Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против синдрома гидроперикардита кур

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ включает приготовление антигенного материала в виде 5-10%-ной вируссодержащей суспензии из печени 5-50-суточных цыплят или первичной культуры клеток печени эмбрионов SPF-кур, инфицированных штаммом КР95 114-ДЕП вируса синдрома гидроперикардита кур (коллекция ВГНКИ) с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Вирус культивируют в организме цыплят или в культуре клеток в течение 48-120 ч. Для изготовления вакцины используют вирус с биологической активностью 4,25-5,0 Ig ТЦД₅₀/см³. После очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей известным образом в нее вносят димер этиленимина в концентрации 0,15-0,4% для инактивации вируса. Очищенный и авирулентный антигенный материал соединяют с масляным адъювантом в эффективном соотношении. Вакцина обладает повышенной антигенной и иммуногенной активностью, безвредна. 14 з.п.ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств для специфической профилактики синдрома гидроперикардита кур (СГПК).

СГПК (болезнь Ангара, болезнь Личи) - это остро протекающая инфекционная болезнь кур вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб развитому птицеводству многих стран мира.

Вирус СГПК вызывает заболевание молодняка кур, преимущественно в возрасте от 10 до 50 суток, которое характеризуется внезапной гибелью птицы, скоплением избыточного количества жидкости в перикардиальной полости, поражением печени и почек, депрессией, диареей, а в некоторых случаях и анемией.

В августе 1987 года в Пакистане на бройлерной ферме в местности Angara Goth близ Карачи зарегистрировали болезнь с признаками гепатита с тельцами-включениями и поражением сердца (гидроперикардит). Заболевание отмечалось, как правило, у птиц 3-6-недельного возраста, но иногда встречалось у более молодых либо более старших птиц, смертность достигала 50+70%. Первоначально заболеванию дали название "болезнь Ангара" в соответствии с географической местностью, где впервые зарегистрировали вспышку инфекции. Позднее заболеванию присвоили название "синдром гидроперикардита" в связи с тем, что при вскрытии трупов птиц отмечали скопление жидкости (до 20 мл) в сердечной сорочке, обусловленное нарушением кровообращения в сердечно-сосудистой системе. Подобное заболевание регистрировалось в Ираке, Индии, Мексике, Кувейте, Австралии, Японии и Чили (1).

С начала 90-х гг. вспышки СГПК с высоким уровнем смертности регистрируются на территории России (2). Отсутствие в отечественной ветеринарной практике средств и методов диагностики и специфической профилактики СГПК нанесло значительный экономический ущерб птицехозяйствам. Экономические потери, которые несут птицеводческие хозяйства от вспышек СГПК, складываются из падежа птиц (от 10 до 60%), гибели развивающихся эмбрионов кур во время инкубации, снижения продуктивности и оплаты корма, а также средств, затраченных на проведение внеплановых ветеринарно-санитарных мероприятий и др. (3). Вакцинопрофилактика СГПК занимает ведущее место в борьбе с этим заболеванием. Для профилактики СГПК применяют как живые, так и инактивированные вакцины, методы изготовления которых не отличаются от методов изготовления любых других вирусных вакцин. Все вакцины по способам репродукции вируса распределяются на три вида: 1) вакцины, приготовленные в организме птиц (цыплята); 2) вакцины, приготовленные с использованием вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости куриных эмбрионов (КЭ); 3) вакцины, приготовленные из вируса, репродуцированного в первичной культуре клеток печени и почек КЭ (4).

Однако вакцины, приготовленные из печени цыплят, содержат большое количество балластных веществ, которые иногда вызывают тяжелые осложнения общего и местного характера, часто заканчивающиеся гибелью птиц. Также вакцины, приготовленные из вируссодержащей суспензии, обычно имеют малое количество специфического антигена в сравнении с количеством сопутствующих балластных белков.

Получение более безопасных вакцин для профилактики СГПК стало возможным после отработки методов культивирования вируса СГПК в культуре клеток. Адаптация полевых изолятов вируса СГПК к первичной культуре клеток печени и почек КЭ открыла перспективу культуральных вакцин против СГПК (5).

Однако эти вакцины не лишены недостатков. Так, использование для репродукции вируса первичной культуры клеток печени КЭ сопровождается значительными материальными затратами при культивировании в промышленном масштабе.

В настоящее время в мировом промышленном птицеводстве для профилактики СГПК широко используют инактивированные эмульсионные вакцины, полученные из ткани инфицированной печени цыплят или первичной культуры клеток печени КЭ(6÷15).

Однако технология изготовления инактивированных эмульсионных вакцин против СГПК обладает недостатками, устранение которых остается актуальной задачей и служит основной предпосылкой для проведения исследований по ее усовершенствованию и решения вопроса защиты птицеводства нашей страны от этой опасной инфекции.

