Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ включает приготовление антигенного материала в виде 10-20%-ной вируссодержащей суспензии из печени 5-50-суточных цыплят, инфицированных вирусом синдрома гидроперикардита кур (СГПК) из штамма КР95 114-ДЕП (коллекция ВГНКИ) и павших с признаками СГПК. Вирус культивируют в организме цыплят в течение 48-120 ч. Для изготовления вакцины используют вирус с биологической активностью 3,25-5,0 lgЛД₅₀/0,2 см³. После очистки от балластных примесей известным образом в вируссодержащую суспензию вносят димер этиленимина до концентрации 0,15-0,4% для инактивации вируса. Очищенный и авирулентный антигенный материал соединяют с адъювантами гидроокисью алюминия и сапонином. Готовый препарат подвергают контролю в соответствии с требованиями ТУ. Способ обеспечивает повышение антигенной и иммуногенной активности и безвредности целевого продукта. 13 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики синдрома гидроперикардита кур (СГПК).

СГПК (гепатит с тельцами-включениями, болезнь Ангара, болезнь Личи) - это остро протекающая инфекционная болезнь кур вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб развитому птицеводству многих стран мира.

Вирус СГПК вызывает заболевание кур преимущественно в возрасте от 10 до 50 суток, которое характеризуется внезапной гибелью птицы, скоплением избыточного количества жидкости в перикардиальной полости, поражением печени и почек, депрессией, диареей, а в некоторых случаях и анемией.

В августе 1987 года в Пакистане на бройлерной ферме в местности Angara Goth близ Карачи зарегистрировали болезнь с признаками гепатита с тельцами-включениями и поражением сердца (гидроперикардит). Заболевание отмечалось, как правило, у птиц 3-6-недельного возраста, но иногда встречалось у более молодых либо более старших птиц, смертность достигала 50-70%. Первоначально заболеванию дали название "болезнь Ангара" в соответствии с географической местностью, где впервые зарегистрировали вспышку инфекции. Позднее заболеванию присвоили название "синдром гидроперикардита" в связи с тем, что при вскрытии трупов птиц отмечали скопление жидкости (до 20 мл) в сердечной сорочке, обусловленное нарушением кровообращения в сердечнососудистой системе. Подобное заболевание регистрировалось в Ираке, Индии, Мексике, Кувейте, Австралии, Японии и Чили (1).

С начала 90-х гг. вспышки СГПК с высоким уровнем смертности регистрируются на территории России (2). Отсутствие в отечественной ветеринарной практике средств и методов диагностики и специфической профилактики СГПК нанесло значительный экономический ущерб птицехозяйствам. Экономические потери, которые несут птицеводческие хозяйства от вспышек СГПК, складываются из падежа птиц (от 10 до 60%), гибели развивающихся эмбрионов кур во время инкубации, снижения продуктивности и оплаты корма, а также средств, затраченных на проведение внеплановых ветеринарно-санитарных мероприятий и др. (3). Вакцинопрофилактика СГПК занимает ведущее место в борьбе с этим заболеванием. Для профилактики СГПК применяют как живые, так и инактивированные вакцины. В последние годы наиболее часто применяют инактивированные вакцины (4). Однако технология их изготовления обладает недостатками, устранение которых остается актуальной задачей и служит основной предпосылкой для исследований по усовершенствованию технологии изготовления инактивированной вакцины против СГПК и решения вопроса защиты птицеводства нашей страны от этой опасной болезни.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности признаков является способ изготовления инактивированной вакцины против СГПК, включающий приготовление антигенного материала в виде вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных возбудителем болезни и павших с признаками СГПК, очистку антигенного материала от балластных примесей центрифугированием при 2500-3000 об/мин в течение 15-20 мин, инактивацию вируса формальдегидом в течение 24 ч при 4^oС с периодическим перемешиванием и последующим контролем целевого продукта (5, 6).

