 86,95% и существующая генетическая гетерогенность выражается в существовании уникальных для каждой группы нуклеотидных замен, которые структурно формируют или элиминируют сайты для соответствующих эндонуклеаз рестрикции. Подобные уникальные замены представляют собой своеобразные маркеры дифференциации и могут выявляться при гидролизе соответствующими эндонуклеазами фрагмента генома, в структуру которого входит данный рестрикционный сайт. Большинство же эпизоотических изолятов ВКЧС, формирующих отечественную популяцию вируса, образуют обособленную, относительно стабильную генетическую группу, которая демонстрирует высокий уровень внутригрупповой структурной гомологии и также характеризуется уникальными маркерами дифференциации. В связи с этим на первом этапе проводят анализ первичной структуры как консервативных участков, так и вариабельной области гена E₂ вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС, представленных в банке данных, и их подвергают сравнению с первичной структурой отечественных вакцинных штаммов и полевых изолятов, выделенных на территории страны в 1994-1999 годах. На основе сравнительного анализа осуществляют выбор региона основных антигенных доменов гликопротеина gp 55 (E₂) вируса КЧС в качестве мишени амплификации. Затем на основе сравнительного анализа определяют структуру и осуществляют синтез внешних олигонуклеотидных праймеров, универсальных для рода пестивирусов. Указанные праймеры гомологичны двум консервативным участкам генома пестивирусов с максимальным структурным соответствием для различных представителей рода пестивирусов. Синтезированные внешние универсальные праймеры имеют следующие последовательности олигонуклеотидов:
1 - 5'-ACCACGGCATTCCTCATCTGCTTG-3' и
2 - 5'-CACACATGTCCAGTTGCCC-3'.

Первый праймер используют в реакции обратной транскрипции для синтеза первой цепи ДНК, комплементарной РНК пестивирусов. Потом оба праймера используют для амплификации участка генома пестивирусов в ПЦР. Внутри фрагмента гена E₂, ограниченного внешними праймерами 1 и 2, выбирают участки генома и определяют структуру внутренних праймеров, специфичных для ВКЧС. Структуру внутренних праймеров определяют по принципу наибольшего соответствия структуре гомологичных участков РНК различных штаммов ВКЧС и наименьшего соответствия структуре гомологичных участков РНК других представителей пестивирусов. Синтезированные внутренние ВКЧС-специфичные праймеры имеют следующие последовательности олигонуклеотидов:
3 - 5'-TCATCAACCAATGAGATAGGGCT-3' и
4 - 5'-TCCCTTGACTACAGGACTCGT-3'.

Праймеры 3 и 4 используют в процессе второй стадии ПЦР на матрице кДНК, полученной в результате амплификации с использованием праймеров 1 и 2, универсальных для рода пестивирусов. Использование пары внутренних праймеров обеспечивает специфичность и значительно увеличивает чувствительность предлагаемого способа.

На следующем этапе первичную структуру фрагмента генома вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС анализируют на наличие устойчивых и характерных генетических отличий, которые приводят к появлению или, наоборот, к исчезновению сайтов для различных эндонуклеаз. Анализ первичной структуры выявил, что у всех вакцинных штаммов имеется сайт для эндонуклеазы Taq I, который отсутствует у полевых изолятов вследствие нуклеотидной замены. Кроме того, в геноме вакцинных штаммов ЛК-ВНИИВВиМ, КС и ЛК-К появляется дополнительный сайт для эндонуклеазы Taq I в результате нуклеотидной замены. Таким образом, на участке генома размером 334 нуклеотида, который амплифицируют с использованием внутренних ВКЧС-специфичных праймеров, у вакцинных штаммов и полевых изолятов имеется один общий сайт для эндонуклеазы Taq I. У вакцинных штаммов первой подгруппы имеется два сайта для эндонуклеазы Taq I, а у вакцинных штаммов второй подгруппы (ЛК-ВНИИВВиМ, КС и ЛК-К) три сайта для эндонуклеазы Taq I. Следовательно, рестрикция эндонуклеазой Taq I ампликонов генома полевых изолятов приводит к образованию 2 фрагментов размером 219 и 115 пар нуклеотидов (п. н. ), рестрикция ампликонов генома вакцинных штаммов первой группы - к образованию 3 фрагментов размером 207, 115 и 12 п.н, а ампликонов генома вакцинных штаммов второй подгруппы (ЛК-ВНИИВВиМ, КС и ЛК-К) - к образованию 4 фрагментов размером 207, 70, 45 и 12 п.н. На основе данных о количестве и молекулярной массе рестрикционных фрагментов, полученных при анализе продуктов рестрикции в полиакриламидном геле, осуществляют дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС. Таким образом, предлагаемый способ, включающий специфическую амплификацию фрагмента гена гликопротеина Е₂ (регион основных антигенных доменов гликопротеина) с последующей рестрикцией эндонуклеазой Taq I, позволяет специфично, быстро и с большой чувствительностью дифференцировать полевые изоляты и вакцинные штаммы ВКЧС с идентификацией вакцинных штаммов каждой из генетических подгрупп.

