Способ получения рекомбинантной молекулы днк из одного или более одноцепочечного или двуцепочечного матричных полинуклеотидов (варианты)

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано для осуществления in vitro мутагенеза и рекомбинации полинуклеотидных последовательностей. Способ in vitro мутагенеза и рекомбинации полинуклеотидных последовательностей основан на катализируемом полимеразой удлинении праймерных олигонуклеотидов. Способ включает праймирование матричного полинуклеотида (полинуклеотидов) праймерами со случайными последовательностями или определенными последовательностями для создания пула коротких ДНК фрагментов с низким уровнем точечных мутаций. ДНК фрагменты подвергают денатурированию с последующим отжигом и последующей катализируемой ферментом ДНК полимеризацией. Процедуру повторяют достаточное число раз для получения генов полной длины, которые содержат мутанты исходных матричных полинуклеотидов. Гены далее амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции и клонируют в вектор для экспрессии кодируемых протеинов. Изобретение позволяет получать генные продукты с улучшенными свойствами. 2 с. и 60 з.п.ф-лы, 13 ил., 5 табл.

Текст описания в факсимильном виде. Тг

Формула изобретения

1. Способ получения рекомбинантной молекулы ДНК из одного или более одноцепочечного или двуцепочечного матричных полинуклеотидов, включающий стадии: (I) создания пула ДНК фрагментов в результате (А) получения реакционной смеси, содержащей (1) по крайней мере, одну копию каждого матричного полинуклеотида (полинуклеотидов); (2) множество копий, по крайней мере, одного определенного или определенного с ограниченной случайностью праймера или множество копий, по крайней мере, одного набора случайных праймеров формулы (N)_L, причем каждое N является независимо dAMP, dGMP, dCMP или dTМP, a L представляет собой длину, выраженную в нуклеотидах для каждого праймера в наборе; (3) воду и (4) необязательно, фермент ДНК-полимеразы, dATP, dGTP, dTTP, dCTP и среду для реакции ДНК полимеризации; (В) денатурации любых двуцепочечных полинуклеотидов, присутствующих в указанной реакционной смеси, в условиях денатурации, получая тем самым пул, содержащий одноцепочечный матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) и одноцепочечные праймеры; (С) осуществления отжига указанных одноцепочечных праймеров с указанным одноцепочечным матричным полинуклеотидом (полинуклеотидами) в условиях, обеспечивающих отжиг, (D) необязательно, добавления в реакционную смесь фермента ДНК-полимеразы, dATP, dGTP, dTTP, dCTP и среды для реакции ДНК полимеризации; (Е) инициирования катализируемой ферментом реакции ДНК полимеризации в указанной реакционной смеси в условиях полимеризации; (F) осуществления указанной реакции ДНК полимеризации до, по крайней мере, частичного удлинения, приводящего к образованию ДНК фрагментов; (G) повторения стадий (I. B)-(I.F), если это необходимо и сколько необходимо, до получения в указанной реакционной смеси пула ДНК фрагментов, средний размер (размеры) которого (которых) меньше, чем длина (длины) матричного полинуклеотида (полинуклеотидов), и диапазон размеров ДНК фрагментов достаточен для того, чтобы, по крайней мере, некоторые ДНК фрагменты отжигались друг с другом с образованием, после дальнейших денатурации (денатураций), отжига (отжигов) и удлинения (удлинений) молекулы ДНК, которая имеет, по крайней мере, такую же длину, что и, по крайней мере, один из матричных полинуклеотидов; (II) вторичной сборки ДНК фрагментов в, по крайней мере, одну рекомбинантную полноразмерную молекулу ДНК в результате: (А) денатурации любых двуцепочечных полинуклеотидов, присутствующих в указанной реакционной смеси, в условиях денатурации, получая тем самым пул, содержащий одноцепочечные фрагменты ДНК; (В) осуществления отжига указанных одноцепочечных ДНК фрагментов друг с другом в условиях, обеспечивающих отжиг; (С) инициирования катализируемой ферментом реакции ДНК полимеризации в указанной реакционной смеси в условиях, обеспечивающих полимеризацию; (D) осуществления указанной реакции ДНК полимеризации до, по крайней мере, частичного удлинения