Недостатки способа-прототипа состоят в том, что - для получения антигенного материала используют печень цыплят, в которой содержание антигена часто сильно варьирует, а также она могла быть контаминирована возбудителями других инфекционных болезней птиц (болезнь Гамборо, болезнь Марека, инфекционный бронхит, инфекционная анемия кур и др. ); - для очистки вируссодержащей суспензии от клеточного детрита используют метод низкоскоростного центрифугирования, не обеспечивающего в достаточной степени очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей; - в качестве инактиванта используют формальдегид, вызывающий деструктивные изменения вирусных белков и снижающий иммуногенную активность вакцины. Также велика вероятность неполной инактивации вируса при обработке формальдегидом вирусной суспензии, содержащей значительное количество балластного белка; - данный способ не предусматривает введение в состав препарата адъюванта, использование которого улучшает хранение и повышает антигенную активность вакцины.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа изготовления инактивированной вакцины против СГПК, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью и обеспечивающей защиту птицеводства Российской Федерации от эпизоотического вируса СГПК, наносящего значительный экономический ущерб.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности и безвредности инактивированной вакцины против СГПК.

Указанный технический результат от использования изобретения достигнут созданием способа изготовления инактивированной вакцины против СГПК, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1. Способ изготовления инактивированной вакцины против СГПК.

2. Приготовление антигенного материала в виде 10-20% вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных возбудителем инфекции и павших с признаками СГПК.

3. В качестве возбудителя инфекции используют штамм КР95 114 вируса СГПК в эффективном количестве.

4. Для получения антигенного материала используют печень 5-50-суточных цыплят.

5. Вирус культивируют в организме 5-50-суточных цыплят в течение 48-120 ч.

6. Для приготовления вакцины используют антигенный материал с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ЛД₅₀/0,2 см².

7. Полученный антигенный материал подвергают очистке от балластных примесей.

8. Очищенный антигенный материал подвергают инактивации.

9. В качестве инактиванта используют димер этиленимина (ДЭИ).

10. ДЭИ используют в виде 10% водного раствора.

11. ДЭИ вносят в антигенный материал до концентрации 0,15-0,4%.

12. Инактивацию вируса СГПК ведут в течение 23-25 ч при 35-36^oС и рН 7,4-7,6.

13. Соединение очищенного и авирулентного антигенного материала с адъювантом.

14. Из адъювантов используют гидроокись алюминия (ГОА).

15. ГОА используют в виде 3-4% коллоидного раствора.

16. ГОА вносят в антигенный материал до концентрации 0,1%.

17. Из адъювантов используют дополнительно сапонин.

18. Сапонин используют в виде 10% водного раствора.

19. Сапонин вносят в антигенный материал до концентрации 0,5-2%.

20. Контроль целевого продукта.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1. Способ изготовления инактивированной вакцины против СГПК.

2. Приготовление антигенного материала в виде вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных возбудителем инфекции и павших с признаками СГПК.

3. В каченстве возбудителя инфекции используют штамм КР95 114 вируса СГПК в эффективном количестве.

4. Очистка антигенного материала от балластных примесей.

5. Инактивация антигенного материала.

6. Соединение очищенного и авирулентного антигенного материала с адъювантом.

7. Контроль целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования: 1. Для получения антигенного материала используют печень 5-50-суточных цыплят.

2. Штамм КР95 114 вируса СГПК культивируют в организме 5-50-суточных цыплят в течение 48-120 ч.

3. Для изготовления вакцины используют антигенный материал из штамма КР95 114 с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ЛД₅₀/0,2 см².

4. Очищенный антигенный материал инактивируютДЭИ.

5. ДЭИ используют в виде 10% водного раствора.

6. ДЭИ вносят в антигенный материал до концентрации 0,15-0,4%.

7. Инактивацию антигенного материала ведут в течение 23-25 ч при 35-36^oС и рН 7,4-7,6.

8. Из адъювантов используют ГОА.

9. ГОА используют в виде 3-4% коллоидного раствора.

10. ГОА вносят в антигенный материал до концентрации 0,1%.

11. Из адъювантов используют дополнительно сапонин.

12. Сапонин используют в виде 10% водного раствора.

13. Сапонин вносят в антигенный материал до концентрации 0,5-2%.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются: 1. Способ изготовления инактивированной вакцины против СГПК.

2. Получение антигенного материала в виде вируссодержащей суспензии их печени цыплят, инфицированных возбудителем инфекции и павших с признаками СГПК.

3. Очистка антигенного материала от балластных примесей.

4. Инактивация вируса.

5. Контроль целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются: 1. В качестве возбудителя инфекции используют штамм КР95 114-ДЕП вируса СГПК.

2. Штамм КР95 114 вируса СГПК используют в эффективном количестве.