Пример 2.

Операция 1. Выделение РНК пестивирусов из вирусных препаратов.

Образец патматериала (1 г) растирают в ступке со стеклянным порошком и добавляют 9 мл STE-буфера. Суспензию осветляют центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин 100 мкл осветленной суспензии патматериала или соответствующее количество вакцинного препарата смешивают с 200 мкл 6 М гуанидинизотиоцианата и инкубируют 3-5 мин при комнатной температуре. Добавляют 300 мкл 96% этанола, перемешивают и пропускают смесь через центрифужную миниколонку со стекловолокнистым фильтром типа GF/F (Whatman). Миниколонку с фильтром промывают 2 мл 80% этанола и центрифугируют 1 мин при 13000 g для полного удаления этанола. Затем миниколонку переносят в новую пробирку и РНК элюируют с фильтра 50 мкл воды. Через 1-2 мин после добавления воды пробирку с миниколонкой центрифугируют при 13000 g в течение 30 с, миниколонку удаляют, а раствор РНК используют для реакций обратной транскрипции и амплификации.

Операция 2. Синтез кДНК на матрице вирусной РНК.

Выделенную вирусную РНК добавляют к реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 8 мМ МgСl₂; 50 мМ KCl; 15 пмоль праймера 1; 1 мМ dATF, dTTF, dCTF, dGTF, 10 ед. обратной транскриптазы. Реакцию проводят в течение 30 минут при 42^oС. После этого содержимое пробирки прогревают в течение 3 мин при 95^oС.

Операция 3. Полимеразная цепная реакция (первая стадия).

5 мкл раствора, содержащего кДНК пестивирусов, добавляют к 45 мкл раствора, содержащего 15 мМ трис-HCl, рН 9,0; 50 мМ KCl; 2,5 мМ MgCl₂, 0,1% BSA; 0,2 мМ каждого из четырех dNTP, 2 ед. Taq-полимеразы и по 25 пмоль праймеров 1 и 2. ПЦР состоит из 25 циклов: 95^oС в течение 30 с, 56^oС в течение 15 с, 73^oС в течение 45 с. В конце реакции проводят завершающий синтез при 73^oС в течение 3 мин.

Операция 4. Полимеразная цепная реакция (вторая стадия).

5 мкл раствора, содержащего матрицу кДНК после первой стадии амплификации, добавляют к 45 мкл раствора, содержащего 15 мМ трис-HCl, рН 9,0; 50 мМ KCl; 2,5 мМ MgCl₂, 0,1% BSA; 0,2 мМ каждого из четырех dNTP, 2 ед. Taq-полимеразы и по 25 пмоль праймеров 3 и 4. ПЦР состоит из 30 циклов: 95^oС в течение 15 с, 56^oС в течение 15 с, 73^oС в течение 30 с. В конце реакции проводят завершающий синтез при 73^oС в течение 3 мин.

Операция 5. Рестрикция эндонуклеазой Taq I.

