Полипептид, обладающий гемопоэтической биологической активностью фактора стволовых клеток (варианты), днк (варианты), экспрессирующий вектор (варианты), фармацевтическая композиция для гемопоэтической терапии, способ получения полипептида и способ его использования (варианты)

 

Изобретение относится к области биотехнологии. Получены новые полипептиды, обладающие гемопоэтической биологической активностью фактора стволовых клеток (SCF) с использованием генно-инженерных методов. Полипептиды экспрессируются клеткой-хозяином, несущим вектор, содержащий ДНК, кодирующий один из вариантов полипептида. Способ позволяет получать рекомбинантный полипептидный продукт экспрессии ДНК-последовательности. Полипептиды или рекомбинантные полипептидные продукты входят в состав фармацевтической композиции для гемопоэтической терапии у млекопитающих. Кроме того, они могут быть использованы для повышения эффективности генной терапии, стимуляции ранних гематопоэтических клеток-предшественников, усиления прививки костного мозга при трансплантации, усиления степени восстановления костного мозга при лечении аплазии или миелосупрессии костного мозга, вызванных физико-химическими факторами. Изобретение позволяет получать полипептиды, не встречающиеся в природе, имеющие достаточно дупликативные аминокислотные последовательности, которые могут заменить природные факторы стволовой клетки. 21 с. и 61 з.п.ф-лы, 68 ил., 17 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть) Та

Формула изобретения

1. Полипептид, который имеет частично или полностью первичную структуру последовательности, приведенной на фиг. 15С, и обладает гемопоэтической биологической активностью встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанный полипептид выбирают из группы, состоящей из SCF 1-148, SCF 1-162, SCF 1-164, SCF 1-165 и SCF 1-183 (используя нумерацию фиг. 15С).

2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что он является продуктом прокариотической или эукариотической экспрессии экзогенной ДНК-последовательности.

3. Полипептид по п. 2, отличающийся тем, что экзогенная ДНК-последовательность представляет собой последовательность кДНК.

4. Полипептид по п. 2, отличающийся тем, что экзогенная ДНК-последовательность представляет собой геномную ДНК-последовательность, которая экспрессируется в эукариотической клетке-хозяине.

5. Полипептид по любому из пп. 2-4, отличающийся тем, что экзогенную ДНК-последовательность переносят на автономно реплицирующуюся плазмиду или вирусный вектор.

6. Полипептид по любому из пп. 2-5, отличающийся тем, что он ковалентно связан с детектируемым веществом-меткой.

7. Полипептид по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что один или несколько остатков цистеина заменены остатком аланина или серина.

8. Полипептид, который имеет частично или полностью первичную структуру последовательности, приведенной на фиг. 42, и обладает гемопоэтической биологической активностью встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанный полипептид выбирают из группы, состоящей из SCF 1-185, SCF 1-188, SCF 1-189 и SCF 1-248 (используя нумерацию фиг. 42).

9. Полипептид по п. 8, отличающийся тем, что он является продуктом прокариотической или эукариотической экспрессии экзогенной ДНК-последовательности.

10. Полипептид по п. 9, отличающийся тем, что экзогенная ДНК-последовательность представляет собой последовательность кДНК.

11. Полипептид по п. 9, отличающийся тем, что экзогенная ДНК-последовательность представляет собой геномную ДНК-последовательность, которая экспрессируется в эукариотической клетке-хозяине.

12. Полипептид по любому из пп. 9-11, отличающийся тем, что экзогенную ДНК-последовательность переносят на автономно реплицирующуюся плазмиду или вирусный вектор.

13. Полипептид по любому из пп. 9-12, отличающийся тем, что он ковалентно связан с детектируемым веществом-меткой.

14. Полипептид по любому одному из пп. 8-13, отличающийся тем, что один или несколько остатков цистеина заменены остатком аланина или серина.

15. Полипептид, который имеет частично или полностью первичную структуру последовательности, приведенной на фиг. 44, и обладает гемопоэтической биологической активностью встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанный полипептид выбирают из группы, состоящей из SCF 1-157, SCF 1-160, SCF 1-161 и SCF 1-220 (используя нумерацию фиг. 44).

16. Полипептид по п. 15, отличающийся тем, что он является продуктом прокариотической или эукариотической экспрессии экзогенной ДНК-последовательности.