3. Соединение очищенного авирулентного антигенного материала с адъювантом.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Для получения антигенного материала используют печень 5-50-суточных цыплят.

2. Штамм КР95 114 вируса СГПК культивируют в организме 5-50-суточных цыплят в течение 48-120 ч.

3. Для изготовления вакцины используют антигенный материал из штамма КР95 114 с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ЛД₅₀/0,2 см².

4. Очищенный антигенный материал инактивируют ДЭИ.

5. ДЭИ используют в виде 10% водного раствора.

6. ДЭИ вносят в антигенный материал до концентрации 0,15-0,4%.

7. Инактивацию антигенного материала ведут в течение 23-25 часов при 35-36^oС и рН 7,4-7,6.

8. Из адъювантов используют ГОА.

9. ГОА используют в виде 3-4% коллоидного раствора.

10. ГОА вносят в антигенный материал до концентрации 0,1%.

11. Из адъювантов используют дополнительно сапонин.

12. Сапонин используют в виде 10% водного раствора.

13. Сапонин вносят в антигенный материал до концентрации 0,5-2%.

Вакцина, полученная предлагаемым способом, обладает по сравнению с вакциной, полученной способом-прототипом, более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью, обеспечивает защиту против возбудителя СГПК, циркулирующего на поголовье птицы на территории Российской Федерации.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вакцины используют новый штамм КР95 114 вируса СГПК.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что инактивацию антигенного материала осуществляют ДЭИ, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенного материала.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается за счет использования адъювантов ГОА и сапонина.

Исходный вирус для получения штамма КР95 114 выделен из печени больных бройлеров на птицефабрике "Красноярская" Красноярского края в 1995 году. Производственный штамм КР95 114 получен путем многократных последовательных пассажей на цыплятах.

Штамм КР95 114 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 14.12.2000 г. под регистрационным КР95 114-ДЕП.

Штамм является вирулентным и обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной вакцины.

Штамм КР95 114 вируса СГПК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм КР95 114 вируса СГПК относится к семейству Adenoviridae, роду Aviadenovirus, группе 1, серотипу 4, обладает морфологическими признаками, характерными для аденовирусов: как у всех прочих вирусов этого семейства, лишенных суперкапсидной оболочки, диаметр вириона штамма КР95 114 и нуклеокапсида равны. Размер вириона равен 75-80 нм. Вирион обладает икосаэдрическим типом симметрии. Вирион представлен нуклеоидом, состоящим из нуклеиновой кислоты и сердцевинных белков, и капсидной белковой оболочкой. Капсид содержит 252 капсомера, которые расположены в 20 фасетках, имеющих форму равносторонних треугольников. На ребрах равносторонних треугольных граней, общих для соседних треугольников, лежит по шесть капсомеров; длина ребра составляет около 42 нм. Каждый из 240 капсомеров капсидной оболочки, формирующих равносторонние треугольники, находится в окружении шести таких же капсомеров и носит название гексон. Каждый из 12 капсомеров, расположенных в вершинах икосаэдра, окружен лишь пятью соседними капсомерами и носит название пептона. Каждый капсомер (кроме сложно устроенного пептона) представляет собой призматическую частицу диаметром 6-7 нм с центральной полостью размером 1,5-2 нм. Способ укладки капсомеров в капсид является уникальным для вирусов с икосаэдрическим типом симметрии и отличается геометрической упорядоченностью. Гексоны представляют собой основной растворимый компонент возбудителя при его репродукции в чувствительных клетках.

С пептонами связывают их способность агглютинировать эритроциты, что обусловлено присутствием в их составе полного гемагглютина.

Сердцевина вириона содержит двухцепочную молекулу ДНК и два внутренних белка. ДНК имеет в своем составе около 60 генов, несущих информацию, которая достаточна для кодирования от 30 до 50 белков.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм КР95 114 относится к группе 1 птичьих аденовирусов. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:2-1:64.

Биотехнологические характеристики
Штамм КР95 114 является вирулентным и обладает высокой биологической активностью в нативном виде, а также проявляет высокие антигенные и иммуногенные свойства после инактивации.

Штамм КР95 114 предназначен для использования в качестве сырья для изготовления инактивированной вакцины, а также диагностических биопрепаратов. Штамм КР95 114 репродуцируется на цыплятах 5-90-суточного возраста. В течение 48-120 часов инкубирования вирус накапливается в печени цыплят в титре 3,25-5,0 Ig ЛД₅₀/0,2 мл. Штамм КР95 114 является стабильным.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Сердцевина вириона содержит двухцепочечную молекулу ДНК и два внутренних белка. Масса нуклеиновой кислоты достигает 17,3% массы вириона.