Известен способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК, включающий приготовление антигенного материала в виде 10-20% вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных возбудителем болезни и павших с признаками СГПК, очистку антигенного материала от балластных примесей центрифугированием при 2500-3000 об/мин в течение 15-20 мин, инактивацию вируса формальдегидом в течение 24 ч при 4^oС с периодическим перемешиванием, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта (6).

Недостатки данного способа состоят в том, что: - для получения антигенного материала используют печень цыплят, в которой содержание антигена часто сильно варьирует, а также она могла быть контаминирована возбудителями других инфекционных болезней птиц (болезнь Гамборо, болезнь Марека, инфекционный бронхит, инфекционная анемия кур и др.); - для очистки вируссодержащей суспензии от клеточного детрита используют метод низкоскоростного центрифугирования, не обеспечивающего в достаточной степени очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей; - в качестве инактиванта используют формальдегид, вызывающий деструктивные изменения вирусных белков и снижающий иммуногенную активность вакцины. Также велика вероятность неполной инактивации вируса при обработке формальдегидом вирусной суспензии, содержащей значительное количество балластного белка.

Известен способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК, включающий приготовление антигенного материала из штамма "Adeno-PAK" вируса СГПК, репродуцированного в культуре клеток, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса формальдегидом, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта (7).

Недостаток данного способа состоит в том, что полученная данным способом вакцина обладает низкой иммуногенной активностью.

Известен способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК, включающий приготовление антигенного материала из аденовируса кур 4 серотипа, выращенного в первичной культуре клеток печени куриных эмбрионов (КЗ) SPF-кур, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса β-пропиолактоном, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта (5).

Недостаток данного способа состоит в том, что полученная данным способом вакцина обладает также низкой иммуногенной активностью.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК, включающий приготовление антигенного материала из гомологичного вируса, выращенного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса формальдегидом, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и последующий контроль целевого продукта (15, 16).

Способ-прототип имеет существенные недостатки, состоящие в том, что полученная способом-прототипом вакцина обладает низкой антигенной и иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты против эпизоотического вируса СГПК, циркулирующего на территории Российской Федерации.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против вируса СГПК, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью и обеспечивающей защиту птицеводства Российской Федерации от эпизоотического вируса СГПК, наносящего значительный экономический ущерб.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности и безвредности инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК.

Указанный технический результат от использования изобретения достигнут созданием способа изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК, охарактеризованного следующей совокупностью признаков.

1. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК.

2. Приготовление антигенного материала из штамма возбудителя инфекции, выращенного в чувствительной биологической системе.

3. В качестве возбудителя инфекции используют штамм КР95 114 вируса СГПК в эффективном количестве.

4. Из чувствительных биологических систем используют печень 5-50-суточных цыплят.

5. Антигенный материал используют в виде 5-10% суспензии из печени 5-50-суточных цыплят, инфицированных штаммом КР95 114 вируса СГПК.

6. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, выращенного в печени 5-50-суточных цыплят, используют с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

7. Из чувствительных биологических систем используют первичную культуру клеток печени эмбрионов SPF-кур.

8. Антигенный материал используют в виде 5-10% суспензии первичной культуры клеток печени эмбрионов SPF-кур, инфицированных штаммом КР95 114 вируса СГПК.

9. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, выращенного в первичной культуре клеток печени эмбрионов SPF-кур, используют с биологической активностью 3,25-5,0 Ig Ig ТЦД₅₀/см³.

10. Очистка антигенного материала от балластных примесей известным образом: низкоскоростным центрифугированием, обработкой суспензии различными детергентами (фреон-113, хлороформ) или флокулянтом высокомолекулярным полигексаметиленгуанидингидрохлоридом (ВПГ) в сочетании с низкоскоростным центрифугированием или сепарированием.

11. Очищенный антигенный материал подвергают инактивации.

12. Из инактивантов используют димер этиленимина (ДЭИ).

13. ДЭИ используют в виде 10% водного раствора.

14. ДЭИ вносят в антигенный материал в концентрации 0,15-0,4%.

15. Инактивацию вируса СГПК ведут в течение 23-25 ч при 35-36^oС и рН 7,4-7,6.

16. Соединение очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом.

17. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 70" 18. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 206".

19. Антигенный материал соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 70" в соотношении, по меньшей мере, 1:3.

20. Антигенный материал соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206" в соотношении, по меньшей мере, 1:1.

21. Контроль целевого продукта.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.

1. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК.

2. Приготовление антигенного материала из штамма возбудителя инфекции, выращенного в чувствительной биологической системе.

3. В качестве возбудителя инфекции используют штамм КР95 114 вируса СГПК в эффективном количестве.

4. Очистка антигенного материала от балластных примесей.

5. Инактивация антигенного материала.

6. Соединение очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом.

7. Контроль целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Из чувствительных биологических систем используют печень 5-50-суточных цыплят.

2. Антигенный материал используют в виде 5-10% суспензии из печени 5-50-суточных цыплят, инфицированных штаммом КР95 114 вируса СГПК.