17. Полипептид по п. 16, отличающийся тем, что экзогенная ДНК-последовательность представляет собой последовательность кДНК.

18. Полипептид по п. 16, отличающийся тем, что экзогенная ДНК-последовательность представляет собой геномную ДНК-последовательность, которая экспрессируется в эукариотической клетке-хозяине.

19. Полипептид по любому из пп. 16-18, отличающийся тем, что экзогенную ДНК-последовательность переносят на автономно реплицирующуюся плазмиду или вирусный вектор.

20. Полипептид по любому из пп. 16-19, отличающийся тем, что он ковалентно связан с детектируемым веществом-меткой.

21. Полипептид по любому из пп. 15-20, отличающийся тем, что один или несколько остатков цистеина заменены остатком аланина или серина.

22. Полипептид, который имеет частично или полностью первичную структуру последовательности, приведенной на фиг. 14С, и обладает гемопоэтической биологической активностью встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанный полипептид выбирают из группы, состоящей из SCF 1-162, SCF 1-164 и SCF 1-193 (используя нумерацию фиг. 14).

23. Полипептид по п. 22, отличающийся тем, что он является продуктом прокариотической или эукариотической экспрессии экзогенной ДНК-последовательности.

24. Полипептид по п. 23, отличающийся тем, что экзогенная ДНК-последовательность представляет собой последовательность кДНК.

25. Полипептид по п. 23, отличающийся тем, что экзогенная ДНК-последовательность представляет собой геномную ДНК-последовательность, которая экспрессируется в эукариотической клетке-хозяине.

26. Полипептид по любому из пп. 23-25, отличающийся тем, что экзогенную ДНК-последовательность переносят на автономно реплицирующуюся плазмиду или вирусный вектор.

27. Полипептид по любому из пп. 23-26, отличающийся тем, что он ковалентно связан с детектируемым веществом-меткой.

28. Полипептид по любому одному из пп. 22-27, отличающийся тем, что один или несколько остатков цистеина заменены остатком аланина или серина.

29. Полипептид по любому из пп. 1-28 для использования в производстве медикамента для проведения гемопоэтической терапии у млекопитающих.

30. ДНК-последовательность для использования в экспрессировании в эукариотической клетке-хозяине полипептида по п. 1 или 22, причем указанная последовательность ДНК выбрана из (a) ДНК-последовательностей, приведенных на фиг. 14В (п. 22) или 15В (п. 1); (b) ДНК-последовательностей, которые гибридизуются с ДНК-последовательностями, указанными в (а) или их фрагментами; и (c) ДНК-последовательностей, которые с учетом вырожденности генетического кода, гибридизуются с ДНК-последовательностями, указанными в (а) и (b), причем последовательности кодированного ими полипептида имеют такие же аминокислотные последовательности.

31. ДНК-последовательность по п. 30, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в клетках не млекопитающих.

32. ДНК-последовательность по п. 31, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в дрожжевых клетках.

33. ДНК-последовательность по п. 30, отличающаяся тем, что она кодирует экспрессию фактора стволовых клеток человека.

34. ДНК-последовательность по любому из пп. 30-33, отличающаяся тем, что она ковалентно связана с детектируемой меткой.

35. ДНК-последовательность по п. 34, отличающаяся тем, что метка представляет собой радиоактивную метку.

36. ДНК-последовательность для использования в экспрессировании в эукариотической клетке-хозяине полипептида, имеющего гемопоэтическую биологическую активность встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанная ДНК-последовательность является последовательностью, комплементарной ДНК-последовательности, определенной в пп. 30-33.

37. ДНК-последовательность по п. 36, отличающаяся тем, что она ковалентно связана с детектируемой меткой.

38. ДНК-последовательность для использования в экспрессировании в прокариотической или эукариотической клетке-хозяина полипептидного продукта, имеющего частично или полностью первичную структуру встречающегося в природе фактора стволовых клеток, и обладает гемопоэтической активностью встречающегося в природе фактора стволовых клеток, причем указанная последовательность ДНК выбрана из (а) ДНК-последовательностей, приведенных на фиг. 14С или 15С; (b) ДНК-последовательностей, которые гибридизуются с ДНК-последовательностями, указанными в (а) или их фрагментами; и (c) ДНК-последовательностей, которые с учетом вырожденности генетического кода гибридизуются с ДНК-последовательностями, указанными в (а) и (b), причем последовательности кодированного ими полипептида имеют такие же аминокислотные последовательности.