ДНК фрагментов, подвергнутых отжигу; (Е) повторения стадий (II.A)-(II.D), если это необходимо и сколько необходимо, до тех пор, пока не образуется, по крайней мере, одна молекула ДНК, которая имеет, по крайней мере, такую же длину, что и, по крайней мере, один из матричных полинуклеотидов, получая тем самым, по крайней мере, одну полноразмерную молекулу ДНК, причем, по крайней мере, одна из полноразмерных молекул ДНК содержит ДНК последовательность, которая представляет собой рекомбинацию нуклеотидной последовательности (последовательностей), по крайней мере, одного из матричных полинуклеотидов, получая тем самым рекомбинантную полноразмерную молекулу ДНК; (III) причем, по крайней мере, одна из рекомбинантных полноразмерных молекул ДНК: (А) кодирует генный продукт, содержащий, по крайней мере, одно измененное или улучшенное свойство по сравнению со свойствами генного продукта (продуктов), кодируемого матричным полинуклеотидом (полинуклеотидами); или (В) содержит, по крайней мере, одно измененное или улучшенное свойство по сравнению со свойствами матричного полинуклеотида (полинуклеотидов); или (С) оба (III.A) и (III.B); (IV) при условии, что (А) если на стадии (I.A.2) представлены только внутренние праймеры, то полимерную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ПЦР праймеров осуществляют на пуле ДНК фрагментов, полученных на стадии (I.G) до тех пор, пока не получают, по крайней мере, одну рекомбинантную полноразмерную молекулу ДНК, подпадающую под описание стадии (III); (В) если полное удлинение может происходить в условиях, используемых на стадиях (I.Е-I.F), то на стадии (I.А.2) концевые или фланкирующие праймеры не представлены без одновременного представления множества копий, по крайней мере, одного внутреннего праймера; (С) концентрация связывания праймеров на матрицу ниже, чем концентрация, обеспечивающая такой высокий уровень стерических затруднений, при котором подавляется удлинение праймеров, не позволяя тем самым получить на стадии (I. G) диапазона размеров фрагментов ДНК, достаточного для возможности осуществления отжига по крайней мере некоторых ДНК фрагментов друг с другом с образованием, после дальнейших денатурации (денатураций), отжига (отжигов) и удлинения (удлинений), молекулы ДНК, которая имеет, по крайней мере, такую же длину, что и, по крайней мере, один из матричных полинуклеотидов; и (D) cтадию (I.А.4), или стадию (I.D), или обе стадии (I.А.4) и (I. D) осуществляют в ходе проведения этого способа.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (II.Е) средний размер (размеры) ДНК фрагментов приблизительно равен длине (длинам) матричной ДНК последовательности (последовательностей).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (I.F) указанную реакцию ДНК полимеризации осуществляют до полного удлинения каждого праймера, подвергнутого отжигу.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (I.F) указанную реакцию ДНК полимеризации осуществляют до добавления, по крайней мере, около 24 нуклеотидов к каждому праймеру, подвергнутому отжигу.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанную реакцию полимеризации осуществляют до добавления по крайней мере около 50 нуклеотидов к каждому праймеру, подвергнутому отжигу.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанную реакцию полимеризации осуществляют до добавления, по крайней мере, около 500 нуклеотидов к каждому праймеру, подвергнутому отжигу.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (I.А.2), по крайней мере, один из указанных праймеров является мутагенным праймером.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что между стадиями (I.G) и (II) матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) удаляют из реакционной смеси.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) является РНК, а указанный фермент ДНК-полимеразы является РНК-зависимой ДНК-полимеразой.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) является ДНК, а указанный фермент ДНК-полимеразы является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что полное удлинение может происходить в условиях, используемых на стадии (II.D).