3. Антигенный материал из штамма KP95 114 вируса СГПК, выращенного в печени 5-50-суточных цыплят, используют с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

4. Из чувствительных биологических систем используют первичную культуру клеток печени эмбрионов SPF-кур.

5. Антигенный материал используют в виде 5-10% суспензии первичной культуры клеток печени эмбрионов SPF-кур, инфицированных штаммом КР95 114 вируса СГПК.

6. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, выращенного в первичной культуре клеток печени эмбрионов SPF-кур, используют с биологической активностью 3,25-5,0 Ig Ig ТЦД₅₀/см³.

7. Из инактивантов используют ДЭИ.

8. ДЭИ используют в виде 10% водного раствора.

9. ДЭИ вносят в антигенный материал в концентрации 0,15-0,4%.

10. Инактивацию вируса СГПК ведут в течение 23-25 ч при 35-36^oС и рН 7,4-7,6.

11. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 70".

12. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 206".

13. Антигенный материал соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 70" в соотношении, по меньшей мере, 1:3.

14. Антигенный материал соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206" в соотношении, по меньшей мере, 1:1.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются следующие.

1. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК.

2. Приготовление антигенного материала из штамма возбудителя инфекции, выращенного в чувствительной биологической системе.

3. Очистка антигенного материала от балластных примесей.

4. Инактивация вируса.

5. Соединение антигенного материала с масляным адъювантом.

6. Контроль целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются следующие.

1. В качестве возбудителя инфекции используют штамм КР95 114 вируса СГПК.

2. Штамм КР95 114 вируса СГПК используют в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Из чувствительных биологических систем используют печень 5-50-суточных цыплят.

2. Антигенный материал используют в виде 5-10% суспензии из печени 5-50-суточных цыплят, инфицированных штаммом КР95 114 вируса СГПК.

3. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, выращенного в печени 5-50-суточных цыплят, используют с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

4. Из чувствительных биологических систем используют первичную культуру клеток печени эмбрионов SPF-кур.

5. Антигенный материал используют в виде 5-10% суспензии первичной культуры клеток печени эмбрионов SPF-кур, инфицированных штаммом КР95 114 вируса СГПК.

6. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, выращенного в первичной культуре клеток печени эмбрионов SPF-кур, используют с биологической активностью 3,25-5,0 Ig TЦД₅₀/см³.

7. Из инактивантов используют ДЭИ.

8. ДЭИ используют в виде 10% водного раствора.

9. ДЭИ вносят в антигенный материал в концентрации 0,15-0,4%.

10. Инактивацию вируса СГПК ведут в течение 23-25 ч при 35-36^oС и рН 7,4-7,6.

11. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 70".

12. Антигенный материал соединяют с масляным адъювантом "Монтанидом ИЗА 70" в соотношении, по меньшей мере, 1:3.

13. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 206".

14. Антигенный материал соединяют с масляным адъювантом "Монтанидом ИЗА 206" в соотношении, по меньшей мере, 1:1.

Вакцина, полученная предлагаемым способом, обладает по сравнению с вакциной, полученной способом-прототипом, более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью, обеспечивает защиту против возбудителя СГПК, циркулирующего на поголовье птицы на территории Российской Федерации.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вакцины используют новый штамм КР95 114 вируса СГПК.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что инактивацию антигенного материала осуществляют ДЭИ, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенного материала.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части повышения антигенной и иммуногенной активности целевого продукта достигается также за счет использования в его составе масляных адъювантов "Монтанид ИЗА 70" и "Монтанид ИЗА 206".

Исходный вирус для получения штамма КР95 114 выделен из печени больных бройлеров на птицефабрике "Красноярская" Красноярского края в 1995 году. Производственный штамм КР95 114 получен путем многократных последовательных пассажей на цыплятах. Штамм КР95 114 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 14.12.2000 г. под регистрационным шифром КР95 114-ДЕП. Штамм является вирулентным и обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК.

Штамм КР95 114 вируса СГПК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства Штамм КР95 114 вируса СГПК относится к семейству Adenoviridae, роду Aviadenovirus, группе 1, серотипу 4, обладает морфологическими признаками, характерными для аденовирусов: как у всех прочих вирусов этого семейства, лишенных суперкапсидной оболочки, диаметр вириона штамма КР95 114 и нуклеокапсида равны. Размер вириона равен 75-80 нм. Вирион обладает икосаэдрическим типом симметрии. Вирион представлен нуклеотидом, состоящим из нуклеиновой кислоты и сердцевинных белков, и капсидной белковой оболочкой. Капсид содержит 252 капсомера, которые расположены в 20 фасетках, имеющих форму равносторонних треугольников. На ребрах равносторонних треугольных граней, общих для соседних треугольников, лежит по шесть капсомеров; длина ребра составляет около 42 нм. Каждый из 240 капсомеров капсидной оболочки, формирующих равносторонние треугольники, находятся в окружении шести таких же капсомеров и носит название гексон. Каждый из 12 капсомеров, расположенных в вершинах икосаэдра, окружен лишь пятью соседними капсомерами и носит название пептона. Каждый капсомер (кроме сложно устроенного пептона) представляет собой призматическую частицу диаметром 6-7 нм с центральной полостью размером 1,5-2 нм. Способ укладки капсомеров в капсид является уникальным для вирусов с икосаэдрическим типом симметрии и отличается геометрической упорядоченностью. Гексоны представляют собой основной растворимый компонент возбудителя при его репродукции в чувствительных клетках.