39. ДНК-последовательность по п. 38, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в клетках не млекопитающих.

40. ДНК-последовательность по п. 39, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в E. coli.

41. ДНК-последовательность по п. 39, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экпрессии в дрожжевых клетках.

42. ДНК-последовательность по п. 38, отличающаяся тем, что она кодирует экспрессию фактора стволовых клеток человека.

43. ДНК-последовательность по п. 38, отличающаяся тем, что она кодирует экспрессию метионинового остатка в N-концевом положении указанного полипептида зрелого типа.

44. ДНК-последовательность по любому из пп. 38-43, отличающаяся тем, что она ковалентно связана с детектируемой меткой.

45. ДНК-последовательность по п. 44, отличающаяся тем, что метка представляет собой радиоактивную метку.

46. ДНК-последовательность для использования в экспрессировании в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине полипептидного продукта, имеющего гемопоэтическую биологическую активность встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанная ДНК-последовательность является последовательностью, комплементарной ДНК-последовательности, определенной в пп. 38-43.

47. ДНК-последовательность по п. 46, отличающаяся тем, что она ковалентно связана с детектируемой меткой.

48. ДНК-последовательность для использования в экспрессировании в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине полипептида, имеющего частично или полностью первичную структуру встречающегося в природе фактора стволовых клеток, и обладает гемопоэтической биологической активностью встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанный полипептид выбирают из группы, состоящей из SCF 1-162, SCF 1-164, SCF 1-165 и SCF 1-248 (используя нумерацию фиг. 42), причем указанная последовательность ДНК выбрана из (a) ДНК-последовательностей, приведенных на фиг. 42; (b) ДНК-последовательностей, которые гибридизуются с ДНК-последовательностями, указанными в (а) или их фрагментами; и (c) ДНК-последовательностей, которые с учетом вырожденности генетического кода гибридизуются с ДНК-последовательностями, указанными в (а) и (b), причем последовательности кодированного ими полипептида имеют такие же аминокислотные последовательности.

49. ДНК-последовательность по п. 48, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в клетках не млекопитающих.

50. ДНК-последовательность по п. 49, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в Е. соli.

51. ДНК-последовательность по п. 49, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экпрессии в дрожжевых клетках.

52. ДНК-последовательность по п. 48, отличающаяся тем, что она кодирует экспрессию метионинового остатка в N-концевом положении указанного полипептида зрелого типа.

53. ДНК-последовательность по любому из пп. 48-52, отличающаяся тем, что она ковалентно связана с детектируемой меткой.

54. ДНК-последовательность по п. 53, отличающаяся тем, что метка представляет собой радиоактивную метку.

55. ДНК-последовательность для использования в экспрессировании в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине полипептида, имеющего гемопоэтическую биологическую активность встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанная ДНК-последовательность является последовательностью, комплементарной ДНК-последовательности, определенной в пп. 48-52.

56. ДНК-последовательность по п. 55, отличающаяся тем, что она ковалентно связана с детектируемой меткой.

57. ДНК-последовательность для использования в экспрессировании в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине полипептида, имеющего частично или полностью первичную структуру встречающегося природе фактора стволовых клеток, и обладает гемопоэтической биологической активностью встречающегося в природе фактора стволовых клеток, причем указанный полипептид выбирают из группы, состоящей из SCF metl-157, SCF 1-157, SCF metl-160, SCF 1-160, SCF met 1-161, SCF 1-161, SCF met 1-220 и SCF 1-220 (используя нумерацию фиг. 44), причем указанная последовательность ДНК выбрана из (a) ДНК-последовательностей, приведенных на фиг. 44, (b) ДНК-последовательностей, которые гибридизуются с ДНК-последовательностями, указанными в (а) или их фрагментами; и (c) ДНК-последовательностай, которые с учетом вырожденности генетического кода, гибридизуются с ДНК-последовательностями, указанными в (а) и (b), причем последовательности кодированного ими полипептида имеют такие же аминокислотные последовательности.