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (I.А.1) представлены, по крайней мере, два различных матричных полинуклеотида, включающих первый матричный полинуклеотид и второй матричный полинуклеотид.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанный первый матричный полинуклеотид отличается от указанного второго матричного полинуклеотида, по крайней мере, двумя нуклеотидами.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанные нуклеотиды отделены друг от друга.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанные нуклеотиды отделены друг от друга по крайней мере около 15 нуклеотидами.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по крайней мере, один указанный матричный полинуклеотид представляет собой ДНК, полученную как обратный транскрипт молекулы РНК.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что длина указанного праймера (праймеров) составляет, по крайней мере, 6 нуклеотидов.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что длина указанного праймера (праймеров) составляет от 6 до 100 нуклеотидов.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что длина праймера (праймеров) составляет от 6 до 24 нуклеотидов.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную полноразмерную молекулу (молекулы) ДНК амплифицируют полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанную полноразмерную молекулу (молекулы) ДНК вначале выделяют из реакционной смеси, а затем амплифицируют ПЦР.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный определенный праймер (праймеры) с ограниченной случайностью демонстрирует случайность в одном или более нуклеотидном положении в праймере (праймерах).

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанный определенный праймер (праймеры) с ограниченной случайностью демонстрирует случайность в более чем 30% нуклеотидных положений в праймере (праймерах).

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный определенный с ограниченной случайностью праймер (праймеры) демонстрирует случайность в более чем 60% нуклеотидных положений в праймере (праймерах).

25. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (I.А.2) представлены множество копий, по крайней мере, двух праймеров.

26. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймерами являются случайные праймеры.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что полное удлинение может происходить в условиях, используемых на стадии (I.F).

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что на стадии (I.G) не повторяют стадии (I.В) - (I.F).

29. Способ по п.1, отличающийся тем, что в ходе проведения этого способа стадию (I.А.4) осуществляют один раз, а стадию (I.D) не осуществляют.

30. Способ по п.1, отличающийся тем, что в ходе проведения этого способа стадию (I.D) осуществляют один раз, а стадию (I.А.4) не осуществляют.

31. Способ по п.12, отличающийся тем, что по крайней мере одна из полноразмерных молекул ДНК на стадии (II.Е) содержит ДНК последовательность, которая представляет собой рекомбинацию нуклеотидных последовательностей, по крайней мере, двух матричных полинуклеотидов.

32. Способ по п. 12, отличающийся тем, что ДНК фрагменты осуществляют случайное вторичное праймирование матричных полинуклеотидов на стадии (I.G), или на стадии (II), или на обеих стадиях (I.G) и (II).

33. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по крайней мере, один из указанных матричных полинуклеотидов является рекомбинантной полноразмерной молекулой ДНК, полученной способом по п.1.