С пептонами связывают их способность агглютинировать эритроциты, что обусловлено присутствием в их составе полного гемагглютинина.

Сердцевина вириона содержит двухцепочную молекулу ДНК и два внутренних белка. ДНК имеет в своем составе около 60 генов, несущих информацию, которая достаточна для кодирования от 30 до 50 белков.

Антигенные свойства По своим антигенным свойствам штамм КР95 114 относится к группе 1 птичьих аденовирусов. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:2-1:64.

Биотехнологические характеристики
Штамм КР95 114 является вирулентным и обладает высокой биологической активностью в нативном виде, а также проявляет высокие антигенные и иммуногенные свойства после инактивации.

Штамм КР95 114 предназначен для использования в качестве сырья для изготовления инактивированной вакцины, а также диагностических биопрепаратов. Штамм КР95 114 репродуцируется на цыплятах 5-90-суточного возраста. В течение 48-120 ч инкубирования вирус накапливается в печени цыплят в титре 3,25-5,0 Ig ЛД₅₀/0,2 см³. Штамм КР95 114 является стабильным.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Сердцевина вириона содержит двухцепочечную молекулу ДНК и два внутренних белка. Масса нуклеиновой кислоты достигает 17,3% массы вириона.

Основная масса белков вируса СГПК сосредоточена в капсидной оболочке вириона. На долю сердцевинных белков приходится до 20% всех протеинов вируса. Сердцевинный белок "1" с молекулярной массой 46•10³ г/моль легко отделяется от внутреннего нуклеопротеида, содержащего ДНК в комплексе с богатым аргинином сердцевинным белком "2".

Гексон, основание пептона и его нить (фибер) вируса K95 114 построены из полипептидов с молекулярными массами 120•10³, 70•10³, 62•10³ г/моль соответственно.

Белковые структуры вируса штамма КР95 114 формируют несколько антигенов. В составе структурного вирусного антигена у них обнаружены типоспецифические, группоспецифические, подгруппоспецифические антигены полипептидов гексона, основания пептона и подгруппоспецифические и типоспецифические антигены нити пептона.

В составе структурного вирусного антигена выявлено три основных компонента, обозначенных А, В и С. Антиген А структурно связан с гексоном, антиген В - с пептоном, антиген С - с нитями вириона (фибер). Связанный с гексоном компонент А содержит группоспецифический антиген (α) и типоспецифический антиген (ε). Антигенный фактор, связанный с пептоном, назван антигеном (β), а с нитью вириона (фибер) - (γ).

Физические свойства
Масса вириона - 252•10³ г/моль. Плавучая плотность 1,32-1,35 г/мл в градиенте C_sCl. Константа седиментации зрелого вириона равна 810•10^-13-910•10^-13 с.

Устойчивость к внешним факторам
Штамм КР95 114 устойчив к действию эфира, хлороформа, сапонина и дезоксихолата натрия, чувствителен к формальдегиду, β-пропиолактону, гидроксиламину, производным этиленимина, УФ-облучению, γ-облучению.

Штамм КР95 114 довольно устойчив к нагреванию и к изменению рН среды в широком интервале, резистентен к действию 0,25% раствора трипсина, 2% раствора фенола и 50% раствора этилового спирта. Абсолютный этанол, как и его йодный раствор, вызывает полную инактивацию вируса.

Штамм КР95 114 устойчив к многократному повторению циклов замораживания и оттаивания, не теряет инфекционных свойств при сублимационном высушивании.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - 100%.

Патогенность выражена.

Вирулентность выражена.

Контагиозность выражена.

Онкогенность отсутствует.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм КР95 114 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса СГПК. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная вакцинопрофилактика вновь возникающих очагов болезни, для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1.