Основная масса белков вируса СГПК сосредоточена в капсидной оболочке вириона. На долю сердцевинных белков приходится до 20% всех протеинов вируса. Сердцевинный белок "1" с молекулярной массой 46•10³ г/моль легко отделяется от внутреннего нуклеопротеида, содержащего ДНК в комплексе с богатым аргинином сердцевинным белком "2".

Гексон, основание пептона и его нить (фибер) вируса К95 114 построены из полипептидов с молекулярными массами 120•10³, 70•10³, 62•10³ г/моль соответственно.

Белковые структуры вируса штамма КР95 114 формируют несколько антигенов. В составе структурного вирусного антигена у них обнаружены типоспецифические, группоспецифические, подгруппоспецифические антигены полипептидов гексона, основания пептона и подгруппоспецифические и типоспецифические антигены нити пептона.

В составе структурного вирусного антигена выявлено три основных компонента, обозначенных А, В и С. Антиген А структурно связан с гексоном, антиген В - с пептоном, антиген С - с нитями вириона (фибер). Связанный с гексоном компонент А содержит группоспецифический антиген (α) и типоспецифический антиген (ε). Антигенный фактор, связанный с пептоном, назван антигеном (β), а с нитью вириона (фибер) - (γ).
Физические свойства
Масса вириона - 252•10³ г/моль. Плавучая плотность 1,32-1,35 г/мл в градиенте C_sCl. Константа седиментации зрелого вириона равна 810•10^-13-910•10^-13 с.

Устойчивость к внешним факторам
Штамм КР95 114 устойчив к действию эфира, хлороформа, сапонина и дезоксихолата натрия, чувствителен к формальдегиду, β-пропиолактону, гидроксиламину, производным этиленимина, УФ-облучению, γ-облучению.

Штамм КР95 114 довольно устойчив к нагреванию и к изменению рН среды в широком интервале, резистентен к действию 0,25% раствора трипсина, 2% раствора фенола и 50% раствора этилового спирта. Абсолютный этанол, так же как и его йодный раствор, вызывает полную инактивацию вируса.

Штамм КР95 114 устойчив к многократному повторению циклов замораживания и оттаивания, не теряет инфекционных свойств при сублимационном высушивании.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность -100%
Патогенность выражена
Вирулентность выражена
Контагиозность выражена
Онкогенность отсутствует
Исходя из полученных данных можно утверждать, что штамм КР95 114 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса СГПК. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактика вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существующим признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1.

Для получения вакцины из штамма КР95 114 матровым вирусом внутримышечно в объеме 1 см³ заражают 5-50-суточных цыплят, полученных из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. Цыплят содержат 120 часов после заражения. У больных и павших цыплят отбирают печень. Печень подвергают размолу на коллоидной мельнице в течение 10-12 минут, затем вируссодержащую массу смешивают с фосфатным буферным раствором, получая в результате 10-20% вируссодержащую суспензию. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей известным образом. Для этого можно использовать низкоскоростное центрифугирование, обработку суспензии различными детергентами (фреон-113, хлороформ) и флокулянтом высокомолекулярным полигексаметиленгуанидингидрохлоридом (ВПГ) в сочетании с низкоскоростным центрифугированием или сепарированием. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных белков проводят при 6-12^oС. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор. Для инактивации вируса используют димер этиленимина (ДЭИ). Предварительно готовят 10% раствор ДЭИ на деминерализованной воде рН 7,9-8,0. Затем в подогретую до 28-34^oС вируссодержащую суспензию вносят 10% водный раствор ДЭИ до концентрации 0,15-0,4%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 35-36^oС в течение 24 часов. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8^oС. В качестве адъюванта-сорбента в вакцине используют стерильный 3-4% коллоидный раствор ГОА. рН ГОА устанавливают в пределах 7,5-7,6 и охлаждают до 2-8^oС. К охлажденному антигену при постоянном перемешивании добавляют ГОА до концентрации 0,1%. Затем к смеси дополнительно добавляют 10% водный раствор адъюванта сапонина из расчета 0,5 мг на дозу вакцины, доводя концентрацию сапонина в вакцине до 0,5-2%. После перемешивания смеси в течение часа определяют рН препарата и при необходимости доводят его значение до 7,4-7,6. Полученную вакцину контролируют на авирулентность, безвредность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89.