34. Способ получения рекомбинантной молекулы ДНК из одного или более одноцепочечного или двуцепочечного матричных полинуклеотидов, включающий стадии (I) создания, по крайней мере, одного рекомбинантного ДНК фрагмента в результате: (А) получения реакционной смеси, содержащей: (1) по крайней мере, одну копию каждого матричного полинуклеотида (полинуклеотидов); (2) по крайней мере, одну копию, по крайней мере, одного определенного концевого или определенного с ограниченной случайностью концевого праймера; (3) воду и (4) необязательно фермент ДНК-полимеразы, dATP, dGTP, dTTP, dCTP и среду для реакции ДНК полимеризации; (В) денатурации любых двуцепочечных полинуклеотидов, присутствующих в указанной реакционной смеси в условиях денатурации, получая тем самым пул, содержащий одноцепочечный матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) и одноцепочечный праймер (праймеры); (С) осуществления отжига указанного одноцепочечного праймера (праймеров) вместе с указанным одноцепочечным матричным полинуклеотидом (полинуклеотидами) в условиях, обеспечивающих отжиг; (D) необязательного добавления в реакционную смесь фермента ДНК-полимеразы, dATP, dGTP, dTTP, dCTP и среды для реакции ДНК полимеризации; (Е) инициирования катализируемой ферментом реакции ДНК полимеризации в указанной реакционной смеси в условиях полимеризации; (F) осуществления указанной реакции ДНК полимеризации до, по крайней мере, частичного удлинения, приводящего к образованию ДНК фрагмента (фрагментов); (G) повторения стадий (I.В)-(I.F), где ДНК фрагмент (фрагменты) снова праймируют и удлиняют на матричном полинуклеотиде (полинуклеотидах), до получения в указанной реакционной смеси ДНК фрагмента (фрагментов), средний размер (размеры) которого (которых) меньше, чем длина (длины) матричного полинуклеотида (полинуклеотидов), причем, по крайней мере, один ДНК фрагмент содержит ДНК последовательность, которая представляет собой рекомбинацию нуклеотидной последовательности (последовательностей), по крайней мере, одного матричного полинуклеотида (полинуклеотидов), получая тем самым, по крайней мере, один рекомбинантный ДНК фрагмент; (II) создания, по крайней мере, одной рекомбинантной полноразмерной молекулы ДНК из рекомбинантного ДНК фрагмента (фрагментов) в результате (А) денатурации всех двуцепочечных полинуклеотидов, присутствующих в указанной реакционной смеси, в условиях денатурации, получая тем самым пул, содержащий одноцепочечный матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) и одноцепочечный ДНК фрагмент (фрагменты); (В) осуществления отжига указанных одноцепочечных ДНК фрагментов вместе с указанным одноцепочечным матричным полинуклеотидом (полинуклеотидами) в условиях, обеспечивающих отжиг; (С) инициирования катализируемой ферментом реакции ДНК полимеризации в указанной реакционной смеси в условиях, обеспечивающих полимеризацию; (D) осуществления указанной реакции ДНК полимеризации до, по крайней мере, частичного удлинения ДНК фрагмента (фрагментов), подвергнутого отжигу; (Е) повторения стадий (II. А)-(II. D), если необходимо и сколько необходимо, до образования, по крайней мере, одной молекулы ДНК, которая имеет, по крайней мере, такую же длину, что и, по крайней мере, один из матричных полинуклеотидов, получая тем самым, по крайней мере, одну полноразмерную молекулу ДНК, причем, по крайней мере, одна из полноразмерных молекул ДНК содержит ДНК последовательность, которая представляет собой рекомбинацию нуклеотидной последовательности (последовательностей) из, по крайней мере, одного из матричных полинуклеотидов, получая тем самым, рекомбинантную полноразмерную молекулу ДНК; (III) причем по крайней мере одна из рекомбинантных полноразмерных молекул ДНК А) кодирует генный продукт, содержащий по крайней мере одно измененное или улучшенное свойство по сравнению со свойствами генного продукта (продуктов), кодируемого матричным полинуклеотидом (полинуклеотидами); или (В) обладает, по крайней мере, одним измененным или улучшенным свойством по сравнению со свойствами матричного полинуклеотида (полинуклеотидов) или (С) оба (III.А) и (III.В); (IV) при условии, что (А) концентрация связывания праймеров на матрицу ниже, чем концентрация, которая обеспечивает такой высокий уровень стерических затруднений, при котором подавляется удлинение праймеров, не позволяя тем самым получить на стадии (I.G), по крайней мере, одного ДНК фрагмента, содержащего ДНК последовательность, которая представляет собой рекомбинацию нуклеотидной последовательности (последовательностей) из, по крайней мере, одного матричного полинуклеотида (полинуклеотидов); и (В) стадию (I.А), или стадию (I.D), или обе стадии (I.А.4) и (I.D) осуществляют в ходе проведения этого способа.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что на стадии (II.Е) средний размер (размеры) ДНК фрагментов приблизительно равен длине (длинам) матричной ДНК последовательности (последовательностей).

36. Способ по п.34, отличающийся тем, что на стадии (I.F) указанную реакцию ДНК полимеризации осуществляют до добавления, по крайней мере, около 24 нуклеотидов к каждому праймеру, подвергнутому отжигу.

37. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанную реакцию полимеризации осуществляют до добавления, по крайней мере, около 50 нуклеотидов к каждому праймеру, подвергнутому отжигу.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что указанную реакцию полимеризации осуществляют до добавления, по крайней мере, около 500 нуклеотидов к каждому праймеру, подвергнутому отжигу.

39. Способ по п.34, отличающийся тем, что на стадии (I.А.2), по крайней мере, один из указанных праймеров является мутагенным праймером.

40. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанный матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) является РНК, а указанный фермент ДНК полимеразы является РНК-зависимой ДНК-полимеразой.

41. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанный матричный полинуклеотид (полинуклеотиды) является ДНК, а указанный фермент ДНК полимеразы является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой.

42. Способ по п.34, отличающийся тем, что полное удлинение может происходить в условиях, используемых на стадии (II.D).

43. Способ по п.34, отличающийся тем, что на стадии (I.А. 1) представлены, по крайней мере, два различных матричных полинуклеотида, включающих первый матричный полинуклеотид и второй матричный полинуклеотид.

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что указанный первый матричный полинуклеотид отличается от указанного второго матричного полинуклеотида, по крайней мере, двумя нуклеотидами.

45. Способ по п.44, отличающийся тем, что указанные нуклеотиды отделены друг от друга.

46. Способ по п.45, отличающийся тем, что указанные нуклеотиды отделены друг от друга, по крайней мере, около 15 нуклеотидами.

47. Способ по п.34, отличающийся тем, что, по крайней мере, один указанный матричный полинуклеотид представляет собой ДНК, полученную как обратный транскрипт молекулы рНК.

48. Способ по п. 34, отличающийся тем, что длина указанного праймера (праймеров) составляет по крайней мере 6 нуклеотидов.

49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что длина указанного праймера (праймеров) составляет от 6 до 100 нуклеотидов.

50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что длина праймера (праймеров) составляет от 6 до 24 нуклеотидов.

51. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанную полноразмерную молекулу (молекулы) ДНК амплифицируют полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

52. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанную полноразмерную молекулу (молекулы) ДНК вначале выделяют из реакционной смеси, а затем амплифицируют ПЦР.

53. Способ по п.34, отличающийся тем, что на стадии (I.А.2) представлено множество копий указанного концевого праймера (праймеров).

54. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанный определенный праймер (праймеры) с ограниченной случайностью демонстрирует случайность в одном или более нуклеотидном положении в праймере (праймерах).

55. Способ по п.54, отличающийся тем, что указанный определенный праймер (праймеры) с ограниченной случайностью демонстрирует случайность в более чем 30% нуклеотидных положений в праймере (праймерах).

56. Способ по п.55, отличающийся тем, что указанный определенный с ограниченной случайностью праймер (праймеры) демонстрирует случайность в более чем 60% нуклеотидных положений в праймере (праймерах).

57. Способ по п.34, отличающийся тем, что на стадии (I.А.2) представлены множество копий, по крайней мере, двух праймеров.

58. Способ по п.34, отличающийся тем, что в ходе проведения этого способа стадию (I.А.4) осуществляют один раз, а стадию (I.D) не осуществляют.

59. Способ по п.34, отличающийся тем, что в ходе проведения этого способа стадию (I.D) осуществляют один раз, а стадию (I.А.4) не осуществляют.

60. Способ по п.43, отличающийся тем, что, по крайней мере, одна из полноразмерных молекул ДНК на стадии (II.E) содержит ДНК последовательность, которая представляет собой рекомбинацию нуклеотидных последовательностей, по крайней мере, двух матричных полинуклеотидов.

61. Способ по п. 43, отличающийся тем, что ДНК фрагменты осуществляют случайное вторичное праймирование матричных полинуклеотидов на стадии (I.G), или на стадии (II), или на обеих стадиях (I.G) и (II).

62. Способ по п. 34, отличающийся тем, что, по крайней мере, один из указанных матричных полинуклеотидов является рекомбинантной полноразмерной молекулой ДНК, полученной способом по п.34.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99