Для получения эмульсионной вакцины из штамма КР95 114 матровым вирусом внутримышечно в объеме 1 см³ заражают 5-50-суточных SPF-цыплят или цыплят, полученных из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. Цыплят содержат 48-120 ч после заражения. У больных и павших цыплят отбирают печень. Печень подвергают размолу на коллоидной мельнице в течение 10-12 мин, затем вируссодержащую массу смешивают с фосфатным буферным раствором, получая в результате 5-10% вируссодержащую суспензию с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ЛД₅₀/0,2 см³. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей известным образом. Для этого можно использовать низкоскоростное центрифугирование, обработку суспензии различными детергентами (фреон-113, хлороформ) и флокулянтом высокомолекулярным полигексаметилен-гуанидингидрохлоридом (ВПГ) в сочетании с низкоскоростным центрифугированием или сепарированием. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных белков проводят при 6-12^oС. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор. Для инактивации вируса используют димер этиленимина (ДЭИ). Предварительно готовят 10% раствор ДЭИ на деминерализованной воде рН 7,9-8,0. Затем в подогретую до 28-34^oС вируссодержащую суспензию вносят 10% раствор ДЭИ до концентрации 0,15-0,4%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 35-36^oС в течение 24 ч. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8^oС. К охлажденному антигену при постоянном помешивании добавляют масляный адъювант. В качестве масляного адъюванта используют препараты фирмы "Сеппик" (Франция): "Монтанид ИЗА 70" и "Монтанид ИЗА 206". Масляный адъювант и инактивированный антиген смешивают на гомогенизаторе согласно следующим режимам:
1) при использовании масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 70" - гомогенизация в течение 4-5 мин при скорости вращения винта 3000 об/мин и температуре 10^oС. При этом получают однородную эмульсию белого цвета типа "вода-масло";
2) при использовании масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 206" - гомогенизация в течение 3-4 мин при скорости вращения винта 600 об/мин и температуре 30^oС. Тип получаемой эмульсии "вода-масло-вода". При изготовлении вакцин антиген соединяют с масляным адъювантом в следующем соотношении: с адъювантом "Монтанид ИЗА 70" - 1:3, а с адъювантом "Монтанид ИЗА 206" - 1:1 соответственно.

Вязкость вакцин определяют на вискозиметре ВПЖ-2. Образцы вакцин контролируют на стабильность эмульсии центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин и хранением в термостате при 37^oС в течение 14 суток. Стабильная эмульсия в результате центрифугирования и хранения в термостате не должна расслаиваться на масляную и водную фазу. Контроль эмульсионной формы инактивированной вакцины против СГПК осуществляют определением стерильности, полноты инактивации вируса, безвредности, антигенной и иммуногенной активности и протективности препарата. Стерильность вакцины определяют в соответствии с (17).

Авирулентность и безвредность препарата определяют путем введения 10-15-суточным цыплятам вакцины в двойной дозе. Полученная вакцина представляет собой эмульсию светло-бежевого цвета.

Полученная вакцина против СГПК имеет оптимальный компонентный состав (рецептура), представленный в табл.1.

Содержание антигена в вакцине, в указанных в табл.1 пределах, является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Серию вакцины выпускают для практического применения, если в максимальном прививочном объеме для цыплят, равном 0,5 см³, содержится не менее 7 протективных доз (ПД₅₀).

Вакцину применяют клинически здоровой птице для создания высокого уровня иммунитета. Бройлерных цыплят вакцинируют однократно в возрасте 1-18 суток. Цыплятам вакцину вводят внутримышечно в область бедра или груди или подкожно в среднюю треть шеи в объеме 0,3 см³. Однократная прививка инактивированной эмульсионной вакциной против СГПК обеспечивает 90-100% защиту иммунизированных цыплят от заболевания СГПК в период, начиная с третьего дня после введения вакцины. Ремонтный молодняк иммунизируют дважды: первый раз в 1-18-суточном возрасте в дозе 0,3-0,5 см³ и второй раз в 90-140-суточном возрасте в дозе 0,5-0,7 см³. Иммунитет наступает с третьего дня после вакцинации и сохраняется до 8 месяцев. Двукратное применение вакцины в родительском стаде обеспечивает надежный пассивный материнский иммунитет у молодняка до 8-12-суточного возраста, что позволяет его защитить от полевого вирулентного вируса СГПК в ранний период жизни.

Пример 2.

Проведены исследования по изучению иммунобиологических свойств инактивированной масляной вакцины против СГПК, изготовленной предлагаемым способом. В опыте использовали цыплят кросса "Родонит" 50-суточного возраста в количестве 100 голов, предварительно исследовав их сыворотки крови на отсутствие антител к вирусу СГПК. Птиц разделили на пять опытных групп по 20 голов в каждой, 4 из которых прививали образцами вакцин, изготовленных предлагаемым способом, а одна группа цыплят была использована для контроля.

В качестве положительного контроля использовали инактивированную адсорбат-вакцину против СГПК на основе гидрата окиси алюминия (ГОА).

Цыплят содержали в клетках, корм и воду давали без ограничения.

Образцы вакцин контролировали на стабильность эмульсии при 4, 22 и 37^oС. Показателем стабильности была целостность эмульсии в процессе хранения. Стабильной считали вакцину, если при хранении в течение 2 недель при 37^oС не наблюдается фазового расслоения препарата.