После завершения ПЦР реакционную смесь переосаждают спиртом и растворяют в 30 мкл воды. Затем 10 мкл раствора, содержащего амплифицированные фрагменты кДНК, гидролизуют при температуре 65^oС в течение 1 часа в присутствии 5 ед. эндонуклеазы Taq I в реакционной смеси следующего состава: 10 мМ Трис-HCl; 10 мМ MgCl₂; 100 мМ KCl; 1 мМ DTT (рН 8,7).

Операция 6. Анализ продуктов рестрикции.

Реакционную смесь из каждой пробирки смешивают с 5 мкл раствора, содержащего 50%-ный глицерин, бромфеноловый синий, и наносят в "карман" 10-12% полиакриламидного геля, который после электрофореза окрашивают этидиум бромидом и анализируют под ультрафиолетом. Маркер молекулярной массы представляет собой продукты гидролиза ДНК плазмиды pUCI8 эндонуклеазой Alu I. В результате рестрикции эндонуклеазой Taq I ампликонов генома полевых ВКЧС образуются 2 фрагмента размером 219 и 115 п.н., ампликонов генома вакцинных штаммов первой группы - 3 фрагмента (207, 115 и 12 п.н.), а при рестрикции ампликонов генома вакцинных штаммов ЛК-ВНИИВВиМ, ЛК-К и КС - 4 фрагмента (207, 70, 45 и 12 п.н.).

На основе данных о количестве и молекулярной массе рестрикционных фрагментов, полученных при анализе продуктов рестрикции в полиакриламидном геле, осуществляют дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС.

Результаты анализа представлены на чертеже.

Преимущества предлагаемого способа по сравнению со способом-прототипом заключаются в возможности индикации ВКЧС и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса в течение 2-3 часов с высокой чувствительностью и специфичностью. Это значительно сокращает продолжительность постановки диагноза и предоставляет необходимую информацию для оперативных решений по проведению эффективных противоэпизоотических мероприятий.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- способ индикации и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов ВКЧС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в ветеринарной вирусологии, а именно в молекулярной диагностике вирусных заболеваний животных;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемого способа достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Киев, Урожай, 1993, 369 с.

2. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, 285-294.

3. Методические указания по иммунофлюоресцентной диагностике КЧС. Покров, ВНИИВВиМ, МСХ СССР, 1984, 14 с.

4. Steiger et al. Rapid and Biologically Safe Diagnosis of African Swine Fever Infection by Using Polymerase Chain Reaction. J. Clin. Microbiology, 1992, 30, p.1-8.

5. Shodeyck Tomasz et al. Med. Vet., 1994, 50, 3,122-124.

6. Lohensgard J.P. et al. J. Virol. Methods, 1991, 34, 1, 45-55.

7. Liu Т., Li S. - N., Wang D. - C. et all. Rapid detection of hog cholera virus in tissues by the polymerase chain reaction. J. of Virol. Methods, 1991, 35, 227-236.

8. Патент РФ 2120994; C 12 N 15/00, C 12 Q 1/68, А 61 К 39/187; 27.10.98 г.

9. Katz J. B., Ridpath J. and Bolin S.R. Presumptive diagnostic differentiation of hog cholera virus from bovine viral diarrhea and border disease viruces by using a cDNA nested - amplification approach. J. Clin. Microbiol, 1993, 31, 565-568 (прототип).

Формула изобретения

Способ индикации и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса классической чумы свиней, включающий синтез внешних и внутренних олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции, амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров, рестрикцию полученных амплифицированных фрагментов и анализ размера продуктов полимеразной цепной реакции методом электрофореза, отличающийся тем, что внешние олигонуклеотидные праймеры имеют последовательности:
1 - 5 -ACCACGGCATTCCTCATCTGCTTG-3 и
2 - 5 -CACACATGTCCAGTTGCCC-3 ,
внутренние олигонуклеотидные праймеры имеют последовательности:
3 - 5 -TCATCAACCAATGAGATAGGGCT-3 и
4 - 5 -TCCCTTGACTACAGGACTCGT-3 ,
рестрикцию полученных амплифицированных фрагментов осуществляют эндонуклеазой Taq I, а дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса классической чумы свиней осуществляют на основе данных о количестве и массе рестрикционных фрагментов после проведения электрофореза.

РИСУНКИ

Рисунок 1