58. ДНК-последовательность по п. 57, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в клетках не млекопитающих.

59. ДНК-последовательность по п. 58, отличающаяся тем, что она включает один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в E. coli.

60. ДНК-последовательность по п. 58, отличающаяся тем, что включает один или более кодонов, предпочтительных для экпрессии в дрожжевых клетках.

61. ДНК-последовательность по п. 57, отличающаяся тем, что она кодирует экспрессию метионинового остатка в N-концевом положении указанного полипептида зрелого типа.

62. ДНК-последовательность по любому из пп. 57-61, отличающаяся тем, что она ковалентно связана с детектируемой меткой.

63. ДНК-последовательность по п. 62, отличающаяся тем, что метка представляет собой радиоактивную метку.

64. ДНК-последовательность для использования в экспрессировании в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине полипептида, имеющего гемопоэтическую биологическую активность встречающегося в природе фактора стволовых клеток (SCF), причем указанная ДНК-последовательность является последовательностью, комплементарной ДНК-последовательности, определенной в пп. 57-61.

65. ДНК-последовательность по п. 64, отличающаяся тем, что она ковалентно связана с детектируемой меткой.

66. Экспрессирующий вектор V19.8 (фиг. 17), включающий ДНК по любому из пп. 30-65.

67. Экспрессирующий вектор pCFMl156 (фиг. 19), включающий ДНК по любому из пп. 30-65.

68. Способ получения полипептида, имеющего частично или полностью первичную структуру и обладающего гемопоэтической биологической активностью встречающегося в природе фактора стволовых клеток, отличающийся тем, что культивируют в подходящих питательных условиях прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные ДНК-последовательностью по любому из пп. 30-65 таким образом, чтобы клетка-хозяин была способна экспрессировать указанный полипептид, и выделяют желаемые полипептидные продукты экспрессии ДНК-последовательности.

69. Способ по п. 68, отличающийся тем, что ДНК-последовательность представляет собой последовательность кДНК.

70. Способ по п. 68, отличающийся тем, что ДНК-последовательность представляет собой последовательность геномной ДНК.

71. Рекомбинантный полипептидный продукт, полученный способом по пп. 68-70.

72. Рекомбинантный полипептидный продукт по п. 71 для использования в производстве медикамента для проведения гемопоэтической терапии у млекопитающих.

73. Фармацевтическая композиция для гемопоэтической терапии у млекопитающих, включающая эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-28 и/или рекомбинантного полипептидного продукта по п. 71 и фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель.

74. Фармацевтическая композиция по п. 72, отличающаяся тем, что полипептид по любому из пп. 1-28 и/или рекомбинантный полипептидный продукт по п. 71 ковалентно присоединены к водорастворимому полимеру.

75. Фармацевтическая композиция по п. 74, отличающаяся тем, что полимер выбран из полиэтиленгликоля или сополимера полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.

76. Способ повышения эффективности генной терапии па основе трансфекции гематопоэтических клеток, включающий культивирование гематопоэтических клеток с полипептидом по любому из пп. 1-28 перед трансфекцией культивированных клеток экзогенной ДНК.

77. Способ стимуляции ранних гематопоэтических клеток-предшественников, отличающийся тем, что указанная стимуляция достигается назначением терапевтически эффективного количества полипептида по пп. 1-28 или рекомбинантного полипептидного продукта по п. 71, одного или в сочетании по крайней мере с одним дополнительным гематопоэтическим фактором, пациенту, имеющему нарушение, выбранное из группы лейкопения, тромбоцитопения и анемия.

78. Способ усиления степени прививки костного мозга в ходе трансплантации у млекопитающих, отличающийся тем, что применяют терапевтически эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-28 или рекомбинантного полипептидного продукта по п. 71, одного или в сочетании по крайней мере с одним дополнительным гематопоэтическим фактором.

79. Способ усиления степени восстановления костного мозга при лечении аплазии или миелосупрессии костного мозга, вызванных действием радиации, химических агентов или химиотерапии, отличающийся тем, что лечат пациентов терапевтически эффективным количеством полипептида по любому из пп. 1-28 или рекомбинантного полипептидного продукта по п. 71, одного или в сочетании по крайней мере с одним дополнительным гематопоэтическим фактором.