Антигенную активность вакцин оценивали по динамике накопления антител к вирусу СГПК у привитых цыплят. Для этого цыплятам однократно внутримышечно (в/м) в область груди вводили вакцину в дозе 0,5 см³. На 21, 60 и 90 сутки после вакцинации у привитых цыплят отбирали кровь и получали сыворотки, которые индивидуально тестировали в РДП. Реакцию ставили по общепринятой методике. Полученный результат выражали в виде среднего геометрического титра антител по группе цыплят. В ходе эксперимента было отмечено, что все образцы вакцины, приготовленные с масляными адъювантами "Монтанид ИЗА 70" и "Монтанид ИЗА 206", способны индуцировать у привитой птицы выработку антител к вирусу СГПК на уровне 3,8-4,0 лог₂ уже на 21 сутки после вакцинации, который на 90 сутки после прививки постепенно снизился до 2,6-2,8 лог₂. Следует отметить, что в препарате, изготовленном с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206", содержание антигена в одной прививной дозе было на 17% больше, чем в вакцине на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 70". В контрольной группе цыплят, привитых ГОА-вакциной, уровень антител был ниже и составил на 21 и 90 сутки после вакцинации 2,2 и 1,8 лог₂ соответственно. Результаты исследований приведены в табл.2.

Из данных, представленных в табл.2, видно, что вакцина, приготовленная на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 70", обладала более высокой стабильностью при различных температурах, чем препарат на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 206", однако последний имел ниже показатель вязкости, что делает вакцину более удобной при введении в организм птицы. При проведении исследований не зарегистрировано видимых отклонений от физиологических норм в поведении подопытных птиц. При осмотре места введения эмульсионных вакцин морфологических изменений не обнаружено.

Пример 3.

Проведены исследования по изучению физических и иммунобиологических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК, изготовленной предлагаемым способом. Для этого были изготовлены и испытаны образцы вакцин, содержащие антиген разной концентрации (5 и 10% суспензия инактивированного вируса). Образцы вакцин контролировали на стабильность эмульсии при температурах 6, 22 и 37^oС, вязкость, безвредность и антигенную активность. Результаты исследований представлены в табл.3.

Из данных, представленных в табл.3, видно, что образцы вакцины, приготовленные на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 70", обладали более высокой стабильностью при различных температурах, чем образцы препарата на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 206", однако последние имели ниже показатели вязкости, что делает вакцину более удобной при введении в организм птицы.

У всех испытанных вакцин отмечена высокая способность индуцировать у привитых птиц выработку антител к вирусу СГПК от 4,53±0,1 лог₂ до 4,95±0,3 лог₂. При этом в препаратах, изготовленных с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206", содержание антигена в одной прививной дозе было на 17% больше, чем в вакцинах на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 70". В ходе опыта не зарегистрировано видимых отклонений от физиологических норм в поведении подопытных птиц.

Пример 4.

Проведены сравнительные исследования по изучению продолжительности и напряженности иммунитета инактивированной сорбированной вакцины против СГПК и инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК, изготовленной предлагаемым способом.

Испытания проводили на цыплятах в возрасте 20 суток, свободных от антител к вирусу СГПК. Вакцины вводили птице однократно в грудную мышцу в дозе 0,5 см³. За птицей вели наблюдение в течение 8 месяцев. На 7, 14, 21 и 30 сутки и через 2, 4, 6 и 8 месяцев проводили убой части подопытной птицы с целью визуального осмотра места введения и получения сывороток крови для серологического исследования. Данные опыта представлены в табл.4. Результаты эксперимента показали, что все образцы инактивированной вакцины были антигенно активны на протяжении всего периода исследования. Однако вакцина на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 70" обладала более выраженной антигенной активностью и индуцировала в организме образование более высокого уровня специфических антител против вируса СГПК в сравнении с препаратом на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА 206" и сорбированной формой вакцины.

Изучение динамики накопления антител у привитой птицы показало, что иммунный ответ в группе птиц, которым вводили сорбированную вакцину, проявлялся уже на 7 сутки после вакцинации, достигая максимальных значений в РДП к 21 дню, а в группах цыплят, иммунизированных вакцинами на основе масляных адъювантов, иммунная реакция проявлялась на 14 сутки и достигала высоких значение к 30-60 суткам после вакцинации. При всех формах инактивированной вакцины у привитой птицы стабильно удерживался высокий уровень антител к вирусу СГПК в течение 8 месяцев (срок наблюдения).

Контроль клинического состояния подопытной птицы в ходе эксперимента не выявил патологических признаков общего и местного характера в группах вакцинированной птицы. Контрольное взвешивание птицы в разных группах показало, что средняя живая масса курицы в вакцинированных группах существенно не отличалась от таковой в контрольной группе.

Пример 5.

Для приготовления эмульсионной вакцины используют штамм КР95 114 вируса СГПК, репродуцированный в первичной культуре клеток печени эмбрионов SPF-кур, с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ЛД₅₀/0,2 см³. Полученный вирус очищают от балластных примесей, инактивируют и смешивают с масляным адъювантом так, как описано в примере 1. Контроль полученной вакцины осуществляют определением стерильности, полноты, инактивации вируса, безвредности, антигенной, иммуногенной активности и протективности препарата. Стерильность вакцины определяют в соответствии с (17). Авирулентность и безвредность препарата определяют путем введения 10-15-суточным цыплятам вакцины в двойной дозе.