Авирулентность и безвредность препарата определяют путем введения 10-15-суточным цыплятам вакцины в тройной дозе.

Полученная вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.

Полученная вакцина против СГПК имеет оптимальный компонентный состав (рецептура), мас.% (см. табл.А).

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Серию вакцины выпускают для практического применения, если в максимальном прививочном объеме для цыплят, равном 0,5 см³, содержится не менее 7 протективных доз (ПД₅₀).

Вакцину применяют клинически здоровой птице для создания высокого уровня иммунитета. Бройлерных цыплят вакцинируют однократно в возрасте 1-18 суток. Цыплятам вакцину вводят внутримышечно в область бедра или груди или подкожно в среднюю треть шеи в объеме 0,3 см³. Однократная прививка инактивированной сорбированной вакциной против СГПК обеспечивает 90-100% защиту иммунизированных цыплят от заболевания СГПК в период, начиная с третьего дня после введения вакцины. Ремонтный молодняк иммунизируют дважды: первый раз в 1-18-суточном возрасте в дозе 0,3-0,5 см³ и второй раз в 90-140-суточном возрасте в дозе 0,5-0,7 см³. Иммунитет наступает с третьего дня после вакцинации и сохраняется до 8 месяцев. Двукратное применение вакцины в родительском стаде обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 8-12-суточного возраста, что позволяет его защитить от полевого вирулентного вируса СГПК в ранний период жизни.

Пример 2.

Проведены исследования по определению антигенной активности каждой рецептуры инактивированной вакцины против СГПК, полученной так, как описано в примере 1.

Антигенную активность образцов вакцины определяли на цыплятах 15-суточного возраста, свободных от антител к вирусу СГПК. Образцы вакцины вводили в дозе 0,3 см³ в мышцу бедра. Через 21 сутки после вакцинации у цыплят отбирали кровь, получали сыворотки и их исследовали в РДП со специфической сывороткой, гипериммунной к вирусу СГПК. Результаты исследований представлены в табл. 1, 2 и 3 соответственно.

Результаты, представленные в табл. 1, 2 и 3, свидетельствуют о высокой антигенной активности инактивированной вакцины против СГПК из штамма КР95 114.

Пример 3.

Проведены исследования по определению иммуногенной активности инактивированной вакцины против СГПК, полученной так, как описано в примере 1. Для этого была поставлена серия опытов на цыплятах 10-суточного возраста, не имеющих антител к вирусу СГПК, которые служили биологической моделью для проверки иммунного ответа птицы на введение вакцины. В опыт было взято 350 цыплят, которых разделили на девять групп по 50 голов в каждой. Восемь групп являлись подопытными, которым вводили вакцину, и одна группа служила контролем. Цыплят опытных групп прививали однократно внутримышечно в дозах 0,15; 0,3 и 0,5 см³ инактивированной сорбированной вакциной 2 и 5 серии. На 3, 5, 7, 10 и 14 сутки после вакцинации из каждой группы отбирали по 10 цыплят, которых помещали в отдельный бокс и заражали внутримышечно вирусом СГПК из штамма КР95 в дозе 3,78±0,23 Ig ЛД₅₀/0,2 см³. После контрольного заражения за птицей вели наблюдение в течение 10 дней. Павших цыплят регистрировали и подсчитывали процент защиты. Результаты проведенных исследований представлены в табл.4. Как видно из данных, приведенных в табл.4, однократная вакцинация цыплят в дозе 0,5 см³ обеспечивала 100% защиту от контрольного заражения уже через 3 суток после введения препарата. В группах цыплят, которым вводили инактивированную сорбированную вакцину в дозах 0,15 и 0,3 см³, 100% защита от контрольного заражения наступала на 5-7 сутки после вакцинации. Смертность в контрольной группе цыплят была на уровне 80-100%.

Пример 4.