80. Способ по любому из пп. 77-79, отличающийся тем, что дополнительный гематопоэтический фактор выбран из ЕРО, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и IGF-1.

81. Способ по любому из пп. 77-79, отличающийся тем, что дополнительный гематопоэтический фактор выбран из IL-8, IL-9 и IL-10.

82. Способ по любому из пп. 77-79, отличающийся тем, что дополнительный гематопоэтический фактор выбран из IL-11 и LIF.

Приоритет по пунктам: 16.10.1989 по пп. 1-7, 22-56, 66-73, 76-80; 11.06.1990 по пп. 74-75 и 81; 24.08.1990 по пп. 8-21, 57-65 и 82.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127, Рисунок 128, Рисунок 129, Рисунок 130, Рисунок 131, Рисунок 132, Рисунок 133, Рисунок 134, Рисунок 135, Рисунок 136, Рисунок 137, Рисунок 138, Рисунок 139, Рисунок 140, Рисунок 141, Рисунок 142, Рисунок 143, Рисунок 144, Рисунок 145, Рисунок 146, Рисунок 147, Рисунок 148, Рисунок 149, Рисунок 150, Рисунок 151, Рисунок 152, Рисунок 153, Рисунок 154, Рисунок 155, Рисунок 156, Рисунок 157, Рисунок 158, Рисунок 159, Рисунок 160, Рисунок 161, Рисунок 162, Рисунок 163, Рисунок 164, Рисунок 165, Рисунок 166, Рисунок 167, Рисунок 168, Рисунок 169, Рисунок 170, Рисунок 171, Рисунок 172, Рисунок 173, Рисунок 174, Рисунок 175, Рисунок 176, Рисунок 177, Рисунок 178, Рисунок 179, Рисунок 180, Рисунок 181, Рисунок 182, Рисунок 183, Рисунок 184, Рисунок 185, Рисунок 186, Рисунок 187, Рисунок 188, Рисунок 189, Рисунок 190, Рисунок 191, Рисунок 192, Рисунок 193, Рисунок 194, Рисунок 195, Рисунок 196, Рисунок 197, Рисунок 198, Рисунок 199, Рисунок 200, Рисунок 201, Рисунок 202, Рисунок 203, Рисунок 204, Рисунок 205, Рисунок 206, Рисунок 207, Рисунок 208, Рисунок 209, Рисунок 210, Рисунок 211, Рисунок 212, Рисунок 213, Рисунок 214, Рисунок 215, Рисунок 216, Рисунок 217, Рисунок 218, Рисунок 219, Рисунок 220, Рисунок 221, Рисунок 222, Рисунок 223, Рисунок 224, Рисунок 225, Рисунок 226, Рисунок 227, Рисунок 228, Рисунок 229, Рисунок 230, Рисунок 231, Рисунок 232, Рисунок 233, Рисунок 234, Рисунок 235, Рисунок 236, Рисунок 237, Рисунок 238, Рисунок 239, Рисунок 240, Рисунок 241, Рисунок 242, Рисунок 243, Рисунок 244, Рисунок 245, Рисунок 246, Рисунок 247, Рисунок 248, Рисунок 249, Рисунок 250, Рисунок 251, Рисунок 252, Рисунок 253, Рисунок 254, Рисунок 255, Рисунок 256, Рисунок 257, Рисунок 258, Рисунок 259, Рисунок 260, Рисунок 261, Рисунок 262, Рисунок 263, Рисунок 264, Рисунок 265, Рисунок 266, Рисунок 267, Рисунок 268, Рисунок 269, Рисунок 270, Рисунок 271, Рисунок 272, Рисунок 273, Рисунок 274, Рисунок 275, Рисунок 276, Рисунок 277, Рисунок 278, Рисунок 279, Рисунок 280, Рисунок 281, Рисунок 282, Рисунок 283, Рисунок 284, Рисунок 285, Рисунок 286, Рисунок 287, Рисунок 288, Рисунок 289, Рисунок 290, Рисунок 291, Рисунок 292, Рисунок 293, Рисунок 294, Рисунок 295, Рисунок 296, Рисунок 297, Рисунок 298, Рисунок 299, Рисунок 300, Рисунок 301, Рисунок 302