Пример 6.

Проведены исследования по определению иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против СГПК, полученной так, как описано в примере 5.

Исследования проводили на 10-суточных цыплятах кросса "Хайсекс белый", не имеющих антител к вирусу СГПК. Птицу разделили на три опытные и одну контрольную группы, по 10 голов в каждой. Цыплят 1, 2 и 3 опытных групп прививали однократно внутримышечно инактивированной эмульсионной вакциной в дозах 0,15-0,3 и 0,5 мл соответственно. Цыплят каждой группы содержали в индивидуальных клетках. Через 21 сутки после вакцинации всех цыплят подвергли контрольному заражению вирусом СГПК в дозе 1 см³ с титром инфекционной активности 3,75 Ig ЛД₅₀/0,2 см³. За птицей вели наблюдение в течение 7 суток. Результаты опыта по изучению иммуногенной активности полученной вакцины представлены в табл. 5. Из данных табл.5 видно, что после контрольного заражения 100% защиту наблюдали в группе цыплят, привитых вакциной в дозе 0,5 см³. В группах подопытных цыплят, которым вводили эмульсионную вакцину в дозах 0,15 и 0,3 см³ на голову, уровень защиты составил 70 и 90% соответственно. Падеж в контрольной группе вакцинированных цыплят, после заражения вирусом СГПК, составил 80%.

При патологоанатомическом вскрытии павших цыплят наблюдали изменения, характерные для СГПК. При осмотре места введения вакцины морфологических изменений в виде воспаления, очагов некроза и гранулем, выявлено не было.

На основании результатов проведенного исследования можно сделать вывод, что инактивированная эмульсионная вакцина против СГПК, изготовленная из вируса, культивированного в первичной культуре клеток печени эмбрионов SPF-кур, обладает протективным эффектом при отсутствии побочных реакций на месте введения препарата. Однократная прививка цыплят в дозе 0,3 или 0,5 см³ обеспечивает 90-100% защиту птиц от контрольного заражения.

Пример 7.

Были изготовлены и испытаны образцы инактивированной вакцины против СГПК различного ингредиентного состава и проведены испытания препаратов на антигенную активность в зависимости от сроков хранения.

Испытания вакцин проводили после изготовления и через 6 и 12 месяцев хранения при температуре 2-8^oС.

Исследования проводили на цыплятах 25-суточного возраста, не имеющих антител к вирусу СГПК, которых разделили на три группы. Одну группу прививали инактивированной вакциной против СГПК из штамма КР95 114, приготовленной на основе гидроокиси алюминия и сапонина, вторую - препаратом на основе маcляного адъюванта "Монтанид ИЗА 70", приготовленным так, как описано в примерах 1, и третью - вакциной с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206", приготовленной так, как описано в примере 5.

Иммунный ответ оценивали по приросту антител в РДП через 21 сутки после введения вакцины.

Результаты исследований представлены в табл.6.

Данные табл.6 показывают, что все образцы инактивированной вакцины против СГПК показали высокую активность при хранении в течение 6 месяцев, а при исследовании через 12 месяцев хранения антигенная активность препаратов несколько снизилась. Однако уровень различий был невысок. Данный факт свидетельствует о сохраняемости антигенной активности вакцин сорбированной и масляной форм в интервале температур от 2 до 8^oС.

Таким образом, результаты исследований по антигенной активности, в зависимости от сроков хранения инактивированной вакцины против СГПК, полученной на основе различных адъювантов, показали, что оба варианта препарата, как эмульсионная, так и ГОА-вакцина, обладали выраженной антигенной активностью в течение 12 месяцев после изготовления.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- способ изготовления инактивированнй эмульсионной вакцины против СГПК, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью приведенных в описании или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемого способа достигнут технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентноспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Cower B. S., Lu H. et. al. Charatirization studies of fowl adenoviruces associated with inclusion body hepatitis/Hydropericardium syndrome in chickens, presented at the 68-th Northeastern Conference in Avian Diseases. June 10-12 1996, р. 14.

2. Лагуткин Н.А., Арсентьев А.Р. и др. Массовый гидроперикардит у мясных цыплят раннего возраста. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Материалы научн. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1992, ч. 2, 248-251.

3. Borisov V. V. , Borisov A.V. et. al. Hidropericardium syndrome in chickens in Russia // Proc. of. the 11^th Int. Congress of the world Vet. Ponlt. Ass. August 18-22, Budapest, Hungary. - 1997. - P. 258.

4. Winterfield R.M., Fadly A.M. et. al. Immunisation of chicken against adenovirus infection. Poult, Sci. 1977. - V. 56, N5, 1481-1486.

5. Le Gros F. X. , Bouguet J.F., Gaudry D. Hydropericardium-hepatitis syndrome: potency of an inactivated vaccine produced on cell cultures. Proc. of the 45^th Western Poult. Dis. Conf. May 1-5. Cancun, Mexico. - 1996. - P. 140-142.