Проведены исследования по определению фактической иммуногенной активности (ИмД₅₀/см³) и протективной активности прививной дозы инактивированной сорбированной вакцины против СГПК, изготовленной так, как описано в примере 1. Для этого были поставлены опыты на цыплятах яичного кросса 8-суточного возраста, не имеющих антител к вирусу СГПК. В опытах использовали цыплят общим количеством 250 голов. Цыплят прививали инактивированной сорбированной вакциной против СГПК 2, 3 и 5 серий. Иммуногенную активность образцов вакцины определяли объемным методом с применением расчетов по формуле Кербера-Ашмарина. Протективную активность вакцины (ПД₅₀) рассчитывали путем деления прививной дозы вакцины на значение ИмД₅₀. Результаты исследований приведены в табл. 5. В опытах установлено, что на иммуногенную активность инактивированной вакцины против СГПК существенно не влияет способ введения препарата. Так, ИмД₅₀ при введении вакцины подкожно была равна 0,0107 см³, а внутримышечно - 0,012 см³. Из данных табл.5 видно, что одна прививная доза вакцины в объеме 0,3 см³ при подкожном введении препарата содержит (28±1,15) ПД₅₀, а одна прививная доза вакцины в объеме 0,3 см³ при внутримышечном введении содержит (25±1,15) ПД₅₀.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- способ изготовления инактивированной вакцины против СГПК, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью приведенных в описании или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемого способа изготовления инактивированной вакцины против СГПК достигнут технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Cowen B. S., Lu H. et al. Characterization studies of fowl adenoviruces associated with inclusion body hepatitis / hydropericardium syndrome in chickens. Presented at the 68-th Northeastern Conference in Avian Diseases. June 10-12 1996, p.14.

2. Лагуткин Н.А., Арсентьев А.Р. и др. Массовый гидроперикардит у мясных цыплят раннего возраста. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Материалы научн. конф. ВНИИВВиМ. -Покров, 1992, ч.2, 248-251.

3. Borisov V.V., Borisov A.V. et. al. Hydropericardium syndrome in chickens in Russia // Proc. of the 11^th Int. Congress of the World Vet. Polt. Ass. August 18-22, Budapest, Hungary.-1997.-P.258.

4. Winterfield R.W., Fadly A.M. et al. Immunisation of chicken against adenovirus infection. Poult. Sci., 1977, V.56, N5, 1481-1486.

5. Ahmad I., Malik M.I. et. al. Efficacy of formalinized level-organ-vaccine against Angara disease in broilers // Veterinarski Arhiv.-1990.-V. 60.-N3.-P.131-138 (прототип).

6. Ahmad I. , Ahmad K. et al. Comparative efficacy of different Angara disease vaccine in broilers. Zootecnica International, 1991, V.30, N6, 67-69.

Формула изобретения

1. Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур, включающий приготовление антигенного материала в виде вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных возбудителем инфекции и павших с признаками синдрома гидроперикардита кур, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса и контроль целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве возбудителя инфекции используют штамм вируса синдрома гидроперикардита кур сем. Adenoviridae, род Aviadenovirus, группа 1, серотип 4, коллекция ВГНКИ КР95 114-ДЕП, в эффективном количестве, а очищенный и авирулентный антигенный материал из этого вируса соединяют с адъювантом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения антигенного материала используют печень 5-50-суточных цыплят.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что штамм КР95 114 вируса синдрома гидроперикардита кур культивируют в организме 5-50-суточных цыплят в течение 48-120 ч.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют антигенный материал с биологической активностью 3,25-5,0 lgЛД₅₀/0,2 см³.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что очищенный антигенный материал инактивируют димером этиленимина.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что димер этиленимина используют в виде 10%-ного водного раствора.

7. Способ по любому из пп.5 и 6, отличающийся тем, что димер этиленимина вносят в антигенный материал до концентрации 0,15-0,4%.

8. Способ по любому из пп.5-7, отличающийся тем, что инактивацию антигенного материала димером этиленимина ведут в течение 23-25 ч при 35-36^oС и рН 7,4-7,6.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что из адъювантов используют гидроокись алюминия.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что гидроокись алюминия используют в виде 3-4%-ного коллоидного раствора.

11. Способ по любому из пп.9 и 10, отличающийся тем, что гидроокись алюминия вносят в антигенный материал до концентрации по меньшей мере 0,1%.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что из адъювантов используют дополнительно сапонин.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что сапонин используют в виде 10%-ного водного раствора.

14. Способ по любому из пп.12 и 13, отличающийся тем, что сапонин вносят в антигенный материал до концентрации 0,5-2%.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3