6. Survashe B.D., Pandid S.V. et. al. Inclusion body hepatitis/Hydropericardium syndrome (Leechy heart disease) in India - an overwiew. Proc. of the 20^th world's Poult. Congress. September 2-5 New Delhi. India. - 1996. - V. 2. - P. 375-380.

7. Khusi M., Chaudry H.M., Vanmarcke J. Efficacy trial with an inactivated oil-adjuvant vaccine against Hydropericardium syndrome. Proc. of the 20^th world's Poult. Congress. September 2-5. New Delhi, India. - V.1. - P. 347-348.

8. Gay G.M. у Soto P.E. Valoracion comparativa de une vacuna emulsionada experimental contra la hepatitis con cuerpos de inclusion. Memorias de la XX Convencion Nacional Aneca. - 1995. - P. 82-84.

9. Lucio D.E. Comparacion de la respuesta serologica у proteccion al desafio entre autovacunas producidas con molienda de higado у una vacuna elaborada en embrion de polio SPF contra el syndrome del hidropericardio. XIX Convencion Annual Aneca-Mexico. - 1994. - P. 110-115.

10. Soto P.E., Borrego J.L. et. al. Prevencion у control de la HCI/SHP en Mexico. XII Curso de Actualizacion Avimex. Mexico. - 1995. - P. 57-59.

11. Gay G.M., Soto P.E. et. al. Protection conferred by an inclusion body hepatitis commercial vaccine in birds challenged with several group I adenoviruses. Proc. of the 45^th Western Polt. Conf. May 1-5. Cancun. Mexico. - 1996. - P. 167-170.

12. Soto P. E., Gay G.M. et. al. Experiences with an adjuvanted killed inclusion body hepatitis vaccine. Proc. of the 46^th Western Poult. Dis. Conference, March 1-4. Sacramento, California. - 1997. - P. 19-20.

13. Grimes T.M. Cause and control of a parachute from of inclusion body hepapipis. Proc. of the 41^th Western Poult. Dis Conf. March 1-3. Sacramento, California. - 1992. - P. 42-44.

14. Villegas P. Adenovirus and inclusion body hepatitis in chickens. Proc. of the 45^th Western Poult. Dis Conference. May 1-5. Cancun, Mexico. - 1996. P. 62.

15. Mashkoor S. , Hameed A. et. al. Immune response of Angara disease (Hydropericardium syndrome) vaccines in broilers. Veterinarski Archiv. - 1994. - V. 64. - N 4-6. - P. 103-107 (прототип).

16. Ahmad L, Ahmad R. , Malik M.I. Comparative efficacy of different Angara disease vaccine in broilers. Zootecnica International. - 1991. - V. 30. - N 6. - P. 67-69.

17. ГОСТ 28085-89.

Формула изобретения

1. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против синдрома гидроперикардита кур, включающий получение антигенного материала в виде суспензии возбудителя инфекции, выращенного в чувствительной биологической системе, очистку антигенного материала от балластных примесей, инактивацию вируса, соединение антигенного материала с масляным адъювантом и контроль целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве возбудителя инфекции используют штамм вируса синдрома гидроперикардита кур, ceм. Adenoviridae, род Aviadenovirus, группа 1, серотип 4, коллекция ВГНКИ КР95 114-ДЕП, в эффективном количестве.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что из чувствительных биологических систем используют печень 5-50-суточных цыплят.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что антигенный материал используют в виде суспензии из печени 5-50-суточных цыплят, инфицированных штаммом КР95 114 вируса СГПК.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, выращенного в печени 5-50-суточных цыплят, используют с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что из чувствительных биологических систем используют первичную культуру клеток печени эмбрионов SPF-кур.

6. Способ по п.1 или 5, отличающийся тем, что антигенный материал используют в виде 5-10%-ной суспензии первичной культуры клеток печени эмбрионов SPF-кур, инфицированных штаммом КР95 114 вируса СГПК.

7. Способ по любому из пп.1, 5 и 6, отличающийся тем, что антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, выращенного в первичной культуре клеток печени эмбрионов SPF-кур, используют с биологической активностью 3,25-5,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что из инактивантов используют димер этиленимина.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что димер используют в виде 10%-ной водной суспензии.

10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что димер этиленимина вносят в антигенный материал в концентрации 0,15-0,4%.

11. Способ по любому из пп.1, 8-10, отличающийся тем, что инактивацию вируса ведут в течение 23-25 ч при 35-36^oС и рН 7,4-7,6.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что из адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 70".

13. Способ по п.1 или 12, отличающийся тем, что антигенный материал соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 70" в соотношении, по меньшей мере, 1:3.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что из адъювантов используют масляный адъювант "Монтанид ИЗА 206".

15. Способ по п.1 или 14, отличающийся тем, что антигенный материал соединяют с масляным адъювантом "Монтанид ИЗА 206" в соотношении, по меньшей мере, 1:1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3